Summary
En optimal saccharosekoncentration blev bestemt til ekstraktion af leverglykogen under anvendelse af centrifugering af saccharosedensitetsgradient. Tilsætningen af et 10 minutters kogetrin for at hæmme glykogennedbrydende enzymer viste sig gavnligt.
Abstract
Leverglykogen er en hyperforgrenet glucosepolymer, der er involveret i opretholdelsen af blodsukkerniveauet hos dyr. Glykogens egenskaber påvirkes af dets struktur. Derfor er en passende ekstraktionsmetode, der isolerer repræsentative prøver af glykogen, afgørende for undersøgelsen af dette makromolekyle. Sammenlignet med andre ekstraktionsmetoder kan en metode, der anvender et centrifugeringstrin med saccharosedensitetsgradient, minimere molekylær skade. Baseret på denne metode beskriver en nylig publikation, hvordan densiteten af saccharoseopløsningen, der blev anvendt under centrifugering, varierede (30%, 50%, 72,5%) for at finde den mest egnede koncentration til ekstraktion af glykogenpartikler af en lang række størrelser, hvilket begrænser tabet af mindre partikler. Et 10 minutters kogetrin blev introduceret for at teste dets evne til at denaturere glykogennedbrydende enzymer og dermed bevare glykogen. Den laveste saccharosekoncentration (30%) og tilsætningen af kogetrinnet viste sig at ekstrahere de mest repræsentative prøver af glykogen.
Introduction
Glykogen er en kompleks, hyperforgrenet polymer af glukose, der findes i dyr, svampe og bakterier1. Hos pattedyr fungerer leverglykogen som en blodglukosebuffer, der bevarer homeostase, mens muskelglykogen fungerer som et kortvarigt glukosereservoir for at give energi direkte2. Glykogens struktur beskrives ofte ved tre niveauer (vist i figur 1): 1. Lineære kæder dannes af glucosemonomerer via (1→4)-α glycosidbindinger, hvor grenpunkter forbindes via (1→6)-α glycosidbindinger; 2. stærkt forgrenede β partikler (~ 20 nm i diameter), der, især i væv såsom skeletmuskulatur, fungerer som uafhængige glykogenmolekyler 3,4; 3. Større α glykogenpartikler (op til 300 nm i diameter), der består af mindre β glykogenenheder, som findes i leveren5, hjerte6 og i nogle ikke-pattedyrarter7. Hepatiske α partikler fra diabetiske mus er molekylært skrøbelige med en tilbøjelighed til at nedbrydes til β-partikler, når de opløses i dimethylsulfoxid (DMSO), mens α partikler fra ikke-diabetiske kontroller generelt forbliver uændrede. En hypotese er, at denne skrøbelighed kan forværre den dårlige blodsukkerbalance, der ses ved diabetes, hvor de skrøbelige α partikler potentielt resulterer i højere andele af den hurtigere nedbrudte β partikel 8,9,10,11.
Traditionelle glykogenekstraktionsmetoder udnytter de relativt barske betingelser for at udsætte levervævet for varm alkalisk opløsning12 eller syreopløsninger såsom trichloreddikesyre (TCA)13 eller perchlorsyre (PCA)14. Mens de er effektive til at adskille glykogen fra andre komponenter i levervævet, nedbryder disse metoder uundgåeligt glykogenstrukturen til en vis grad15,16. Selvom disse metoder er egnede til kvantitativ måling af glykogenindholdet, er de ikke ideelle til undersøgelser med fokus på at opnå strukturelle oplysninger om glykogen på grund af denne strukturelle skade. Siden udviklingen af disse metoder er der udviklet en mildere ekstraktionsprocedure, der udnytter kold Tris-buffer (vist sig at hæmme nedbrydning af glucosidase) med saccharosedensitetsgradient ultracentrifugering 17,18,19. Med pH kontrolleret ved ~8 udsætter denne metode ikke glykogen for den sure eller alkaliske hydrolyse, der er set i tidligere procedurer.
Saccharosedensitetsgradient ultracentrifugering af homogeniseret levervæv kan adskille glykogenpartikler fra størstedelen af cellematerialet. Om nødvendigt kan yderligere oprensning udføres ved præparativ størrelseseksklusionskromatografi, hvilket resulterer i indsamling af renset glykogen med bundne glykogenassocierende proteiner20. Selvom denne metode med mildere betingelser er mere tilbøjelig til at bevare glykogenstrukturen, er det vanskeligt at forhindre, at en del af glykogen går tabt i supernatanten, især mindre glykogenpartikler, der er mindre tætte15. En anden potentiel årsag til glykogentab er, at de mildere forhold tillader en vis enzymatisk nedbrydning, hvilket resulterer i lavere glykogenudbytter sammenlignet med hårdere ekstraktionsmetoder. Nyere forskning rapporterede optimering af lever-glykogenekstraktionsmetoden for at bevare strukturen af glykogen21. Her blev forskellige saccharosekoncentrationer (30%, 50%, 72,5%) testet for at afgøre, om lavere saccharosekoncentrationer minimerede tabet af mindre glykogenpartikler. Begrundelsen var, at den lavere densitet ville tillade mindre, mindre tætte partikler at trænge ind i saccharoselaget og aggregere i pellet med resten af glykogen.
I denne undersøgelse blev ekstraktionsmetoderne med og uden et 10 minutters kogetrin sammenlignet for at teste, om glykogennedbrydningsenzymer kunne denatureres, hvilket resulterede i ekstraktion af mere glykogen, der også var fri for delvis nedbrydning. Hele molekylstørrelsesfordelinger og glykogenkædelængdefordelingerne blev brugt til at bestemme strukturen af det ekstraherede glykogen, svarende til en stivelsesekstraktionsoptimering, der tidligere var offentliggjort22. Størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) med differentiel brydningsindeks (DRI) detektion blev brugt til at opnå størrelsesfordelingen af glykogen, som beskriver den samlede molekylvægt som en funktion af molekylstørrelsen. Fluoroforassisteret kulhydratelektroforese (FACE) blev brugt til at analysere kædelængdefordelingerne, som beskriver det relative antal glucosidkæder af hver given størrelse (eller polymerisationsgrad). Dette papir beskriver metoden til ekstraktion af glykogen fra levervæv baseret på den tidligere optimeringsundersøgelse21. Dataene tyder på, at den metode, der er bedst egnet til at bevare glykogenstrukturen, er en saccharosekoncentration på 30% med et 10 minutters kogetrin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Muselever, der blev brugt til at optimere denne procedure21 , var fra 12 BKS-DB/Nju-baggrundsmus (7,2 uger gamle, se materialetabellen). Dyrebrug blev godkendt af Renmin Hospital of Wuhan University Animal Care and Ethics Committee, IACUC Issue No. WDRM 20181113.
1 Animalsk væv
- Væg muselever (1-1,8 g hel lever fra hver mus).
- Museleveren fryses hurtigt ned i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C.
2. Fremstilling af buffer og reagenser
- Forbered glykogenisolationsbuffer indeholdende 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF og 5 mM natriumpyrophosphat med deioniseret vand, og juster pH til 8.
- Forbered 30% (w / w) saccharoseopløsning (fundet at være mest optimal til leverglykogen21).
- Forbered natriumacetatbuffer (1 M, pH 4,5), eddikesyrebuffer (0,1 M, pH 3,5), natriumhydroxidopløsning (0,1 M) og natriumcyanoborhydrid (1 M).
- Der fremstilles 8-aminopyren-1,3,6-trisulfonat (APTS)-opløsning ved tilsætning af 5 mg APTS til 50 μL 15% iseddike.
- Forbered ammoniumnitratopløsning indeholdende 50 mM ammoniumnitrat med 0,02% natriumazid.
3. Glykogenekstraktion (figur 2)
- Overfør det frosne levervæv (~ 1 g) til et 15 ml rør indeholdende 6 ml glykogenisoleringsbuffer.
- Hold det på is, homogeniser levervævet ved hjælp af en vævshomogenisator.
- Overfør halvdelen af suspensionen (3 ml) til et nyt glas og kog i 10 minutter (vist sig at være optimal til glykogenstrukturundersøgelser21). Hold den anden halvdel af suspensionen (3 ml) på is for at ekstrahere glykogen indeholdende associerede proteiner, der ikke er denatureret.
BEMÆRK: Ukogte prøver skal altid opbevares på is under glykogenekstraktionstrin. Hvis glykogenproteiner ikke er vigtige for undersøgelsen, kan hele prøven gennemgå 10 minutters kogetrin. - Der fjernes en 8 μL delprøve fra hvert rør, alikvoterne opbevares på is, og de anvendes til bestemmelse af glykogenindholdet (se punkt 4).
- Den resterende suspension centrifugeres ved 6.000 × g i 10 minutter ved 4 °C.
- Supernatanterne overføres til ultracentrifugeglassene, og de centrifugeres ved 3,6 × 105 g i 90 minutter ved 4 °C.
- De resterende supernatanter kasseres, og pellets resuspenderes i 1,5 ml glykogenisolationsbuffer.
- Prøverne lægges i lag over 1,5 ml 30% saccharoseopløsning i 4 ml ultracentrifugeglas og centrifugeres ved 3,6 × 10,5g i 2 timer ved 4 °C.
- De resterende supernatanter kasseres, og pellets resuspenderes i 200 μl deioniseret vand.
- Der tilsættes 800 μL absolut ethanol til suspensionerne, og der blandes godt til bundfald af23,24 glycon. Blandingerne opbevares ved -20 °C i mindst 1 time for at tillade udfældning.
- Prøverne centrifugeres ved 6 000 × g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanterne kasseres, og pellets resuspenderes i 200 μl deioniseret vand.
- Gentag denne ethanoludfældningsproces 3x og resuspender den endelige glykogenpellet i 200 μL deioniseret vand.
- Der fjernes en prøve på 8 μL fra hvert glas til bestemmelse af glykogenindholdet (se punkt 4).
- De resterende supernatanter fryses ned i flydende nitrogen og frysetørres (frysetørres) natten over. De tørre glykogenprøver opbevares i fryseren ved -20 °C.
BEMÆRK: De tørre glykogenprøver skal være stabile ved -20 °C; Der er dog ingen data, der angiver, hvor længe de varer uden strukturelle ændringer.
4. Bestemmelse af glykogenindhold (figur 3)
- Der tilsættes 8 μL glykogensupernatanter (se pkt. 3.13 og 3.4), 5 μliter amyloglucosidase (3269 E/ml) og 100 μl natriumacetatbuffer (1 M, pH 4,5) til et mikrocentrifugeglas, og glasset fyldes til 500 μL-mærket med deioniseret vand.
- Forbered kontroller, der bruger deioniseret vand i stedet for amyloglucosidase.
- Prøverne inkuberes ved 50 °C i 30 minutter, mens kontrollerne holdes på is.
- Der centrifugeres ved 6.000 × g ved 4 °C i 10 minutter, og 300 μl af hver resulterende supernatant blandes med 1 ml glucosidaseoxidase/peroxidase (GOPOD)-reagens.
- Konstruer en kalibreringskurve ved at blande 300 μL denioniseret vand indeholdende 0, 10, 20, 30, 40 og 50 μg D-glucose med 1 ml GOPOD-reagens.
- Blandingerne inkuberes ved 50 °C i yderligere 30 minutter.
- Absorbansen (510 nm) for hver prøve aflæses ved hjælp af plader med 96 brønde (150 μL pr. hul) ved hjælp af et UV-vis-spektrofotometer.
- Absorbanserne af kontrolprøver (uden amyloglucosidase) trækkes fra absorbanserne af forsøgsprøver, og glykogenindholdet beregnes derefter baseret på D-glucosestandardkurven.
5. Råudbytte, glykogenudbytte og renhedsbestemmelse
- For råudbyttet vejes den frysetørrede glykogenprøve og udbyttet beregnes som en procentdel af det våde levervæv.
BEMÆRK: Dette udbytte bør justeres for at korrigere for de delprøver, der tages i hvert trin med glykogenindhold. - For glykogenrenhed bestemmes glykogenindholdet i de endelige pellets som beskrevet i punkt 4. Renheden beregnes som en procentdel af det bestemte glykogenindhold i forhold til råudbyttet (se trin 5.1).
- For glykogenudbyttet bestemmes glykogenindholdet i de homogeniserede prøver uden kogning og før centrifugering som beskrevet i punkt 4. Glykogenudbyttet beregnes som en procentdel af glykogenindholdet i de endelige pellets (se trin 5.2) i forhold til glykogenindholdet bestemt i initialhomogenatet.
6. Analyse af kædelængdefordelinger (figur 4)
- Væg 0,5 mg frysetørret glykogen i 1,5 ml rør.
- Der tilsættes 90 μL deioniseret vand og 1,5 μL natriumazid (0,04 g/ml) til glassene.
- Der tilsættes 5 μL eddikesyrebuffer (0,1 M, pH 3,5) og 2 μL isoamylaseopløsning (180 E/mg) til glassene for at afgrene glykogen.
- Prøverne inkuberes ved 37 °C i 3 timer.
- Der tilsættes 5 μL natriumhydroxidopløsning (0,1 M) til prøverne for at øge pH-værdien til 7,0.
- Frys prøverne i flydende nitrogen og frysetør (frysetørre) natten over.
- Der tilsættes 2 μL APTS-opløsning (5 mg APTS i 50 μL 15 % iseddike) og 2 μL natriumcyanoborhydrid (1 M) til det frysetørrede, afgrenede glykogen.
- Prøverne centrifugeres ved 4.000 × g i 2 min.
- Prøverne inkuberes ved 60 °C i 3 timer i mørke.
BEMÆRK: Røret kan dækkes med aluminiumsfolie for at beskytte indholdet mod lys. - Der tilsættes 200 μL deioniseret vand til prøverne og hvirvler dem, indtil alt bundfald er opløst.
- Prøverne centrifugeres ved 4.000 × g i 2 min.
- Der overføres alikvoter af 50 μL til mikrohætteglas med fluoroforassisteret kulhydratelektroforese (FACE) til analyse.
BEMÆRK: Dataene vises som den relative forekomst af (afgrenede) kæder (Nde(X)) for hver polymerisationsgrad (DP, symbol X).
7. Analyse af molekylstørrelsesfordelinger (figur 5)
- 0,5 mg frysetørret glykogen opløses i 50 mM ammoniumnitrat og 0,02 % natriumazid ved 1 mg/ml.
- Prøverne inkuberes i en termomixer ved 80 °C i 3 timer ved 300 omdr./min.
- Injicer prøverne i et SEC-system ved hjælp af en forkolonne og 1000 Å og 10.000 Å søjler ved 80 °C med en strømningshastighed på 0,3 ml / min (se materialetabellen). Brug en brydningsindeksdetektor til at bestemme molekylernes relative vægt ved hvert elueringsvolumen.
- Ved hjælp af pullulanstandarder (PSS) med molære masser fra 342 til 1,22 × 106 plottes en SEC universel kalibreringskurve for at konvertere elueringstiden til Rh (hydrodynamisk radius). Dataene fra detektoren for differentialbrydningsindeks (DRI) udtrykkes som en SEC-vægtfordeling w (log Rh) som funktion af Rh.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mens den ovenfor beskrevne procedure er for den mest optimale metode (30% saccharose med tilsætning af et 10min kogetrin), gives der her data for glykogen ekstraheret via tre saccharosekoncentrationer (30%, 50%, 72,5%), med og uden kogetrin, som tidligere beskrevet21. Efter protokollen er renheden, råudbyttet og glykogenudbyttet af tørt glykogen ekstraheret under forskellige betingelser angivet i tabel 1, gengivet fra21. Der var ingen signifikante forskelle i råudbytte og glykogenudbytte mellem grupperne ekstraheret med de forskellige betingelser. I modsætning hertil blev glykogenrenheden signifikant påvirket af både saccharosekoncentrationerne (tabel 1, P < 0,001) og af tilsætningen af et kogetrin (tabel 1, P < 0,0001). Glykogen med den højeste renhed blev ekstraheret ved hjælp af 30% saccharosekoncentrationen sammen med et 10 minutters kogetrin, hvorfor det blev bestemt til at være det mest optimale ud af de testede betingelser.
Molekylstørrelsesfordelinger blev brugt til at vurdere virkningerne af de forskellige betingelser på størrelsen af molekyler i det endelige ekstrakt. Disse blev opnået ved anvendelse af et vandigt SEC-system som beskrevet tidligere25. Normalisering af hver fordeling til den samme maksimale værdi gjorde det muligt at sammenligne den relative andel af α til β partikler fra hver metode, vist i figur 6, gengivet fra21. De Rh, hvor maksima forekommer (Rh,max), og gennemsnittet Rh (
) er vist i tabel 2, gengivet fra21. Glykogenmolekyler med Rh < 30 nm blev defineret som β partikler11. Det β partikelindhold blev beregnet som arealet under kurven (AUC) på (Rh < 30 nm)/AUC (total Rh). De kogte prøver havde lavere gennemsnitlige R-værdier og et højere β partikelindhold end de ukogte prøver (tabel 2, P < 0,05). Lavere saccharosekoncentrationer resulterede i lavere værdier og højere β partikelindhold (tabel 2, P <0.05). Indførelsen af et kogetrin førte også til lavere R,h,max-værdier (tabel 2, P<0.05), mens saccharosekoncentrationen ikke havde nogen signifikant virkning.
Kædelængdefordelinger (CLD'er) tilvejebringer det relative antal kæder af hver given længde (antal tilsluttede glukoseenheder eller polymerisationsgrad), opnået ved anvendelse af FACE. CLD'erne er vist i figur 7, gengivet ved hjælp af data fra21. Den gennemsnitlige antalskædelængde (ACL) blev beregnet som (ΣX X Nde(X)))/ (ΣX Nde(X)) (tabel 2). ACL'erne for ukogte prøver var signifikant mindre og mere varierede end for de kogte prøver (tabel 2, P < 0,05). Saccharosekoncentrationen påvirkede imidlertid ikke ACL'erne signifikant. Dette understøttede hypotesen om, at kogning af prøverne i 10 minutter som et præekstraktionstrin ville bevare glykogenstrukturen. Den foreslåede mekanisme er denaturering af glykogennedbrydende enzymer.
Figur 1: De tre niveauer af glykogenstruktur. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Glykogenekstraktionsproces. Trin til ekstraktion og rensning af glykogen fra muselever. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Bestemmelse af glykogenindhold. Trin til bestemmelse af glykogenindholdet i leverhomogenat, renset tørt glykogen eller glykogenopløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Analyse af kædelængdefordelinger. Trin til analyse af kædelængdefordelinger ved hjælp af et fluoroforassisteret kulhydratelektroforesesystem. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Analyse af molekylstørrelsesfordelinger. Trin til analyse af molekylstørrelsesfordelingerne ved hjælp af et vandigt størrelsesekskluderingskromatografisystem. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: SEC-vægtfordeling af hele (ikke afgrenede) museleverglykogen. Ekstraktion blev udført under forskellige betingelser, normaliseret til at have det samme maksimum i w (log Rh). Hvert leverhomogenat blev opdelt i seks lige store mængder, og glykogen blev ekstraheret med enten 30%, 50% eller 72,5% saccharose, kogt eller ukogt. Kurver repræsenterer gennemsnittet ved en given Rh , idet SD leveres på hver side af hovedlinjen (n = 4-6, hvor prøver, der ikke har tilstrækkeligt signal til støj, fjernes). A) Glykogen ekstraheret med 30% saccharose, kogt eller ukogt; B) glykogen ekstraheret af 50% saccharose, kogt eller ukogt C) glykogen ekstraheret med 72,5% saccharose, kogt eller ukogt. Dette tal blev tilpasset fra21. Forkortelser: SEC = størrelseseksklusionskromatografi; SD = standardafvigelse; Rh = hydrodynamisk radius; w(log Rh) = SEC vægtfordeling. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Kædelængdefordelinger, Nde(X), af glykogen. Kædelængdeanalyse blev udført på seks lever for både kogte og ukogte under anvendelse af 30%, 50% og 72,5% saccharosekoncentrationer i ultracentrifugeringstrinnet. Værdier for hver DP repræsenterer gennemsnittet ± SD (N = 6). A) Glykogen ekstraheret med 30% saccharose, kogt eller ukogt; B) glykogen ekstraheret af 50% saccharose, kogt eller ukogt C) glykogen ekstraheret med 72,5% saccharose, kogt eller ukogt. Dette tal blev tilpasset fra21. Forkortelse: Nde(X) = kædelængdefordeling. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Råudbytte (%) | Renhed (%) | Glykogen udbytte (%) | |
| 30% Saccharose-c | 2.1 ± 1.0a | 13.1 ± 12.0b | 10.7 ± 9.1a |
| 50% Saccharose-c | 1,2 ± 0,7a | 23.3 ± 20.1b | 10.2 ± 8.1a |
| 72,5% Saccharose-c | 1,9 ± 0,8a | 9,8 ± 9,0 b | 5.3 ± 2.4a |
| 30% Saccharose-b | 0,8 ± 0,4a | 67,9 ± 16,8a | 16,0 ± 5,1a |
| 50% Saccharose-b | 1.1 ± 0,6a | 48,6 ± 16,9a | 14.8 ± 7.6a |
| 72,5% Saccharose-b | 2,0 ± 0,9a | 14,7 ± 12,6b | 6.9 ± 3.7a |
| Tovejs ANOVA | Saccharose: P = 0,053 | Saccharose: P < 0,001 | Saccharose: P = 0,034 |
| Temperatur: P = 0,108 | Temperatur: P < 0,0001 | Temperatur: P = 0,116 | |
| Interaktion: P = 0,11 | Interaktion: P = 0,003 | Interaktion: P = 0,801 |
Tabel 1: Renhed, råudbytte, glykogenudbytte. Råudbytte, renhed og glykogenudbytte for leverglykogenprøver ekstraheret med 30%, 50% eller 72,5% saccharose, kogt eller ukogt. -c var prøver ekstraheret ved hjælp af kold buffer; -b var prøver ekstraheret ved kogning i 10 min. Værdierne angives som gennemsnittet ± standardafvigelse (SD), n = 6. Forskelle i værdier med forskellige hævede bogstaver i samme kolonne er statistisk signifikante (P < 0,05). Denne tabel er gengivet med tilladelse fra21.
|
Gennemsnit Rh,max | β indhold | Gennemsnitlig ACL | |
| 30% Saccharose-c | 29,4 ± 1,5b | 34,9 ± 0,6a | 40,9 ± 6,2%a,b | 4,8 ± 0,5c |
| 50% Saccharose-c | 32,0 ± 1,1a,b | 36,1 ± 0,5a | 28,5 ± 3,0% b,c | 5.6 ± 1.1b,c |
| 72,5% Saccharose-c | 34,3 ± 1,8a | 36,2 ± 0,4a | 23,7 ± 3,5%c | 4,7 ± 0,9c |
| 30% Saccharose-b | 29,4 ± 1,2b | 33.7 ± 3.1a | 43,1 ± 5,1 %a | 8.6 ± 1.8a |
| 50% Saccharose-b | 30.1 ± 1.2b | 34,9 ± 0,7a | 36,0 ± 7,2%a,b,c | 8.8 ± 1.7a |
| 72,5% Saccharose-b | 30,9 ± 3,5a,b | 33,6 ± 3,5a | 34,0 ± 13,1%a,b,c | 7,6 ± 1,9a,b |
| Tovejs ANOVA | Saccharose: P = 0,002 | Saccharose: P = 0,442 | Saccharose: P < 0,001 | Saccharose: P = 0,290 |
| Temperatur: P = 0,010 | Temperatur: P = 0,032 | Temperatur: P = 0,016 | Temperatur: P < 0,0001 | |
| Interaktion: P = 0,431 | Interaktion: P = 0,640 | Interaktion: P = 0,441 | Interaktion: P = 0,750 |
Tabel 2: og Rh , hvor maksimum forekommer (Rh,max) og gennemsnitlig kædelængde (ACL). og Rh , hvor maksima forekommer (Rh,max), β partikelindhold og gennemsnitlig kædelængde (ACL) af glykogen ekstraheret med enten 30%, 50% eller 72,5% saccharose, kogt eller ukogt. -c ukogt; -b involverede et 10 minutters kogetrin. Forskelle i værdier med forskellige hævede bogstaver i samme kolonne er statistisk signifikante (P < 0,05). Denne tabel er gengivet med tilladelse fra 21. Forkortelser: Rh = hydrodynamisk radius; = ; ACL = gennemsnitlig kædelængde Rh,max = Rh , hvor maksimum forekommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere undersøgelser har vist, at glykogens struktur er vigtig for dens egenskaber; For eksempel påvirker molekylstørrelsen nedbrydningshastigheden af glykogen10, og kædelængdefordelingen påvirker dens opløselighed26. For korrekt at forstå disse forhold er det vigtigt at ekstrahere glykogen med en procedure, der isolerer så meget som muligt en repræsentativ og ubeskadiget prøve. Traditionelle ekstraktionsmetoder udnyttede enten varme alkaliske forhold eller kold syre. Selvom de er effektive til at adskille glykogen fra andre vævskomponenter, er disse metoder kemisk hårde og har vist sig at nedbryde den molekylære struktur af glykogen27.
Der er siden udviklet en forholdsvis skånsom metode, der anvender centrifugeringaf saccharosedensitetsgradient 17,18, hvilket gør det muligt at danne glykogen i pelleten, mens det meste af cellematerialet forbliver i supernatanten. Denne metode er især nyttig til levervæv, hvor glykogen α partikler er følsomme over for syrehydrolyse28. Denne mildere metode har imidlertid mindst to potentielle mekanismer til isolering af glykogen, der afviger i struktur fra den, der ses in vivo: 1) mindre, mindre tætte glykogenpartikler er mere modtagelige for at blive efterladt i supernatanten under saccharosedensitetsgradientcentrifugering17,18, da de muligvis ikke kan nå pellet; 2) De mildere forhold kan tillade, at glykogennedbrydningsenzymer, som ville blive denatureret under de hårdere alkaliske/syreekstraktionsbetingelser, fortsætter med at nedbryde glykogenpartikler under ekstraktion.
En nylig publikation21 havde til formål at hjælpe med at løse disse potentielle problemer ved at teste en række saccharosekoncentrationer (og derfor tætheder) og fandt, at anvendelse af en koncentration på 30% i modsætning til de traditionelt anvendte 72,5% hjalp med at minimere tabet af mindre glykogenpartikler. Fremtidige forsøg kunne teste endnu lavere koncentrationer for at se, om nogle mindre partikler stadig fortrinsvis går tabt i supernatanten under centrifugering. Denne publikation testede også effektiviteten af at indføre et 10 minutters kogetrin direkte efter vævshomogenisering for at denaturere glykogennedbrydningsenzymerne og derved bevare glykogenstrukturen. Det blev vist, at dette trin hjalp med at hæmme glykogennedbrydning, idet glykogenkædelængderne blev signifikant bevaret. Yderligere eksperimenter i denne undersøgelse gav bevis for, at dette 10 minutters kogetrin sandsynligvis ikke ville forårsage væsentlig skade på glykogenstrukturen. Dette kogetrin kan imidlertid påvirke strukturen af glykogenassocierede proteiner, hvilket potentielt kan resultere i denaturering og efterfølgende dissociation af proteiner fra glykogen. Derfor, hvis proteomics er af interesse, kan det være at foretrække at bruge den lave saccharosekoncentration (30%) uden kogning (prøver opbevares på is) med det forbehold, at glykogen kan nedbrydes let.
Ved anvendelse af centrifugering af saccharosedensitetsgradient uden yderligere optimeringsforsøg er den mest egnede metode at udnytte en relativt lav koncentration af saccharose (30%) med introduktion af et 10 minutters kogetrin direkte efter vævshomogenisering. Der er nogle begrænsninger for denne teknik. For det første blev dette optimeret til leverglykogen, og det er vigtigt at bemærke, at det måske ikke er så passende for glykogen fra andre væv. For det andet var den laveste testede saccharosekoncentration som nævnt 30%, og det er muligt, at lavere koncentrationer kunne være at foretrække. For det tredje er en optimeret teknik, der forhindrer enzymatisk nedbrydning af glykogen, samtidig med at det tilknyttede proteom bevares, endnu ikke tilgængelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for Mr. Gaosheng Wu og Miss Yunwen Zhu for teknisk assistance med FACE og Mr. Zhenxia Hu og Mr. Dengbin for teknisk assistance med SEC. MAS støttes af et Advance Queensland Industry Research Fellowship, Mater Foundation, Equity Trustees og L G McCallam Est og George Weaber Trusts. Dette arbejde blev støttet af det prioriterede akademiske program for Jiangsu Higher Education Institutions, et Natural Science Foundation of China-tilskud C1304013151101138 og 2017 Jiangsu Innovation and Entrepreneurship talents-programmet. Figur 1-5 blev oprettet ved hjælp af BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS) | SIGMA Aldrich | 9341 | 0.1 M solution |
| Acetic acid | SIGMA Aldrich | 695092 | 0.1 M, pH 3.5 solution |
| Agilent 1260 Infinity SEC system | Agilent, Santa Clara, CA, USA | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| BKS-DB/Nju background mice | Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University | ||
| D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format) | Megazyme | K-GLUC | |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA) | SIGMA Aldrich | 431788 | |
| Homogenizer | IKA | T 25 | |
| Hydrochloric acid | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M solution |
| Hydrochloric acid | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M solution |
| P/ACE MDQ plus system | Ab Sciex, US | Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) | |
| Refractive index detector | Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA) | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| Sodium acetate | SIGMA Aldrich | 241245 | 1 M, pH 4.5 solution |
| Sodium azide | SIGMA Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | SIGMA Aldrich | S9888 | |
| Sodium cyanoborohydride | SIGMA Aldrich | 156159 | 1 M solution |
| Sodium fluoride | SIGMA Aldrich | 201154 | |
| Sodium hydroxide | SIGMA Aldrich | 43617 | 0.1 M solution |
| Sodium nitrate | SIGMA Aldrich | NISTRM8569 | |
| Sodium pyrophosphate | SIGMA Aldrich | 221368 | |
| Sucrose | SIGMA Aldrich | V90016 | |
| SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns | Polymer Standards Services, Mainz, Germany | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| Trizma | SIGMA Aldrich | T 1503 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm |
References
- Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M. Life: the science of biology. 12th edn. Freeeman, W. H. , (2020).
- Calder, P. C., Geddes, R. Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle. Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).
- Rybicka, K. K. Glycosomes - The organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Takeuchi, T., Iwamasa, T., Miyayama, H. Ultrafine structure of glycogen macromolecules in mammalian-tissues. Journal of Electron Microscopy. 27 (1), 31-38 (1978).
- Drochmans, P. Morphologie du glycogene - etude au microscope electronique de colorations negatives du glycogene particulaire. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Besford, Q. A., et al. The structure of cardiac glycogen in healthy mice. International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).
- Lumsden, R. D. Macromolecular structure of glycogen in some cyclophyllidean and trypanorhynch cestodes. Journal of Parasitology. 51 (4), 501-515 (1965).
- Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
- Deng, B., et al. The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen. Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).
- Jiang, X., et al. The molecular-size dependence of glycogen enzymatic degradation rate and its importance for diabetes. European Polymer Journal. 82 (1), 175-180 (2016).
- Hu, Z., et al. Glycogen structure in type 1 diabetic mice: towards understanding the origin of diabetic glycogen molecular fragility. International Journal of Biological Macromolecules. 128, 665-672 (2019).
- Suzuki, Y., et al. Insulin control of glycogen metabolism in knockout mice lacking the muscle-specific protein phosphatase PP1G/R-GL. Molecular and Cellular Biology. 21 (8), 2683-2694 (2001).
- Stetten, M. R., Katzen, H. M., Stetten, D. Metabolic inhomogeneity of glycogen as a function of molecular weight. Journal of Biological Chemistry. 122 (2), 587-599 (1956).
- Nahorski, S. R., Rogers, K. J. An enzymic fluorometric micro method for determination of glycogen. Analytical Biochemistry. 49 (2), 492-497 (1972).
- Wang, Z., et al. Molecular structural features of glycogen in the kidneys of diabetic rats. Carbohydrate Polymers. 229, 115526 (2020).
- Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in Escherichia coli. Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362, 811-815 (2007).
- Ryu, J. -H., et al. Comparative structural analyses of purified glycogen particles from rat liver, human skeletal muscle and commercial preparations. International Journal of Biological Macromolecules. 45 (5), 478-482 (2009).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11 (4), 1094-1100 (2010).
- Tan, X., et al. A new non-degradative method to purify glycogen. Carbohydrate Polymers. 147 (1), 165-170 (2016).
- Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. Optimization of liver glycogen extraction when considering molecular fine structure. Carbohydrate Polymers. 261, 117887 (2020).
- Zhao, Y., Tan, X., Wu, G., Gilbert, R. G. Using molecular fine structure to identify optimal methods of extracting starch. Starch - Starke. 72, 1900214 (2020).
- Shokri-Afra, H., Ostovar-Ravari, A., Rasouli, M. Improvement of the classical assay method for liver glycogen fractions: ASG is the main and metabolic active fraction. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 20, 4328-4336 (2016).
- Kerly, M.
- Sullivan, M. A., et al. Improving size-exclusion chromatography for glycogen. Journal of Chromatography A. 1332 (1), 21-29 (2014).
- Sullivan, M. A., et al. Skeletal muscle glycogen chain length correlates with insolubility in mouse models of polyglucosan-associated neurodegenerative diseases. Cell Reports. 27 (5), 1334-1344 (2019).
- Orrell, S. A., Bueding, E. A comparison of products obtained by various procedures used for the extraction of glycogen. Journal of Biological Chemistry. 239 (12), 4021-4026 (1964).
- Sullivan, M. A., et al. Molecular insights into glycogen alpha-particle formation. Biomacromolecules. 13 (11), 3805-3813 (2012).
