Summary
O presente protocolo descreve a injeção de célula de osteossarcoma intratibia para gerar modelos de camundongos com osteossarcoma ortotópico e lesões de metástase pulmonar.
Abstract
O osteossarcoma é o câncer ósseo primário mais comum em crianças e adolescentes, sendo os pulmões o local metastático mais comum. A taxa de sobrevivência de cinco anos de pacientes com osteossarcoma com metástase pulmonar é inferior a 30%. Portanto, a utilização de modelos de camundongos imitando o desenvolvimento do osteossarcoma em humanos é de grande importância para a compreensão do mecanismo fundamental da osteossarcoma carcinogênese e metástase pulmonar para desenvolver novas terapêuticas. Aqui, procedimentos detalhados são relatados para gerar os modelos primários de osteossarcoma e metástase pulmonar através da injeção de intratibia de células osteossarcoma. Combinados com o sistema de bioluminescência ou imagem viva de raios-X, esses modelos de camundongos vivos são utilizados para monitorar e quantificar o crescimento e a metástase do osteossarcoma. Para estabelecer esse modelo, uma matriz de membrana de porão contendo células osteossarcoma foi carregada em uma seringa de micro volume e injetada em uma tíbia de cada rato atímico após ser anestesiada. Os camundongos foram sacrificados quando o osteossarcoma primário atingiu a limitação de tamanho no protocolo aprovado pela IACUC. As pernas com osteossarcoma e os pulmões com lesões de metástase foram separados. Esses modelos são caracterizados por um curto período de incubação, crescimento rápido, lesões graves e sensibilidade no monitoramento do desenvolvimento de lesões metastáticas primárias e pulmonares. Portanto, estes são modelos ideais para explorar as funções e mecanismos de fatores específicos na carcinogênese osteossarcoma e metástase pulmonar, o microambiente tumoral e avaliar a eficácia terapêutica in vivo.
Introduction
O osteossarcoma é o câncer ósseo primário mais comum em crianças e adolescentes 1,2, que se infiltra principalmente no tecido circundante, e até mesmo metástase nos pulmões quando os pacientes são diagnosticados. A metástase pulmonar é o principal desafio para a terapia osteossarcoma, e a taxa de sobrevivência de cinco anos de pacientes com osteossarcoma com metástase pulmonar permanece tão baixa quanto 20%-30%3,4,5. No entanto, a taxa de sobrevivência de cinco anos de osteossarcoma primário foi aumentada para cerca de 70% desde a década de 1970 devido à introdução da quimioterapia6. Portanto, é urgentemente necessário entender o mecanismo fundamental da osteossarcoma carcinogênese e metástase pulmonar para desenvolver novas terapias. A aplicação de modelos de camundongos que melhor imitam a progressão do osteossarcoma em humanos é de grande significado7.
Os modelos animais osteossarcoma são gerados por engenharia genética espontânea e induzida, transplante e outras técnicas. O modelo de osteossarcoma espontâneo raramente é utilizado devido ao longo tempo de formação do tumor, taxa de ocorrência de tumor inconsistente, baixa morbidade e baixa estabilidade 8,9. Embora o modelo de osteossarcoma induzido seja mais acessível para obter do que o osteossarcoma espontâneo, a aplicação do modelo osteossarcoma induzido é limitada porque o fator indutor afetará o microambiente, a patogênese e características patológicas da osteossarcoma10. Modelos transgênicos estão ajudando a entender a patogênese dos cânceres, pois podem simular melhor os ambientes fisiológicos e patológicos humanos; no entanto, os modelos animais transgênicos também têm suas limitações devido à dificuldade, a longo prazo e alto custo de modificação transgênica. Além disso, mesmo nos modelos de animais transgênicos mais amplamente aceitos gerados pela modificação genética p53 e rb, apenas 13,6% do sarcoma ocorreu nos ossos de quatro membros11,12.
O transplante é um dos métodos de produção de câncer metastáticos primários e distantes mais utilizados nos últimos anos devido à sua manobra simples, taxa de formação de tumores estáveis e melhor homogeneidade13. O transplante inclui transplante heterotópico e transplante ortotópico de acordo com os locais de transplante. No transplante heterotópico osteossarcoma, as células osteossarcoma são injetadas fora dos sítios osteossarcoma primários (osso) dos animais, comumente sob a pele, subcutâneamente14. Embora o transplante heterotópico seja simples sem a necessidade de realizar cirurgia em animais, os locais onde as células osteossarcoma são injetadas não representam o microambiente osteossarcoma humano real. Transplante ortotópico osteossarcoma é quando as células osteossarcoma são injetadas nos ossos dos animais, como a tíbia15,16. Em comparação com os enxertos heterotópicos, os enxertos de osteossarcoma ortotópicos são caracterizados por um curto período de incubação, crescimento rápido e forte natureza erosiva; portanto, são modelos animais ideais para estudos relacionados ao osteossarcoma17.
Os animais mais usados são camundongos, cães e zebrafish18,19. O modelo espontâneo de osteossarcoma é geralmente usado em caninos porque o osteossarcoma é um dos tumores mais comuns em caninos. No entanto, a aplicação desse modelo é limitada devido ao longo tempo de formação do tumor, à baixa taxa de tumorigênese, à má homogeneidade e à estabilidade. Zebrafishes são frequentemente usados para construir modelos de tumor transgênicos ou nocaute por causa de sua reprodução rápida20. Mas os genes dos zebrafish são diferentes dos genes humanos, então suas aplicações são limitadas.
Este trabalho descreve os procedimentos detalhados, precauções e imagens representativas para a produção do osteossarcoma primário na tíbia com metástase pulmonar por injeção intratibia de células osteossarcoma em camundongos atrímicos. Este método foi aplicado para criar o osteossarcoma primário na tíbia do camundongo para avaliação da eficácia terapêutica, que apresentou alta reprodutibilidade21,22.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comitê de bem-estar animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai. Camundongos atrímicos balb/c machos de quatro semanas de idade foram aclimatados por uma semana antes da cirurgia para injeção ortotópica de células osteossarcoma. Os camundongos foram alojados em gaiolas de camundongos ventiladas individualmente com cinco ratos por gaiola em um ciclo claro/escuro de 12 horas com acesso ad libitum à alimentação spf e água estéril.
1. Preparação de células
- No dia da injeção de célula osteossarcoma (143B-Luciferase), lave 80%-90% de células confluentes cultivadas em um prato de cultura celular de 10 cm duas vezes com PBS (pH 7.4) e trypsinize com 1,5 mL de trippsina de 0,25% para 3 min. Em seguida, adicione 6 mL de mídia mem contendo soro de 10% para saciar a trippsina e colete as células em um tubo de centrífuga de 15 mL.
NOTA: A linha celular 143B-Luciferase é obtida a partir de transfeto de linha celular 143B com vetor pLV-luciferase23. - Aspire 20 μL de suspensão celular na câmara da placa de contagem celular e calcule a concentração celular usando um contador automático de células (ver Tabela de Materiais).
- Centrifugar as células a 800 x g por 5 min a temperatura ambiente.
- Aspire o supernaente com uma pipeta e resuspenme a pelota celular em uma matriz de membrana de porão de 8,5 mg/mL (ver Tabela de Materiais) a uma concentração final de 2 x 107 células/mL.
- Mantendo as células no gelo, leve-as para a sala de cirurgia. As células devem ser usadas dentro de 2 h.
NOTA: Para evitar doses imprecisas de injeção (por exemplo, devido ao espaço morto nas seringas), uma suspensão celular extra é preparada (geralmente duas vezes o volume necessário de suspensão celular). A matriz de membrana do porão é mantida no gelo o tempo todo, uma vez que tem propriedade de coagulação acima da temperaturaambiente 24.
2. Cirurgia para injeção ortotópica das células osteossarcoma
NOTA: As ferramentas de cirurgia são mostradas na Figura 1.
- Os camundongos foram criados em condições específicas sem patógenos. Todos os procedimentos foram feitos em um armário asséptico com ferramentas estéreis.
- Anestesiar os camundongos expondo-os a 2% de isoflurane e 98% de oxigênio (taxa de fluxo de oxigênio, 2 L/min).
- Aplique uma pequena quantidade de pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento enquanto estiver sob anestesia.
NOTA: Realize todo o procedimento em uma área bem ventilada. Antes da injeção de células osteossarcoma, certifique-se de que cada rato esteja sob anestesia profunda por uma pitada de dedo do dedo do dedo; se o mouse ainda tiver respostas, como contração ou empurrão, espere por um longo tempo até que as respostas acima desapareçam. - Mantenha cada rato em uma posição supina. Segure o tornozelo do rato usando o polegar e o dedo indicador e desinfete o local de injeção da tíbia com um cotonete de 70% de etanol.
NOTA: Para segurar firmemente o tornozelo do rato, tanto as pontas do polegar quanto do dedo indicador são de grande importância para os procedimentos subsequentes. - Gire a articulação do tornozelo de cada rato para fora para mover a tíbia e a fíbula, e dobre a articulação do joelho para uma posição adequada até que o planalto da tíbia proximal (a parte superior da tíbia) seja claramente visível através da pele (Figura 2A).
- Coloque a agulha em uma seringa de 1 mL e aponte a ponta da agulha para o local da injeção. Certifique-se de que a agulha da seringa é paralela ao longo eixo da tíbia.
- Insira percutâneamente a agulha através ou adjacente ao ligamento patelar à medida que passa pela cápsula da pele/articulação; th0en, gire a seringa (1/2 a 3/4-círculo) para perfurar um orifício através da plataforma tíbia em direção à extremidade distal da tíbia (cavidade medular) para injeção de célula osteossarcoma com uma seringa de micro volume (Figura 2B,C).
NOTA: A rotação simultânea da tíbia pode ser sentida durante a perfuração se a ponta da agulha estiver precisa. Certifique-se de que a necessidade se move para a frente com a rotação da seringa em vez de ser diretamente empurrada para a frente até que cerca de metade da agulha esteja na tíbia.
- Insira percutâneamente a agulha através ou adjacente ao ligamento patelar à medida que passa pela cápsula da pele/articulação; th0en, gire a seringa (1/2 a 3/4-círculo) para perfurar um orifício através da plataforma tíbia em direção à extremidade distal da tíbia (cavidade medular) para injeção de célula osteossarcoma com uma seringa de micro volume (Figura 2B,C).
- Verifique se a agulha da seringa fez um movimento proeminente no canal medular para garantir a perfuração bem sucedida.
NOTA: Realize um exame de raio-X (ver Tabela de Materiais) para confirmar a posição adequada da agulha e coletar as imagens. - Carregue a suspensão celular osteossarcoma 143B (a partir da etapa 1.5) em uma seringa de micro volume e substitua a seringa de 1 mL na tíbia com a seringa de micro volume carregada por células 143B (Figura 2D). Injete lentamente ~10 μL (ignore a solução pré-existente na agulha) de suspensão celular de 143B na tíbia de cada rato atrímico (cerca de 2 x 105 células) sem aplicar alta pressão.
- Pressione o local da injeção com um cotonete para 20-30 s quando a seringa de micro volume for removida.
- Coloque cada rato de volta em uma gaiola limpa e monitore de perto até que o rato esteja completamente recuperado da anestesia (cerca de 10 min).
- Monitore o crescimento do tumor in vivo usando um sistema de imagem de raios-X. Meça o diâmetro mais longo (a) e o diâmetro curto (b) da massa cancerígeno toda semana com uma pinça para cálculo de volume de tumor (V): V = 1/2 x a x b2.
NOTA: Anestesiar os camundongos expondo-os a 2% de isoflurano e 98% de oxigênio. Os camundongos foram anestesiados para imagens de raio-x. A injeção intratibia de células osteossarcoma rotuladas por proteínas intratibia ou fluorescentes permite o rastreamento de lesões osteossarcoma primárias e metastáticas.
NOTA: Os pontos finais humanos dos camundongos com osteossarcoma devido ao crescimento tumoral do joelho e da metástase pulmonar basearam-se nos seguintes critérios: (1) Escore da Condição Corporal, (2) limiar de perda de peso de 20%, (3) diâmetro máximo médio dos tumores de 2 cm, ou (4) comportamento animal severamente limitado.
3. Exame patológico (coleta de amostras de osteossarcoma metastático primário e pulmonar para análise)
- Seis semanas após a injeção de células de osteossarcoma, sacrifique os camundongos por luxação cervical depois de expô-los por inalação de CO2 .
- Mantenha o mouse em uma posição supina e estique os dois membros traseiros.
- Separe as pernas inteiras com osteossarcoma da área inguinal.
NOTA: Certifique-se de que todas as pernas estão separadas do mesmo local anatômico. - Prepare o espécime histológico das pernas com osteossarcoma removendo a pele, músculos e pés, e, em seguida, fixe o espécime de cada rato em um tubo de 50 mL com solução de formalina de 20 mL (10%) por 24 h, seguido de decalcificação em solução 10% EDTA por 14 dias com troca de tampão ocasional.
- Incorpore o espécime em parafina e prepare seções para exame histológico após o trabalho publicado anteriormente25.
- Separe suavemente os pulmões e coloque-os em um tubo de 50 mL cheio de solução de formalina de 20 mL (10%). Após 24 horas, transfira os pulmões de cada rato para um tubo de 15 mL com 70% de etanol. Incorpore os pulmões em parafina para hematoxylin e eosin (H&E) de coloração e ensaio imunohistoquímico25.
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Representative Results
Modelos pulmonares ortotópicos (primários) bem sucedidos (primários) e metastáticos dependem da injeção ortotópica precisa das células osteossarcoma. Aqui, um modelo ortotópico (primário) de osteossarcoma através da injeção de célula osteossarcoma intratibial foi desenvolvido com sucesso. A Figura 3A mostra um rolamento ortotópico representativo (primário) osteossarcoma, e a Figura 3B mostra um representante isolado ortotópico (primário) osteossarcoma. O volume do tumor foi medido uma vez por semana com uma pinça e calculado como descrito na etapa 2.11 (Figura 3C). O crescimento ortotópico (primário) de osteossarcoma in vivo foi acompanhado tanto pelo raio-X quanto pela bioluminescência (quando as células injetadas foram rotuladas com luciferase) sistema de imagem ao vivo. As imagens de raio-X foram obtidas da primeira semana à sexta semana após a injeção celular de osteossarcoma 143B (Figura 3D). Além disso, a imagem do crescimento ortotópico (primário) de osteossarcoma in vivo foi obtida após a luciferase rotular 143B células foram injetadas na tíbia do camundongo (Figura 3E).
A metástase pulmonar causada pela injeção intratibial de células osteossarcoma rotuladas pela luciferase foi rastreada in vivo com sucesso por um sistema de imagem ao vivo de bioluminescência (Figura 4A). As colônias metastáticas nos tecidos pulmonares isolados também foram visualizadas sob o estereótipo (Figura 4B). As lesões metastáticas foram confirmadas ainda pela coloração da H&E em tecidos pulmonares embutidos em parafina (Figura 4C).
Figura 1: Ferramentas de Cirurgia. (A) 1 mL de seringa de escala. (B) Seringa de micro volume. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Representação da cirurgia de injeção intratibiana. (A) O local de injeção intratibiana de um rato atrímico. (B) Uma seringa estéril de 1 mL com agulha acompanhada foi percutânea inserida na tíbia em direção à extremidade distal através do planalto da tíbia proximal (o topo da tíbia). (C) Uma visão lateral do processo de perfuração. A agulha da seringa era paralela ao eixo tíbia longo (linha sólida). (D) Injeção intratibial com célula osteossarcoma carregada de seringa micro-volume. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Visualização do crescimento do osteossarcoma em camundongos. (A) Modelo de osteossarcoma ortotópico de camundongos bem sucedido. (B) Osteossarcoma ortotópico isolado. (C) O volume do tumor foi medido com uma pinça e calculado utilizando a seguinte fórmula: volume do tumor = 0,5 x diâmetro mais longo x diâmetro curto x diâmetro curto. As barras de erro representam o desvio padrão (n = 8). (D) As imagens de raio-X foram obtidas do mesmo rato em um momento diferente (de 1 a 6 semanas). (E) Imagem obtida no28º dia após a luciferase rotular células 143B foram injetadas na tíbia do camundongo. As setas vermelhas indicaram a intensidade de luminescência do osteossarcoma ortotópico (primário). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Metástase pulmonar de osteossarcoma. (A) Imagem obtida no28º dia após a luciferase rotular células 143B foram injetadas na tíbia do camundongo. As setas vermelhas indicaram a intensidade de luminescência da metástase pulmonar. (B) Os pulmões isolados com metástases osteossarcoma. As setas vermelhas indicaram as colônias metastáticas (x20). (C) A coloração de H&E mostrou lesões metastáticas nos tecidos pulmonares (barra de escala = 200 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A injeção ortotópica de células osteossarcoma é um modelo ideal para estudar a função e o mecanismo de fatores específicos na carcinogênese e desenvolvimento da osteossarcoma para avaliar a eficácia terapêutica. Para evitar diferenças no crescimento do tumor, a maioria das células de osteossarcoma ativas a 80%-90% confluentes com o mesmo número são cuidadosamente injetadas na tíbia de cada rato, e o tempo de experimentação celular é estritamente controlado sem afetar a viabilidade celular. Como as aglomerações celulares afetam a contagem celular levando a números de células imprecisos sendo injetados na tíbia de cada rato, a suspensão celular precisa ser adequadamente misturada para cima e para baixo com uma pipeta para evitar a formação de aglomerados celulares.
Outro aspecto crítico que deve ser levado em consideração é a solução resuspended para células osteossarcoma. As células injetadas são resuspendidas em uma matriz de membrana de porão em vez de em PBS ou meio de cultura. Além disso, uma alta concentração de matriz de membrana de porão é desafiadora para ser pipetada e afeta o volume preciso; assim, é necessária uma concentração adequada da matriz de membrana do porão26. Para fazer um buraco através da plataforma de tíbia para injeção de células de osteossarcoma, o necessitamento avança com a rotação da seringa em vez de ser diretamente empurrado para a frente até que cerca de metade da agulha esteja na tíbia. Mais particularmente, camundongos imunodeficientes são aplicados para estabelecer um modelo de osteossarcoma ortotópico usando células osteossarcoma humanas27. Enquanto isso, o procedimento de injeção é realizado no gabinete de segurança biológica usando ferramentas cirúrgicas estéreis. Como os camundongos podem sentir mal-estar após anestesia e cirurgia, os camundongos devem ser monitorados de perto na primeira semana pós-cirurgia.
A injeção intratibia de células osteossarcoma rotuladas com proteína fluorescente ou luciferase permite o rastreamento de lesões primárias e metastáticas usando imagem óptica28. O osteossarcoma nunca é permitido além do limite de tamanho como no protocolo aprovado pelo IACUC; Enquanto isso, as ulcerações podem ocorrer em massa tumoral de enorme tamanho, o que pode levar a análises imunohistoquímicas fracassadas. Embora os tumores ósseos primários e a metástase óssea tenham sido recentemente relatados como sendo alcançados pela implantação de enxerto tumoral sólido no osso, e os animais desenvolveram crescimento reprodutível, bem como metástase pulmonar eventualmente29; no entanto, os autores implantaram diretamente fragmentos tumorais frescos ou criopreservados na tíbia proximal, o que mostrou desvantagem da cirurgia aberta causada infecção potencial e falha no desenvolvimento do enenxerto tumoral. Além disso, o volume de fragmentos tumorais implantados sem controle rigoroso resultará em uma diferença significativa no volume do tumor produzido, o que é difícil na aplicação seguinte, como avaliar a eficácia terapêutica in vivo. Aqui, uma técnica simples e reprodutível é relatada para estabelecer o osteossarcoma primário intratibia com modelos posteriores de camundongos de metástase pulmonar através da injeção de intratibia de células osteossarcoma. Isso mostrou as vantagens de melhor imitar as características de desenvolvimento clínico do osteossarcoma em humanos; números precisos de células osteossarcoma sendo injetadas diretamente na tíbia usando seringa de micro volume permitindo taxa de formação de tumores idênticos (100%) e volume tumoral. O método garante evitar as possibilidades de infecção ou até mesmo morte por meio de técnicas de cirurgia aberta e permitir o monitoramento animado e quantificação do crescimento osteossarcoma e metástase utilizando o sistema de imagem ao vivo bioluminescência após as células osteossarcoma injetadas serem rotuladas com bioluminescência. Isso impede que as células osteossarcoma injetadas atinjam diretamente a corrente sanguínea e a colonização nos pulmões para formar embolia pulmonar e/ou metástases pulmonares falsamente positivas, reutilizando as células osteossarcoma injetadas na concentração adequada da matriz da membrana do porão, uma vez que a matriz da membrana do porão tem a propriedade da coagulação acima da temperatura ambiente. A coagulação imediata suporta e restringe as células de osteossarcoma dentro da matriz de membrana do porão depois de ser injetada na tíbia do camundongo.
Outra literatura tem relatado o estabelecimento do modelo de metástase óssea por inoculação intracardiac ou inoculação intratibial de células cancerígenas de mama30; no entanto, as células utilizadas nesta literatura são as células cancerígenas de mama, que possuem características biológicas e clínicas diferentes com células osteossarcoma; além disso, tanto o intracardiac quanto a inoculação intratibial estabelecida modelos de câncer no osso são formados por células cancerígenas colonizando diretamente ou atingindo através da corrente sanguínea, em vez de lesões de metástase formadas pela disseminação de células cancerosas a partir das lesões primárias do câncer.
Existem várias limitações do protocolo atual. Camundongos usados neste protocolo são camundongos nus defeituosos do sistema imunológico genético sem timo que os impede de rejeitar imunologicamente células humanas e são amplamente utilizados em ensaios pré-clínicos, que não são aplicáveis para pesquisas funcionais imunológicas. Além disso, descobrimos que nem todas as linhas celulares osteossarcoma são idênticas relevantes nesses modelos, e as habilidades de tumorgênese de 143B, MNNG, MG-63 e U-2 AS são maiores que as células Saos-2.
Em conclusão, os atuais modelos de osteossarcoma metastático primário e pulmonar gerados pela injeção de células osteossarcópicas ortotópicas são ferramentas úteis para estudar o microambiente tumoral, eficácia da terapêutica no crescimento osteossarcoma e/ou metástase. Além disso, pela injeção intratibia das células osteossarcoma geneticamente modificadas especificamente visando um gene, os modelos são úteis para explorar os principais oncogenes e supressores tumorais no crescimento do osteossarcoma e metástase pulmonar.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por bolsas do (1) Programa Nacional de P&D da China (2018YFC1704300 e 2020YFE0201600), (2) National Nature Science Foundation (81973877 e 82174408).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| 1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
| vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
| Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
| X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |
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