Summary
本文介绍了一种方案，用于使用共聚焦活显微镜确定原代海马和皮质神经元中基底氧化还原状态和氧化还原反应的差异。该协议可以应用于其他细胞类型和显微镜，只需最少的修改。
Abstract
线粒体氧化还原稳态对神经元的活力和功能很重要。虽然线粒体含有几种氧化还原系统，但高度丰富的硫醇二硫化物氧化还原缓冲液谷胱甘肽被认为是抗氧化防御的核心参与者。因此，测量线粒体谷胱甘肽氧化还原电位提供了有关线粒体氧化还原状态和氧化应激的有用信息。戊二醇1-roGFP2 （Grx1-roGFP2） 是一种基于遗传编码的绿色荧光蛋白 （GFP） 的谷胱甘肽氧化还原电位比率指标，在 400 nm 和 490 nm 处具有两个氧化还原状态敏感的激发峰，在 510 nm 处具有单个发射峰。本文介绍了如何在原代海马和皮质神经元中对线粒体靶向Grx1-roGFP2进行共聚焦实时显微镜检查。它描述了如何评估稳态线粒体谷胱甘肽氧化还原电位（例如，比较疾病状态或长期治疗）以及如何测量急性治疗时的氧化还原变化（以兴奋性毒性药物 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）为例）。此外，本文还介绍了Grx1-roGFP2和线粒体膜电位指示剂四甲基罗丹明乙酯（TMRE）的共同成像，以证明Grx1-roGPF2如何与其他指标进行多参数分析。该协议详细说明了如何（i）优化共聚焦激光扫描显微镜设置，（ii）应用药物进行刺激，然后用二酰胺和二硫甲状腺素进行传感器校准，以及（iii）使用ImageJ / FIJI分析数据。
Introduction
几种重要的线粒体酶和信号传导分子受到硫醇氧化还原调节1。此外，线粒体是活性氧的主要细胞来源，并且选择性地容易受到氧化损伤2。因此，线粒体氧化还原电位直接影响生物能量、细胞信号传导、线粒体功能，并最终影响细胞活力3，4。线粒体基质含有大量（1-15 mM）的硫醇二硫化物氧化还原缓冲谷胱甘肽（GSH），以维持氧化还原稳态并建立抗氧化防御5，6。GSH可以共价附着在靶蛋白（S-谷胱甘氨酸化）上以控制其氧化还原状态和活性，并被一系列减少氧化蛋白的解毒酶使用。因此，在研究线粒体功能和病理生理学时，线粒体谷胱甘肽氧化还原电位是一个高度信息性的参数。
roGFP2是GFP的一种变体，通过添加两个表面暴露的半胱氨酸而变得氧化还原敏感，形成人造二硫醇 - 二硫醚对7，8。它在~510nm处具有单个发射峰，在~400 nm和490 nm处具有两个激发峰。重要的是，两个激发峰的相对振幅取决于roGFP2的氧化还原状态（图1），使该蛋白质成为比例传感器。在Grx1-roGFP2传感器中，人戊二醇氧化氢-1（Grx1）已经融合到roGFP29，10的N端。Grx1酶与roGFP2的共价连接为传感器提供了两项重大改进：它使传感器响应特定于GSH / GSSG谷胱甘肽氧化还原对（图1），并且它将GSSG和roGFP2之间的平衡速度提高了至少100，0009倍。因此，Grx1-roGFP2能够对细胞谷胱甘肽氧化还原电位进行特异性和动态成像。
Grx1-roGFP2成像可以在各种显微镜上进行，包括宽视场荧光显微镜，旋转盘共聚焦显微镜和激光扫描共聚焦显微镜。传感器在原代神经元中的表达可以通过各种方法实现，包括脂肪感染11，DNA /磷酸钙共沉淀12，病毒介导的基因转移或使用转基因动物作为细胞源（图2）。本文使用含有1：1比例的AAV1和AAV2衣壳蛋白 13，14 的假型重组腺相关病毒（rAAV）进行实验。使用该载体，通常在感染后 4-5 天达到最大传感器表达，并保持稳定至少 2 周。我们已经成功地将Grx1-roGFP2用于小鼠和大鼠的原代海马和皮质神经元。
在本文中，rAAV介导的线粒体靶向Grx1-roGFP2在原代大鼠海马和皮质神经元中的表达用于评估基础线粒体谷胱甘肽氧化还原状态及其急性扰动。为共聚焦实时成像提供了一个协议，其中包含有关如何（i）优化激光扫描共聚焦显微镜设置，（ii）运行实时成像实验以及（iii）使用FIJI分析数据的详细说明。
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Protocol
所有动物实验均符合国家和机构指南，包括欧洲议会理事会指令2010/63 /EU，并已获得内政部的完全道德批准（海德堡大学动物福利办公室和卡尔斯鲁厄Regierungspraesidium，许可证T14 /21和T13/21）。根据标准程序从新生小鼠或大鼠幼崽中制备原代海马和皮质神经元，并如前所述维持12-14天13。
1. 溶液的制备
- 成像缓冲液的库存解决方案
- 根据 表1 准备每种储备溶液，并将其保持在4°C。 对于长期储存（>3个月），将等分试样保存在-20°C。
| 元件 | 兆瓦 | 浓度（M） | 量（g） | 容积（毫升） |
| 氯化钠 | 58.44 | 5 | 14.61 | 50 |
| 氯化钾 | 74.55 | 3 | 1.12 | 5 |
| 氯化镁·6H2O | 203.3 | 1.9 | 2 | 5 |
| 氯化钙2·2H2O | 147.01 | 1 | 1.47 | 10 |
| 甘氨酸 | 75.07 | 0.1 | 0.375 | 50 |
| 蔗糖 | 342.3 | 1.5 | 25.67 | 50 |
| 丙酮酸钠 | 110.04 | 0.1 | 0.55 | 50 |
| 异丙酮 | 238.3 | 1 | 11.9 | 50 |
| 葡萄糖 | 180.15 | 2.5 | 45 | 100 |
表1：用于成像缓冲液的储备溶液。
- 药物和染料的储备溶液
- 将二酰胺（DA;用于校准最大405：488比例）溶解在水中，以获得0.5M储备溶液（例如，在11.615mL水中加入1g）。等分试样并储存在-20°C。
- 将二硫代甲状腺醇（DTT;用于校准最小405：488比例）溶于水中，以获得1M储备溶液（例如，在32.425mL水中加入5g）。等分试样并在-20°C下储存最多3个月。
- 将N-甲基-D-天冬氨酸盐（NMDA;用于诱导兴奋性毒性和线粒体氧化）溶解在水中，以获得10mM储备溶液（例如，在16.991mL水中加入25mg）。将等分试样储存在-20°C。 对于长期储存（>6个月），将等分试样保持在-80°C。
- 四甲基罗丹明乙酯高氯酸酯（TMRE;线粒体膜电位的小分子指标）
- 将TMRE粉末溶解在甲醇中以获得20mM的储备（例如，在2.427 mL甲醇中加入25mg）。
- 在甲醇中以1：1，000稀释20mM原液以获得20μM原液。
- 等分20 mM和20μM储备溶液，用parafilm密封，并在-20°C下避光保存。
注意：两种库存解决方案都稳定了几年。使用1，000x储备溶液（20μM）进行实验。
- 成像缓冲液
- 通过在测量筒中加入 表2 中的所有组分至80 mL无菌水来制备100 mL成像缓冲液。用无菌水将体积调高至 100 mL。通过仔细摇动测量缸来混合，直到溶液看起来均匀。
注意：建议使用渗透压计检查缓冲液的渗透压。它应该尽可能接近细胞的生长培养基。这里，这是315 mOsmol / L.根据需要增加或减少蔗糖浓度，以匹配成像缓冲液和生长培养基的渗透压。 - 将pH值调节至7.4。制作等分试样，并在4°C下保存长达两周。对于长期储存，将等分试样保持在-20°C。 使用前让成像缓冲液达到室温。
- 通过在测量筒中加入 表2 中的所有组分至80 mL无菌水来制备100 mL成像缓冲液。用无菌水将体积调高至 100 mL。通过仔细摇动测量缸来混合，直到溶液看起来均匀。
| 元件 | 储备溶液 （M） | 终浓度（毫马） | 容积（毫升） |
| 氯化钠 | 5 | 114 | 2.3 |
| 氯化钾 | 3 | 5.29 | 0.176 |
| 氯化镁 | 1.9 | 1 | 0.053 |
| 氯化钙 | 1 | 2 | 0.2 |
| 甘氨酸 | 0.1 | 0.005 | 0.005 |
| 蔗糖 | 1.5 | 52 | 3.5 |
| 丙酮酸钠 | 0.1 | 0.5 | 0.5 |
| 异丙酮 | 1 | 10 | 1 |
| 葡萄糖 | 2.5 | 5 | 0.2 |
表2：成像缓冲液的组成。 指示的体积用于制备100mL成像缓冲液。
- 刺激和校准解决方案
注意：在实验前，始终通过将指示药物的储备溶液添加到成像缓冲液中来制备新鲜的刺激溶液。在实验过程中，刺激和校准溶液将依次添加到成像室中（见第3-5节）。根据实验的类型，需要不同的溶液才能在成像室中的相应最终体积中达到相同的最终浓度。- 通过将63μL的10mMNMDA储备液加入6.937m的成像缓冲液中来制备3x NMDA溶液（90μM;在腔室中的最终浓度：30μM）。将500μL所得溶液加入腔室（最终体积：1.5mL）。
- 通过将14μL0.5 M DA储备液加入6.986m成像缓冲液中，为步骤3和4（1mM;腔室中的最终浓度：0.5mM）准备2x DA溶液。向腔室中加入1 mL（最终体积：2 mL）。
- 通过将28μL0.5M DA储备液加入6.972mL成像缓冲液中，为步骤5（2mM;腔室中的最终浓度：0.5mM）准备4x DA溶液。向腔室中加入500μL（最终体积：2mL）。
- 通过将45μL的1 M DTT储备液加入8955μL成像缓冲液中来制备1x DTT溶液（5mM;腔室中的终浓度：5mM）。吸出成像缓冲液（最终体积：1 mL）后，将1mL该溶液加入腔室中。
2. 用TMRE加载细胞
注：在该协议中，TMRE以非淬灭模式15 使用，终浓度为20 nM。一般而言，应使用尽可能低的TMRE浓度，该浓度仍可在所选显微镜上提供足够的信号强度。由于蒸发不均匀，在长期初级培养物中，不同孔中培养基的体积可能不同。为确保所有孔中的TMRE浓度一致，请勿将TMRE直接添加到孔中。相反，用相同量的含TMRE培养基替换每个孔中的培养基。下面的方案是为24孔板中的原代神经元设计的，每孔含有约1mL培养基。
- 在组织培养层流罩中工作，将每个孔中的500μL培养基收集到单个锥形管中。
- 每孔，将0.5μL20μM TMRE储备液加入锥形管中（例如，12μL用于24孔）。
- 小心地从第一个孔中吸出剩余的培养基，并用500μL含TMRE的培养基代替。继续，逐孔，与剩余的井。
注意：注意不要让细胞变干，也不要打扰细胞。 - 将细胞返回培养箱并等待至少60分钟以进行染料平衡。
注意：加载时间可以延长到几个小时而不会产生不良影响。 - 为了确保在整个成像实验过程中TMRE浓度和平衡的一致性，请确保在成像缓冲液和所有刺激溶液中包括20 nM TM的终浓度。
3. 优化扫描共聚焦显微镜设置
注意：此步骤旨在实时成像期间在图像质量和细胞活力之间找到最佳折衷方案。本节介绍 roGFP 成像设置的优化。如果进行多参数成像，则需要对其他指标进行类似的优化，包括检查没有漂白或光毒性迹象的稳定基线。
- 启动共聚焦显微镜并加载GFP成像的标准设置（488 nm激发，505 - 550 nm发射）。
- 将 检测器设置为 12 位 或 16 位。
注意：通常，8位不足以进行定量成像。 - 激活 顺序扫描 模式并添加 第二序列/跟踪 （405 nm 激发，505 - 550 nm 发射）。
- 对于这两个通道，请选择一个 伪彩色查找表 ，该表指示过度曝光和曝光不足的像素（例如， GLOW OU）。
- 选择适合感兴趣对象的物镜。
注：10x-40x适用于单细胞分析，63x-100x适用于单线粒体分析。 - 将装有细胞的盖玻片安装到成像室中，加入1 mL成像缓冲液，然后将腔室放在显微镜上。
- 使用目镜和透射光聚焦细胞。
注意：不要使用落射光来定位和聚焦细胞。即使在低功率下，也会对电池产生不利影响。 - 使用不同的像素格式录制图像。根据这些图像，选择提供可接受的感兴趣结构分辨率的最低像素数。
注意：通常，512 x 512 像素适用于具有 20 倍和 40 倍物镜的单细胞成像，而 1024 x 1024 或 2048 x2048 像素通常适用于具有 63 倍物镜的单线粒体成像。 - 记录具有不同针孔尺寸的图像。根据这些图像，选择最大针孔尺寸，以提供目标结构的可接受分辨率。
注意：通常，3-7 个通风装置工作良好。 - 记录具有不同激光强度的图像。
- 相应地调整检测器增益和阈值。根据这些图像，选择提供可接受信号强度和信背景比的最低激光强度。
- 要确定信背景比，请测量包含细胞或线粒体 （ROI1） 的感兴趣区域 （ROI） 以及不含细胞或线粒体 （ROI2） 的 ROI 中的信号强度。然后，将 ROI1 的强度除以 ROI2 的强度。
注：对于激光功率为 >1-3%的405 nm激发，以1-3%的激光功率为目标，以200-1，000的单个ROI和300-1，500的单个ROI的强度为300-1，500，对于具有1%激光功率的488 nm激发。
- 要确定信背景比，请测量包含细胞或线粒体 （ROI1） 的感兴趣区域 （ROI） 以及不含细胞或线粒体 （ROI2） 的 ROI 中的信号强度。然后，将 ROI1 的强度除以 ROI2 的强度。
- 相应地调整检测器增益和阈值。根据这些图像，选择提供可接受信号强度和信背景比的最低激光强度。
- 记录具有不同扫描速度和帧数平均值的图像。为每个设置组合记录4-5张图像。根据这些图像系列，选择可提供可接受的图像噪声和图像间可变性的最高速度和最低平均设置。
注：在大多数情况下，600 Hz和1-2帧的平均扫描速度效果很好。 - 使用新的盖玻片，使用优化的设置录制延时系列。
注意：该系列的持续时间和图像间隔应与计划的实验相似。 - 在延时系列结束时，向记录室中加入1 mL的2x DA溶液。另外2分钟的图像。
- 使用蠕动泵或手持式移液器吸出成像缓冲液。加入 1 mL 1x DTT 溶液。额外5分钟的图像。
- 分析延时实验（见第5节）。
- 使用优化的设置，验证在DA和DTT处理期间，两个通道都没有过度曝光或曝光不足。
- 确保在延时录制期间，两个通道均未显示明显的漂白;目标是在第一张图像和最后一张图像之间损失<2%的强度。
- 验证 405：488 比率在成像过程中是否没有显著变化。
- 使用多个盖玻片以迭代方式重复整个过程，直到定义了始终提供可接受结果的设置。
4. 基础氧化还原状态评估
- 启动显微镜并加载第3部分的优化设置。
- 将 帧平均值 设置为 3-5。
- 将装有细胞的盖玻片安装到成像室中，加入1 mL成像缓冲液，然后将腔室放在显微镜上。
- 使用目镜和透射光聚焦细胞。
注意：不要使用落射光来定位和聚焦细胞。即使在低功率下，也会对电池产生不利影响。 - 切换到扫描模式，并在实时取景中使用 488 nm 通道对焦和定位细胞以进行成像。
- 使用 多点功能 在盖玻片上选择3-5个视野。
- 记录基线图像。
- 向腔室中加入1 mL的2x DA溶液。
- 1、2 和 3 分钟后，使用 实时取景 确认/调整对焦，然后录制图像。
注意：细胞通常在2分钟后完全氧化。 - 用1 mL的1x DTT溶液替换成像室中的缓冲液。
- 3 分钟和 5 分钟后，使用 实时取景 确认/调整对焦，然后录制图像。
注意：细胞通常在4-5分钟后完全减少。
5. 急性治疗的实时成像
注意：以下方案描述了对NMDA治疗的线粒体氧化还原反应的成像。可能需要针对其他治疗调整实验的图像间隔和持续时间。
- 启动显微镜并加载第3部分的优化设置。
- 将 延时间隔 设置为 30 秒 ， 将持续时间 设置为 25 分钟。
- 将装有细胞的盖玻片安装到成像室中，加入1 mL成像缓冲液，然后将腔室放在显微镜上。
注意：为避免热焦点漂移，在开始延时成像之前，将细胞放在显微镜载物台上10-15分钟。 - 使用目镜和透射光聚焦细胞。
注意：不要使用落射光来定位和聚焦细胞。即使在低功率下，也会对电池产生不利影响。 - 切换到扫描模式，在实时取景中使用 488 nm 通道对焦和定位细胞以进行成像。
- 可选：要增加每次运行记录的单元格数，请使用 多点功能 为每个盖玻片成像 2-3 个视场。
- 开始延时采集，并将5张图像记录为2分钟的基线记录。
- 向腔室中加入500μL的3x NMDA溶液（终浓度30μM），并记录另外20张图像作为10分钟的NMDA响应。
注意：神经元对渗透压的变化非常敏感。因此，请确保将成像缓冲液的蒸发降至最低。对于较长时间的治疗，成像室应盖上盖子。 - 向腔室中加入500μL4x DA溶液，并再记录6张图像（最大校准3分钟）。
- 从成像室中抽吸缓冲液，并用1 mL的1x DTT溶液代替。再录制 10 张图像（最小校准 5 分钟）。
- 结束录制并保存图像系列。
6. 数据分析
- 斐济的数据导入和图像预处理
- 使用 Bio 格式导入程序 打开步骤 4 中的一组图像或步骤 5 中的图像文件。点击 插件|生物制剂|生物格式进口商。在对话框中，使用 "查看堆栈"和：超堆栈，将 "颜色模式："设置为默认值"，选择" 自动缩放"，并且不拆分为单独的窗口。
注意： 自动缩放 可优化数据在计算机屏幕上的显示。它不会改变像素强度。 - 如果打开了步骤 4 中的单个图像，请单击" 图像|堆栈|工具|连接 以将它们合并到单映像堆栈中。
- 如果在图像系列中存在XY漂移，请单击 插件|StackReg 用于注册映像。在对话框中，选择" 刚体" 或" 平移"。
- 通过单击图像|将图像格式更改为32位 类型|32 位。
- 通过单击"图像"将颜色通道拆分为单独的窗口 |颜色|拆分通道。
- 选择 通道 1 （405 nm） 并调整阈值以选择要分析的线粒体，方法是单击 "图像|调整|阈值。在对话框中，选择 "默认"、"红色"、"深色背景"和" 堆栈直方图" ，然后等待所选像素显示为红色。单击" 应用"。选择 "将背景像素设置为 NaN "并 处理所有图像。
注意：为避免潜在的观察者偏差，应使用自动阈值确定。FIJI 提供了几种自动化方法（如默认、黄、互模、Otsu），可以从阈值对话框的下拉菜单中选择这些方法。通常，Default 方法会给出一个好的结果。建议在第一次分析期间比较几种方法，以找到给定图像集的最佳阈值方法。选择方法后，需要将其应用于所有图像。 - 对 通道 2 （488 nm） 重复步骤 6.1.6。
- 创建比率图像以可视化 405：488 nm 比率，方法是单击" 处理|图像计算器。在对话框中，依次选择 "图像 1：通道 1"、"操作：划分"、"图像 2：通道 2"、"创建新窗口"、"处理所有图像"。
- 将比率图像的 查找表 更改为 伪彩色。例如，要更改为 Fire，请单击" 图片|查阅表格|火。
- 使用 Bio 格式导入程序 打开步骤 4 中的一组图像或步骤 5 中的图像文件。点击 插件|生物制剂|生物格式进口商。在对话框中，使用 "查看堆栈"和：超堆栈，将 "颜色模式："设置为默认值"，选择" 自动缩放"，并且不拆分为单独的窗口。
- 图像分析
- 在比率图像上，在单个细胞或线粒体周围绘制ROI。绘制每个 ROI 后，将其添加到 ROI 管理器。 分析|工具|投资回报率经理|添加。（键盘快捷键："T"）选择" 全部显示"。
注意：由于背景像素在步骤 6.1.6 和 6.1.7 中已设置为"非数字"（NaN），因此它们不会影响测量结果。因此，在 ROI 中包含一些背景像素是可以接受的。 - 通过单击 ROI管理器|ctrl + A来测量单个单元格的405：488比率，以选择所有ROI|更多|多指标。在对话框中，选择" 测量所有切片 "和" 每个切片一行"。
- 将测量结果导出到电子表格软件。
- 选择 405 nm 图像。如步骤6.2.2所示，测量所有投资回报率的强度。使用存储在 ROI 管理器中的 ROI。
- 将测量结果导出到电子表格软件。
- 选择 488 nm 图像。如步骤 6.2.2 中所示，测量所有 ROI 的强度。使用存储在 ROI 管理器中的 ROI。
- 将测量结果导出到电子表格软件。
- 通过单击 ROI 管理器 | ctrl+A 选择所有 ROI |更多|保存。
- 建议：生成 405 和 488 nm 迹线的强度与时间的关系图。验证两个通道中均未出现明显的漂白（成像系列末端的信号强度应≥第一幅图像的98%），以及两条迹线在传感器响应期间是否向相反方向移动（例如，405 nm迹线在氧化过程中应增加，而488 nm迹线应减少）。
- 在比率图像上，在单个细胞或线粒体周围绘制ROI。绘制每个 ROI 后，将其添加到 ROI 管理器。 分析|工具|投资回报率经理|添加。（键盘快捷键："T"）选择" 全部显示"。
- 数据规范化
- 对于比率图像中的每个 ROI，确定 DA 处理期间的最大值 （Rmax） 和 DTT 处理期间的最小值 （Rmin）。
- 按如下方式计算归一化比率：
注意：这会将最大比率设置为 1.0，将最小比率设置为 0。
- 线粒体形态分析
- 要获得与步骤6.2.6中的roGFP强度并行的线粒体形态测量值，请转到 分析|设置度量 并选中 形状描述符 和 适合椭圆。
注意：除了平均强度外， 结果 窗口中的测量值还包括长轴的长度（长轴）、短轴的长度（次要）、长宽比（AR;长轴除以短轴;圆形线粒体的AR~1，细长线粒体的AR更大），以及圆度（Circ.）和圆度（圆形）的测量值。
- 要获得与步骤6.2.6中的roGFP强度并行的线粒体形态测量值，请转到 分析|设置度量 并选中 形状描述符 和 适合椭圆。
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Representative Results
生长因子戒断后稳态线粒体氧化还原状态差异的定量分析
为了证明线粒体氧化还原状态稳态差异的定量，在成像前将标准培养基中生长的原代神经元与没有生长因子培养48小时的神经元进行比较。生长因子戒断导致72小时16后凋亡神经元细胞死亡。在48小时后对细胞进行成像，以测试在此之前是否在线粒体氧化还原状态发生变化。在聚L-鸟氨酸包被盖玻片上生长的原代大鼠皮质神经元在 体外 第6天（DIV6）上感染rAAV-mito-Grx1-roGFP2，并在DIV12上成像。根据该协议的第4节，在配备40x / 1.10水浸物镜的倒置激光扫描共聚焦显微镜上在室温下进行实时成像。共聚焦设置为针孔7通风单元，像素大小568.7nm（512 x 512像素），扫描速度600 Hz，激光功率405 nm 3%，激光功率488 nm 1%，发射带宽505-550 nm和帧平均4。两种条件的原始405：488nm比值之间没有显着差异（图3B）。数据归一化后，在生长因子戒断组中可检测到具有增加的405：488nm比值的细胞子集（图3C）。这表明线粒体氧化还原变化可能先于神经元细胞死亡，并且强调了最大/最小数据归一化与组间基础氧化还原状态比较的相关性。
NMDA治疗神经元时线粒体氧化还原状态的动态变化
NMDA型谷氨酸受体（NMDAR）在神经元可塑性中起核心作用，但也可以介导神经元损伤和细胞死亡。NMDAR的病理激活导致对线粒体的几种不良影响，包括基质钙超载，线粒体氧化和碎片化以及线粒体通透性转变。在之前的一项研究中，上述方案用于研究NMDA诱导的线粒体钙超负荷与线粒体氧化之间的因果关系13。在聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白包被盖玻片上生长的原代大鼠海马神经元在DIV4上感染rAAV-mito-Grx1-roGFP2并在DIV12上成像。在37°C下在配备20x / 0.75多浸入物镜（使用水浸）和舞台孵育系统的倒置旋转盘共聚焦显微镜上进行实时成像。使用405 nm和488 nm激光线每20秒依次激发Mito-Grx1-roGFP2，并用527/55 nm发射滤光片收集两种激发波长的发射。用30μM NMDA治疗神经元在几分钟内引起线粒体的氧化（图4A，B）。值得注意的是，NMDA诱导的线粒体酸中毒导致roGFP2荧光的显着猝灭，与其众所周知的pH敏感性一致8。为了证实这种pH依赖性淬火不影响405：488的比例9，在对照实验中加入NMDA之前，线粒体被DA完全氧化。用DA预处理排除了NMDA对线粒体的任何进一步氧化，因此，尽管roGFP2荧光强度进行了相当大的淬灭，但405：488的比例在本实验中没有改变（图4C）。
NMDA诱导树突状线粒体变化的多参数分析
为了评估NMDA诱导的线粒体形态、膜电位和氧化还原状态变化的时间序列，在高空间和时间分辨率下对TMRE-和mito-Grx1-roGFP2荧光进行了平行成像。在聚-L-鸟氨酸包被盖玻片上生长的原代大鼠皮质神经元在DIV6上感染rAAV-mito-Grx1-roGFP2并在DIV12上成像。使用63x / 1.40油浸物镜，扫描速度为600 Hz，像素尺寸为90.2 nm（2倍扫描变焦时为1024 x 1024像素），针孔尺寸为3个通风单位，帧平均值为2，在室温下在室温下进行实时成像。每30秒，以顺序模式记录三张图像：405 nm激发/ 505-550 nm发射;488 nm 激发/505-550 nm 发射;552 nm 激发/560-600 nm 发射。用60μM NMDA治疗神经元导致TMRE信号丢失和405：488nm roGFP比值增加，随后线粒体的一些延迟四舍五入（图5）。
图1：Grx1-roGFP2功能和roGFP2激发光谱的示意图 （A）氧化应激和抗氧化防御系统的作用氧化细胞谷胱甘肽池。Grx1-roGPF2融合蛋白中的Grx1促进roGFP2氧化还原状态与谷胱甘肽池氧化还原状态的快速平衡。roGFP2池的氧化还原状态可以通过监测激发后在510 nm处的GFP-荧光发射比值来评估。减少的物种以蓝色显示;氧化物种以红色显示。（B）完全还原（蓝色）和氧化（红色）roGFP2的激发光谱。roGFP2氧化后，400 nm激发时的荧光发射增加，而490 nm激发时的发射减少。此图已从以前的出版物13修改而来。 B 中的激发光谱是根据 图1B 从 8中得出的。 B 中的虚线表示常用的405nm和488nm激光线的波长。缩写： GSH = 谷胱甘肽;GSSG = 氧化谷胱甘肽;Grx = 戊二醛毒素;roGFP = 氧化还原敏感的绿色荧光蛋白变体。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：该方法的工作流。 激发比氧化还原敏感荧光蛋白roGFP2在神经元中的表达可以通过多种方法实现，包括转染，脂质感染，病毒基因转移和转基因动物。该传感器可用于研究培养的原代神经元， 离体 组织外植体和完整动物的神经元氧化还原状态。roGFP2成像可以在各种显微镜上进行，包括宽视场荧光显微镜，共聚焦显微镜和2光子显微镜。roGFP2成像数据的分析可以使用免费软件ImageJ / FIJI进行。缩写：roGFP = 氧化还原敏感的绿色荧光蛋白变体。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：生长因子戒断导致神经元线粒体氧化。 （A）在成像前48小时在生长因子存在（+ GF）或不存在（-GF）下培养的神经元的代表性405：488nm比例图像。颜色编码的刻度表示非归一化的405：488 nm比率（较低的比率对应于还原状态;较高的比率对应于氧化状态）。比例尺 = 50 μm. （B） 单个神经元中 405：488 nm 比率的定量。（C）最大/最小校准的单个神经元的405：488nm比率。圆形符号表示单个单元格;条表示平均值。N = 来自一种制剂的3个盖玻片的40-44个细胞。缩写：GF = 生长因子。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：NMDA诱导的神经元线粒体氧化（A）具有代表性的405：488nm比图像，在用30μM NMDA处理之前和之后以及用DA和DTT进行最大/最小校准后。在此放大倍率下，roGFP信号主要在体马和近端树突中检测到。颜色编码的刻度表示非归一化的405：488 nm比率（较低的比率对应于降低的状态;较高的比率对应于氧化状态）。比例尺 = 50 μm. （B） 成像运行的定量，如A所示。NMDA诱导快速和持续的线粒体氧化，可以使用DA和DTT进行校准。（C）NMDA诱导的线粒体酸中毒在405nm和488nm激发时引起GFP荧光下降（上图）。为了分离pH驱动的效应并确认405：488nm的比率对pH不敏感，首先使用DA对神经元进行最大氧化，随后在DA存在下用NMDA进行挑战（下图）。在这些条件下，NMDA仍然会导致线粒体酸中毒，但没有进一步的线粒体氧化。因此，尽管405 nm和488 nm痕量均显示出pH驱动的荧光强度下降，但405：488 nm的比率仍然稳定。此数字是从13修改而来的。缩写： GFP = 绿色荧光蛋白;roGFP = 氧化还原敏感的绿色荧光蛋白变体;NMDA = N-甲基-D-天冬氨酸;DA = 二酰胺;DTT = 二硫代甲状腺素。请点击此处查看此图的放大版本。
图5：NMDA诱导的树突线粒体膜电位，氧化还原状态和形态的变化。 （A）来自延时实验的三张高倍率图像，在t = 1，4和9分钟时获得，显示树突和轴突线粒体。着色表示TMRE强度（参见校准条）。（B） 来自与（A）相同的延时实验的405：488 nm roGFP比率图像，在t = 1，4和9分钟。请注意，由于AAV感染效率有限，只有一部分神经元表达mito-Grx1-roGFP2，因此，并非所有TMRE阳性线粒体都是roGFP阳性。颜色编码的校准条表示非归一化的405：488 nm比率（较低的比率对应于降低的状态;较高的比率对应于氧化状态）。（C）定量TMRE强度，roGFP 405：488nm比值和单个线粒体的圆度（用 A， B中的箭头表示）。基线记录1分钟后，将60μMNMDA加入到浴液中。比例尺 = 5 μm。 C 中的 y 轴表示相对于基线 T0 的 405：488 nm roGFP 比值（绿色虚线）、相对于基线 T0 的 TMRE 荧光强度（红色虚线）和 FIJI/ImageJ 形状描述符"圆度"（黑色实线）。缩写：GFP = roGFP = 氧化还原敏感绿色荧光蛋白变体;mito-Grx1-roGFP2 = 溶解在 roGFP 的 N-末端的戊二醇毒素-1;AAV = 腺相关病毒;TMRE = 四甲基罗丹明，乙酯;NMDA = N-甲基-D-天冬氨酸。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
线粒体氧化还原状态的定量和动态测量提供了有关线粒体和细胞生理学的重要信息。有几种荧光化学探针可用于检测活性氧，"氧化还原应激"或"氧化应激"。然而，后一术语没有明确界定，往往缺乏特异性9，17，18。与化学染料相比，Grx1-roGFP2具有几个优点9，19：（i）作为激发比传感器，它为传感器表达水平，绝对荧光强度和细胞或细胞器密度提供了固有的归一化;（ii）作为遗传编码探针，它可以靶向细胞器或特定的亚细胞区室，如突触前末端或突触后树突棘;（iii）传感器的遗传表达消除了对染料负载的需求，在化学染料的情况下，这可能对原代神经元造成压力;（iv）与一般的氧化还原敏感化学染料相比，Grx1-roGFP2对谷胱甘肽氧化还原电位具有高度特异性;（v）传感器的氧化和还原是可逆的，能够测量瞬态氧化还原变化;（vi）与仅允许检测相对变化的化学染料相比，可以校准Grx1-roGPF2荧光比以确定mV9中的绝对氧化还原电位。
该协议描述了原代神经元中线粒体谷胱甘肽氧化还原电位的动态测量。分析完整细胞内的线粒体有几个优点15。与孤立的线粒体研究相比，细胞内的线粒体保留与其他细胞器（例如，内质网 - 线粒体接触，线粒体 - 溶酶体接触）的生理相关接触，并且暴露于细胞浓度的信号分子和代谢物。与完整动物的研究相比，原代神经元为遗传和药理学操作以及显微镜检查提供了更好的可及性。然而，对于某些问题，分离线粒体的分析将更适合，因为这可以精确控制递送的底物和抑制剂。值得注意的是，mito-Grx1-roGFP2也可用于分离的线粒体20。为了研究完整组织或动物内的神经元线粒体，可以使用在神经系统中表达mito-Grx1-roGFP2的转基因苍蝇和小鼠系21，22，23。值得注意的是，roGFP2的激发光谱适合于双光子激发，分别能够在组织外植体和完整动物中实现离体和体内双光子成像23，24。硫醇氧化还原敏感荧光蛋白的光谱变体也可用，例如黄色rxYFP-Grx1p25和红色Grx1-roCherry26。这些为多路复用提供了额外的灵活性，原则上，可以同时测量不同细胞类型或细胞区室中的氧化还原反应。
如方案所述，405：488 nm比可以通过分别在应用DA和DTT后测量最大和最小荧光比来校准。这种归一化不是必需的，因为传感器由于其比率性质而提供了一定程度的固有归一化。但是，我们建议在每次成像运行后执行最大/最小校准，主要有两个原因。首先，它确保传感器响应在实验过程中不会饱和。其次，绝对的405：488 nm比率是一个任意数字，取决于两个通道的显微镜设置。即使保持相同的设置，也不能确定激光功率和探测器性能在两次实验之间是否保持不变，特别是当它们相隔几周时。一种解决方法是在每个实验中将对照细胞的平均基线比率设置为1.0。这允许在给定实验中相对量化治疗引起的氧化还原扰动，但限制了不同实验的可比性。特别是在比较来自不同实验或细胞类型的细胞的基础氧化还原状态时，获得最大/最小校准的绝对定量非常重要。有时，DTT处理后405：488nm的比率不会低于基线比率，特别是如果线粒体在基线时已经处于相对降低的状态。这通常是长时间延时实验期间传感器漂白的迹象。在这种情况下，使用显微镜设置重复实验，以减少光照。
使用不会导致传感器漂白或光毒性诱导的线粒体氧化的显微镜设置至关重要。在开始实际实验之前，请确保花费足够的时间进行方案优化。一旦定义了可接受的设置，就可以在后续实验中以最小的调整使用它们。mito-Grx1-roGFP2成像可以在室温或35-37°C的加热台上进行。传感器在这两种情况下都可以工作;然而，细胞内信号级联反应和酶反应的动力学会根据温度自然而有所不同。因此，传感器响应的动力学和振幅可能因所选温度而异。温度的选择取决于用户，具体取决于实验的具体需求。
最后，我们想指出传感器的两个局限性。首先，在405nm处激发时，发射光的强度比在488nm处激发时要低得多，通常会导致相当嘈杂的405 nm图像。需要更高的激光功率来改善405 nm通道中的信噪比。然而，405 nm处的激发通常比488 nm处的激发更具光毒性，并且产生更多的自发荧光，从而限制了允许的405 nm激光强度。例如，在这项研究中，弱roGFP荧光与相当大的405nm激发组织自发荧光相结合，阻止了从活视网膜平底体中表达丝裂-Grx1-roGFP2的神经节细胞获取稳健的数据（Depp和Bas-Orth，未发表的观察结果）。其次，尽管405：488 nm的比率对pH 5.5至pH 8.5（图4）9左右的生理范围内的pH变化不敏感，但roGFP2发射的pH依赖性淬灭会导致通常较弱的405 nm信号降至显微镜的检测限以下，从而阻止获取可量化的比率图像。例如，在NMDA诱导的神经元细胞质基质13中毒期间就是这种情况。
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Disclosures
作者声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft（BA 3679/5-1;对于 2289：BA 3679/4-2）。A.K.由ERASMUS +奖学金支持。我们感谢Iris Bünzli-Ehret，Rita Rosner和Andrea Schlicksupp准备了原代神经元。我们感谢Tobias Dick博士提供pLPCX-mito-Grx1-roGFP2。 图4 所示的实验是在海德堡大学尼康成像中心进行的。 图2 是用 BioRender.com 准备的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Calcium chloride (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Diamide (DA) | Sigma-Aldrich | D3648 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth GmbH | 6908.1 | |
| Glucose (2.5 M stock solution) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycine | neoFroxx GmbH | LC-4522.2 | |
| HEPES (1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | 15630-080 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Sodium chloride (NaCl) | neoFroxx GmbH | LC-5932.1 | |
| Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.1 | |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) | Sigma-Aldrich | 87917 | |
| equipment | |||
| imaging chamber | Life Imaging Services (Basel, Switzerland) | 10920 | Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips |
| laser scanning confocal microscope, microscope | Leica | DMI6000 | |
| laser scanning confocal microscope, scanning unit | Leica | SP8 | |
| peristaltic pump | VWR | PP1080 181-4001 | |
| spinning disc confocal microscope, camera | Hamamatsu | C9100-02 EMCCD | |
| spinning disc confocal microscope, incubationsystem | TokaiHit | INU-ZILCF-F1 | |
| spinning disc confocal microscope, microscope | Nikon | Ti microscope | |
| spinning disc confocal microscope, scanning unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| software | |||
| FIJI | https://fiji.sc | ||
| StackReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java | ||
| TurboReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java |
References
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