Summary
在这里，我们描述了1-（2-[18F]氟乙基）-L-色氨酸的放射合成，这是一种用于研究色氨酸代谢的正电子发射断层扫描成像剂，在放射化学合成系统中使用一锅两步策略，具有良好的放射化学产率，高对映体过量和高可靠性。
Abstract
犬尿氨酸途径 （KP） 是色氨酸代谢的主要途径。有证据表明，KP的代谢物由于其免疫调节作用，神经调节和神经毒性作用，在肿瘤增殖，癫痫，神经退行性疾病和精神疾病中起着至关重要的作用。用于绘制色氨酸代谢的最广泛使用的正电子发射断层扫描（PET）剂 ，α-[11C]甲基-L-色氨酸（[11C]AMT），在费力的放射合成程序中具有20分钟的短半衰期。需要现场回旋加速器对[11C]AMT进行无线电合成。只有有限数量的中心生产[11C]AMT用于临床前研究和临床研究。因此，迫切需要开发一种具有更长半衰期，有利的 体内 动力学且易于自动化的替代成像剂。1-（2-[18F]氟乙基）-L-色氨酸（一种氟-18 标记色氨酸类似物）的效用和价值已在细胞系来源的异种移植物、患者来源的异种移植物和转基因肿瘤模型的临床前应用中得到报道。
本文提出了一种采用一锅两步策略的1-（2-[18F]氟乙基）-L-色氨酸的放射合成方案。使用该协议，放射性示踪剂可以以20±5%（合成结束时衰变校正，n>20）放射性化学产率生产，放射化学纯度和对映体过量均超过95%。该协议具有小前体量，每步反应溶剂不超过0.5mL，潜在毒性4，7，13，16，21，24-六氧沙-1，10-二氮杂双环[8.8.8]六十二烷（K222）的低负载量，以及用于纯化的环境良性和可注射流动相。该协议可以很容易地配置为在市售模块中生产1-（2-[18F]氟乙基）-L-色氨酸用于临床研究。
Introduction
在人类中， 色氨酸是日常饮食的重要组成部分.色氨酸主要通过犬尿氨酸途径（KP）代谢。KP由两种限速酶催化，吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）和色氨酸2，3-双加氧酶（TDO）。超过95%的色氨酸转化为犬尿氨酸及其下游代谢物，最终产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，这对细胞能量转导至关重要。KP是免疫系统的关键调节剂，也是神经可塑性和神经毒性作用的重要调节剂1，2。色氨酸代谢异常与各种神经系统、 肿瘤、 精神和代谢紊乱有关;因此， 放射性标记色氨酸类似物已被广泛用于临床研究.临床上最常见的两种色氨酸放射性示踪剂是11C-α-甲基-L-色氨酸（[11C]AMT）和11C-5-羟基色氨酸（11C-5-HTP）3。
在20世纪90年代，11C-5-HTP用于可视化分泌5-羟色胺的神经内分泌肿瘤4，并诊断和监测转移性激素难治性前列腺癌的治疗5。 后来，它被用作内分泌胰腺中5-羟色胺能系统定量的成像工具6。12C-5-HTP也是门内胰岛移植和2型糖尿病中可行胰岛的无创检测的有希望的示踪剂7，8。在过去的二十年中，许多放射性标记的氨基酸已进入临床研究9，10。特别是，碳-11标记的色氨酸类似物[11C]AMT在绘制脑5-羟色胺合成图谱11，12，13，14和定位癫痫病灶，致痫性肿瘤，结节性硬化症复合体，胶质瘤和乳腺癌方面受到广泛关注15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26.[11C]AMT在儿童各种低级和高级别肿瘤中也具有高摄取率27。此外，人类受试者中[11C]AMT的动力学示踪剂分析已被用于区分和分级各种肿瘤，并将胶质瘤与辐射诱导的组织损伤区分开来15。[11C]AMT 引导的影像学检查显示，在脑部疾病方面有显著的临床益处3，25。然而，由于碳-11的半衰期短（20分钟）和费力的放射合成程序，[11C]AMT的使用仅限于少数具有现场回旋加速器和放射化学设施的PET中心。
氟-18的半衰期为109.8分钟，而碳-11的半衰期为20分钟。人们越来越关注开发用于色氨酸代谢的氟-18标记放射性示踪剂3，28。在放射性标记，转运机制，体外和体内稳定性，生物分布和异种移植物中的肿瘤摄取方面，共报道了15种独特的氟-18放射性标记色氨酸放射性示踪剂。然而，观察到几种示踪剂的快速体内脱氟，包括4-，5-和6-[18F]氟三磷酸吡喃，排除了进一步的临床转化29。5-[18F]氟-α-甲基色氨酸（5-[18F]FAMT）和1-（2-[18F]氟乙基）-L-色氨酸（L-[18F]FETrp，也称为（S）-2-氨基-3-（1-（2-[18F]氟乙基）-1H-吲哚-3-基）丙酸，分子量为249.28克/摩尔），是两种最有前途的放射性示踪剂，在动物模型中具有良好的体内动力学，并且具有超越[111]的巨大潜力C]AMT用于评估色氨酸代谢失调的临床状况28.5-[18F]FAMT在免疫功能低下小鼠的IDO1阳性肿瘤异种移植物中显示出高摄取率，并且比[11C]AMT28，30对KP成像更具特异性。然而，5-[18F]FAMT的体内稳定性仍然是一个潜在的问题，因为在注射示踪剂30后30分钟以上没有报告体内脱氟数据。
基因工程髓母细胞瘤小鼠模型的临床前研究表明，与18F-氟脱氧葡萄糖（18F-FDG）相比，L-[18F]FETrp在脑肿瘤中的积累率高，体内脱氟可忽略不计，背景摄取低，显示出优越的靶向与非靶向比31，32。小鼠辐射剂量测定研究表明，L-[18F]FETrp的有利剂量测定暴露比临床18F-FDG PET示踪剂低约20%。与其他研究人员的发现一致，临床前研究数据提供了大量证据，以支持L-[18F]FETrp的临床翻译，用于研究患有癫痫，神经肿瘤学，自闭症和结节性硬化症等脑部疾病的人类色氨酸代谢异常28，31，32，33，34，35，36.表1显示了三种最广泛研究的色氨酸代谢示踪剂11C-5-HTP，[11C]AMT和L-[18F]FETrp之间的总体比较。 11C-5-HTP和[11C]AMT都有较短的半衰期和费力的放射性标记程序。这里描述了使用一锅两步法对L-[18F]FETrp进行无线电合成的协议。该协议的特点是使用少量放射性标记前体，少量反应溶剂，低毒性K222的负载以及环境友好和可注射的流动相用于纯化和易于配制。
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Protocol
注意：该协议涉及放射性物质。任何额外剂量的放射性物质都可能导致癌症等不良健康影响的机会成比例增加。研究人员必须遵循“尽可能低的合理可实现”（ALARA）剂量实践，以指导无线电合成方案，并在热电池或引线罩中提供足够的保护。在无线电合成过程中，最大限度地减少直接接触时间，使用铅屏蔽，并在任何辐射暴露步骤中保持最大距离至关重要。在整个实验过程中佩戴辐射剂量学徽章和手动监测环，并经常监测可能受污染的表面，如手套、袖子和脚。任何放射性材料的使用、运输和处置都必须遵守核管理委员会（NRC）、地方和机构法规。
1. 初步准备
- 在50mM乙酸钠/乙酸流动相中制备10%乙醇，用于半制备高效液相色谱（HPLC）。
- 将3 mL冰醋酸放入干净的1000 mL容量瓶中。将900毫升超纯水（25°C时电阻率为1800万欧姆厘米）加入容量瓶中;加入约8 mL的6 M氢氧化钠溶液，并使用校准的pH计和pH条将pH调节至5.5。溶液冷却至室温后，用超纯水将体积补到1000mL，以制备50mM乙酸钠/乙酸（pH 5.5）溶液。
- 通过0.2μm膜过滤器对溶液进行真空过滤，并将溶液转移到两个500 mL溶剂瓶中。
- 将约250mL上述缓冲液置于500mL容量瓶中。使用量筒测量50 mL美国药典（USP）乙醇，并将乙醇加入容量瓶中。用50 mM乙酸钠/乙酸将体积补到500 mL，并用pH试纸测量pH值。
- 为系统适用性测试准备质量控制（QC）解决方案。
- 用新鲜的超纯水（溶剂A）和乙醇（溶剂B）重新填充HPLC溶剂瓶。启动 HPLC 泵，并以 1 mL/min 的流速加载 HPLC 程序，该流速由 30% 溶剂 A 和 70% 溶剂 B （v/v） 组成。
- 为QC制作控制溶液（空白溶液）。将5 mL 0.9%氯化钠加入20 mL玻璃瓶中。将0.15mL的23.4%氯化钠加入上述溶液中。将步骤1.1.3中制备的6mL半制备HPLC流动相（10%乙醇在50mM乙酸钠/乙酸中，pH 5.5）加入玻璃小瓶中。
- 准备1μg/ mL非放射性分贝的L-FETrp和5μg/ mL外消旋L-FETrp和D-FETrp混合物（标准溶液）。
- 使用标准 L-FETrp 溶液（0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL）构建校准曲线。
- 设置 HPLC 序列。确保该序列包括一次空白样品溶液的运行，两次标准L-FETrp（1μg/ mL），一次外消旋L-FETrp和D-FETrp混合物（5μg/ mL）的运行，以及一次最终的放射性药物。
- 在使用分析HPLC柱（250 x 4.6 mm）分析放射性样品之前，运行部分HPLC序列以测试系统适用性。
- 运行一个空白样品，并确保空白样品的色谱图在空隙体积和色谱图的10分钟之间没有或微不足道的峰。
- 运行两次标准溶液的重复（含有1μg/ mL的L-FETrp）。确保两个重复中 L-FETrp 的面积在平均值的 ±5% 以内。
- 运行一个L-FETrp和D-FETrp混合物样品（分别为5μg/ mL L-FETrp和D-EFTrp）。确保可以在色谱图和基线上识别L-FETrp和D-FETrp。
- 准备放射性标记溶液和其他用品。
- 将以下溶液分别加入五个1.5 mL V形小瓶中。小瓶1：1毫升碳酸钾（K2CO3）/ K222溶液（5mg / mL K222和1mg / mL K2CO3在水/乙腈溶液中，1/99，v / v）用于[18F]氟化物洗脱;小瓶2：0.4毫升无水乙腈，用于[18F]氟化物干燥;小瓶3：放射性标记前体在无水乙腈（1-2mg在0.5毫升无水乙腈中）中用于[18F]氟化物掺入;小瓶4：盐酸（2 M，0.25 mL）在乙腈（0.25 mL）中用于酸解;小瓶5：2M氢氧化钠（0.25mL）用于中和反应混合物。
- 激活季铵（QMA）光盒，首先通过10 mL饱和碳酸氢钠溶液，然后通过10 mL超纯水，然后用氮气冲洗滤芯。通过10 mL乙醇调节轻质C8墨盒和中性氧化铝墨盒，然后通过10 mL超纯水。
- 将0.15 mL 23.4%氯化钠和5 mL 0.9%氯化钠加入30 mL无菌配方小瓶中，以调节张力并稀释HPLC级分。
- 在注射器中制备溶液（1 mL乙酸钠/乙酸缓冲液，50 mM，pH = 5.5，在步骤1.1.1中制备，1 mL乙醇和0.5 mL水[总计2.5 mL]）用于冲洗反应容器;装入10 mL无菌小瓶中。
2. 组装放射性标记用品和无线电合成L-[18F]FETrp
- 组装放射性标记用品。
- 打开模块电源、二氧化碳、压缩空气、氩气管路和可编程逻辑控制器 （PLC） 电源。单击 mod_pscf18 按钮以激活放射化学合成系统的程序。初始化输入、输出和公式 MVP，并确保 MVP 分别位于位置 4、1 和 1。
- 确保HPLC回路处于 注射 位置，QMA灯盒处于[18F]氟化物 捕获 位置。
- 安装半制备HPLC流动相瓶（包含步骤1.1.3中制备的溶液）。通过流动相以2 mL / min的流速通过手性HPLC柱（250 x 10 mm）和C18色谱柱（100 x 10 mm）至少30分钟来平衡HPLC系统，然后切换分流阀，让HPLC移动装置仅通过手性HPLC色谱柱，并将流速增加到3 mL / min。
- 将 QMA 灯盒安装在 [18F] 氟化物捕获/释放管路中。在输入MVP位置6和中间小瓶之间安装堆叠的氧化铝/ C8卡瓶，中间小瓶是连接到HPLC样品回路的10 mL V形样品瓶。将一个 10 mL 空小瓶（排气小瓶）安装到输出 MVP 位置 4，并将另一根针连接到小瓶上作为通风口。将试剂小瓶1-5分别安装到输入MVP位置1-5。
- 将含有步骤1.3.4中制备的漂洗溶液的小瓶安装到输出MVP位置6。
- 将一个500 mL废液瓶（收集通过手性色谱柱和C18色谱柱的HPLC废液）安装到配方MVP位置1。将另一个500 mL废物瓶（通过手性柱收集HPLC废物）安装到四口两位阀的废物收集端。
- 将馏分收集小瓶（在步骤1.3.3中制备的预填充溶液）连接到制剂MVP位置2。将输出 MVP 位置 3（气体管路）和最终产品输送线连接到配方 MVP 位置 2 小瓶，以回收最终配方产品。在配方MVP位置3安装一个10 mL空无菌小瓶，该小瓶将用作目标馏分收集的备用小瓶。
- 在四口、双位导流阀和配方MVP之间安装C18短柱。
注意：在试剂和配方小瓶的安装过程中，请确保控制面板中的氩气供应已关闭，并且氩气压力为零，以避免在样品瓶组装过程中出现任何意外的液体转移。仔细检查所有针头连接、小瓶位置和 MVP 位置，以进行可重复的放射合成。
- L-[ 的放射性合成18F]FETrp
- 接收和调查 [18F]氟化物。
- 当在合成开始时接收[18F]氟化物溶液（15±3千兆贝克勒（GBq））时，参见 材料表），在表面和1m处检查铅盒以记录最大辐射暴露速率。进行擦拭测试，以确保装运箱未被污染。记录[18F]氟化物剂量和时间。
- 转移[18F]氟化物。
- 将放射性转移到放射化学合成系统中。
- 用短针连接氩气管路，用长针连接[18F]氟化物转移管路到[18F]氟化物小瓶。关闭热室玻璃门和铅门。
注意：使用长钳将两根针向下推;确保长针尖位于[18F]氟化物小瓶的底部，以便所有[18F]氟化物都可以转移出去。通常，要求V形小瓶用于[18F]氟化物递送。
- 捕获、洗脱和共沸干燥 [18F]氟化物。
- 单击 Ar Supply 打开氩气供应管路，增加氩气压力，打开 [18F] 氟化物推杆，然后推动 [18F] 氟化水溶液通过 QMA 灯筒。在将所有放射性物质捕获在QMA光盒中并且放射性检测器读数稳定后，增加氩气压力并通过滤筒再吹5分钟以除去多余的水。
- 关闭[18F]氟化物推杆，将氩气压力降至零，将六口双位阀从[18F]氟化物捕获位置切换到洗脱位置。打开反应瓶，打开输入MVP位置1氩气管路，将K222 / K2CO3溶液通过QMA光盒推入输入MVP位置1小瓶，以洗脱出放射性进入反应瓶。将 [18F] 氟化物洗脱位置切换到捕获位置。
- 单击“ 加热 ”按钮将反应器加热到110°C，打开连接到反应器的输出MVP位置4氩气线（扫描线），并将溶剂蒸发到输出MVP位置4小瓶中。
- 单击 “冷却 ”按钮，用压缩的二氧化碳将反应器冷却到室温，关闭清扫线，将输入MVP位置1切换到位置2，然后在小瓶2中加入无水乙腈。打开清扫线和加热器，在110°C下共沸干燥[18F]氟化物。
- 加入放射性标记前体并掺入[18F]氟化物。
- 将反应器冷却至室温，关闭扫描线，将输入MVP位置2切换到位置3，并在小瓶3中添加甲苯磺酸盐放射性标记前体。关闭反应器，并将反应混合物在100°C下加热10分钟。
- 蒸发反应溶剂并酸解。
- 冷却并打开反应器，打开清扫线，并在100°C下蒸发反应溶剂。
- 冷却反应器，关闭清扫线，将输入MVP位置3切换到位置4，然后加入盐酸/乙腈混合物（0.5 mL，1/1，v / v）。在100°C下加热反应10分钟，以对放射性标记前体中的 叔丁基和 叔丁氧基羰基保护基团进行脱保护。
- 中和反应。
- 将反应器冷却至室温，并将输入MVP位置4切换到位置5以加入2M氢氧化钠以中和反应混合物。关闭输入 MVP 氩气行。
- 将反应混合物转移到中间小瓶中。
- 单击输出 MVP 中的 F 按钮，将输出 MVP 从排气位置 4 切换到位置 5，然后单击输入 MVP 中的 F 按钮，将输入 MVP 从位置 5 切换到位置 6。打开输出 MVP 氩气行。将反应混合物通过堆叠的中性氧化铝和C8卡夹推到HPLC样品回路之前安装的中间小瓶中。
- 冲洗反应器并转移溶液。
- 将输出MVP位置5切换至位置6，将输出MVP位置6的小瓶中的漂洗液推过反应瓶，并先后将卡入中间小瓶。请注意，混合混合物的体积约为3.5 mL。关闭反应容器。
- 将混合的混合物加载到HPLC回路中并纯化混合物。
- 将 HPLC 回路从注射位置切换到加载位置，打开输入 MVP 氩气管路，然后将混合物加载到 5 mL HPLC 回路。加载完成后，切换加载按钮进行注入，然后单击 “注入HPLC ”以3 mL /分钟的流速启动HPLC色谱图。单击 HPLC 监视器 按钮以访问实时 HPLC 色谱图。
- 将目标分数转移到 C18 列。
- 单击 转移MVP 按钮，在大约12分钟后将目标HPLC分数转移到短C18柱上。
- 冲洗手性HPLC色谱柱并纯化C18色谱柱中的馏分。
- 在C18色谱柱中收集目标放射性后（并且HPLC流动相流入制剂MVP位置1的废液瓶中），将四口两位分流阀切换到废液收集位置。以4 mL /min冲洗手性色谱柱6分钟，以除去轻微的D-[18F]FETrp对映异构体和其他紫外线（UV）杂质。
- 单击 转移MVP 按钮，以3 mL/min的流速将HPLC流动相转移回配方MVP位置1。观察流动相通过手性柱和C18柱以纯化保留在C18柱中的L-[18F]FETrp。
- 收集目标分数。
- 在大约32-34分钟时将淋洗液收集到制剂MVP位置2小瓶中。
注意：通常，收集2分钟的HPLC级分，总体积加上预填充的氯化钠溶液为8-15mL。
- 在大约32-34分钟时将淋洗液收集到制剂MVP位置2小瓶中。
- 将剂量递送到无菌的最终产品小瓶中。
- 将制剂MVP位置2小瓶中的溶液通过输送线和无菌过滤器推入最终剂量的小瓶中（通过预安装的无菌通风过滤器针）。
注意：实验方案步骤2.2.9-2.2.13是用于L-[18F]FETrp的HPLC纯化的步骤。
- 将制剂MVP位置2小瓶中的溶液通过输送线和无菌过滤器推入最终剂量的小瓶中（通过预安装的无菌通风过滤器针）。
- 测定放射性和剂量体积。
- 取出无菌过滤器并测定最终剂量活性和体积。
- 用超纯水冲洗系统，然后用乙醇以4 mL /分钟的速度冲洗系统，每次至少15分钟。关闭HPLC泵和PLC盒;关闭程序;关闭压缩空气管路、氩气管路和二氧化碳管路;并关闭模块的主电源。
- 抽出QC剂量并运行QC样品。
- 将约0.1mL最终剂量倒入QC小瓶的0.2mL插入液中。按照步骤1.2.6中描述的系统适用性测试，将热样品作为“部分序列”程序运行。
- 分析QC数据并释放剂量。
- 计算化学和放射化学纯度，对映体过量值和摩尔活性;确定 pH 值。
- 如果所有测试结果都通过可接受的范围，则释放剂量。
- 接收和调查 [18F]氟化物。
3. 运行后系统清理
- 使用盖革-穆勒（GM）测量仪测量放射性标记模块，以确保在系统清洁之前放射性充分衰减（至少24小时）。
- 打开无线电标记模块电源和PLC盒电源;激活放射化学合成系统的程序;并初始化输入 MVP、输出 MVP 和公式 MVP。将列选择器切换到旁路位置。
- 卸下 QMA 灯、氧化铝和 C8 灯芯。
- 首先用超纯水冲洗所有小瓶和管路，然后用乙醇冲洗。用高纯度氩气干燥小瓶和管路。
- 使用带盖子的无菌针头密封每个管路通风口。分别用烤箱燃烧的小瓶和反应容器替换试剂瓶和反应容器。
- 关闭HPLC泵和PLC盒;关闭程序;关闭压缩空气管路、氩气管路和二氧化碳管路;并关闭模块的主电源。
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Representative Results
反应方案如图 1所示。放射性标记包括以下两个步骤：1）甲苯磺酸盐放射性标记前体与[18F]氟化物的反应提供 18F标记的中间体，以及2）中间体中 叔丁氧基羰基和 叔丁基保护基团的脱保护，得到最终产物L-[18F]FETrp。两个反应步骤在100°C下继续10分钟。
在从商业供应商处收到[18F]氟化物之前，请组装试剂瓶，配方瓶和药筒;平衡半制备的QC系统;并运行 QC 系统适用性测试。图2概述了L-[18F]FETrp的无线电合成的详细工作流程。简而言之，对放射性进行调查并转移到放射化学合成系统中，并且在捕获/释放步骤之后，[18F]氟化物在反应容器中共沸干燥。在第一步中掺入[18F]氟化物后，加入酸以对两个官能团进行脱保护，然后碱中和。将反应混合物转移到中间小瓶中，并用混合溶液冲洗反应容器。将组合的混合物加载到HPLC回路中进行纯化。手性色谱柱和 C18 HPLC 色谱柱的组合用于去除化学杂质。将目标级分收集到预先填充有氯化钠的制剂小瓶中，以调节剂量浓度和张力。最终产物被无菌过滤到最终剂量的小瓶中，在释放剂量之前进行测定并等分用于QC。
系统设置的原理图如图 3所示。该模块由以下主要组件组成：1）用于试剂添加的输入MVP，2）用于反应器通风和冲洗的输出MVP，3）用于HPLC馏分收集和剂量配方的配方MVP，4）[18F]氟化物捕获和释放MVP，以及5）HPLC纯化系统。放射性、反应温度和压力的趋势可以通过控制面板实时监控。典型的半制备HPLC色谱图如图 4所示。将含有UV杂质的目标馏分转移到短C18柱中（黑色迹线与红色UV迹线重叠， 图4）。目标组分中的杂质可以通过使馏分通过C18色谱柱来去除。从C18柱洗脱的纯化的HPLC级分收集在制剂小瓶中。测定剂量并等分QC。
用于QC的代表性HPLC色谱图如图5所示。空白样品的色谱图显示空隙体积和程序10分钟之间的微不足道的峰值。非放射性标准参考L-FETrp显示单个异构体，与其D-对应物的标准参考物分离良好。L-[18F]FETrp的最终剂量显示出高化学纯度和放射化学纯度。在最高剂量浓度下对最终产物进行长达8小时的稳定性测试表明，L-[18F]FETrp在化学纯度，放射化学纯度，对映体过量和pH值方面是稳定的（表2）37。L-[18F]FET的单罐两步无线电合成方案大约需要100分钟。衰变校正收率为20±5%，化学和放射化学纯度大于95%。从氟化物的12-18 GBq开始，L-[18F]FET的摩尔活性为88-118 GBq/μmol。质量浓度通常小于0.5μg/mL，剂量浓度在37-185 MBq/mL范围内。
图1：L-[18F]FETrp的一锅两步无线电合成的反应方案。 缩写： MeCN = 乙腈;L-[18F]FETrp = 1-（2-[18F]氟乙基）-L-色氨酸;K222 = 4，7，13，16，21，24-六氧杂-1，10-二氮杂双环[8.8.8]六十二烷。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：L-[18F]FETrp 无线电合成工作流程概述。 *根据USP823进行完整的质量控制，USP797将遵循人类使用L-[18F]FETrp。缩写： QC = 质量控制;MeCN = 乙腈;L-[18F]FETrp = 1-（2-[18F]氟乙基）-L-色氨酸。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：L-[18F]FETrp的产量。 设置示意图（左）和无线电合成平台的照片（右）。该设置包括以下主要组件：1.输入MVP;2. 输出最有价值球员;3. 配方MVP;4. [18F]氟化物捕获/释放MVP;5. QMA滤芯;6.中间小瓶;7. 氧化铝/C8滤芯;8. 反应釜;9. 手性高效液相色谱柱;10、C18立柱;11.高效液相色谱柱废旧瓶至手性柱;12. 转移MVP;13.高效液相色谱柱废旧瓶至手性色谱柱和C18色谱柱;14. 配方小瓶;15.备份小瓶。缩写： L-[18F]FETrp = 1-（2-[18F]氟乙基）-L-色氨酸;MVP = 模块化西林瓶定位器;QMA = 季铵盐。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：用于纯化L-[18F]FETrp的典型半制备色谱图。 红色迹线，254 nm 处的 UV 通道。黑色痕迹，放射性通道。箭头1，2分别表示将含有L-[18F]FETrp的放射性馏分转移到C18柱的开始和结束。箭头3，4分别表示收集从C18柱洗脱的纯化目标馏分L-[18F]FETrp的开始和结束。缩写： L-[18F]FETrp = 1-（2-[18F]氟乙基）-L-色氨酸。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：用于L-[18F]FETrp质量控制的典型分析HPLC色谱图。 1）空白溶液，2）L-FETrp的标准溶液，3）L-FETrp和D-FETrp混合物的标准溶液，4）L-FETrp在230nm处的紫外线痕量，4）L-[18F]FETrp制剂的放射性痕量。缩写： L-[18F]FETrp = 1-（2-[18F]氟乙基）-L-色氨酸;L-FETrp = 1-（2-氟乙基）-L-色氨酸;D-FETrp = 1-（2-氟乙基）-D-色氨酸。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 示 踪 | 临床调查 | 主要适应症 | 优点 | 缺点 | |||
| 12C-5-硫代丁烷 | 是的 | 对产生5-羟色胺的神经内分泌肿瘤、神经精神疾病进行成像 | 对检测小神经内分泌肿瘤敏感 | 需要现场回旋加速器，半衰期短，程序费力，多酶放射性合成，对前体浓度和溶液pH敏感，在多巴胺能和去甲肾上腺素能区域的非特异性摄取 | |||
| [11C]安德森·毛利·毛利· | 是的 | 基于强犬尿氨酸通路激活的致痫组织和脑肿瘤定位 | 提供 cGMP 生产，但未掺入蛋白质合成 | 需要现场回旋加速器，半衰期短，程序费力，病理条件下定量复杂 | |||
| L-[18F]铁栅 | 不 | 显像犬尿氨酸通路，包括癫痫病灶、脑肿瘤和检测癫痫相关的神经炎症异常 | 良好的半衰期，可用于卫星投递、cGMP无线电合成、高脱氟稳定性和有利的辐射剂量测定 | L-氨基酸转运蛋白和丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运蛋白促进摄取，尚无人体研究 | |||
表1：11C-5-HTP，[11C]AMT和L-[18F]FETrp的比较。缩写：cGMP = 当前的良好生产规范;α-[11C]甲基-L-色氨酸;L-[18F]FETrp = 1-（2-[18F]氟乙基）-L-色氨酸;12C-5-HTP = 11C-5-羟基色氨酸。
| 测定合成结束后数小时 | 高效液相色谱（%）的放射性化学纯度（%） | 化学纯度（%） | 对映体过量（%） | pH 值 |
| 0 | 99 | >96 | 98 | 5.5 |
| 1 | 99 | >96 | 99 | 5.5 |
| 2 | 99 | >96 | 99 | 5.5 |
| 4 | 99 | >96 | 98 | 5.5 |
| 6 | 98 | >96 | 98 | 5.5 |
| 8 | 97 | >96 | 97 | 5.5 |
表2：L-[18F]FETrp在最高剂量浓度下的典型批次的稳定性测试。 缩写： L-[18F]FETrp = 1-（2-[18F]氟乙基）-L-色氨酸。
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Discussion
色氨酸是人体必需的氨基酸.它在情绪，认知功能和行为的调节中起着重要作用。放射性标记的色氨酸衍生物，特别是碳-11标记的[11C]AMT，由于其在绘制血清素合成图谱38，39，检测和分级肿瘤40，指导癫痫手术41，42以及评估糖尿病治疗反应方面的独特作用，已被广泛研究43。然而，短半衰期和费力的放射性标记程序限制了[11C]AMT的广泛应用，正在努力开发用于色氨酸代谢的氟-18标记剂。最近的两篇综述文章总结了氟-18标记色氨酸成像剂的发展和成像特性3，28。
与其11C标记的前身相比，L-[18F]FETrp表现出良好的体内成像特性，良好的代谢稳定性和对脱氟的抵抗力33。此外，与18F-FDG相比，L-[18F]FETrp显示出良好的剂量测定曲线，并已被提议作为临床转化的有前途的色氨酸成像剂32，33。这里描述的方法利用一锅两步策略在放射化学合成系统中对L-[18F]FETrp进行无线电合成。L-[18F]FETrp具有高化学纯度，放射化学纯度和对映体过量。最终剂量中非放射性L-FETrp的总质量不超过5μg，乙醇含量不超过10%。L-[18F]FETrp在PET中心常规生产，用于转基因髓母细胞瘤小鼠脑肿瘤模型中色氨酸代谢的成像，并已显示出良好的成像结果32。与报道的L-[18F]FETrp方法相比，当前方案包括以下详述的好处。
首先，与其他报道的放射性标记模块和方法（其中使用1.1 mL溶剂中的9mg前体）相比，使用较小的反应容器和较少的前体和反应溶剂进行放射性标记35，并且仅将1-2mg放射性标记前体加入到0.5mL溶剂中，但对映异构体的收率要高得多。据报道，L-[18F]FETrp的两锅三步放射合成的产量不到1%，而没有任何对映体超额值的报告44。
其次，与报道的L-[18F]FETrp或外消旋[18F]FETrp手术相比，使用最低量的毒性K222。通常使用4-5毫克的K222，而其他人使用的是37.5毫克35。K222是一种相转移催化剂，常用于18F标记PET示踪剂的放射性合成。USP 中针对 K222 规定的限值小于 50 μg/mL。在释放最终剂量供临床使用之前，必须进行色斑测试以检测残留的K222浓度以满足标准45。
第三，在K2CO3/K222溶液中仅引入1%的水进行[18F]氟化物洗脱，这加快了[18F]氟化水溶液的干燥过程。[18F]氟化物阴离子在水介质中大量水合并变得化学惰性46。因此，通过脱溶[18F]氟化物和共沸干燥水溶液来增强亲核性是[18F]氟化物掺入所必需的。水还将与[18F]氟化物竞争以水解，而不是放射性标记前体所需的[18F]氟化物亲核取代。
第四，可注射流动相用于L-[18F]FETrp的纯化。50 mM乙酸钠/乙酸中的10%乙醇，pH 5.5，用作流动相以纯化放射性示踪剂，在临床使用的最终剂量中，乙醇含量容易降低到10%以下。虽然据报道水中90%的乙醇可以分解对映异构体，但在78°C34下将乙醇含量蒸发到低于10%需要更多的时间。
L-[18F]FETrp在转基因髓母细胞瘤小鼠模型中的临床前研究表明，1-L-[18F]FETrp具有较高的脑肿瘤积累和良好的动力学，体内脱氟可以忽略不计，背景摄取低32。1-L-[18F]FETrp也显示出与18F-FDG31的优越目标与非目标比。此外，该方案易于设置，用于生产用于临床研究的L-[18F]FETrp37。对于放射性药物的最终剂量，可以很容易地进行额外的全面QC测试，包括过滤器完整性，放射性无毒纯度，残留溶剂水平，K222浓度，细菌内毒素水平和无菌测试。L-[18F]FETrp在人类受试者中的临床应用的监管批准过程正在积极进行中。
该方法有一些限制。使用两个HPLC色谱柱来获得足够的化学纯度和对映体过量的L-[18F]FETrp。流动相的流速为3 mL/min用于纯化。较高的流速会导致高背压，而较低的流速会导致较长的纯化时间和峰值的基线分辨率较差。与流动相相兼容并显示出对映体更好的选择性和优于杂质的良好分辨率的替代HPLC色谱柱可以简化纯化步骤。
放射化学合成模块是一个非商业系统。外消旋[18F]FETrp的全自动无线电合成已在商用GE FASTlab合成器中报道。对映异构体的手性分离用手性分析HPLC柱进行;最终的L-和D-异构体在第二个FASTLab盒上配制35。Xin和Cai34 报道了使用GE FX-N系统对光学纯L-[18F]FETrp进行自动无线合成。虽然两种对映异构体可以很容易地用半制备手性HPLC柱分离，但具有高乙醇含量（水中乙醇含量为90%）的流动相不适合直接注射人34。对于具有高对映体过量的L-[18F]FETrp，使用商用放射合成器和可注射流动相是非常理想的，以便于临床研究。
综上所述，采用一锅两步法，采用一锅两步法合成了氟-18标记色氨酸类似物L-[18F]FETrp，具有高可靠性和重现性。放射性合成具有少量放射性标记前体和溶剂，可注射的流动相，并且易于临床生产供人使用的L-[18F]FETrp。该协议将促进更广泛地利用这种放射性示踪剂用于与色氨酸代谢有关的神经系统疾病和癌症.
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Disclosures
作者声明不存在相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了诊断与研究PET / MRI中心以及Nemours / Alfred I. DuPont儿童医院生物医学研究和放射学部门的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [18F]Fluoride in [18O]H2O | PETNET Solutions Inc. | N/A | |
| 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosane | ACROS | 291950010 | Kryptofix 222 or K222, 98% |
| Acetic acid | ACROS | 222142500 | 99.8% |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | anhydrous, 99.8% |
| Agilent 1260 HPLC system | Agilent Technologies | Agilent 1260 | Agilent 1260 series |
| Analytcial chiral HPLC column | Sigma-Aldrich | 12024AST | Astec CHIROBIOTIC T, 25 cm × 4.6 mm |
| Carbon dioxide, 60 LBS | Airgas | REFR744R200S | 99.99% |
| D-FETrp standard reference | Affinity Research Chemicals Inc | N/A | Custom synthesis |
| Empty sterile vial | Jubilant HollisterStier | 7515 | 20 mm closure, 10 mL |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | 200 proof, USP grade. ≥99.9% |
| Fisherbrand 13 mm Syringe Filter, 0.22 µm, PVDF, sterile | Fisher Scientific | 09-720-3 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721 | ≥37% |
| Isopropanol | Decon Labs | 8316 | 70%, sterile |
| L-[18F]FETrp radiolabeling precursor | Affinity Research Chemicals Inc | N/A | Custom synthesis |
| L-FETrp standard reference | Affinity Research Chemicals Inc | N/A | Custom synthesis |
| Light C8 cartridge | Waters | WAT036770 | Sep-Pak C8 plus light cartridge |
| Needle, 20 G x 1 | Becton-Dickinson & Co. | 305175 | |
| Needle, 20 G x 1 ½ | Becton-Dickinson & Co. | 305176 | |
| Needle, 21 G x 2 | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | |
| Neutral aluminum oxide | Waters | WAT023561 | Sep-Pak alumina N plus light |
| Nylon membrane (0.20 µm ) | MilliPore | GNWP04700 | 47 mm |
| Pall Acrodisc 25 mm syringe sterile filter | Pall Corporation | 4907 | |
| PETCHEM radiochemistry synthesis system | PETCHEM Solutions Inc. Pinckney, MI | N/A | Radiosynthesizer |
| pH strips 2.0 - 9.0 | EMD Millipore | 1.09584.0001 | |
| Potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 367877 | 99.995% |
| Quaternary methylammonium light cartridge | Waters | 186004051 | Sep-Pak QMA light |
| Semi-preparative C18 HPLC column | Phenomenex | 00D-4253-N0 | 100 × 10 mm |
| Semi-preparative chiral HPLC column | Sigma-Aldrich | 12034AST | Astec CHIROBIOTIC T, 25 cm × 10 mm |
| Sodium chloride injection 23.4% | APP Pharmaceutical, LLC | 18730 | USP grade |
| Sodium chloridei injection 0.9% | Hospira | NDC 0409-4888-10 | USP grade |
| Sodium hydroxide | Honeywell | 306576 | 99.99% |
| Spinal needle, 20 G x 3 ½ | Becton-Dickinson & Co. | 405182 | |
| Sterile alcohol prep pads | BioMed Resource Inc. | PC661 | |
| Sterile empty vials, 2 mL | Hollister Stier | 7505ZA | 13 mm closure |
| Sterile empty vials, 30 mL | Jubilant HollisterStier | 7520ZA | 20 mm closure |
| Syringe PP/PE, 3 mL, Luer Lock | Air-Tite | 4020-X00V0 | |
| Syringe PP/PE, 5 mL, Luer Lock | Becton-Dickinson & Co. | 309646 | |
| Syringe, PP/PE, 10 mL, NORM-JECT | Air-Tite | 4100-000V0 | |
| Syringe, 1 mL, Luer Slip | Becton-Dickinson & Co. | 309659 | |
| Syringe, 3 mL, Luer-Lock | Becton-Dickinson & Co. | 309657 | |
| Ultra high purity argon | Airgas | AR UHP300 | 99.999% |
| Ultrapure water | MilliporeSigma | ZRQSVP300 | Direct-Q 3 tap to pure and ultrapure water purification system |
References
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![1-（2-[<sup>18F</sup>]氟乙基）-L-色氨酸的放射性合成，采用一锅两步实验方案](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/63025.jpg)
