Summary
Dit protocol beschrijft de microfabricagetechnieken die nodig zijn om een lab-on-a-chip, microfluïdisch elektroporatieapparaat te bouwen. De experimentele opstelling voert gecontroleerde transfecties op één celniveau uit in een continue stroom en kan worden uitgebreid naar hogere doorvoersnelheden met populatiegebaseerde controle. Er wordt een analyse verstrekt die de mogelijkheid toont om de mate van celmembraanpermeabilisatie in realtime elektrisch te bewaken.
Abstract
Huidige therapeutische innovaties, zoals CAR-T-celtherapie, zijn sterk afhankelijk van viraal gemedieerde genafgifte. Hoewel efficiënt, gaat deze techniek gepaard met hoge productiekosten, wat heeft geleid tot een interesse in het gebruik van alternatieve methoden voor genafgifte. Elektroporatie is een elektrofysische, niet-virale benadering voor de intracellulaire afgifte van genen en andere exogene materialen. Bij het aanbrengen van een elektrisch veld maakt het celmembraan tijdelijk moleculaire afgifte in de cel mogelijk. Meestal wordt elektroporatie uitgevoerd op de macroschaal om grote aantallen cellen te verwerken. Deze aanpak vereist echter uitgebreide empirische protocolontwikkeling, wat kostbaar is bij het werken met primaire en moeilijk te transfecteren celtypen. Langdurige protocolontwikkeling, in combinatie met de vereiste van grote spanningen om voldoende elektrische veldsterkten te bereiken om de cellen te permeabiliseren, heeft geleid tot de ontwikkeling van elektroporatie-apparaten op microschaal. Deze micro-elektroporatie-apparaten worden vervaardigd met behulp van gangbare microfabricagetechnieken en zorgen voor een grotere experimentele controle met het potentieel om hoge doorvoermogelijkheden te behouden. Dit werk bouwt voort op een microfluïdische elektroporatietechnologie die in staat is om het niveau van celmembraanpermeabilisatie op eencellig niveau onder continue stroom te detecteren. Deze technologie was echter beperkt tot 4 cellen die per seconde werden verwerkt, en daarom wordt hier een nieuwe aanpak voor het verhogen van de systeemdoorvoer voorgesteld en gepresenteerd. Deze nieuwe techniek, aangeduid als celpopulatie-gebaseerde feedbackcontrole, beschouwt de celpermeabilisatierespons op een verscheidenheid aan elektroporatiepulserende omstandigheden en bepaalt de meest geschikte elektroporatiepulsomstandigheden voor het celtype dat wordt getest. Vervolgens wordt een modus met een hogere doorvoer gebruikt, waarbij deze 'optimale' puls wordt toegepast op de celsuspensie tijdens het transport. De stappen voor het fabriceren van het apparaat, het opzetten en uitvoeren van de microfluïdische experimenten en het analyseren van de resultaten worden in detail gepresenteerd. Ten slotte wordt deze micro-elektroporatietechnologie gedemonstreerd door een DNA-plasmide af te leveren dat codeert voor groen fluorescerend eiwit (GFP) in HEK293-cellen.
Introduction
Huidige therapeutische innovaties in biomedisch onderzoek, zoals CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) celtherapie en genetische bewerking met behulp van CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeat DNA sequences)/Cas9, zijn sterk afhankelijk van het vermogen om exogene stof zowel succesvol als efficiënt in de intracellulaire ruimte af te leveren1. In CAR-T-therapie is de gouden standaard om de genafgiftestap uit te voeren in de productie van celtherapie het gebruik van virale vectoren2. Hoewel viraal-gemedieerde genafgifte een efficiënte leveringsmodaliteit is, heeft het ook verschillende nadelen. Deze omvatten productiekosten, cytotoxiciteit, immunogeniciteit, mutagenese/tumorigenesepotentieel en groottebeperkingen op het te leveren gen(en)3. Deze beperkingen hebben geleid tot het onderzoek en de ontwikkeling van alternatieve, niet-virale toedieningstechnologieën.
Elektroporatie, een alternatief voor virale gemedieerde genafgifte, vertrouwt op de toepassing van een optimale elektrische pulsgolfvorm om DNA-, RNA- en eiwittransfecties van cellen uit te voeren. Na de toepassing van een extern elektrisch veld wordt het celmembraan kortstondig aangetast, waardoor de cel gevoelig wordt voor de intracellulaire afgifte van anders ondoordringbare exogene materialen4. In vergelijking met virale gemedieerde toediening is elektroporatie voordelig omdat het over het algemeen veilig is, gemakkelijk te bedienen en lage bedrijfskosten heeft. Elektroporatie kan zowel kleine als grote moleculaire lading leveren en kan efficiënt zijn in het transfecteren van cellen, ongeacht afstamming5. Om gewenste resultaten na elektroporatie te bereiken, d.w.z. een goede levensvatbaarheid en een goede elektrotransfectie-efficiëntie, moeten verschillende experimentele parameters worden geco-geoptimaliseerd. Deze omvatten celtype6, celdichtheid, molecuulconcentratie7, elektroporatiebuffereigenschappen (bijv. Moleculaire samenstelling, geleidbaarheid en osmolariteit)8, elektrodegrootte/geometrie9 en elektrische pulsgolfvorm (vorm, polariteit, aantal pulsen)10 (zie figuur 1 voor een illustratie). Hoewel elk van deze parameters een significant effect kan hebben op de uitkomsten van elektroporatie-experimenten, is de pulsgolfvorm vooral in detail bestudeerd, omdat de elektrische energie van de toegepaste puls (en) de wortel is van de intrinsieke afweging tussen de resulterende cel levensvatbaarheid en elektrotransfectie-efficiëntie8.
Typisch worden elektroporatie-experimenten uitgevoerd op macroschaal, waarbij cellen worden opgehangen in 100s microliter buffer tussen een set grote, parallelle plaatelektroden in een elektroporatiecuvet. De elektroden worden meestal vervaardigd uit aluminium met een elektrodeafstand van 1-4 mm. Zodra de cellen handmatig via de pipet zijn geladen, wordt de cuvette elektrisch verbonden met een omvangrijke, elektrische pulsgenerator waar de gebruiker de pulsgolfvormparameters kan instellen en toepassen om de celsuspensie te elektropoteren. Hoewel macroschaal of bulkelektroporatie celdichtheden > 106 cellen / ml kan verwerken, kan deze functie verspillend zijn bij het optimaliseren van de instellingen voor de elektrische pulsgolfvorm. Dit is met name van belang bij het elektropoderen van primaire celtypen waarbij de celpopulatieaantallen beperkt kunnen zijn. Bovendien moet de pulsgenerator vanwege de grote afstand tussen de elektroden grote spanningen kunnen leveren om elektrische veldsterktes te bereiken >1kV / cm11. Deze hoge spanningen veroorzaken resistieve vermogensdissipatie door de elektrolytenbuffer, wat resulteert in Joule-verwarming, wat schadelijk kan zijn voor de resulterende levensvatbaarheid van de cel12. Ten slotte zal het uitvoeren van elektroporatie op een dichte suspensie van cellen consequent worden belast met een aangeboren variabiliteit in de resulterende elektrotransfectie-efficiëntie en cel levensvatbaarheid. Elke cel in suspensie kan een andere elektrische veldsterkte ervaren als gevolg van de omliggende cellen. Afhankelijk van of de ervaren elektrische veldsterkte wordt verhoogd of verlaagd, kan de resulterende levensvatbaarheid van de cel of de efficiëntie van elektrotransfectie elk negatief worden beïnvloed11. Deze nadelen van elektroporatie op macroschaal hebben geleid tot het nastreven en ontwikkelen van alternatieve technologieën die op microschaal werken en een betere controle op het niveau van één cel mogelijk maken.
Het gebied van BioMEMS, of biomedische micro-elektromechanische systemen, komt voort uit de technologische vooruitgang in de micro-elektronica-industrie. In het bijzonder het gebruik van microfabricageprocessen om micro-apparaten te ontwikkelen voor de vooruitgang van biomedisch onderzoek. Deze ontwikkelingen omvatten de ontwikkeling van micro-elektrode-arrays voor in vivo elektrische monitoring13, capacitieve micro-elektroden voor in situ elektroporatie14, geminiaturiseerde organ-on-a-chip-apparaten15, microfluïdische point-of-care diagnostiek16, biosensoren17 en medicijnafgiftesystemen18, inclusief nano- en micro-elektroporatieapparaten 19,20,21 . Vanwege de mogelijkheid om apparaten te ontwerpen en te produceren op dezelfde schaal als biologische cellen, zijn nano- en micro-elektroporatietechnologieën voordelig in vergelijking met hun tegenhanger op macroschaal22,23. Deze elektroporatie-apparaten elimineren de vereiste van hoogspanningspulstoepassingen, omdat elektrodesets met afstanden van 10s tot 100s van micrometers meestal zijn geïntegreerd. Deze functie vermindert de stroom door de elektrolyt drastisch, wat op zijn beurt de accumulatie van toxische elektrolyseproducten en de effecten van Joule-verwarming in deze systemen vermindert. De kanalen op microschaal zorgen er ook voor dat een veel uniformer elektrisch veld betrouwbaar wordt toegepast op de cellen tijdens de pulstoepassing, wat resulteert in consistentere resultaten24. Daarnaast is het ook gebruikelijk dat micro-elektroporatie-apparaten worden geïntegreerd in een microfluïdisch platform dat zich leent voor toekomstige integratie in een volledig geautomatiseerde technologie, een zeer wenselijke mogelijkheid in de productie van celtherapie25. Ten slotte maakt elektroporatie op microschaal de elektrische ondervraging van elektroporatiegebeurtenissen mogelijk. De mate van celmembraanpermeabilisatie kan bijvoorbeeld in realtime worden bewaakt op een enkel celniveau26,27. Het doel van deze methode is om de microfabricage, systeemwerking en analyse te beschrijven van een microfluïdisch, eencellig micro-elektroporatieapparaat dat in staat is om de mate van celmembraanpermeabilisatie te meten voor het optimaliseren van elektroporatieprotocollen, maar toch de doorvoer te verhogen ten opzichte van de vorige state-of-the-art.
Het uitvoeren van elektroporatie op eencellig niveau is niet langer een nieuwe techniek, zoals het voor het eerst werd aangetoond door Rubinsky et al. in 2001 met de ontwikkeling van een statische celelektroporatietechnologie28. Hun micro-apparaat was innovatief omdat ze de eersten waren die het vermogen demonstreerden om het geval van elektroporatie elektrisch te volgen. Dit heeft verder geleid tot de ontwikkeling van statische, eencellige elektroporatietechnologieën die in staat zijn om de mate van celmembraanpermeabilisatie op een parallelle manier elektrisch te detecteren om de doorvoer van de apparaten te verhogen. Maar zelfs met parallellisatie en batchverwerking missen deze apparaten ernstig het totale aantal cellen dat ze per tijdseenheidkunnen verwerken 29,30. Deze beperking heeft geleid tot de ontwikkeling van doorstroomapparaten die in staat zijn om micro-elektroporatie op eencellig niveau uit te voeren met een veel grotere doorvoer31. Deze apparaatovergang, van statische naar doorstroomomgeving, beperkt de mogelijkheid om de mate van celmembraanpermeabilisatie elektrisch te bewaken na de toepassing van de elektroporatiepuls. De methode die in dit werk wordt beschreven, overbrugt de kloof tussen deze twee technologieën, een micro-elektroporatietechnologie die in staat is om de mate van celmembraanpermeabilisatie van individuele cellen elektrisch te detecteren, pulseren en bewaken, op een continue stroom, seriële manier.
Deze technologie werd onlangs beschreven in Zheng et al. In dat werk werden de mogelijkheden van deze technologie geïntroduceerd met de voltooiing van een parametrische studie, waarbij zowel de amplitude als de duur van de elektroporatiepuls werden gevarieerd en het daaropvolgende elektrische signaal, indicatief voor celmembraanpermeabilisatie, werd onderzocht32. De resultaten toonden aan dat een toename van de intensiteit van de elektroporatiepuls (d.w.z. toename van het toegepaste elektrische veld of toename van de pulsduur) een toename van de gemeten celmembraanpermeabilisatie veroorzaakte. Om het systeem verder te valideren, werd een gemeenschappelijke fluorescerende indicator van succesvolle elektroporatie, propidiumjodide33, toegevoegd aan de celsuspensie en werd een fluorescentiebeeld vastgelegd onmiddellijk na het aanbrengen van de elektrische puls. Het optische signaal, d.w.z. de fluorescentie-intensiteit van propidiumjodide in de cel, was sterk gecorreleerd met de elektrische meting van de mate van celmembraanpermeabilisatie, waardoor de betrouwbaarheid van deze elektrische meting werd geverifieerd. Dit werk hield echter alleen rekening met de levering van het kleine molecuul propidiumjodide, dat weinig tot geen vertaalbare betekenis heeft.
In dit werk wordt een nieuwe toepassing van deze technologie geïntroduceerd om de doorvoer van het systeem te verbeteren, terwijl een biologisch actieve plasmide-DNA (pDNA) -vector wordt afgeleverd en de elektrotransfectie-efficiëntie van cellen die opnieuw worden geplateerd en gekweekt na elektroporatie wordt beoordeeld. Hoewel het vorige werk beter presteert dan bestaande micro-elektroporatietechnologieën die in staat zijn om elektrisch de gebeurtenis van elektroporatie te meten, vereist de huidige toestand van het apparaat nog steeds lange celtransittijden tussen de elektrodenset (~ 250 ms) om de celdetectie, pulstoepassing en de celmembraanpermeabilisatiemeting uit te voeren. Met een enkel kanaal beperkt dit de doorvoer tot 4 cellen/s. Om deze beperking te bestrijden, wordt een nieuw concept van op celpopulatie gebaseerde feedbackgestuurde elektroporatie geïntroduceerd om pDNA-elektrotransfectie uit te voeren. Door gebruik te maken van een hypofysiologische geleidbaarheid elektroporatiebuffer, maakt dit systeem de elektrische ondervraging van afzonderlijke cellen mogelijk in een groot aantal elektroporatiepulstoepassingen. Op basis van de elektrische respons wordt vervolgens een 'optimale' elektroporatiepuls bepaald. Vervolgens wordt een 'high-throughput'-modus geïmplementeerd waarbij de bepaling van de celmembraanpermeabilisatie teniet wordt gedaan, het debiet wordt verhoogd en de duty cycle van de elektroporatiepuls wordt afgestemd op de transittijd van de cel om één puls per cel in transit tussen de elektroden te garanderen. Dit werk zal uitgebreide details geven over de microfabricagestappen voor de productie van het micro-apparaat, het materiaal / de apparatuur en hun opstelling die nodig is om de experimenten uit te voeren, en de werking / analyse van het apparaat en zijn elektrotransfectie-efficiëntie (eTE).
Figuur 1: Experimentele factoren die van invloed zijn op de uitkomsten van elektroporatie. (Links) Celsuspensie-Belangrijke factoren om te overwegen voorafgaand aan het begin van elektroporatie zijn: Payload (in dit geval pDNA), concentratie, celdichtheid en elektroporatiebuffereigenschappen. Elektroporatiebuffereigenschappen om te overwegen zijn geleidbaarheid, osmolariteit en de exacte moleculaire samenstelling die bijdraagt aan deze waarden. (Midden) Pulstoepassing - Het exacte pulstype (blokgolf versus exponentieel verval) en pulsgolfvorm (enkele puls versus pulstrein) moeten worden geoptimaliseerd om zowel de resulterende levensvatbaarheid van de cel als de efficiëntie van elektrotransfectie te maximaliseren. Gemeenschappelijke pulstreinen die worden geïmplementeerd in elektroporatieprocessen zijn meestal samengesteld uit een reeks hoogspanningspulsen (HV) of een reeks pulsen die roteren tussen HV- en laagspanningspulsen (LV). (Rechts) Cell Recovery-Down-stream verwerkingsstappen, in het bijzonder de recovery cell culture media waar cellen naar worden overgebracht, moeten worden geoptimaliseerd. Niet weergegeven (uiterst links), kunnen extra upstream celverwerkingsstappen worden geïmplementeerd voor algehele elektroporatieprocesoptimalisatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Gebruikers moeten alle VIB's controleren op de materialen en benodigdheden die in dit protocol worden gebruikt. Bij elke stap moeten geschikte PBM's worden gedragen en steriele technieken die tijdens experimenten worden gebruikt. In secties 1-7 wordt de fabricage van het apparaat besproken.
1. Fabricage van het apparaat - Maskerontwerp
OPMERKING: Zie figuur 2 voor een illustratie van het microfabricageproces. De microfabricagestappen moeten worden uitgevoerd in een cleanroomomgeving. Extra PBM's zijn nodig (haarnetje, gezichtshaarnetje, masker, cleanroompak, schoenovertrekken).
- Installeer een CAD-software naar keuze, ontwerp een 2-dimensionaal 'masker' van zowel het microfluïdische kanaal als de elektroden en sla het ontwerp op in het gewenste bestandsformaat (d.w.z. .dxf, .dwg).
OPMERKING: Raadpleeg Aanvullende figuur 1 voor een voorbeeld van een 2-dimensionaal maskerschema. - Stuur naar een leverancier naar keuze om te worden afgedrukt. Zorg ervoor dat de afmetingen van de ontwerpen binnen de resolutiemogelijkheden van de leverancier liggen.
2. Fabricage van apparaten - Fotolithografie
OPMERKING: De meegeleverde microfabricagerecepten zijn overgenomen van de aanbevelingen van de fabrikant van de fotoresisten en mogen alleen als uitgangspunt worden gebruikt34. Exacte waarden voor baktijden, belichtingstijden, enz., Moeten worden geoptimaliseerd voor elk fabricageprotocol. Het wordt aanbevolen om een waferpincet te gebruiken voor het hanteren van zowel siliciumwafers als glazen dia's.
- Microfluïdische kanaalfabricage
- Siliciumwafer en soda-kalkglas schuifreiniging: Volg stappen 2.1.2-2.1.3 om siliciumwafer en 1" × 3" soda-lime glasplaatreiniging uit te voeren (beide aangeduid als 'substraat').
- Dompel de substraten onder in een acetonbad, een isopropanol (IPA) bad en een gedeïoniseerd waterbad gedurende elk 10 minuten. Voer deze 3-staps was serieel uit bij kamertemperatuur.
- Verwijder en droog het oppervlak met behulp van een stikstof onder druk of gefilterde luchtgasbron. Plaats de substraten minimaal 30 minuten in een oven van 150 °C om verdamping van het resterende vocht mogelijk te maken.
- SU-8 fotolithografie op silicium wafer: Voer fotolithografie uit op de silicium wafer volgens stappen 2.1.5-2.1.14.
OPMERKING: Om een microfluïdische kanaalhoogte van 20 μm te bereiken, werd SU-8 2000-serie negatieve fotoresist gebruikt. Exacte spinsnelheden variëren afhankelijk van de formulering van SU-8 (d.w.z. 2010, 2015, enz.); de volgende voorwaarden zijn echter voor de SU-8 2010 formulering35. - Haal de siliconen wafer uit de oven van 150 °C en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur (RT).
- Bevestig de wafer aan de klauwplaat van de wafer spin coater met behulp van het vacuümsysteem van de spin coater. Programmeer de spinner. Stap 1 - 500 tpm voor 10 s bij een acceleratie van 100 tpm / s, stap 2 - 1000 tpm voor 30 s bij een acceleratie van 300 tpm / s.
- Doseer 4 ml SU-8 2010 fotoresist op het midden van de siliciumwafer. Voer het programma uit. Zodra het systeem tot stilstand komt, schakelt u de stofzuiger uit.
- Breng met een pincet de SU-8 gecoate siliciumwafer gedurende 4-5 minuten over op een hete plaat bij 95 °C voor zacht bakken. Haal vervolgens de wafer van de hete plaat en laat deze afkoelen tot RT.
OPMERKING: Volg de juiste opstartprocedure voor de labspecifieke fotolithografische maskeropstelling. - Bevestig het fotomasker met de 2D microfluïdische kanaalontwerpen op de maskerhouder. Plaats de siliciumwafer, met de SU-8-coating naar boven gericht, op de waferhouder.
- Stel de belichtingsinstellingen in op 150 mJ/cm2 en laat de machine draaien.
LET OP: Kijk niet direct naar de UV-lichtbron om mogelijke oogbeschadiging te voorkomen. - Plaats de SU-8 gecoate siliciumwafer op een hete plaat bij 95 °C gedurende 4-5 minuten voor het bakken na blootstelling.
- Dompel de siliciumwafer gedurende 3-4 minuten onder in de SU-8 developer solution (zie Materiaaltabel). Breng zachte agitatie aan. Verwijder de wafer uit de oplossing en spoel het oppervlak af met IPA.
- Droog het oppervlak met behulp van een stikstof onder druk of gefilterde luchtgasbron. Inspecteer de functies onder een microscoop met behulp van een UV-filter en zorg ervoor dat er geen duidelijke defecten in de microfluïdische kanalen zijn.
- Zet de siliciumwafel minimaal 30 min in een oven van 150 °C voor een harde bak.
- Laat afkoelen tot RT en gebruik stylus profilometrie om de exacte hoogte en helling van de zijwanden van het kanaal te meten.
- Fotolithografie op glasdia's
OPMERKING: Hexamethyldisilazane (HMDS) wordt gebruikt als adhesiebevorderaar voor de S1818 positieve fotoresist36.- Haal de glasschuif uit de oven van 150 °C en laat deze afkoelen tot RT.
- Bevestig de glazen schuif met behulp van vacuüm aan de klauwplaat van de spinner en programmeer de spinner. Stap 1 - 500 tpm gedurende 10 s bij een acceleratie van 100 tpm / s. Stap 2 - 3000 tpm voor 30 zat een versnelling van 300 rpm / s.
- Doseer 3-4 druppels HMDS over het oppervlak van de glasplaat. Voer het programma uit.
OPMERKING: Om een oppervlaktecoating van ~ 3 μm te bereiken, moet S1800 positieve fotoresist-serie worden gebruikt. Exacte spinsnelheden variëren afhankelijk van de formulering; de onderstaande aanbevelingen zijn voor de S1818-formulering34. - Doseer 1 ml fotoresist op het oppervlak van de glasplaat. Zorg voor voldoende om het oppervlak te bedekken.
- Voer het programma uit. Zodra het systeem tot stilstand komt, schakelt u het vacuüm uit en verwijdert u de glazen schuif.
- Plaats de S1818 gecoate glasschuif op een hete plaat op 120 °C gedurende 4 minuten voor een zachte bakbeurt. Verwijderen en laten komen naar RT.
- Bevestig het fotomasker met de 2D-elektrodeontwerpen op de maskerhouder.
- Plaats en lijn de glasschuif, met de S1818-coating naar boven gericht, op de waferhouder. Stel de belichtingsinstellingen in op 250 mJ/cm2 en laat de machine draaien.
OPMERKING: Verschillende contact alignermodellen kunnen min of meer geschikt zijn voor niet-cirkelvormige substraten van verschillende dikte. - Dompel de glazen schuif onder in de MF-319 developer-oplossing gedurende 2 minuten. Breng zachte agitatie aan. Spoel het oppervlak van de glasplaat af met gedeïoniseerd water.
- Droog het oppervlak met behulp van een stikstof onder druk of gefilterde luchtgasbron en observeer de kenmerken onder een microscoop met behulp van een UV-filter. Zorg ervoor dat er geen duidelijke defecten zijn in de lithografische patronen.
- Plaats de glasglaas in de oven van 150 °C en zorg ervoor dat het substraatoppervlak naar boven is gericht, gedurende minimaal 30 minuten voor een harde bakbeurt. Haal uit de oven en bescherm tegen licht.
3. Fabricage van het apparaat: Fluorwaterstofzuur (HF) ets
LET OP: Deze stap omvat de behandeling en verwijdering van fluorwaterstofzuur (HF), dat diepe, pijnlijke chemische brandwonden kan veroorzaken. Extra PBM's moeten worden gebruikt om de handler te beschermen (gezichtsscherm, chemisch resistente handschoenen over ellebooglengte, chemisch resistent schort met mouwen). Calciumgluconaatzuur neutralisator en huidgel moeten in de buurt van de laboratoriumbank worden gehouden. Deze stap mag niet alleen worden uitgevoerd. HF mag nooit worden opgeslagen in of afgegeven in glazen containers, omdat de container door het zuur wordt geëtst.
OPMERKING: De HF etst het blootgestelde glas (d.w.z. het elektrodeontwerp) gelijkmatig om een uitsparing in het glas te vormen, waardoor een betere randresolutie van het elektrodepatroon na metaalafzetting mogelijk is (sectie 4).
- Dompel de glasschuif gedurende 1 minuut onder in een 10:1 gebufferde HF-oplossing in een polytetrafluorethyleencontainer. Breng de glasglijbanen over en was ze in gedeïoniseerd water. Herhaal de wasstap 3 keer.
- Droog het oppervlak met behulp van een stikstof onder druk of gefilterde luchtgasbron. Plaats glazen substraten een nacht in een oven van 65 °C om eventueel achtergebleven vocht te verwijderen. Bedek de substraten tegen licht.
4. Fabricage van het apparaat: fysieke dampafzetting
OPMERKING: Deze stap omvat de metaalafzetting op de glasschrastraten om de elektrodepatronen te definiëren. Veelgebruikte metaalelektroden zijn chroom/goud en titanium/platina. Goud en platina hechten zich niet aan het glazen substraat, dus een zaadhechtingslaag van respectievelijk chroom of titanium is vereist om adhesie37 te bevorderen.
- Volg het cleanroom-specifieke protocol om het interne PVD-systeem te bedienen. Dit werk maakt gebruik van een DC sputtersysteem en sputter met 100 SCCM Argon gas bij een druk van ~8 mTorr en 200 W vermogen.
- Sputter titanium gedurende 8 minuten met een snelheid van ~100 Å/min. Sputter platina gedurende 10 minuten met een snelheid van ~200 Å/min. Verwijder de substraten uit de PVD-kamer.
5. Fabricage van het apparaat: Photoresist lift-off
OPMERKING: Deze stap omvat het oplossen van de fotoresistlaag in een acetonbad, waardoor de gehechte platina-elektroden op de glazen dia's worden achtergelaten.
- Dompel de met metaal beklede glasglijbanen gedurende ~ 10 minuten onder in een acetonbad.
- Soniceer het bad om agitatie te introduceren om de niet-geherdeed metalen film te breken. Gebruik een met aceton doordrenkt doekje om eventuele resten indien nodig te verwijderen.
- Zodra alle fotoresist/metaal is verwijderd, wast u de elektrodepatronen met gedeïoniseerd water en plaatst u ze 's nachts in een oven van 65 °C om het resterende oppervlaktevocht te verwijderen.
- Gebruik stylusproilometrie om het profiel van de patroonelektroden te meten.
6. Fabricage van het apparaat: zachte lithografie
OPMERKING: Deze stap omvat het replicagieten van het microfluïdische kanaal op de SU-8 masterreliëfstructuur met behulp van een elastomeer, polydimethylsiloxaan (PDMS).
- Silicium wafer silanisatie
OPMERKING: Dit is een optionele stap; het zal echter de levensduur van de SU-8-reliëfstructuur die in subsectie 2.1 is vervaardigd, verlengen. Deze stap moet worden uitgevoerd in een chemische zuurkast.- Bevestig de wafel aan de bodem van een petrischaal en plaats de petrischaal in een exsiccator.
- Omring de omtrek van de siliciumwafer met ongeveer 50 μL trichlooriso (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silaan. Sluit vacuüm (vacuümpomp of huisvacuümleiding) aan en laat 20 minuten draaien.
- PDMS replica molding
- Meng in een wegwerpcontainer (bijv. weegboot, plastic beker) PDMS-elastomeerbasis tot verharder met een gewichtsverhouding van 10: 1 bovenop een elektronische balans. Giet de PDMS-oplossing over de siliciumwafer en plaats het mengsel onder een vacuüm om alle luchtbellen te verwijderen.
- Uitharden bij 65 °C gedurende minimaal 4 uur waardoor het PDMS kan stollen. Snijd met behulp van de punt van een scheermesje het gegoten PDMS uit en schil uit de siliciumwafer.
- Verwijder met behulp van een geslepen biopsiepunch PDMS uit de in- / uitlaten van het apparaat. Voor dit apparaat werden respectievelijk 0,75 mm en 3 mm biopsieponsen gebruikt voor de inlaten en de uitlaten.
OPMERKING: De gebruikte biopsiepons moet een iets kleinere diameter hebben dan de buitendiameter van de onderling verbonden buis om een strakke afdichting van buizen in de reservoirs te garanderen.
- Sonicatie reiniging van PDMS
- Dompel de PDMS-apparaten onder in IPA en plaats ze gedurende 30-45 minuten in een sonicator om PDMS-vuil van de inlaat / uitgangen te verwijderen. PDMS kan opzwellen in de IPA-oplossing.
- Spoel af met gedeïoniseerd water en plaats een nacht in een oven van 65 °C om het PDMS weer te laten opzwellen tot de normale grootte.
OPMERKING: Eventuele restjes kunnen het apparaat tijdens het experimenteren verstoppen. Grote stukken puin kunnen van het PDMS-oppervlak worden verwijderd met behulp van een stuk plakband voorafgaand aan ultrasoonapparaat.
7. Fabricage van het apparaat: PDMS-binding / draadbevestiging
OPMERKING: Deze stap omvat het behandelen van het oppervlak van het PDMS en het glazen substraat met een zuurstofplasma om een onomkeerbare binding te vormen tussen het PDMS en glas38. Het kan nodig zijn om het verstrekte recept aan te passen aan het exacte systeem dat in het laboratorium wordt gebruikt.
- Snijd de apparaten op maat en zorg ervoor dat het oppervlak van het PDMS-apparaat schoon is. Als u niet opnieuw reinigt, volgt u de stappen in subsectie 6.3.
- Programmeer de plasmagenerator. Stel vermogen in op 70 W, tijd op 35 s, druk op 325 mTorr, stroomsnelheid van zuurstofgas op 60 SCCM. Plaats PDMS en elektrode glas schuif in het systeem met de functies naar boven gericht en voer het programma uit.
- Verwijder de apparaten en lijn snel kanaalfuncties uit op de elektroden met behulp van een stereoscoop. Oefen stevig druk uit vanuit het midden van het PDMS naar de zijkanten om ongewenste luchtbellen op de verlijmingsinterface te verwijderen.
- Plaats op een hete plaats bij 95 °C gedurende ten minste 2 minuten om de hechtingsprocedure af te ronden en laat het apparaat afkoelen bij RT.
- Knip 2 stukken 22-G massieve draad op ~ 6 "lengtes en strip de isolator van beide uiteinden.
- Verlijm de draden aan elektrodepads met behulp van zilvergeleidende epoxy. Plaats de afgewerkte apparaten 's nachts in een oven van 65 °C.
Figuur 2: Fabricage van microdevice. (A) Microfluïdische kanaalfabricage- Belangrijkste stappen: siliciumwaferreiniging (stappen 2.1.1-2.1.3), fotoresistcoating en zachte bak (stappen 2.1.7-2.1.8), UV-blootstelling (stap 2.1.10), ontwikkeling (stap 2.1.12) en PDMS-gieten (subsectie 6.2). (B) Elektrodefabricage-Belangrijkste stappen: glasglijden reinigen (stappen 2.1.1-2.1.3), HMDS-coating en fotoresistcoating (stappen 2.2.3-2.2.4), UV-blootstelling (stap 2.2.8), ontwikkeling (stap 2.2.9), HF-ets (sectie 3), fysieke dampafzetting (sectie 4) en fotoresist lift-off (sectie 5). (C) Stappen voor apparaatafrondingssleutel: toegang tot inlaat-/uitlaatopening en ultrasoonapparaat (stap 6.2.3 en paragraaf 6.3), PDMS-binding en draadbevestiging (sectie 7). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
8. Celkweek en oogst
OPMERKING: Standaard celkweek en steriele behandelingsprocedures moeten worden gebruikt. Volg het celtypespecifieke protocol voor celkweek.
- Celkweek
- Celpassage: Kweek en passeer de cellen volgens de stappen 8.1.2-8.1.5.
- Kweek HEK293-cellen in complete DMEM-oplossing (88% DMEM, 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 1% L-glutamine, 1% penicilline-streptomycine) in een T25-kolf in een couveuse bij 37 °C, 95% O2, 5% CO2. Passagecellen op schema bij het bereiken van ~80% samenvloeiing.
- Ontlucht de media met behulp van een pipet of vacuümsysteem en incubeer de cellen in 0,25% trypsine-EDTA (2 ml-T25 kolf) gedurende 2 minuten bij 37 °C. Neutraliseer trypsine met tweemaal het volume van cultuurmedia.
- Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer HEK293-cellen bij 770 x g gedurende 2 minuten. Aspirateer het supernatant met behulp van een pipet of vacuümsysteem
- Resuspend HEK293 cellen in 1 ml voorverwarmde DMEM.
- Cell plating: Plaats de cellen volgens de stappen 8.1.7-8.1.8
- Plaats de cellen in een verdunning van 10:1 tot 20:1 in een T25-kolf (5 ml DMEM) om de kweek voort te zetten.
- Plaats de cellen op een verdunning van 5:1 tot 20:1 in een 6-well plaat (2 ml DMEM per put) die moet worden geoogst voor elektroporatie-experimenten.
OPMERKING: HEK293-cellen verguld 24 uur voorafgaand aan elektroporatie-experimenten om ~ 70% confluentie te bereiken bij celoogst (subsectie 8.3). Een inconsistent oogstschema kan leiden tot variabiliteit in elektroporatieresultaten.
- Elektroporatiebuffer
- Elektroporatiebuffer voorbereiden
OPMERKING: Raadpleeg Sherba et al. voor details over het elektroporatiebufferpreparaat8. De buffersamenstelling was 285 mM Sucrose, 0,7 mM MgCl2, 1 mM KCl, 10 mM HEPES, 3 mM NaOH (pH: 7,4; osmolaliteit: 310 mOsm, geleidbaarheid: 500 μS/cm). De elektroporatiebuffer moet steriel worden geformuleerd en bij 4 °C worden bewaard gedurende een houdbaarheid van ~1 maand. De formulering van de elektroporatiebuffer moet per celtype worden geoptimaliseerd.
- Elektroporatiebuffer voorbereiden
- Celoogst en pDNA-toevoeging
- Volg dezelfde stappen als celpassage (8.1.2-8.1.4).
- Was de cellen in steriele 1x PBS, transfer-cel suspensie in een conische buis van 15 ml en centrifugeer cellen op 770 x g gedurende 2 min.
- Was HEK293 cel pellet in de elektroporatie buffer en centrifuge op 770 x g gedurende 2 min. Resuspendeer de cellen in de elektroporatiebuffer op ~ 5 miljoen cellen / ml.
OPMERKING: De celdichtheid moet per celtype worden geoptimaliseerd. - Voeg pDNA-codering voor groen fluorescerend eiwit (GFP) toe aan een eindconcentratie van 20 μg/ml. Meng voorzichtig de pDNA/celsuspensie en breng de suspensie over in een spuit van 1 cc om te experimenteren.
9. Hardware/experimentele installatie
OPMERKING: Voordat u cellen oogst voor experimenten, moet u ervoor zorgen dat de experimentele opstelling is voltooid om de hoeveelheid tijd dat de cellen in de elektroporatiebuffer zijn opgehangen te minimaliseren. Schakel elektronica 20-30 minuten voorafgaand aan experimenten in om op te warmen. Zie figuur 3 voor een schema van de experimentele opstelling voor de werking van de eencellige detectiemodule.
OPMERKING: Een op maat gemaakt PA90 Op-Amp-circuit is ontwikkeld om tegemoet te komen aan zowel de gevoeligheid die nodig is voor eencellige niveaudetectie met behulp van de lock-in versterker als de hoge spanningen die nodig zijn om voldoende sterke elektroporatiepulsen toe te passen. Raadpleeg het GEGEVENSBLAD PA90 voor specificaties over aanbevolen circuits39.
- Initialiseer de lock-in versterker met de huidige voorversterkerinstellingen en stel deze in via het algoritme. Raadpleeg Zheng et al. voor meer informatie over de lock-in instellingen32.
- Voedingen, functiegenerator en versterker
- Voeding 1: Stel in op -15 V om het negatieve uiteinde van het circuit van stroom te voorzien.
- Voeding 2 (functiegenerator): Stel in op het dc-signaal en stel de amplitude in op 2 V. Sluit aan op 50x versterkeringang.
- Programma Electroporation Pulse Generator voor de blokgolf: Stel de gewenste pulsbreedte (duty cycle) en gewenste pulsamplitude (Volt) in.
- Stel de uitvoer in op de triggermodus (1 puls). Sluit de uitgang aan op de ingang van de 50x versterker.
OPMERKING: Onthoud de 50x versterking bij het programmeren van de pulsamplitude. D.w.z. om een elektrische veldsterkte van 1 kV/cm te bereiken, is in totaal 30 V vereist, 30 V/300 μm (afstand tussen elektroden), daarom moet de uitgang van de functiegenerator worden ingesteld op 30/50 of 600 mV. - Controleer de uitgangen van de 50x-versterker met behulp van een oscilloscoop. Uitgang 1-100 V van voeding 2 (9.2.2). Uitgang 2-Variabele amplitude voor de elektroporatiepuls (9.2.4).
- Sluit een 10x-sonde aan op een oscilloscoopkanaal en op het voltooide micro-apparaat (apparaat in test, DUT) in stap 7.6 waar de elektroporatiepuls wordt toegepast. Bewaak het systeem tijdens het experimenteren om ervoor te zorgen dat pulsen worden toegepast.
- Zorg ervoor dat lock-in USB is aangesloten en geregistreerd. Controleer alle lock-in-instellingen in de algoritmecode (vooral de uitgangsfrequentie van de lock-in).
- Microscoop/CCD camera
- Plaats het micro-apparaat op het podium van de microscoop via een diahouder. Schakel de CCD-camera in en breng het microfluïdische kanaal in beeld. Gebruik een 4x of 10x objectief.
Figuur 3: Experimenteel installatieschema-Detectie van één cel. De krachtige op-amp (PA-90) maakt de superpositie van de hoogspanningselektroporatiepuls op het lock-in Output AC-signaal mogelijk dat nodig is voor de detectie van één cel. Dit excitatiesignaal passeert het micro-elektroporatieapparaat (Device Under Test, DUT) waar de stroom vervolgens wordt versterkt door de huidige voorversterker en in het algoritme wordt ingevoerd. Het systeem controleert continu op de celdetectiegebeurtenis. Bij binnenkomst van de cel wordt een digitaal signaal gegenereerd door de lock-in versterker om de toepassing van de elektroporatiepuls op de cel (en) in transit te activeren. Legenda: PA-90 (high power op amp), DUT (apparaat onder test), DIO (digitale input/output), FG-EP (functie generator / elektroporatiepuls), 50X (50X versterker), PS-V- (voeding / negatieve spanning voor PA 90), FG-V+ (Function Generator, positieve spanning voor PA 90). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
10. Experimentele werking
- Microfluïdische kanaalaanzuigen
- Verwijder alle luchtbellen uit de spuit met cellading. Bevestig een naald van 30 G aan de spuit met cellading.
- Schuif met behulp van een pincet de tygonbuizen over de lengte van de naald naar beneden. Vul het uitlaatreservoir vooraf met herstelmedia (hetzelfde als stap 8.1.2 zonder de antibiotica), ~40-50 μL.
- Oefen met de duim voorzichtig druk uit op de zuiger, zodat de vloeistof langzaam het einde van de buislijn bereikt.
- Bevestig de spuit aan de spuitpomp. Zet de pomp van de spuit aan en zorg ervoor dat deze is ingesteld op forward perfusie.
- Programmeer de pomp voor de juiste diameter van de spuit om ervoor te zorgen dat de stroomsnelheden nauwkeurig zijn. Raadpleeg de handleiding van de pomp voor meer informatie over spuitdiameters.
OPMERKING: Om te voorkomen dat cellen zich in de spuit nestelen, bevestigt u de spuitpomp op een klemstandaard zodat deze in een verticale positie kan werken met het uiteinde van de spuit naar beneden gericht. - Stel het debiet van de spuitpomp in, ~10-20 μL/min, en laat de pomp draaien totdat de vloeistof het einde van de slanglijn bereikt. Bevestig de slang aan het microfluïdische apparaat.
- Verlaag het debiet van de spuitpomp, ~ 5-10 μL / min, en laat de pomp draaien totdat alle lucht uit het microfluïdische apparaat is verdreven en cellen naar de uitlaat van het apparaat gaan.
- Verwijder de cellen uit de uitlaat via pipetaspiratie. Vul het uitlaatreservoir opnieuw met herstelmedia (hetzelfde als stap 8.1.2 zonder de antibiotica), ~40-50 μL.
- Single-cell electroporation-cell membraanpermeabilisatie mapping
OPMERKING: Zie figuur 4 en figuur 5 voor een beter begrip van de elektrische gegevens die respectievelijk wijzen op celmembraanpermeabilisatie en de celmembraanpermeabilisatiemapping.- Stel het debiet van de spuitpomp in op ~0,1-0,3 μL/min om een stroom van afzonderlijke cellen door de elektrodeset te garanderen. De celdoorgangstijd tussen de elektroden moet ~250 ms zijn.
- Start het computerprogramma door op Uitvoeren te klikken. Zorg ervoor dat het systeem de elektrische gegevens opslaat.
- Zorg ervoor dat het systeem op betrouwbare wijze cellen detecteert om de computergestuurde pulstoepassingen te activeren. Pas de detectiedrempel dienovereenkomstig aan.
- Stel de pulsparameters in voor de initiële elektroporatiepuls met de laagste elektrische energie. Raadpleeg tabel 1 voor elektroporatiepulsparameters in dit onderzoek.
- Schakel het uitgangskanaal voor de elektroporatiepulsgenerator in (stap 9.2.3.).
- Volg een vooraf bepaald aantal celdetectie-/pulstoepassingen (n =100). Aan het einde van elke geteste toestand ademt u cellen uit de microdevice-uitgang en vult u de uitlaat aan met herstelmedia.
- Herhaal naar de volgende elektroporatiepulstoestand. Herhaal dit totdat alle elektroporatiepulscondities zijn getest.
- Bepaal de mate van celmembraanpermeabilisatie voor elke geteste pulstoepassing. (Validatie na het proces wordt beschreven in subsectie 11.1). Genereer de celmembraanpermeabilisatiekaart (figuur 5).
- Bepaal de elektroporatiepulsparameters voor populatiegebaseerde feedback met hoge doorvoer.
- Schakel de spuitpomp uit, verwijder cellen uit het uitlaatreservoir en vul de uitlaat aan met herstelmedia.
- Populatiegebaseerde feedbackgestuurde elektroporatie - hoge doorvoer
OPMERKING: Raadpleeg figuur 6 voor een schema dat het op populatie gebaseerde feedbackproces illustreert.- Stel het debiet van de spuitpomp in op ~1-3 μL/min om een stroom van afzonderlijke cellen door de elektrodenset te garanderen. De celdoorgangstijd tussen de elektroden moet ~25 ms zijn.
- Stel de pulsamplitude in op de 'geoptimaliseerde' toestand (10.2.9), schakel de triggermodus uit en stel de pulsbreedte in op de transittijd van de cel.
- Stel de taakcyclus zo in dat de AAN-tijd van de puls overeenkomt met de 'geoptimaliseerde' toestand. Zie tabel 1.
- Stel de uitgangskanaalfunctiegenerator in op AAN, schakel de spuitpomp in en laat het systeem draaien totdat het gewenste aantal cellen is geëlektropoeerd.
- Als u klaar bent, schakelt u zowel de spuitpomp als de functiegenerator uit.
- Breng de cellen van het uitlaatreservoir over in de celkweekkolf/-plaat van de juiste grootte gevuld met voorverwarmde herstelmedia en breng de kweekkolf/-plaat over in de incubator.
11. Analyse
- Detectie van membraanpermeabilisatie op eencellig niveau
OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de 'optimale' puls werd gebruikt tijdens de module met hoge doorvoer, moet een analyse na het experiment worden uitgevoerd om de elektrische gegevens te verifiëren die uit subsectie 10.2 zijn geëxporteerd. Zie figuur 4 voor een grafische weergave van het elektrische signaal dat representatief is voor membraanpermeabilisatie als gevolg van elektroporatie.- Laad gegevens in een analysesoftware (MATLAB, Python, enz.). Genereer een plot van Huidig versus Tijd voor elke pulserende toestand.
- Bepaal handmatig de mate van celmembraanpermeabilisatie (ΔIP / ΔIC). Zie figuur 4. Genereer de celmembraanpermeabilisatiekaart (ΔIP / ΔIC versus elektrische energie, figuur 5) over alle geteste pulsomstandigheden. Controleer de 'optimale' pulserende toestand.
- elektrotransfectie-efficiëntie (eTE)
- Verwijder na de incubatietijd van 24 uur de geëlektropoeerde cellen uit de incubator.
- Voer een live celvlek uit. Verdun DRAQ5 1:1000 tot een eindconcentratie van 5 μM in het celkweekvat. Meng de cellen/kleuringsoplossing voorzichtig en incubeer bij 37 °C gedurende 5-30 minuten.
OPMERKING: In deze stap kan een andere vlek worden geïmplementeerd. Zorg ervoor dat de fluorescerende eigenschappen niet overlappen met de fluorescerende marker die een succesvolle elektrotransfectie aangeeft (d.w.z. GFP bevindt zich in de groene golflengte en DRAQ5 is verrood). - Schakel een epifluorescente microscoop, lamp en camera's in (zie Materiaaltabel).
- Verwijder de cellen uit de couveuse en breng ze in beeld op de microscoop.
- Leg een fasecontrastafbeelding (brightfield) van het geselecteerde veld vast.
- Leg epifluorescente beelden van hetzelfde veld vast met FITC (GFP) en Far-Red (DRAQ5) filters. Analyseer de beeldsets handmatig of via een algoritme.
OPMERKING: Raadpleeg figuur 7 voor representatieve afbeeldingen. - Tel het totale aantal GFP-positieve cellen in alle afbeeldingen. Tel het totale aantal DRAQ5-gekleurde cellen in alle afbeeldingen. Bereken eTE (verhouding van GFP-positieve cellen tot DRAQ5-gekleurde cellen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 4 belicht de werkingsprincipes achter de membraanpermeabilisatiedetectie op één celniveau voor een enkele pulsamplitude. Na de start van het elektroporatie-experiment bepaalt het celdetectiealgoritme een optimale drempel voor celdetectie via een puntsgewijze, op helling gebaseerde detectiemethode. Het systeem controleert vervolgens continu (1) op een significante negatieve verandering in de gemeten elektrische stroom, die indicatief is voor het binnendringen van een cel. Dit komt door de isolerende aard van het biologische celmembraan, zodanig dat wanneer de cel door de elektrodeset reist, er een onmiddellijke toename van de impedantie is, wat resulteert in een scherpe afname van de gemeten stroom, waardoor consistente celdetectie mogelijk is (2), wat uiteindelijk de omschakeling naar de computergestuurde pulstoepassing activeert (4). De geïsoleerde cel verplaatst een volume elektrolyt tussen de elektroden, wat resulteert in een stroomval die evenredig is met de grootte van de cel. Deze verandering in stroom wordt aangeduid als ΔIC (3). Onmiddellijk na de berekening van ΔIC wordt de vooraf bepaalde elektrische puls (4) toegediend aan de cel in transit. Deze onmiddellijke instroom van energie introduceert een kort detectie-artefact in het systeem (grijze doos). Bij het opnieuw vergrendelen van het signaal, d.w.z. terugschakelen naar celmonitoring, (5) is het duidelijk dat de elektroporatiepuls het celmembraan permeabiliseerde als de grootte van de stroomverandering als gevolg van de aanwezigheid van de cel tussen de elektrodeset daalt bij uitgang (6). Het verschil in de twee druppels in stroom als gevolg van de impedantie magnitude pre / post elektroporatie pulstoepassing wordt de permeabilisatiestroom genoemd en wordt aangeduid als ΔIP. Zodra de cel het volume tussen de elektroden verlaat, stabiliseert de basislijn en keert het systeem terug naar de celdetectiemodus (1). Nadat een vooraf bepaald aantal cellen is geëlektropoeerd, wordt de op een na hoogste energie-elektroporatiepuls getest (zie tabel 1 voor pulsinstellingen). Voor elke geteste elektroporatiepuls wordt een gemiddelde 'mate van membraanpermeabilisatie' bepaald. Deze waarde wordt berekend als ΔIP/ΔIC. Zodra elke vooraf bepaalde elektroporatiepuls is getest, wordt de ΔIP/ΔIC uitgezet tegen de toegepaste elektrische energiedichtheid (σ x E2 x t), waarbij σ de oplossingsgeleidbaarheid (S/cm) is, E de elektrische veldsterkte (kV/cm) en t de pulsduur (ms). Zie figuur 5 voor de celmembraanpermeabilisatiekaart voor HEK293-cellen die in dit voorbeeld wordt gebruikt.
Tabel 1: Elektroporatiepulsparameters. Voor deze studie werden elektroporatiepulsen zodanig gekozen dat de ladingsflux (σ×E×t) constant blijft, waarbij σ de oplossingsgeleiding (S/cm) is, E de elektrische veldsterkte (kV/cm) en t de pulsduur (ms). Het resultaat is een spectrum van de toegepaste elektrische energie van de puls. Voorbeelden van de vereiste duty cycle (d.c.) om de gespecificeerde pulsparameters te bereiken, worden gegeven voor zowel een 5× als 10× toename van het initiële (single-cell-detection) debiet. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Figuur 4: Single cell membrane permeabilization - Algoritme operatie. (Naar boven) Elektrische opname van een reeks eencellige detecties / pulstoepassingen (aangegeven door de scherpe pieken in stroom). (Onder) Systeembediening voor de detectie en pulsering van een enkele cel. (1) Het systeem detecteert continu een verandering in de stroom, via een punt-voor-punt hellingsberekening. (2) Er wordt een sterke afname van de helling gedetecteerd, wat wijst op het binnendringen van een cel tussen de elektroden en de computergestuurde pulstoepassing activeert. (3) Een stroomdruppel (ΔIC) wordt bepaald en is evenredig met de grootte van de cel. (4) De elektroporatiepuls wordt toegepast op de cel tijdens het transport, waardoor een detectieartefact in het elektrische signaal (grijze doos) ontstaat. (5) De lock-in versterker schakelt terug naar celbewaking terwijl deze opnieuw wordt vergrendeld in de cel tijdens het transport. (6) De cel verlaat de elektrodenset, waardoor een andere piek in de stroom van een kleinere magnitude ontstaat (ΔIC > (I6 - I5)). Het verschil in de impedantiemetingen is te wijten aan porievorming door het geïsoleerde celmembraan. Deze verandering in stroom wordt de permeabilisatiestroom (ΔIP) genoemd. De mate van celmembraanpermeabilisatie wordt berekend (ΔIP/ΔIC). De basislijn stabiliseert en het systeem keert terug naar de detectiemodus (1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Er wordt een duidelijke correlatie waargenomen tussen de toegepaste elektrische energie en de mate van celmembraanpermeabilisatie (figuur 5), met het bestaan van een overgangsgebied waar een aanzienlijke toename van de mate van celmembraanpermeabilisatie optreedt. Daartoe wordt een puls met elektrische energie geselecteerd die dit overgangsgebied overtreft voor de high-throughput fase van het micro-elektroporatieproces (figuur 6). In dit experiment werd de 1,8 kV/cm:670 μs puls als 'optimaal' bepaald. Zoals in detail is beschreven in subsectie 10.3 van het protocol, wordt het systeemdebiet verhoogd en wordt de functiegenerator ingesteld om continu een puls uit te voeren met een ingestelde puls- en duty cycle (zie tabel 1 voor pulsinstellingen voor 1,5 μL/min en 3,0 μL/min debieten) om ervoor te zorgen dat 1 puls wordt toegepast op elke cel tijdens het transport. In deze studie werd het debiet met 5x verhoogd, waardoor de pulsbreedte werd ingesteld op 50 ms (overeenkomend met de celtransittijd) bij een duty cycle (dc) van 2,7%.
Figuur 5: HEK293 celmembraanpermeabilisatie mapping -ΔIp/ ΔIc versus elektrische energie. De elektrische gegevens (ΔIP/ ΔIC) worden weergegeven als de Gemiddelde ± SEM. Pulserende omstandigheden (van links naar rechts)- 0,4 kV/cm : 3 ms, 0,8 kV/cm : 1,5 ms, 1,0 kV/cm : 1,2 ms, 1,2 kV/cm : 1 ms, 1,8 kV/cm : 0,67 ms, 2,4 kV/cm : 0,5 ms. Er wordt een duidelijke correlatie waargenomen tussen de mate van celmembraanpermeabilisatie en de elektrische energiedichtheid van de toegepaste puls. Voor deze experimenteerronde werd de 1,8 kV/cm: 0,67 ms pulserende toestand geselecteerd als de 'optimale' elektroporatiepuls voor de high-throughput module. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Celpopulatie-gebaseerde feedback-gecontroleerde elektroporatie-Proces workflow. Om te beginnen wordt een initieel debiet geprogrammeerd (Q0) om elektrische ondervraging op één celniveau mogelijk te maken. Een programmeerbaar aantal cellen wordt gepulseerd bij elke vooraf bepaalde elektroporatiepulsingscondities (E0/t0 tot EN/tN), waarbij de toegepaste elektrische energie toeneemt met elke iteratie van elektroporatiepulstoepassingen. Na de voltooiing van de hoogste elektrische energiepuls die in de studie is opgenomen, EN / tN, wordt de celmembraanpermeabilisatiecurve uitgezet en wordt de optimale elektroporatiepuls bepaald voor de te testen celpopulatie. Het systeem gaat naar de high-throughput-modus, waarbij de stroomsnelheid wordt verhoogd totQ-doorvoer en de snelheidsbeperkende ondervragingsstappen met één cel worden weggelaten. De optimale pulstrein zal continu worden toegepast Eopt / topt op d.c.opt, zodat elke cel in transit een enkele elektroporatiepuls ontvangt op basis van de celtransittijd en de pulsbreedte duty cycle (d.c.). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Na 24 uur post-elektroporatieherstel werden de cellen in beeld gebracht om de elektrotransfectie-efficiëntie (eTE) te bepalen. Zoals beschreven in subsectie 11.2 van het protocol, werd de eTE bepaald als het totale aantal cellen dat GFP tot expressie brengt, genormaliseerd tot het totale aantal cellen gekleurd met DRAQ5. De eTE voor de puls van 1,8 kV/cm : 670 μs werd bepaald op ~70% (figuur 7A). Om het belang van het systeem te benadrukken om de mate van celmembraanpermeabilisatie nauwkeurig in kaart te brengen en een voldoende hoge elektroporatiepulsenergie te selecteren bij de overgang naar de high-throughput-modus, werd de 0,4 kV / cm: 3 ms pulsconditie ook onderzocht in termen van eTE (figuur 7B). In dit geval was de resulterende eTE na 24 uur minder dan 5%.
Figuur 7: elektrotransfectie-efficiëntie-GFP-expressie na 24 uur. HEK293-cellen werden gedurende 24 uur geïncubeerd bij 37 °C na micro-elektroporatie-experimenten. Alle cellen werden gekleurd met DRAQ5 (rood) en de elektrotransfectie-efficiëntie (eTE) werd bepaald op basis van de verhouding van cellen die GFP (groen) tot expressie brengen tot het totale celnummer (rood). De levensvatbaarheid van cellen werd in deze studie niet beoordeeld als uitkomstmaatstaf. (A) Representatief, gestapeld 4× fluorescentiebeeld van HEK293-cellen die met succes zijn getransfecteerd via een puls van 1,8 kV/cm: 670 μs met eTE van ongeveer 70%. (B) Representatief, gestapeld 4× fluorescentiebeeld van HEK293-cellen die zonder succes zijn getransfecteerd via een puls van 0,4 kV/cm: 3 ms met eTE << 5%. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 1: 2-dimensionaal CAD-schema. Het micro-elektroporatieapparaat bestaat uit een recht, 100 μm breed microkanaal met een inlaat met een diameter van 1 mm en een uitlaat met een diameter van 3 mm. Elk elektrodespoor is 100 μm breed en de elektrodenset omvat het elektroporatiegebied van het apparaat, dat 300 μm lang is. De 3-dimensionale hoogte van het microkanaal wordt bepaald door de dikte van de fotoresist. In dit werk was de hoogte van het apparaat 20 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methodologie die in dit protocol wordt gepresenteerd, richt zich voornamelijk op de microfabricage van een microfluïdisch apparaat dat vervolgens wordt geïntegreerd in een gespecialiseerde elektroporatie-experimentele opstelling. De term 'recept', die vaak wordt gebruikt bij het beschrijven van de specifieke kenmerken van het microfabricageproces, wijst op het belang van het volgen / optimaliseren van elke stap om een werkend apparaat met succes te fabriceren. Bepaalde kritieke stappen binnen het proces, wanneer ze niet zijn geoptimaliseerd, zoals UV-blootstellingstijd / energie, PVD-sputtersnelheden / -duur en zuurstofplasmageneratorinstellingen, kunnen echter problematisch zijn voor zowel het fabricageproces als de succesvolle uitvoering van de elektroporatie-experimenten. Het oplossen van problemen met het fabricageproces gebeurt voornamelijk met vallen en opstaan of een meer gecontroleerd experimenteel ontwerp van het ontwerp van experimenten. Bovendien zijn er alternatieve microfabricagetechnieken, zoals Deep Reactive Ion Etching (DRIE), die kunnen worden vervangen om de verschillende stappen binnen het protocol uit te voeren (d.w.z. met behulp van een DRIE-geëtste gietstructuur om het zachte lithografieproces uit te voeren). Bovendien kan het optimaliseren van recepten en het ontwerpen / fabriceren van apparaten tijdrovend zijn voor beginners in het veld. Zodra het microfabricageproces echter met succes is ontwikkeld, heeft de ingenieur / wetenschapper de vrijheid om een apparaat te ontwerpen dat geschikt is voor hun specifieke behoeften.
Daartoe is het apparaat dat in dit protocol wordt beschreven ontwikkeld om ons eerdere werk uit te breiden32. Dit hield in dat de elektrische detectie van de eencellige membraanpermeabilisatie werd gebruikt, maar op een manier met een hogere doorvoer. De experimentele opstelling die binnenin wordt beschreven, vereist de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur, d.w.z. lock-in versterker, die ongebruikelijk kan zijn voor het standaard onderzoekslaboratorium en dus het potentiële bereik en aanpassingsvermogen van deze techniek beperkt. Een 'kaal' microfluïdisch elektroporatieapparaat kan echter volgens dit protocol worden geïmplementeerd, waarbij alleen een functiegenerator en mogelijk een spanningsversterker nodig zijn om de elektroporatiepulsen te genereren.
Toch onderscheidt dit micro-elektroporatieplatform zich van andere eencellige elektroporatietechnologieën. De mogelijkheid om elektroporatieparameters op een eencellige suspensie zowel elektrisch te detecteren als te optimaliseren in een continue stroomomgeving is echt innovatief. Toekomstig werk omvat het optimaliseren van de andere belangrijke experimentele parameters met betrekking tot succesvolle elektroporatie-uitkomsten (zie figuur 1) om de algehele effectiviteit van dit platform verder te verbeteren. Aanvullende levensvatbaarheids- en metabole assays zullen worden ontwikkeld en geïmplementeerd om mogelijke negatieve downstream-effecten geassocieerd met het micro-elektroporatieplatform te beoordelen. Bovendien kan het microfluïdische ontwerp verder worden verbeterd om een hogere cellulaire doorvoer te bereiken, zoals is aangetoond door andere groepen40. Bij het aanpakken van deze zorgen heeft deze technologie het potentieel om te worden toegepast in het productieproces van celtherapie om genafgifte en / of genbewerking uit te voeren, omdat deze methodologie zeer vatbaar is voor zowel een gesloten als geautomatiseerd proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag financiële steun erkennen van de National Science Foundation (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) en de Graduate Training van het Amerikaanse ministerie van Onderwijs in opkomende gebieden van precisie en gepersonaliseerde geneeskunde (P200A150131) voor het financieren van afgestudeerde student J.J.S. op fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 150-mm diameter petri dishes | VWR | 25384-326 | step 6.1.1 to secure wafer |
| 24-well tissue culture plates | VWR | 10062-896 | step 10.3.6 to plate electroporated cells |
| 33220A Waveform/Function generator | Agilent | step 9.2.3 electroporation pulse generator | |
| 4'' Si-wafers | University Wafer | subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication | |
| 6-well tissue culture plates | VWR | 10062-892 | step 8.1.8 to plate cells |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | step 2.1.2 for cleaning and step 5.1 photoresist lift-off |
| Allegra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells | |
| AutoCAD 2018 | Autodesk | subsection 1.1. to design transparency masks | |
| Buffered oxide etchant 10:1 | VWR | 901621-1L | subsection 3.1 for HF etching |
| CCD Monochrome microscope camera | Hamamatsu | Orca 285 C4742-96-12G04 | step 11.2.3. for imaging |
| CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP | PCO | subsection 9.3 part of the experimental setup | |
| Conductive Epoxy | CircuitWorks | CW2400 | subsection 7.6. for wire attachement |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-70C | step 8.1.4. for cell centrifuging |
| Dektak 3ST Surface Profilometer | Veeco (Sloan/Dektak) | step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry | |
| Disposable biopsy punch, 0.75 mm | Robbins Instruments | RBP075 | step 6.2.3 for inlet access |
| Disposable biopsy punch, 3 mm | Robbins Instruments | RBP30P | step 6.2.3 for outlet access |
| DRAQ5 | abcam | ab108410 | step 11.2.2. for live cell staining |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | ThermoFisher Scientific | 11885084 | step 8.1.2. part of media composition |
| E3631A Bipolar Triple DC power supply | Agilent | step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup | |
| Eclipse TE2000-U Inverted Microscope | Nikon | subsection 9.3. part of the experimental setup | |
| EVG620 UV Lithography System | EVG | step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure | |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001 | step 8.1.2. part of media composition |
| FS20 Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | subsection 5.1. for photoresist lift-off | |
| Glass Media Bottle with Cap, 100mL | Fisher Scientific | FB800100 | step 8.2.1. for buffer storage |
| Glass Media Bottle with Cap, 500mL | Fisher Scientific | FB800500 | step 8.1.2.for media storage |
| HEK-293 cell line | ATCC | CRL-1573 | subsection 8.1 for cell culturing |
| HEPES buffer solution | Sigma Aldrich | 83264-100ML-F | step 8.2.1 part of electroporation buffer composition |
| Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 379212-25ML | step 2.2.3 adhesion promoter |
| HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
| HF2TA Current amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | A459-1 | step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS |
| IX81 fluorescence microscope | Olympus | step 11.2.3 for imaging | |
| L-Glutamine Solution | Sigma Aldrich | G7513-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
| M16878/1BFA 22 gauge wire | AWC | B22-1 | subsection 7.5 for device fabrication |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 208337-100G | step 8.1.2 part of electroporation buffer composition |
| MF 319 Developer | Kayaku Advanced Materials | 10018042 | step 2.2.9. photoresist developer |
| Microposit S1818 photoresist | Kayaku Advanced Materials | 1136925 | step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning |
| Microscope slides, 75 x 25 mm | VWR | 16004-422 | step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate |
| Model 2350 High voltage amplifier | TEGAM | 2350 | step 9.2.5. part of the experimental setup |
| National Instruments LabVIEW | National Instruments | data acquisition | |
| Needle, 30G x 1 in | BD Scientific | 305128 | step 10.1.1. part of the system priming |
| PA90 IC OPAMP Power circuit | Digi-key | 598-1330-ND | Part of the custom circuit |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4458-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
| Plasmid pMAX-GFP | Lonza | VCA-1003 | step 8.3.4. for intracellular delivery |
| Plastic tubing, 0.010'' x 0.030" | VWR | 89404-300 | step 10.1.2. for system priming |
| Platinum targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
| Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump | Harvard Apparatus | MA1 70-2213 | step 10.1.4. for system priming |
| PVD75 Physical vapor deposition system | Kurt J. Lesker | subsection 4.1. for physical vapor deposition | |
| PWM32 Spinner System | Headway Research | steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist | |
| PX-250 Plasma treatment system | March Instruments | subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding | |
| SDG1025 Function/Waveform generator | Siglent | step 9.2.2. part of the experimental setup | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S8045-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
| SU-8 2010 negative photoresist | Kayaku Advanced Materials | Y111053 | step 2.1.7. for microfluidic channel patterning |
| SU-8 developer | Microchem | Y010200 | step 2.1.12. for photoresist developing |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-1KG | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
| Sylgard 184 elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | step 6.2.1 10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | step 8.3.4. part of system priming |
| SZ61 Stereomicroscope System | Olympus | subsection 7.3. for channel and electrode alignment | |
| Tissue Culture Treated T25 Flasks | Falcon | 353108 | step 8.1.2 for cell culturing |
| Titanium targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
| Transparency masks | CAD/ART Services | steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | step 6.1.2. for wafer silanization |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049-100ML | steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting |
References
- Gao, Q. Q., et al. Therapeutic potential of CRISPR/Cas9 gene editing in engineered T-cell therapy. Cancer Medicine. 8 (9), 4254-4264 (2019).
- Aijaz, A., et al. Biomanufacturing for clinically advanced cell therapies. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 362-376 (2018).
- Milone, M. C., O'Doherty, U.
- Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A.
- Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavcic, D. Membrane electroporation and electropermeabilization: mechanisms and models. Annual Review of Biophysics. 48, 63-91 (2019).
- Rosazza, C., Meglic, S. H., Zumbusch, A., Rols, M. P., Miklavcic, D. Gene electrotransfer: A mechanistic perspective. Current Gene Therapy. 16 (2), 98-129 (2016).
- Clauss, J., et al. Efficient non-viral T-cell engineering by sleeping beauty minicircles diminishing DNA toxicity and miRNAs silencing the endogenous T-cell receptors. Human Gene Therapy. 29 (5), 569-584 (2018).
- Sherba, J. J., et al. The effects of electroporation buffer composition on cell viability and electro-transfection efficiency. Scientific Reports. 10 (1), 3053 (2020).
- Lu, H., Schmidt, M. A., Jensen, K. F. A microfluidic electroporation device for cell lysis. Lab on a Chip. 5 (1), 23-29 (2005).
- Kar, S., et al. Single-cell electroporation: current trends, applications and future prospects. Journal of Micromechanics and Microengineering. 28 (12), (2018).
- Shi, J. F., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
- Wang, S. N., Zhang, X. L., Wang, W. X., Lee, L. J. Semicontinuous flow electroporation chip for high-throughput transfection on mammalian cells. Analytical Chemistry. 81 (11), 4414-4421 (2009).
- Wei, W. J., et al. An implantable microelectrode array for simultaneous L-glutamate and electrophysiological recordings in vivo. Microsystems & Nanoengineering. 1, (2015).
- Maschietto, M., Dal Maschio, M., Girardi, S., Vassanelli, S. In situ electroporation of mammalian cells through SiO2 thin film capacitive microelectrodes. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
- Wu, Q. R., et al. Organ-on-a-chip: recent breakthroughs and future prospects. Biomedical Engineering Online. 19 (1), (2020).
- Pandey, C. M., et al.
- Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent advances in biosensor technology for potential applications - An overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, (2016).
- Nuxoll, E.
- Kang, S., Kim, K. H., Kim, Y. C. A novel electroporation system for efficient molecular delivery into Chlamydomonas reinhardtii with a 3-dimensional microelectrode. Scientific Reports. 5, (2015).
- Zheng, M. D., Shan, J. W., Lin, H., Shreiber, D. I., Zahn, J. D. Hydrodynamically controlled cell rotation in an electroporation microchip to circumferentially deliver molecules into single cells. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (1), (2016).
- Santra, T. S., Kar, S., Chang, H. Y., Tseng, F. G.
- Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications. Integrative Biology. 1 (3), 242-251 (2009).
- Santra, T. S., Chang, H. Y., Wang, P. C., Tseng, F. G. Impact of pulse duration on localized single-cell nano-electroporation. Analyst. 139 (23), 6249-6258 (2014).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab on a Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).
- Hsi, P., et al. Acoustophoretic rapid media exchange and continuous-flow electrotransfection of primary human T cells for applications in automated cellular therapy manufacturing. Lab on a Chip. 19 (18), 2978-2992 (2019).
- Khine, M., Ionescu-Zanetti, C., Blatz, A., Wang, L. P., Lee, L. P. Single-cell electroporation arrays with real-time monitoring and feedback control. Lab on a Chip. 7 (4), 457-462 (2007).
- Ye, Y. F., et al. Single-cell electroporation and real-time electrical monitoring on a microfluidic chip. 2020 33rd Ieee International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (Mems 2020). , 1040-1043 (2020).
- Huang, Y., Rubinsky, B. Microfabricated electroporation chip for single cell membrane permeabilization. Sensors and Actuators a-Physical. 89 (3), 242-249 (2001).
- Guo, X. L., Zhu, R. Controllable in-situ cell electroporation with cell positioning and impedance monitoring using micro electrode array. Scientific Reports. 6, (2016).
- Punjiya, M., Nejad, H. R., Mathews, J., Levin, M., Sonkusale, S. A flow through device for simultaneous dielectrophoretic cell trapping and AC electroporation. Scientific Reports. 9, (2019).
- Wang, H. Y., Lu, C. Microfluidic electroporation for delivery of small molecules and genes into cells using a common DC power supply. Biotechnology and Bioengineering. 100 (3), 579-586 (2008).
- Zheng, M. D., et al. Continuous-flow, electrically-triggered, single cell-level electroporation. Technology. 5 (1), 31-41 (2017).
- Batista Napotnik, T., Miklavcic, D. In vitro electroporation detection methods - An overview. Bioelectrochemistry. 120, 166-182 (2018).
- MICROPOSIT™ S1800® G2 Series Photoresists. KAYAKU. , Available from: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf (2021).
- SU-8 2000 Permanent Negative Epoxy Photoresist. KAYAKU. , Available from: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf (2001).
- Substrate Preparation. MicroChemicals. , Available from: https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf (2021).
- Lisinenkova, M., Hahn, L., Schulz, J. 4M 2006 - Second International Conference on Multi-Material Micro Manufacture. , Elsevier. 91-94 (2006).
- Beh, C. W., Zhou, W. Z., Wang, T. H. PDMS-glass bonding using grafted polymeric adhesive - alternative process flow for compatibility with patterned biological molecules. Lab on a Chip. 12 (20), 4120-4127 (2012).
- PA90 High Voltage Power Operational Amplifiers. APEX. , Available from: https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf (2021).
- Lissandrello, C. A., et al. High-throughput continuous-flow microfluidic electroporation of mRNA into primary human T cells for applications in cellular therapy manufacturing. Scientific Reports. 10 (1), 18045 (2020).
