Summary
Kardiyolojide hücresel ve moleküler fonksiyonel deneyler için altın standart kardiyomiyositlerdir. Bu makalede, fare kardiyomiyositlerini izole etmek için Langendorff dışı tekniğe yapılan uyarlamalar açıklanmaktadır.
Abstract
Yüksek kaliteli kardiyomiyositler veren tekrarlanabilir ancak teknik olarak basit yöntemlere duyulan ihtiyaç, kalp biyolojisindeki araştırmalar için gereklidir. Kardiyomiyositler üzerinde yapılan hücresel ve moleküler fonksiyonel deneyler (örneğin, kasılma, elektrofizyoloji, kalsiyum döngüsü, vb.) hastalığın mekanizmalarını belirlemek için altın standarttır. Fare, fonksiyonel deneyler için tercih edilen türdür ve açıklanan teknik, özellikle fare kardiyomiyositlerinin izolasyonu içindir. Langendorff aparatı gerektiren önceki yöntemler, aort kanülasyonu için yüksek düzeyde eğitim ve hassasiyet gerektirir ve sıklıkla iskemi ile sonuçlanır. Alan, basit, tekrarlanabilir ve fizyolojik veri toplama ve kültür için uygulanabilir miyositler veren Langendorff'suz izolasyon yöntemlerine doğru kaymaktadır. Bu yöntemler aort kanülasyonuna kıyasla iskemi süresini büyük ölçüde azaltır ve güvenilir bir şekilde elde edilen kardiyomiyositlerle sonuçlanır. Langendorff'suz yönteme adaptasyonumuz, buz gibi soğuk temizleme çözeltisi ile ilk perfüzyonu, perfüzyon sırasında sabit bir iğne sağlayan stabilize edici bir platformun kullanımını ve fonksiyonel ölçümlerde ve kültürde kullanılmak üzere güvenilir bir şekilde elde edilen kardiyomiyositleri sağlamak için ek sindirim adımlarını içerir. Bu yöntemin uygulanması basit ve hızlıdır ve çok az teknik beceri gerektirir.
Introduction
On yıllar boyunca, kardiyak biyoloji literatüründe önemli bir fikir, moleküler etki mekanizmasıdır. Güvenilir çalışmaların yayınlanması için etki mekanizması kurulmalıdır. Moleküler mekanizmayı belirlemek için iyi kurulmuş bir strateji, güvenilir verilere ulaşmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gerektiren izole kardiyomiyosit çalışmalarıdır. Kardiyomiyositler üzerinde etki mekanizmasını belirlemek için yapılan hücresel ve moleküler deneyler kasılma1, elektrofizyoloji2, kalsiyum (Ca2+) döngüsü3, miyofilamanCa2+ duyarlılığı4, hücre iskeleti5, metabolizma6, hormonların etkileri7, sinyal molekülleri8, ilaç çalışmaları9 araştırmak için altın standarttır ve saire. Fare, genetik manipülasyonun kolaylığı, küçük boyutu, nispeten kısa ömrü, düşük maliyeti vb.10 nedeniyle çoğu kardiyak biyoloji deneyi için tercih edilen tür haline gelmiştir. Bununla birlikte, yüksek kaliteli fare kardiyomiyositlerinin güvenilir izolasyonu, mevcut tekniklerle önemsiz değildir.
Laboratuvarlar neredeyse 70 yıldır kardiyomiyositleri izole ediyor11. Kardiyomiyositleri izole etmek için hemen hemen tüm teknikler, kalbin çeşitli enzimler (kollajenaz, proteaz, tripsin vb.) Erken dönemlerde (1950'ler-1960'lar), kalbin çıkarılmasını, çok daha küçük parçalara ayrılmasını ve kollajenaz / proteaz / tripsin12 ile çözelti içinde inkübe edilmesini içeren yığın yöntemi kullanılmıştır. 1970'lerde laboratuvarlar, koroner arter perfüzyonuna dayalı bir izolasyon tekniği (Langendorff cihazı aracılığıyla enzim ile retrograd perfüzyon) kullanarak kardiyomiyositleri izole eden iyileştirilmiş "Langendorff" yöntemi13'ü uyguladı; Bu teknik, bugün sahada miyosit izolasyonunun baskın yöntemi olmaya devam etmektedir, ~ 50 yıl sonra14,15,16. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, hipoksi süresini ve iskemik hasarı sınırlamak için kalbin in vivo olarak kanüle edilmesine kaymıştır ve bu da üstün kardiyomiyosit izolasyonları (daha iyi verim ve daha yüksek kalite) ile sonuçlanmıştır17. Son zamanlarda, bu in vivo, Langendorff içermeyen kalp perfüzyonları 18,19,20,21,22 performans göstermeye dönüşmüştür. Langendorff-free kardiyomiyosit izolasyon tekniğini Ackers-Johnson ve ark.18 tekniğine dayanarak geliştirdik ve önceki birçok izolasyon tekniğinden çeşitli bileşenleri uyarladık. Bu önemli uyarlamalar, buz gibi soğuk bir temizleme tamponunun enjeksiyonunu ve iğneyi stabilize etmek için destekleyici bir platformun dahil edilmesini içerir ve bu da kalbin manipülasyonunun azaltılmasına izin verir. Bu teknikte ayrıca ayrıntılı olarak açıklanan, enjekte edilen tamponların sıcaklık kontrolüdür (37 ° C), bu da daha önce yayınlandığı gibi daha az EDTA perfüzyonu nedeniyle in vivo enjeksiyon ve sindirim arasındaki süreyi azaltmıştır18. Kalbin manipülasyonunu azaltarak ve dolayısıyla delinme yeri boyutunu en aza indirerek, koroner arterlerin tam ve sürekli perfüzyonu elde edilir. Ayrıca tekniği ikincil bir yığın yöntemi sindirimi, enjekte edilen temizleme tamponundaki EDTA miktarı ile rafine ettik ve pH'ı değiştirdik. Tarif ettiğimiz teknik daha güvenilir, daha verimlidir ve Langendorff aparatının kullanımına kıyasla kapsamlı bir eğitim/uygulama gerektirmez (Tablo 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada gerçekleştirilen tüm prosedürler, Ohio State Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından NIH kurallarına uygun olarak onaylanmıştır.
1. Çözelti hazırlama
NOT: Tampon konsantrasyonları için lütfen Tablo 2'ye bakınız.
- Ön izolasyon (miyosit izolasyonundan 2 hafta öncesine kadar)
- Perfüzyon tampon bazı: 1 L ultra saf 18.2 MΩ · cm H2O. 0.22 μm steril filtrasyondan önce pH 7.4'e ayarlayın. İzolasyon gününe kadar 4 °C'de saklayınız.
- Temizleme tamponu: 1 L ultra saf 18,2 MΩ·cm H2 O'da 1 L temizleme tamponu (NaCl, KCl, NaH2PO 4, HEPES, Glikoz, EDTA ve BDM) hazırlayın 0,22 μm steril filtrasyondanönce pH7,4'e ayarlayın. İzolasyon gününe kadar 4 °C'de saklayınız.
- 100 mM CaCl 2 stok çözeltisi: 1,11 g CaCl 2'yi tartın ve 100 mL ultra saf 18,2 MΩ · cmH2O. İzolasyon gününe kadar oda sıcaklığında saklayın.
- Liberaz alikotları: 5 mg sindirim enzimini 5 mL steril, RNaz içermeyen suda çözün. 0.8 mL alikot hazırlayın ve izolasyon gününe kadar -20 ° C'de saklayın.
- Bulaşıkları lamine edin: Steril, cam tabanlı 30 mL Petri kaplarına 100 μL 40 μg/mL fare laminin uygulayın. 30 dakika bekletin ve fazla laminin çıkarın. Laminini 30 dakika boyunca oda sıcaklığında UV inkübasyonlu bir Petri kabına yerleştirin. İzolasyon gününe kadar 4 ° C'de saklayın (lamine Petri tabakları 2 haftaya kadar kullanılabilir).
- DMEM ortamı: Bir biyogüvenlik kabininde, 46 mL DMEM'e 2,5 mL FBS, 0,5 mL Penisilin-Streptomisin (50 U/mL-50 μg) ve 1 mL 500 mM BDM ekleyin. İzolasyon gününe kadar 4 ° C'de saklayın (medya 2 haftaya kadar kullanılabilir).
- M199 ortamı: 1 L ultra saf 18,2 MΩ·cm H2 O. Steril filtrasyondan önce pH 7,4'e ayarlayın (0,22 μm filtre). İzolasyon gününe kadar 4 °C'de saklayınız.
- 500 mM BDM stoğu: 10 mL ultra saf 18,2 MΩ·cmH2O'ya 0,5 g BDM ekleyin.
- Stabilize edici platform oluşturma: Luer stopcock'a vidalanan iğnenin tabanı etrafındaki kalıp oyun hamuru. Kalbi içerecek ve iğnenin ventrikül enjeksiyonu için uygun yükseklikte olmasını sağlayacak Petri kabına kalıplayın (çanağın tabanının ~ 5 mm üstünde).
- İzolasyon günü
- Perfüzyon tamponu: İzolasyon gününde, 9.5 mg MgCl2 ila 100 mL perfüzyon tampon tabanı ekleyin. 30 mL tamamlanmış perfüzyon tamponunu çıkarmadan önce tamamen karışmaya bırakın ve vidalı kapak kapağı (sindirim tamponu) olan temiz, geniş ağızlı, 100 mL'lik bir cam şişeye yerleştirin.
NOT: Bu ilaveler, ilaveleri pH'ı ihmal edilebilir şekilde değiştirdiği için izolasyon gününde ek pH ayarlamaları yapılmadan yapılabilir.- 12 mL perfüzyon tamponunu çıkarın ve yan tarafa koyun (durdurma tamponu). Kalan 58 mL perfüzyon tamponunu, vidalı kapak kapaklı temiz, geniş ağızlı, 100 mL'lik başka bir cam şişeye dökün. Kalan perfüzyon tamponunu izolasyon boyunca 37 °C'de saklayın.
- Sindirim tamponu: 25 μM'lik son konsantrasyon için 7,5 μL 100 mM CaCl2 ila 30 mL perfüzyon tamponu ekleyin. İzolasyondan hemen önce, 26 μg / mL'lik nihai bir konsantrasyon için sindirim tamponuna 770 μL Liberaz ekleyin.
- Durdurma tamponu: 240 mg BSA'yı 12 mL perfüzyon tamponunda çözün. İzolasyon boyunca 37 °C'de saklayın.
- Temizleme tamponu: 3 mL'lik bir temizleme tamponu şırıngası hazırlayın ve kabarcıkların iğnesini temizleyin. İzolasyona kadar buz üzerinde saklayın.
- Perfüzyon tamponu: İzolasyon gününde, 9.5 mg MgCl2 ila 100 mL perfüzyon tampon tabanı ekleyin. 30 mL tamamlanmış perfüzyon tamponunu çıkarmadan önce tamamen karışmaya bırakın ve vidalı kapak kapağı (sindirim tamponu) olan temiz, geniş ağızlı, 100 mL'lik bir cam şişeye yerleştirin.
2. Manifold hazırlığı
- Sıcaklık kontrollü manifoldu yeni hazırlanmış perfüzyon tamponu ile temizleyin ve kabarcık kalmamasına dikkat edin. Bir Luer kilit konektörü kullanarak, 27 G iğneye vidalayın ve kabarcıkları temizleyin. Başarılı bir izolasyon için temizlenmiş bir manifold gereklidir.
3. Hayvan hazırlama
- İzolasyondan hemen önce fareye intraperitoneal olarak vücut ağırlığına göre 100 mg / kg ketamin ve 20 mg / kg ksilazin enjekte edin. Bu prosedürde 4 aylık bir erkek C57Bl/6 fare kullanılmıştır.
- Gerekirse, sedasyonu teşvik etmek için fareyi ısıtılmış bir cerrahi pedin üzerine yerleştirin. Farenin kollarını çadırlayın ve kuyruğun uzuvlarını ve tabanını mavi bir laboratuvar bezine bantlayın. Ayak parmağı sıkışma refleksinin çekilmesiyle hayvanın tamamen anestezi altına alındığından emin olun. Ameliyat alanının etrafına steril bir örtü uygulayın.
4. Kardiyomiyosit izolasyon prosedürü
- Farenin sternumunu açığa çıkarın ve orta hatta yanal olarak, kaburgalardan ve aksilladan proksimal olarak kesin. Diyaframı nazikçe tamamen kesin, kalbi önlemek için sığ kesimler sağlayın. Sternumu bir hemostatla sıkıştırın ve göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için kaburgaları geriye doğru katlayın.
- Perikadı kalpten yavaşça çıkarın ve hemen kalbe distal olan inferior vena kavadan tamamen kesin. 3 mL buz gibi soğuk temizleme tamponunu 1 dakika boyunca kalbin sağ ventrikülüne hızlı bir şekilde enjekte etmek için 27 G iğneli 3 mL'lik bir şırınga kullanın.
- Cımbız kullanarak kalbi yavaşça tutun ve aortun mümkün olduğunca çoğunu açığa çıkararak vücuttan çekin. Bir hemostat kullanarak, yükselen aortu kelepçeleyin, atriyumu sıkıştırmamaya dikkat edin ve kalbi göğüsten çıkarın.
- Kelepçeli kalbi, yaklaşık 10 mL ılık perfüzyon tamponu ile bir polipropilen Petri kabının kapağına hızlı bir şekilde aktarın. Kelepçeli kalbi destek platformuna yerleştirin ve 5 dakika boyunca sol ventriküle 10 mL sıcaklık kontrollü 37 °C perfüzyon tamponu enjekte etmek için manifolda bağlı stabilize edilmiş bir 27 G iğne kullanın.
- Kelepçeli kalbi ve destek platformunu yaklaşık 5 mL sindirim tamponuna sahip bir Petri kabına aktarın. Giriş şırıngalarını, 25 mL sindirim tamponuna sahip 50 mL'lik bir şırınga için değiştirin.
- Enjeksiyondan önce herhangi bir kabarcığın manifoldunu ve kalan perfüzyon tamponunu temizleyin. İğneyi dikkatlice sol ventrikül tepesindeki aynı iğne pozisyonuna yerleştirin.
- Sıcaklık kontrollü 37 °C sindirim tamponunu 50 mL'lik bir şırınga kullanarak 15 dakika boyunca sol ventriküle enjekte etmek için bir perfüzyon pompası kullanın. Çözeltinin sıcaklığını, iğnenin sonunda 37 ° C'lik çözeltiyi çıkarmak için önceden kalibre edilmiş bir su ceketi ile kontrol edin.
- Ventrikülleri atriyumdan çıkarın ve 10 mL'lik bir behere aktarın. Beherin içine 3 mL sindirim tamponu ekleyin ve keskin makas kullanarak ventrikülleri büyük parçalar halinde kesin. Beheri alüminyum folyo ile örtün ve 5 dakika boyunca 37 ° C'ye ısıtılmış sallanan bir su banyosuna yerleştirin.
- Süpernatanı atın, herhangi bir doku parçasını çıkarmaktan kaçınmaya dikkat edin. Doku parçalarını 3 mL sindirim tamponunda tekrar askıya alın ve yaklaşık 4 dakika boyunca veya homojen bir karışım elde edilene kadar tritüre edin.
- Hücreleri 70 μm'lik bir naylon hücre süzgecinden 50 mL'lik bir polipropilen tüpe filtreleyin.
- Filtreyi 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir polipropilen tüpe geri koyun ve 100 rpm'de 1 dakika boyunca santrifüj. Supernatantı atın ve peleti 3 mL durdurma tamponunda tekrar askıya alın.
- 1,8 mM'lik nihai bir CaCl 2 konsantrasyonu için askıya alınmış hücrelere 54 μL 100 mM CaCl2 stoğu ekleyin. Bu adım, hücre verimini artırmak için kademeli olarak da gerçekleştirilebilir.
- Ölü hücreler içeren süpernatantı çıkarmadan önce canlı hücrelerin 10 dakika boyunca yerçekimi ile yerleşmesine izin verin. Peletin depolama çözeltisinde yeniden askıya alınması (200 μM CaCl2 ile perfüzyon çözeltisi). Bu hücreler artık fonksiyonel deneyler (yani kalsiyum görüntüleme / kasılma, yama kelepçesi, vb.), Kültür vb. İçin kullanılabilir.
NOT: Hücreler ayrıca laboratuar veya deneye bağımlı çözeltilerde yeniden askıya alınabilir.
5. Hücre kültürü
- Hücreleri bir hemositometre kullanarak veya ızgaralı bir kapak fişi kullanarak bir alan görünümü sayımı ile sayın. Miyositler çok büyük olduğundan, hemositometre kullanarak saymak her zaman doğru değildir. Bu, izolasyondan yaklaşık kaç hücre elde edildiğine dair bir fikir edinmek için kullanılır.
- DMEM ortamı ile hücreleri ~ 25.000 hücre / mL'ye seyreltin. Her bir kuyucuğa 1 mL hücre çözeltisi ekleyin.
- 2 saat boyunca 37 ° C,% 95O2,% 5 CO2'de inkübe edin.
- DMEM ortamını her bir kuyucuktan nazikçe aspire edin ve 2 mL M199 ortamı ekleyin.
- 37 ° C'de,% 95 O 2,% 5 CO2'de 24 saate kadar inkübe edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir izolasyonun başarısını belirlerken incelenmesi gereken birkaç unsur vardır. İlk olarak, kardiyomiyositler, Şekil 1'de izole edilen hücreler gibi membran lekeleri olmadan çubuk şeklinde olmalıdır. Tipik bir izolasyon, çubuk şeklindeki miyositlerin ~% 80'ini verecektir. İzolasyon% 50'den daha az çubuk şeklindeki hücreler verirse, başarısız bir izolasyon olarak kabul edilir ve kardiyomiyositler kullanılmaz. Son olarak, kardiyomiyositler sessiz olmalıdır. Spontan kontraksiyon miyositleri Ca2 + intoleransını gösterir ve güvenilmez veriler üretir. Yukarıdaki teknik kullanılarak gerçekleştirilen tüm izolasyonlar arasında, neredeyse tüm izolasyonlar başarılı kabul edilir. Kültürlü kardiyomiyositler, membran lekeleri olmayan çubuk şeklinde veya yüksek sağkalım oranlarına sahip yuvarlak kenarlı olduklarında başarılı kabul edilir (Şekil 2).
Tablo 1. Yöntemimiz, Langendorff yöntemleri ve fare kardiyomiyositlerini izole etmek için daha önce yayınlanmış Langendorff'suz yöntemler arasındaki farkların bir tablosu. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: Tampon ortam konsantrasyonları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 1. (A) Parlak alan mikroskobu kullanılarak görüntülenen 4 aylık C57Bl/6 fare kardiyomiyositleri. Verim: ~% 80; 20x büyütme. (B) 4 aylık bir C57Bl/6 fare kardiyomiyositinin parlak alan görüntüsü. Kardiyomiyositler sessizdir ve membran lekeleri olmadan çubuk şekli sergilerler. Ölçek çubuğu 100 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. (A) M199 ortamında 24 saat boyunca kültüre alınan 4 aylık C57Bl/6 fare kardiyomiyositleri. Canlılık: ~% 80; 20x büyütme. (B) 24 saat boyunca kültürlenen miyositler. 24 saatte, kardiyomiyositler membran lekeleri olmadan çubuk şekli sergiler. (C) Tarif edilen yöntem kullanılarak 24 saat boyunca kültürlenen kardiyomiyositler için % sağkalım eğrisi. Ölçek çubuğu 100 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Langendorff içermeyen kardiyomiyosit izolasyon tekniğimizin temel avantajı, Langendorff cihazına kanülasyon gerektirmeyerek hipoksi ve iskemik zamanı sınırlamasıdır. Kalbin çıkarılması, temizlenmesi ve asılması birkaç dakika süren ve genellikle miyositte iskemik hasara neden olan klasik Langendorff tekniklerine alternatif olarak, yöntemimiz buz gibi soğuk bir temizleme çözeltisi ile kanın in vivo temizlenmesini içerir. Buz gibi soğuk temizleme tamponu, etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içerir, kalsiyumu etkili bir şekilde uzaklaştırmak için iki değerli katyonları geri dönüşümsüz olarak şelatlar, bu da onu mükemmel bir antikoagülan yapar ve bu nedenle kasılmayı durdurur23. Buz gibi soğuk solüsyonların kullanılması, iyon değişimini ve hücresel metabolizma hızını yavaşlatarak kasılmayı inhibe eder ve iskeminin neden olduğu hasarı önler24. Aort kanülasyonu ihtiyacını ortadan kaldırarak, Langendorff'suz teknikler sağlam miyositler üretir ve Langendorff izolasyon yöntemleri için her zaman geçerli olmayan güvenilir veriler elde etmek için daha güvenilir bir preparatla sonuçlanır.
Bu, daha önce yayınlanmış Langendorff'suz izolasyon tekniği18'in Tablo 1'de vurgulandığı gibi uyarlamalarla bir varyasyonudur. En önemlisi, bu teknik, iğnenin kalpten çıkarılması ve değiştirilmesi gereken süreyi sınırlayan stabilize edici bir platform sunar. Ventrikül içine sokulduğunda iğneye verilen gereksiz herhangi bir hareket, delinme bölgesini genişletir. Daha geniş bir delinme bölgesi, delinme bölgesinden ventrikülden dışarı akışa, kalpteki basıncın azalmasına ve koronerlere akışın azalmasına neden olur. Bu sorun, dengeleme platformu kullanılarak giderilmiştir. İğne hareketini ve iğnenin çıkarılma ve değiştirme sayısını sınırlayarak (daha önce tarif edildiği gibi üç kez karşılaştırıldığında18), koronerlere tutarlı akışı koruruz ve sürekli olarak sindirim sağlarız. Bir diğer önemli adaptasyon, kalbe girdikten sonra enzim çözeltilerini 37 ° C'de tutmak için sıcaklık kontrollü bir ceketin eklenmesiydi (sıcaklık banyosu iğneden 37 ° C'de dışarı atılacak şekilde kalibre edildi). Kullanılan sindirim enzimi 37 ° C'de optimum reaksiyon aktivitesine sahiptir ve sıcaklık kontrolünün eklenmesi enzim aktivitesini arttırır, böylece sindirim süresini azaltır. Liberaz ayrıca minimal lot-lot değişkenliğine sahiptir ve diğer enzimlere kıyasla daha yüksek tekrarlanabilirliğe sahiptir. Önceki tekniklerin bir başka uyarlaması, enjekte edilen temizleme çözeltisinin miktarının azalmasıdır. Kalbe girecek temizleme tamponu miktarının azaltılması ve perfüzyon tamponu ile daha fazla kanın temizlenmesine izin verilmesi, sindirim enziminin EDTA tarafından inaktivasyonunu azaltır. Yöntemimizin sürekli olarak başarılı miyosit izolasyonlarına ulaşmasının bir başka nedeni de BDM kullanımıdır. BDM, sarkomerin güç inme mekanizmasını önleyen, böylece sindirim sırasında kasılmayı inhibe eden ve reoksijenasyon yaralanmasını sınırlayan bir miyozin inhibitörüdür. Kasılmayı sınırlayarak, kültürdeki miyositlerin büzülmesinde kalsiyum döngüsünü ve doğal reaktif oksijen türlerinin üretimini önlüyoruz. Kültür ortamı kalsiyum içerdiğinden, miyositlerin kültürden sonra sonraki verimi daraltması ve azaltması mümkündür. Kasılmayı önlemek ve verimi25,26 artırmak için BDM'deki miyositleri kültürlemeyi seçiyoruz. BDM, kültürden sonra fonksiyonel ölçümler için her zaman miyositlerden büyük bir başarı ile yıkanabilir. Alternatif olarak, bu prosedürün tüm adımları BDM ilavesi olmadan gerçekleştirilebilir, ancak izolasyonlar BDM'siz izole miyositlerde "başarılı" olarak kabul edilmeyebilir.
İskemik zamanın yanı sıra, bir izolasyonun sağlam miyositler üretip üretmeyeceğini belirleyecek birçok faktör vardır. Bireysel laboratuvarlarda farklı koşullar olduğu için, izolasyonu gerçekleştiren kişilerin enzim ve / veya kalsiyum miktarını, perfüzyon süresini ve / veya pompa hızını ve sallanan su banyosu hızını ve / veya süresini değiştirmeleri gerekebilir. Bu parametreler, sağlıklı veya hastalıklı, yaşlanma vb. gibi kullanılan fare modeline bağlı olacaktır.
Bu teknik, Langendorff tabanlı teknikler için gereken cerrahi beceriyi gerektirmese de, tekniğin başarılı olması için hala kritik adımlar vardır. Bu teknikle zayıf miyositler veren en yaygın sorun, perfüzyon sistemine giren kabarcıklar ve miyokard dokusunun perfüzyon tamponuna erişimini engellemektir. Bu sorunun çözümü, kabarcıklardan kaçınmak için dikkatli bir uygulamadır (uygun şırınga temizleme tekniği, uygun iğne temizleme tekniği, şırıngaları değiştirirken kabarcıkların manifoldunun geğirilmesi, vb.) ve ayrıca manifolda bir kabarcık yerleştirilmesi durumunda perfüzyon sisteminden çoklu çıkış noktaları. Kabarcıklar olmadan, deneyimlerimize göre,% 100'e yakın başarılı miyosit izolasyonları elde ederiz (% 50'nin üzerinde çubuk şeklindeki miyositler olarak tanımlanır; ortalama ~% 80'dir).
Langendorff yöntemi için gerekli cerrahi becerinin kaldırılmasıyla yöntem basitleştirilmiş olsa da, uyarlanmış bu yöntem sadece farelerde denenmiştir. Langendorffsuz yöntemin bir diğer avantajı, daha önce tarif edildiği gibi birçok murin modeli (yani, yenidoğandan yaşlanmaya) için kullanılabilmesidir19. Ne yazık ki, daha büyük memeliler (örneğin, köpekler, domuzlar, vb.), Kalplerinin büyüklüğü nedeniyle bu teknik için uygun olmayacaktır. Güvenilir miyositler elde etmek için kalbi yeterli çözelti ile perfüze etmek imkansız olacaktır.
Langendorff-free yönteminin adaptasyonu, fare kardiyomiyositlerinin başarılı bir şekilde izole edilmesi için güvenilir bir yöntemdir. Langendorff yöntemiyle karşılaştırıldığında, bu alternatif yaklaşım kardiyomiyositleri tutarlı bir şekilde elde etmek için çok az teknik beceri gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
İfşa edilecek çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) ve T32 HL134616 (Sturgill ve Salyer) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cc Bd Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-827-52 | |
| 10 mL Pyrex Low-Form Beaker | Cole-Palmer | UX-34502-01 | |
| 100 mL polypropylene cap glass media storage bottle | DWK Life Sciences | UX-34523-00 | |
| 14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher Sci | 14-959-11B | |
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma | B0753 | >98% |
| 3 cc BD Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-823-435 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-20-C | |
| 50 mL BD Syringe without Needle | Fisher Sci | 13-689-8 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Cole-Palmer | EW-22999-84 | |
| 95% O2 5% CO2 | |||
| AIMS Space Gel Heating Pad | Fisher Sci | 14-370-223 | |
| BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles | Becton Dickinson | 305109 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3803 | Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98% |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C7902 | >99% |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | Suitable for cell culture, >99.5% |
| DMEM | Fisher Sci | 11965092 | |
| EDTA | Fisher Sci | AAA1071336 | |
| Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| FBS | R&D Systems (Bio-techne) | S11195 | |
| Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators | Fisher Sci | 13-874-432 | |
| Hartman Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 15921 | |
| Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set | Fisher Sci | 02-671-11 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | >99.5% |
| Labeling Tape | Fisher Sci | 15-901-10R | |
| Legato 100 Syringe Pump | kdScientific | 788100 | |
| L-glutathione | Fisher Sci | ICN19467980 | |
| Liberase TH Research Grade | Sigma | 5401135001 | High thermolysin concentration |
| M199 | Fisher Sci | MT10060CV | |
| Magnesium Chloride | Invitrogen | AM9530G | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | |
| Pen/Strep | Fisher Sci | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P5405 | >99% |
| Precision Digital Reciprocating Water Bath | ThermoFisher Scientific | TSCIR19 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Suitable for cell culture |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | >99% |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | >99% |
| Sterile Cell Strainer 70 µm | Fisher Sci | 22-363-548 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| VWR Absorbent Underpads | Fisher Sci | NC9481815 |
References
- Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).
- Ziolo, M. T., et al. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).
- Traynham, C. J., et al. Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling. PLoS One. 7 (12), 52005 (2012).
- Nixon, B. R., et al. Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).
- Swager, S. A., et al. Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1. Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).
- Pinckard, K. M., et al. A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function. Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).
- Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).
- Harris, J. E., et al. Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring. Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).
- Roof, S. R., et al. CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat. Frontiers in Physiology. 8, 894 (2017).
- Milani-Nejad, N. J. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).
- Kono, T. Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues. Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).
- Baker, J. B. An improved apparatus for mammalian heart perfusion. The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).
- Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).
- Zhang, Z., et al. An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).
- Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart. AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140 (2019).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).
- Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice. Journal of Visualized Experiments. (171), e61866 (2021).
- Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers. Methods in Cell Biology. 99, 126 (1994).
- Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart. Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).
- Thum, J. B. Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).
