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Bioengineering

La fabbricazione e il funzionamento di un sistema di micro-elettroporazione a flusso continuo con rilevamento di permeabilizzazione

Published: January 7, 2022 doi: 10.3791/63103
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1
1The Department of Biomedical Engineering, Rutgers, The State University of New Jersey, 2The Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Rutgers, The State University of New Jersey

Summary

Questo protocollo descrive le tecniche di microfabbricazione necessarie per costruire un dispositivo di elettroporazione microfluidica lab-on-a-chip. La configurazione sperimentale esegue trasfezioni controllate a livello di singola cellula in un flusso continuo e può essere estesa a portate più elevate con controllo basato sulla popolazione. Viene fornita un'analisi che mostra la capacità di monitorare elettricamente il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare in tempo reale.

Abstract

Le attuali innovazioni terapeutiche, come la terapia cellulare CAR-T, dipendono fortemente dalla somministrazione genica mediata da virus. Sebbene efficiente, questa tecnica è accompagnata da elevati costi di produzione, che hanno suscitato un interesse nell'utilizzo di metodi alternativi per la consegna genica. L'elettroporazione è un approccio elettrofisico non virale per la consegna intracellulare di geni e altri materiali esogeni. Dopo l'applicazione di un campo elettrico, la membrana cellulare consente temporaneamente la consegna molecolare nella cellula. Tipicamente, l'elettroporazione viene eseguita su macroscala per elaborare un gran numero di cellule. Tuttavia, questo approccio richiede un ampio sviluppo di protocolli empirici, che è costoso quando si lavora con tipi di cellule primarie e difficili da trasfettare. Il lungo sviluppo del protocollo, insieme alla necessità di grandi tensioni per ottenere sufficienti intensità di campo elettrico per permeabilizzare le celle, ha portato allo sviluppo di dispositivi di elettroporazione su microscala. Questi dispositivi di micro-elettroporazione sono fabbricati utilizzando tecniche di microfabbricazione comuni e consentono un maggiore controllo sperimentale con il potenziale di mantenere elevate capacità di produttività. Questo lavoro si basa su una tecnologia di elettroporazione microfluidica in grado di rilevare il livello di permeabilizzazione della membrana cellulare a livello di singola cellula in un flusso continuo. Tuttavia, questa tecnologia è stata limitata a 4 celle elaborate al secondo, e quindi un nuovo approccio per aumentare il throughput del sistema è proposto e presentato qui. Questa nuova tecnica, indicata come controllo di feedback basato sulla popolazione cellulare, considera la risposta di permeabilizzazione cellulare a una varietà di condizioni di impulso dell'elettroporazione e determina le condizioni di impulso di elettroporazione più adatte per il tipo di cellula in esame. Viene quindi utilizzata una modalità a throughput più elevato, in cui questo impulso "ottimale" viene applicato alla sospensione cellulare in transito. I passaggi per fabbricare il dispositivo, impostare e gestire gli esperimenti microfluidici e analizzare i risultati sono presentati in dettaglio. Infine, questa tecnologia di micro-elettroporazione è dimostrata fornendo un plasmide del DNA che codifica per la proteina fluorescente verde (GFP) nelle cellule HEK293.

Introduction

Le attuali innovazioni terapeutiche nella ricerca biomedica, come la terapia cellulare CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) e l'editing genetico utilizzando CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat DNA sequences) / Cas9, si basano fortemente sulla capacità di fornire materiale esogeno sia con successo che in modo efficiente nello spazio intracellulare1. Nella terapia CAR-T, il gold standard per eseguire la fase di consegna genica nella produzione di terapia cellulare è l'utilizzo di vettori virali2. Sebbene la consegna genica mediata da virus sia una modalità di consegna efficiente, presenta anche diversi inconvenienti. Questi includono i costi di produzione, la citotossicità, l'immunogenicità, il potenziale di mutagenesi/tumorigenesi e le limitazioni delle dimensioni dei geni da somministrare3. Queste limitazioni hanno portato alla ricerca e allo sviluppo di tecnologie di somministrazione alternative e non virali.

L'elettroporazione, un'alternativa alla consegna genica mediata da virus, si basa sull'applicazione di una forma d'onda di impulso elettrico ottimale per eseguire trasfezioni di DNA, RNA e proteine delle cellule. A seguito dell'applicazione di un campo elettrico esterno, la membrana cellulare viene brevemente compromessa, rendendo la cellula suscettibile alla consegna intracellulare di materiali esogeni altrimenti impermeabili4. Rispetto alla somministrazione mediata da virus, l'elettroporazione è vantaggiosa in quanto è generalmente sicura, facile da usare e ha bassi costi operativi. L'elettroporazione può trasportare sia piccoli che grandi carichi molecolari e può essere efficiente nel trasfettare le cellule indipendentemente dal lignaggio5. Per ottenere risultati desiderabili dopo l'elettroporazione, cioè una buona vitalità e una buona efficienza di elettro-trasfezione, una varietà di parametri sperimentali deve essere co-ottimizzata. Questi includono il tipo di cella6, la densità cellulare, la concentrazione della molecola7, le proprietà del tampone di elettroporazione (ad esempio, composizione molecolare, conducibilità e osmolarità)8, dimensione/geometria dell'elettrodo9 e forma d'onda dell'impulso elettrico (forma, polarità, numero di impulsi)10 (fare riferimento alla Figura 1 per un'illustrazione). Sebbene ciascuno di questi parametri possa avere un effetto significativo sui risultati degli esperimenti di elettroporazione, la forma d'onda dell'impulso è stata studiata in modo particolarmente dettagliato, poiché l'energia elettrica degli impulsi applicati è la radice del compromesso intrinseco tra la vitalità cellulare risultante e l'efficienza di elettro-trasfezione8.

Tipicamente, gli esperimenti di elettroporazione vengono eseguiti su macro-scala, dove le celle sono sospese in 100 microlitri di tampone tra una serie di grandi elettrodi a piastra parallela all'interno di una cuvetta di elettroporazione. Gli elettrodi sono comunemente fabbricati in alluminio con una distanza dell'elettrodo di 1-4 mm. Una volta che le celle vengono caricate manualmente tramite pipetta, la cuvetta è collegata elettricamente a un ingombrante generatore di impulsi elettrici in cui l'utente può impostare e applicare i parametri della forma d'onda dell'impulso per elettropolare la sospensione della cella. Sebbene l'elettroporazione su macroscala o di massa possa elaborare densità cellulari >106 celle/ml, questa funzione può essere dispendiosa quando si ottimizzano le impostazioni della forma d'onda dell'impulso elettrico. Ciò è particolarmente preoccupante quando si elettroporano tipi di cellule primarie in cui il numero di popolazioni cellulari può essere limitato. Inoltre, a causa della grande distanza tra gli elettrodi, il generatore di impulsi deve essere in grado di fornire grandi tensioni per ottenere intensità di campo elettrico >1kV / cm11. Queste alte tensioni causano una dissipazione di potenza resistiva attraverso il tampone elettrolitico con conseguente riscaldamento Joule, che può essere dannoso per la vitalità della cella risultante12. Infine, l'esecuzione dell'elettroporazione su una sospensione densa di cellule sarà costantemente gravata da una variabilità innata nell'efficienza di elettro-trasfezione risultante e nella vitalità cellulare. Ogni cellula in sospensione potrebbe sperimentare una diversa intensità del campo elettrico a causa delle cellule circostanti. A seconda che l'intensità del campo elettrico sperimentato sia aumentata o diminuita, la vitalità cellulare risultante o l'efficienza di elettro-trasfezione possono essere influenzate negativamente11. Questi aspetti negativi dell'elettroporazione su macro-scala hanno portato alla ricerca e allo sviluppo di tecnologie alternative che operano su micro-scala e consentono un migliore controllo a livello di singola cella.

Il campo dei BioMEMS, o sistemi biomedici micro-elettro-meccanici, deriva dai progressi tecnologici compiuti nel settore della microelettronica. In particolare, utilizzando processi di microfabbricazione per sviluppare micro-dispositivi per il progresso della ricerca biomedica. Questi progressi includono lo sviluppo di array di micro-elettrodi per il monitoraggio elettrico in vivo13, micro-elettrodi capacitivi per elettroporazione in situ 14, dispositivi miniaturizzati organ-on-a-chip 15, diagnostica microfluidica point-of-care 16, biosensori 17 e sistemi di somministrazione di farmaci 18, compresi dispositivi di nano e micro-elettroporazione 19,20,21 . Grazie alla capacità di progettare e produrre dispositivi alla stessa scala dimensionale delle celle biologiche, le tecnologie di nano e micro-elettroporazione sono vantaggiose rispetto alla loro controparte su macroscala22,23. Questi dispositivi di elettroporazione eliminano la necessità di applicazioni a impulsi ad alta tensione, poiché i set di elettrodi con spaziature da 10 a 100 secondi di micrometri sono tipicamente integrati. Questa caratteristica riduce drasticamente la corrente attraverso l'elettrolita, che a sua volta riduce l'accumulo di prodotti di elettrolisi tossici e gli effetti del riscaldamento Joule in questi sistemi. I canali su microscala assicurano inoltre che un campo elettrico molto più uniforme venga applicato in modo affidabile alle celle durante l'applicazione dell'impulso, con risultati più coerenti24. Inoltre, è anche normale che i dispositivi di microelettroporazione siano integrati in una piattaforma microfluidica che si presta per la futura integrazione in una tecnologia completamente automatizzata, una capacità altamente auspicabile nella produzione di terapie cellulari25. Infine, l'elettroporazione su microscala consente l'interrogazione elettrica degli eventi di elettroporazione. Ad esempio, il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare può essere monitorato in tempo reale a livello di singola cellula26,27. Lo scopo di questo metodo è quello di descrivere la microfabbricazione, il funzionamento del sistema e l'analisi di un dispositivo microfluidico di microelettroporazione monocellulare in grado di misurare il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare per ottimizzare i protocolli di elettroporazione, aumentando al contempo la produttività rispetto al precedente stato dell'arte.

L'esecuzione dell'elettroporazione a livello di singola cellula non è più una tecnica nuova, come è stato dimostrato per la prima volta da Rubinsky et al. nel 2001 con lo sviluppo di una tecnologia di elettroporazione a celle statiche28. Il loro micro-dispositivo è stato innovativo in quanto sono stati i primi a dimostrare la capacità di monitorare elettricamente l'evento di elettroporazione. Ciò ha ulteriormente portato allo sviluppo di tecnologie statiche di elettroporazione a cella singola in grado di rilevare elettricamente il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare in modo parallelizzato per aumentare la produttività dei dispositivi. Tuttavia, anche con la parallelizzazione e l'elaborazione batch, questi dispositivi mancano gravemente del numero totale di celle che possono elaborare per unità di tempo29,30. Questa limitazione ha portato allo sviluppo di dispositivi flow-through in grado di eseguire microelettroporazione a livello di singola cella a portate molto maggiori31. Questa transizione del dispositivo, dall'ambiente statico a quello flow-through, limita la capacità di monitorare elettricamente il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare in seguito all'applicazione dell'impulso di elettroporazione. Il metodo descritto in questo lavoro colma il divario tra queste due tecnologie, una tecnologia di micro-elettroporazione in grado di rilevare, pulsare e monitorare elettricamente il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare delle singole cellule, in modo seriale a flusso continuo.

Questa tecnologia è stata recentemente descritta in Zheng et al. In quel lavoro, le capacità di questa tecnologia sono state introdotte con il completamento di uno studio parametrico, in cui sono state variate sia l'ampiezza che la durata dell'impulso di elettroporazione, e il conseguente segnale elettrico, indicativo della permeabilizzazione della membrana cellulare, è stato esplorato32. I risultati hanno mostrato che un aumento dell'intensità dell'impulso di elettroporazione (cioè aumento del campo elettrico applicato o aumento della durata dell'impulso) ha causato un aumento della permeabilizzazione della membrana cellulare misurata. Per convalidare ulteriormente il sistema, un indicatore fluorescente comune di elettroporazione riuscita, lo ioduro di propidio33, è stato aggiunto alla sospensione cellulare e un'immagine di fluorescenza è stata acquisita immediatamente dopo l'applicazione dell'impulso elettrico. Il segnale ottico, cioè l'intensità di fluorescenza dello ioduro di propidio all'interno della cellula, è stato fortemente correlato con la misura elettrica del grado di permeabilizzazione della membrana cellulare, verificando l'affidabilità di questa misura elettrica. Tuttavia, questo lavoro ha considerato solo la consegna della piccola molecola ioduro di propidio, che ha poco o nessun significato traducibile.

In questo lavoro, viene introdotta una nuova applicazione di questa tecnologia per migliorare la produttività del sistema, fornendo al contempo un vettore di DNA plasmidico biologicamente attivo (pDNA) e valutando l'efficienza di elettro-trasfezione delle cellule riplaccate e coltivate dopo l'elettroporazione. Sebbene il lavoro precedente superi le tecnologie di micro-elettroporazione esistenti che sono in grado di misurare elettricamente l'evento di elettroporazione, lo stato attuale del dispositivo richiede ancora lunghi tempi di transito della cella tra il set di elettrodi (~ 250 ms) per eseguire il rilevamento cellulare, l'applicazione dell'impulso e la misurazione della permeabilizzazione della membrana cellulare. Con un singolo canale, questo limita il throughput a 4 celle/s. Per combattere questa limitazione, viene introdotto un nuovo concetto di elettroporazione controllata da feedback basata sulla popolazione cellulare per eseguire l'elettro-trasfezione del pDNA. Utilizzando un tampone di elettroporazione a conducibilità ipofisiologica, questo sistema consente l'interrogazione elettrica di singole celle attraverso una moltitudine di applicazioni di impulsi di elettroporazione. Sulla base della risposta elettrica, viene quindi determinato un impulso di elettroporazione "ottimale". Viene quindi implementata una modalità "high-throughput" in cui la determinazione della permeabilizzazione della membrana cellulare viene annullata, la portata viene aumentata e il duty cycle dell'impulso di elettroporazione viene abbinato al tempo di transito della cella per garantire un impulso per cella in transito tra gli elettrodi. Questo lavoro fornirà ampi dettagli sulle fasi di microfabbricazione per la produzione del micro-dispositivo, il materiale / attrezzatura e la loro configurazione necessaria per eseguire la sperimentazione, e il funzionamento / analisi del dispositivo e la sua efficienza di elettro-trasfezione (eTE).

Figure 1
Figura 1: Fattori sperimentali che influenzano i risultati dell'elettroporazione. (Sinistra) Sospensione cellulare: i fattori importanti da considerare prima dell'inizio dell'elettroporazione includono: carico utile (in questo caso, pDNA), concentrazione, densità cellulare e proprietà del tampone di elettroporazione. Le proprietà del tampone di elettroporazione da considerare sono la conduttività, l'osmolarità e l'esatta composizione molecolare che contribuisce a questi valori. (Al centro) Applicazione dell'impulso - Il tipo di impulso esatto (onda quadra vs. decadimento esponenziale) e la forma d'onda dell'impulso (singolo impulso vs. treno di impulsi) devono essere ottimizzati per massimizzare sia la vitalità cellulare risultante che l'efficienza di elettro-trasfezione. I treni di impulsi comuni implementati nei processi di elettroporazione sono tipicamente composti da una serie di impulsi ad alta tensione (HV) o serie di impulsi che ruotano tra le grandezze di impulso HV e bassa tensione (BT). (Destra) Le fasi di elaborazione a valle del recupero cellulare, in particolare i terreni di coltura cellulare di recupero in cui le cellule vengono trasferite, dovrebbero essere ottimizzati. Non in primo piano (estrema sinistra), è possibile implementare ulteriori fasi di elaborazione delle celle a monte per l'ottimizzazione complessiva del processo di elettroporazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Protocol

NOTA: gli utenti devono esaminare tutte le schede di sicurezza per i materiali e i materiali di consumo utilizzati in questo protocollo. In ogni fase devono essere indossati DPI appropriati e durante la sperimentazione deve essere utilizzata una tecnica sterile. Le sezioni 1-7 illustrano la fabbricazione del dispositivo.

1. Fabbricazione del dispositivo - Design della maschera

NOTA: Fare riferimento alla Figura 2 per un'illustrazione del processo di microfabbricazione. Le fasi di microfabbricazione devono essere eseguite in un ambiente di camera bianca. Sono necessari DPI aggiuntivi (retina per capelli, rete per capelli facciale, maschera, tuta per camera bianca, copriscarpe).

  1. Installare un software CAD di scelta, progettare una "maschera" 2-dimensionale sia del canale microfluidico che degli elettrodi e salvare il progetto nel formato di file desiderato (ad esempio, .dxf, .dwg).
    NOTA: fare riferimento alla Figura supplementare 1 per un esempio di schema di maschera 2-dimensionale.
  2. Inviare a un fornitore di scelta per la stampa. Assicurarsi che le dimensioni dei progetti rientrino nelle capacità di risoluzione del fornitore.

2. Fabbricazione del dispositivo - Fotolitografia

NOTA: Le ricette di microfabbricazione fornite sono adottate dalle raccomandazioni del produttore dei fotoresist e devono essere utilizzate solo come punto di partenza34. I valori esatti per i tempi di cottura, i tempi di esposizione, ecc., Devono essere ottimizzati per ogni protocollo di fabbricazione. Si consiglia di utilizzare pinzette per wafer per la manipolazione sia di wafer di silicio che di vetrini.

  1. Fabbricazione di canali microfluidici
    1. Pulizia dei vetrini in silicone e vetro soda-calce: seguire i passaggi da 2.1.2 a 2.1.3 per eseguire la pulizia del wafer di silicio e della pulizia dei vetrini da 1" × 3" di vetro soda-calcico (entrambi indicati come "substrato").
    2. Immergere i substrati in un bagno di acetone, un bagno di isopropanolo (IPA) e un bagno d'acqua deionizzato per 10 minuti ciascuno. Eseguire questo lavaggio in 3 fasi in serie a temperatura ambiente.
    3. Rimuovere e asciugare la superficie utilizzando una fonte di azoto pressurizzato o gas filtrato ad aria. Mettere i substrati in un forno a 150 °C per un minimo di 30 minuti per consentire l'evaporazione dell'umidità residua.
    4. Fotolitografia SU-8 su wafer di silicio: Eseguire la fotolitografia sul wafer di silicio seguendo i passaggi 2.1.5-2.1.14.
      NOTA: Per ottenere un'altezza del canale microfluidico di 20 μm, è stato utilizzato il fotoresist negativo serie SU-8 2000. Le velocità di rotazione esatte variano a seconda della formulazione di SU-8 (ad esempio, 2010, 2015, ecc.); tuttavia, le seguenti condizioni sono per la formulazione SU-8 201035.
    5. Rimuovere il wafer di silicio dal forno a 150 °C e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente (RT).
    6. Fissare il wafer al mandrino del wafer spin coprter utilizzando il sistema di aspirazione del spin coater. Programma lo spinner. Passo 1 - 500 giri/min per 10 s ad un'accelerazione di 100 giri/min, Passo 2 - 1000 giri/min per 30 s ad un'accelerazione di 300 giri/min.
    7. Erogare 4 mL di SU-8 2010 photoresist al centro del wafer di silicio. Eseguire il programma. Una volta che il sistema si arresta, spegnere l'aspirapolvere.
    8. Utilizzando una pinzetta, trasferire il wafer di silicio rivestito SU-8 su una piastra calda a 95 °C per 4-5 minuti per cuocere morbidamente. Quindi rimuovere il wafer dalla piastra riscaldante e lasciarlo raffreddare a RT.
      NOTA: seguire la procedura di avvio corretta per l'allineatore di maschere fotolitografiche specifico per laboratorio.
    9. Fissare la fotomaschera con i disegni del canale microfluidico 2D sul supporto della maschera. Inserire il wafer di silicio, con il rivestimento SU-8 rivolto verso l'alto, sul mandrino del wafer.
    10. Impostare le impostazioni di esposizione per 150 mJ/cm2 e far funzionare la macchina.
      ATTENZIONE: Non guardare direttamente la sorgente di luce UV per evitare potenziali danni agli occhi.
    11. Posizionare il wafer di silicone rivestito SU-8 su una piastra calda a 95 °C per 4-5 minuti per la cottura post-esposizione.
    12. Immergere il wafer di silicio nella soluzione di sviluppo SU-8 (vedere la tabella dei materiali) per 3-4 minuti. Applicare una leggera agitazione. Rimuovere il wafer dalla soluzione e risciacquare la superficie con alcool isopropilico.
    13. Asciugare la superficie utilizzando una fonte di azoto pressurizzato o gas filtrato. Ispezionare le caratteristiche al microscopio utilizzando un filtro UV e assicurarsi che non vi siano difetti evidenti nei canali microfluidici.
    14. Mettere il wafer di silicio in un forno a 150 °C per un minimo di 30 minuti per una cottura dura.
    15. Lasciare raffreddare fino a RT e utilizzare la profilometria dello stilo per misurare l'altezza e la pendenza esatte delle pareti laterali del canale.
  2. Fotolitografia su vetrini
    NOTA: L'esametildisilazano (HMDS) viene utilizzato come promotore di adesione per il fotoresist positivo S181836.
    1. Rimuovere il vetrino dal forno a 150 °C e lasciarlo raffreddare a RT.
    2. Fissare il vetrino al mandrino dello spinner usando il vuoto e programmare lo spinner. Passo 1 - 500 giri/min per 10 s con un'accelerazione di 100 giri/min. Passo 2 - 3000 rpm per 30 sat un'accelerazione di 300 rpm/s.
    3. Erogare 3-4 goccioline di HMDS sulla superficie del vetrino. Eseguire il programma.
      NOTA: Per ottenere un rivestimento superficiale di ~ 3 μm, è necessario utilizzare la serie di fotoresist positivi S1800. Le velocità di rotazione esatte variano a seconda della formulazione; le raccomandazioni riportate di seguito si riferiscono alla formulazione S181834.
    4. Erogare 1 mL di fotoresist sulla superficie del vetrino. Assicurarsi di coprire la superficie.
    5. Eseguire il programma. Una volta che il sistema si arresta, spegnere l'aspirapolvere e rimuovere il vetrino.
    6. Posizionare il vetrino rivestito S1818 su una piastra calda a 120 °C per 4 minuti per una cottura morbida. Rimuovi e consenti di venire a RT.
    7. Fissare la fotomaschera con i disegni dell'elettrodo 2D sul supporto della maschera.
    8. Inserire e allineare il vetrino, con il rivestimento S1818 rivolto verso l'alto, sul mandrino del wafer. Impostare le impostazioni di esposizione per 250 mJ/cm2 ed eseguire la macchina.
      NOTA: diversi modelli di allineatori a contatto possono essere più o meno adatti a substrati non circolari e di spessore variabile.
    9. Immergi il vetrino nella soluzione di sviluppo MF-319 per 2 minuti. Applicare una leggera agitazione. Risciacquare la superficie del vetrino con acqua deionizzata.
    10. Asciugare la superficie utilizzando una fonte di azoto pressurizzato o gas filtrato e osservare le caratteristiche al microscopio utilizzando un filtro UV. Assicurati che non ci siano difetti evidenti nei modelli litografici.
    11. Posizionare il vetrino nel forno a 150 °C, assicurandosi che la superficie del substrato di interesse sia rivolta verso l'alto, per un minimo di 30 minuti per una cottura dura. Togliere dal forno e tenere al riparo dalla luce.

3. Fabbricazione del dispositivo: acido fluoridrico (HF) incidere

ATTENZIONE: Questa fase comporta la manipolazione e lo smaltimento dell'acido fluoridrico (HF), che può causare ustioni chimiche profonde e dolorose. Per proteggere il conduttore devono essere utilizzati DPI supplementari (visiera, guanti resistenti agli agenti chimici lunghi fino al gomito, grembiule resistente agli agenti chimici con maniche). Il neutralizzatore acido gluconato di calcio e il gel cutaneo devono essere tenuti in prossimità del banco di laboratorio. Questo passaggio non dovrebbe essere eseguito da solo. L'HF non deve mai essere conservato o erogato in contenitori di vetro poiché il contenitore sarà inciso dall'acido.

NOTA: L'HF incide uniformemente il vetro esposto (cioè il design dell'elettrodo) per formare una rientranza nel vetro, consentendo una migliore risoluzione del bordo del modello di elettrodi dopo la deposizione del metallo (sezione 4).

  1. Immergere il vetrino in una soluzione HF tamponata 10:1 per 1 minuto in un contenitore di politetrafluoroetilene. Trasferire e lavare i vetrini in acqua deionizzata. Ripetere il passaggio di lavaggio 3 volte.
  2. Asciugare la superficie utilizzando una fonte di azoto pressurizzato o gas filtrato. Mettere i substrati di vetro in un forno a 65 °C per una notte per rimuovere l'umidità residua. Coprire i substrati dalla luce.

4. Fabbricazione del dispositivo: deposizione fisica da vapore

NOTA: Questa fase prevede la deposizione di metallo sui substrati del vetrino per definire i modelli degli elettrodi. Gli elettrodi metallici comunemente usati sono cromo / oro e titanio / platino. L'oro e il platino non aderiscono al substrato di vetro, quindi è necessario uno strato di adesione del seme di cromo o titanio, rispettivamente, per promuovere l'adesione37.

  1. Seguire il protocollo specifico della camera bianca per far funzionare il sistema PVD interno. Questo lavoro utilizza un sistema di sputtering DC e sputter con 100 gas Argon SCCM ad una pressione di ~ 8 mTorr e 200 W di potenza.
  2. Sputter titanio per 8 minuti ad una velocità di ~100 Å / min. Sputter platino per 10 minuti ad una velocità di ~200 Å/min. Rimuovere i substrati dalla camera PVD.

5. Fabbricazione del dispositivo: decollo Photoresist

NOTA: Questo passaggio prevede la dissoluzione dello strato fotoresist in un bagno di acetone, lasciando gli elettrodi di platino aderenti modellati sui vetrini.

  1. Immergere i vetrini rivestiti di metallo in un bagno di acetone per ~ 10 min.
  2. Sonicare il bagno per introdurre agitazione per rompere il film metallico non aderito. Utilizzare una salvietta imbevuta di acetone per rimuovere eventuali residui, se necessario.
  3. Una volta rimosso tutto il fotoresist/metallo, lavare gli elettrodi con acqua deionizzata e metterli in un forno a 65 °C durante la notte per rimuovere l'umidità superficiale residua.
  4. Utilizzare la profilometria dello stilo per misurare il profilo degli elettrodi modellati.

6. Fabbricazione del dispositivo: litografia morbida

NOTA: Questa fase prevede lo stampaggio replica del canale microfluidico sulla struttura di rilievo principale SU-8 utilizzando un elastomero, polidimetilsilossano (PDMS).

  1. Silanizzazione di wafer di silicio
    NOTA: questo è un passaggio facoltativo; tuttavia, aumenterà la durata della struttura di soccorso SU-8 che è stata fabbricata nella sottosezione 2.1. Questo passaggio deve essere eseguito in una cappa aspirante chimica.
    1. Fissare il wafer sul fondo di una capsula di Petri e posizionare la capsula di Petri in un essiccatore.
    2. Circondare il perimetro del wafer di silicio con circa 50 μL di tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluoroottil) silano. Collegare il vuoto (pompa per vuoto o linea di vuoto domestico) e funzionare per 20 minuti.
  2. Stampaggio replica PDMS
    1. In un contenitore usa e getta (ad esempio, pesare una barca, un bicchiere di plastica), mescolare la base di elastomero PDMS con un indurente con un rapporto di peso di 10:1 su una bilancia elettronica. Versare la soluzione PDMS sul wafer di silicio e posizionare la miscela sotto vuoto per rimuovere tutte le bolle d'aria.
    2. Polimerizzare a 65 °C per un minimo di 4 ore permettendo al PDMS di solidificarsi. Usando la punta di una lama di rasoio, ritagliare il PDMS stampato e staccarlo dal wafer di silicio.
    3. Utilizzando un punzone bioptico affilato, rimuovere PDMS dall'ingresso/uscita del dispositivo. Per questo dispositivo, sono stati utilizzati punzoni bioptici da 0,75 mm e 3 mm rispettivamente per gli ingressi e le uscite.
      NOTA: Il punzone per biopsia utilizzato deve avere un diametro leggermente inferiore rispetto al diametro esterno del tubo di interconnessione per garantire una tenuta ermetica dei tubi nei serbatoi.
  3. Pulizia sonicazione del PDMS
    1. Immergere i dispositivi PDMS in IPA e posizionarli in un sonicatore per 30-45 minuti per rimuovere eventuali detriti PDMS dall'ingresso/uscita. PDMS può gonfiarsi nella soluzione IPA.
    2. Risciacquare con acqua deionizzata e porre in forno a 65 °C per una notte per consentire al PDMS di rigonfiarsi alle dimensioni normali.
      NOTA: eventuali residui possono ostruire il dispositivo durante la sperimentazione. Grandi pezzi di detriti possono essere rimossi dalla superficie PDMS utilizzando un pezzo di scotch prima della sonicazione.

7. Fabbricazione del dispositivo: legame PDMS / attacco del filo

NOTA: Questa fase comporta il trattamento della superficie del PDMS e del substrato di vetro con un plasma di ossigeno per formare un legame irreversibile tra il PDMS e il vetro38. La ricetta fornita potrebbe dover essere adattata al sistema esatto utilizzato in laboratorio.

  1. Tagliare i dispositivi a misura e assicurarsi che la superficie del dispositivo PDMS sia pulita. In caso contrario, seguire i passaggi indicati nella sottosezione 6.3.
  2. Programmare il generatore di plasma. Impostare la potenza su 70 W, il tempo su 35 s, la pressione su 325 mTorr, la portata dell'ossigeno gassoso su 60 SCCM. Posizionare il PDMS e il vetro dell'elettrodo nel sistema con le funzionalità rivolte verso l'alto ed eseguire il programma.
  3. Rimuovere i dispositivi e allineare rapidamente le caratteristiche del canale agli elettrodi utilizzando uno stereoscopio. Applicare saldamente una pressione dal centro del PDMS verso i lati per rimuovere eventuali bolle d'aria indesiderate sull'interfaccia di incollaggio.
  4. Posizionare in un luogo caldo a 95 °C per almeno 2 minuti per finalizzare la procedura di incollaggio e lasciare raffreddare il dispositivo a RT.
  5. Tagliare 2 pezzi di filo solido da 22 G a ~ 6 "lunghezze e rimuovere l'isolante da entrambe le estremità.
  6. Incollare i fili ai cuscinetti degli elettrodi utilizzando resina epossidica conduttiva d'argento. Collocare i dispositivi completati in un forno a 65 °C durante la notte.

Figure 2
Figura 2: Fabbricazione di microdispositivi. (A) Fabbricazione di canali microfluidici - Fasi chiave: pulizia dei wafer di silicio (fasi 2.1.1-2.1.3), rivestimento fotoresistente e cottura morbida (fasi 2.1.7-2.1.8), esposizione ai raggi UV (fase 2.1.10), sviluppo (fase 2.1.12) e versamento PDMS (sottosezione 6.2). (B) Fasi chiave della fabbricazione degli elettrodi: pulizia del vetrino (fasi 2.1.1-2.1.3), rivestimento HMDS e rivestimento fotoresist (fasi 2.2.3-2.2.4), esposizione ai raggi UV (fase 2.2.8), sviluppo (fase 2.2.9), incisione HF (sezione 3), deposizione fisica da vapore (sezione 4) e decollo fotoresist (sezione 5). (C) Fasi chiave della finalizzazione del dispositivo: accesso all'ingresso/uscita e sonicazione (passaggio 6.2.3 e sezione 6.3), incollaggio PDMS e attacco del filo (sezione 7). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

8. Coltura cellulare e raccolta

NOTA: devono essere utilizzate colture cellulari standard e procedure di manipolazione sterili. Seguire il protocollo specifico del tipo di cellula per la coltura cellulare.

  1. Coltura cellulare
    1. Passaggio cellulare: coltura e passaggio delle cellule seguendo i passaggi 8.1.2-8.1.5.
    2. Coltura di cellule HEK293 in soluzione completa di DMEM (88% DMEM, 10% siero fetale bovino inattivato dal calore, 1% L-glutammina, 1% penicillina-streptomicina) in un matraccio T25 in un incubatore a 37 °C, 95% O2, 5% CO2. Cellule di passaggio nei tempi previsti quando raggiungono ~ 80% di confluenza.
    3. Aspirare il fluido utilizzando una pipetta o un sistema a vuoto e incubare le cellule in tripsina-EDTA allo 0,25% (pallone da 2 mL-T25) per 2 minuti a 37 °C. Neutralizzare la tripsina con il doppio del volume dei terreni di coltura.
    4. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare le celle HEK293 a 770 x g per 2 minuti. Aspirare il surnatante utilizzando una pipetta o un sistema a vuoto
    5. Risospendere le cellule HEK293 in 1 mL di DMEM preriscaldato.
    6. Placcatura cellulare: placcare le celle seguendo i passaggi 8.1.7-8.1.8
    7. Placcare le cellule con una diluizione da 10:1 a 20:1 in un matraccio T25 (5 ml di DMEM) per continuare la coltura.
    8. Placcare le cellule con una diluizione da 5:1 a 20:1 in una piastra a 6 pozzetti (2 ml di DMEM per pozzetto) da raccogliere per esperimenti di elettroporazione.
      NOTA: cellule HEK293 placcate 24 ore prima degli esperimenti di elettroporazione per ottenere ~ 70% di confluenza al prelievo cellulare (sottosezione 8.3). Un programma di raccolta incoerente può portare a variabilità nei risultati dell'elettroporazione.
  2. Tampone per elettroporazione
    1. Preparare il tampone per elettroporazione
      NOTA: Fare riferimento a Sherba et al. per le specifiche sulla preparazione del tampone di elettroporazione8. La composizione tampone era 285 mM di saccarosio, 0,7 mM MgCl2, 1 mM KCl, 10 mM HEPES, 3 mM NaOH (pH: 7,4; osmolalità: 310 mOsm, conducibilità: 500 μS/cm). Il tampone per elettroporazione deve essere formulato in modo sterile e conservato a 4 °C per una durata di conservazione di ~ 1 mese. La formulazione del tampone per elettroporazione deve essere ottimizzata in base al tipo di cellula.
  3. Raccolta cellulare e aggiunta di pDNA
    1. Seguire gli stessi passaggi del passaggio cellulare (8.1.2-8.1.4).
    2. Lavare le cellule in 1x PBS sterile, sospensione di cellule di trasferimento in un tubo conico da 15 mL e centrifugare le celle a 770 x g per 2 minuti.
    3. Lavare il pellet cellulare HEK293 nel tampone di elettroporazione e centrifugare a 770 x g per 2 minuti. Risospendere le cellule nel tampone di elettroporazione a ~ 5 milioni di cellule / ml.
      NOTA: la densità delle celle deve essere ottimizzata per tipo di cella.
    4. Aggiungere la codifica del pDNA per la proteina fluorescente verde (GFP) a una concentrazione finale di 20 μg/ml. Mescolare delicatamente la sospensione pDNA/cellula e trasferire la sospensione in una siringa da 1 cc per la sperimentazione.

9. Configurazione hardware/sperimentale

NOTA: Prima di raccogliere le celle per la sperimentazione, assicurarsi che la configurazione sperimentale sia completata per ridurre al minimo la quantità di tempo in cui le celle sono sospese nel tampone di elettroporazione. Accendi l'elettronica 20-30 minuti prima degli esperimenti per riscaldarti. Fare riferimento alla Figura 3 per uno schema della configurazione sperimentale per il funzionamento del modulo di rilevamento a cella singola.

NOTA: È stato sviluppato un circuito Op-Amp PA90 personalizzato per soddisfare sia la sensibilità richiesta per il rilevamento del livello a cella singola utilizzando l'amplificatore lock-in sia le alte tensioni richieste per applicare impulsi di elettroporazione sufficientemente forti. Fare riferimento alla scheda tecnica PA90 per le specifiche sui circuiti consigliati39.

  1. Inizializzare l'amplificatore lock-in con le impostazioni del preamplificatore corrente e impostarlo tramite l'algoritmo. Fare riferimento a Zheng et al. per le specifiche sulle impostazioni di lock-in32.
  2. Alimentatori, generatore di funzioni e amplificatore
    1. Alimentazione 1: impostata su -15 V per alimentare l'estremità negativa del circuito.
    2. Alimentatore 2 (generatore di funzioni): impostare l'uscita del segnale CC e impostare l'ampiezza su 2 V. Collegare all'ingresso dell'amplificatore 50x.
    3. Programma Generatore di impulsi di elettroporazione per l'onda quadra: imposta la larghezza dell'impulso desiderata (duty cycle) e l'ampiezza dell'impulso desiderata (Volt).
    4. Impostare l'uscita sulla modalità trigger (1 impulso). Collegare l'uscita all'ingresso dell'amplificatore 50x.
      NOTA: Ricordare il guadagno 50x quando si programma l'ampiezza dell'impulso. Cioè, per ottenere un'intensità del campo elettrico di 1 kV / cm, è necessario un totale di 30 V, 30 V / 300 μm (distanza tra gli elettrodi), quindi l'uscita del generatore di funzioni deve essere impostata su 30/50 o 600 mV.
    5. Verificare le uscite dell'amplificatore 50x utilizzando un oscilloscopio. Uscita 1-100 V dall'alimentatore 2 (9.2.2). Uscita 2-Ampiezza variabile per l'impulso di elettroporazione (9.2.4).
    6. Collegare una sonda 10x a un canale dell'oscilloscopio e al micro-dispositivo completato (dispositivo in prova, DUT) nel passaggio 7.6 in cui verrà applicato l'impulso di elettroporazione. Monitorare il sistema durante la sperimentazione per assicurarsi che gli impulsi vengano applicati.
    7. Assicurarsi che il lock-in USB sia collegato e registrato. Ricontrolla tutte le impostazioni di lock-in nel codice dell'algoritmo (soprattutto, la frequenza di uscita del lock-in).
  3. Microscopio/telecamera CCD
    1. Posizionare il microdispositivo sul palco del microscopio tramite un supporto per vetrino. Accendere la telecamera CCD e mettere a fuoco il canale microfluidico. Usa un obiettivo 4x o 10x.

Figure 3
Figura 3: Schema di configurazione sperimentale-Rilevamento di singole celle. L'amplificatore operazionale ad alta potenza (PA-90) consente la sovrapposizione dell'impulso di elettroporazione ad alta tensione sul segnale CA di uscita lock-in necessario per il rilevamento a cella singola. Questo segnale di eccitazione passa attraverso il dispositivo di micro-elettroporazione (Device Under Test, DUT) dove la corrente viene poi amplificata dal preamplificatore di corrente e immessa nell'algoritmo. Il sistema monitora continuamente l'evento di rilevamento delle celle. All'ingresso della cella, un segnale digitale viene generato dall'amplificatore lock-in per attivare l'applicazione dell'impulso di elettroporazione alle celle in transito. Legenda: PA-90 (amplificatore operazionale ad alta potenza), DUT (dispositivo in prova), DIO (ingresso/uscita digitale), FG-EP (generatore di funzioni / impulso di elettroporazione), 50X (amplificatore 50X), PS-V- (alimentazione / tensione negativa per PA 90), FG-V+ (generatore di funzioni, tensione positiva per PA 90). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

10. Funzionamento sperimentale

  1. Innescamento del canale microfluidico
    1. Rimuovere tutte le bolle d'aria dalla siringa caricata con cellula. Collegare un ago da 30 G alla siringa caricata con cellule.
    2. Usando una pinzetta, fai scorrere il tubo tygon lungo la lunghezza dell'ago. Pre-riempire il serbatoio di uscita con mezzi di recupero (come il punto 8.1.2 senza gli antibiotici), ~40-50 μL.
    3. Usando il pollice, applicare delicatamente una pressione sullo stantuffo in modo tale che il fluido raggiunga lentamente la fine della linea del tubo.
    4. Fissare la siringa alla pompa della siringa. Accendere la pompa della siringa e assicurarsi che sia impostata per la perfusione in avanti.
    5. Programmare la pompa per il diametro corretto della siringa per garantire che le portate siano accurate. Fare riferimento al manuale della pompa per le specifiche sui diametri delle siringhe.
      NOTA: Per evitare che le cellule si depositino nella siringa, fissare la pompa della siringa su un supporto a morsetto in modo che possa funzionare in posizione verticale con l'estremità della siringa rivolta verso il basso.
    6. Impostare la portata della pompa a siringa, ~ 10-20 μL / min, e lasciare che la pompa funzioni fino a quando il fluido raggiunge la fine della linea di tubi. Fissare i tubi al dispositivo microfluidico.
    7. Ridurre la portata della pompa a siringa, ~5-10 μL/min, e lasciare che la pompa funzioni fino a quando tutta l'aria non viene espulsa dal dispositivo microfluidico e le celle attraversano l'uscita del dispositivo.
    8. Rimuovere le celle dall'uscita tramite l'aspirazione della pipetta. Riempire nuovamente il serbatoio di uscita con mezzi di recupero (come al punto 8.1.2 senza antibiotici), ~40-50 μL.
  2. Mappatura della permeabilizzazione della membrana a cella singola per elettroporazione
    NOTA: Fare riferimento alla Figura 4 e alla Figura 5 per una migliore comprensione dei dati elettrici indicativi rispettivamente della permeabilizzazione della membrana cellulare e della mappatura della permeabilizzazione della membrana cellulare.
    1. Impostare la portata della pompa a siringa su ~0,1-0,3 μL/min per garantire un flusso di singole celle attraverso il set di elettrodi. Il tempo di transito della cella tra gli elettrodi dovrebbe essere ~ 250 ms.
    2. Avviare il programma per computer facendo clic su Esegui. Assicurarsi che il sistema stia salvando i dati elettrici.
    3. Assicurarsi che il sistema rilevi in modo affidabile le celle per attivare le applicazioni a impulsi controllate dal computer. Regolare la soglia di rilevamento di conseguenza.
    4. Impostare i parametri di impulso per l'impulso iniziale di elettroporazione con energia elettrica più bassa. Fare riferimento alla Tabella 1 per i parametri di elettroporazione pulsata in questo studio.
    5. Accendere il canale di uscita per il generatore di impulsi di elettroporazione (passaggio 9.2.3.).
    6. Seguire un numero predeterminato di applicazioni di rilevamento/impulso cellulare (n = 100). Al termine di ogni condizione testata, aspirare le celle dalla presa del microdispositivo e ricostituire l'uscita con i mezzi di recupero.
    7. Iterare fino alla successiva condizione di impulso di elettroporazione. Ripetere l'operazione fino a testare tutte le condizioni dell'impulso di elettroporazione.
    8. Determinare il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare per ogni applicazione di impulso testata. (La convalida post-processo è descritta nella sottosezione 11.1). Generare la mappa di permeabilizzazione della membrana cellulare (Figura 5).
    9. Determinare i parametri dell'impulso di elettroporazione per un feedback basato sulla popolazione ad alta produttività.
    10. Spegnere la pompa della siringa, rimuovere le celle dal serbatoio di uscita e riempire l'uscita con il mezzo di recupero.
  3. Elettroporazione controllata da feedback basata sulla popolazione - elevata produttività
    NOTA: fare riferimento alla Figura 6 per uno schema che illustra il processo di feedback basato sulla popolazione.
    1. Impostare la portata della pompa a siringa su ~1-3 μL/min per garantire un flusso di singole celle attraverso il set di elettrodi. Il tempo di transito della cella tra gli elettrodi dovrebbe essere ~ 25 ms.
    2. Impostare l'ampiezza dell'impulso sulla condizione "ottimizzata" (10.2.9), disattivare la modalità trigger e impostare la larghezza dell'impulso in modo che corrisponda al tempo di transito della cella.
    3. Impostare il ciclo di lavoro in modo tale che il tempo di accensione dell'impulso corrisponda alla condizione "ottimizzata". Fare riferimento alla Tabella 1.
    4. Impostare il generatore di funzioni del canale di uscita su ON, accendere la pompa a siringa e lasciare che il sistema funzioni fino a quando il numero desiderato di celle non è stato elettroporato.
    5. Al termine, spegnere sia la pompa a siringa che il generatore di funzioni.
    6. Trasferire le cellule dal serbatoio di uscita nel pallone/piastra di coltura cellulare di dimensioni appropriate riempito con mezzi di recupero preriscaldati e trasferire il pallone/piastra di coltura nell'incubatore.

11. Analisi

  1. Rilevamento della permeabilizzazione della membrana a livello di singola cellula
    NOTA: Per garantire che l'impulso "ottimale" sia stato utilizzato durante il modulo ad alta produttività, è necessario eseguire un'analisi post-esperimento per verificare i dati elettrici esportati dalla sottosezione 10.2. Fare riferimento alla Figura 4 per una rappresentazione grafica del segnale elettrico rappresentativo della permeabilizzazione della membrana dovuta all'elettroporazione.
    1. Caricare i dati in un software di analisi (MATLAB, Python, ecc.). Genera un grafico di Corrente rispetto al Tempo per ogni condizione pulsante.
    2. Determinare manualmente il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare (Δ IP/ΔIC). Fare riferimento alla Figura 4. Generare la mappa di permeabilizzazione della membrana cellulare (Δ IP / ΔIC versus Electrical Energy, Figura 5) su tutte le condizioni di impulso testate. Verificare la condizione pulsante "ottimale".
  2. efficienza elettro-trasfezione (eTE)
    1. Dopo il periodo di incubazione di 24 ore, rimuovere le cellule elettroporate dall'incubatore.
    2. Eseguire una colorazione cellulare viva. Diluire DRAQ5 1:1000 fino ad una concentrazione finale di 5 μM nel recipiente di coltura cellulare. Mescolare delicatamente le cellule/la soluzione colorante e incubare a 37 °C per 5-30 minuti.
      NOTA: in questo passaggio è possibile implementare una colorazione diversa. Assicurarsi che le proprietà fluorescenti non si sovrappongano al marcatore fluorescente che indica una corretta elettrotrasfezione (cioè, GFP è nella lunghezza d'onda verde e DRAQ5 è il rosso lontano).
    3. Accendere un microscopio epifluorescente, una lampada e una fotocamera (vedere Tabella dei materiali).
    4. Rimuovere le cellule dall'incubatore e metterle a fuoco sul microscopio.
    5. Acquisire un'immagine a contrasto di fase (campo chiaro) del campo selezionato.
    6. Cattura immagini epifluorescenti dello stesso campo utilizzando i filtri FITC (GFP) e Far-Red (DRAQ5). Analizza i set di immagini manualmente o tramite un algoritmo.
      NOTA: fare riferimento alla Figura 7 per le immagini rappresentative.
    7. Contare il numero totale di celle GFP-positive in tutte le immagini. Contare il numero totale di celle colorate DRAQ5 in tutte le immagini. Calcolare l'eTE (rapporto tra cellule GFP positive e celle colorate con DRAQ5).

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Representative Results

La figura 4 evidenzia i principi operativi alla base del rilevamento della permeabilizzazione della membrana a livello di singola cellula per un'ampiezza di impulso singolo. Dopo l'avvio dell'esperimento di elettroporazione, l'algoritmo di rilevamento cellulare determina una soglia ottimale per il rilevamento delle cellule tramite un metodo di rilevamento punto per punto, basato sulla pendenza. Il sistema monitora quindi continuamente (1) una variazione negativa significativa della corrente elettrica misurata, che è indicativa dell'ingresso di una cella. Ciò è dovuto alla natura isolante della membrana cellulare biologica, tale che quando la cellula attraversa il set di elettrodi, c'è un aumento istantaneo dell'impedenza, con conseguente forte diminuzione della corrente misurata, consentendo un rilevamento coerente della cella (2), che alla fine innesca il passaggio all'applicazione a impulsi controllata dal computer (4). La cella isolata sposta un volume di elettrolita tra gli elettrodi, causando un calo di corrente proporzionale alle dimensioni della cella. Questa variazione di corrente è indicata come ΔIC (3). Immediatamente dopo il calcolo di ΔIC, l'impulso elettrico predeterminato viene somministrato (4) alla cellula in transito. Questo afflusso istantaneo di energia introduce un breve artefatto di rilevamento nel sistema (scatola grigia). Dopo il ri-blocco del segnale, cioè il ritorno al monitoraggio della cella, (5) è evidente che l'impulso di elettroporazione permeabilizza la membrana cellulare quando l'entità della variazione di corrente dovuta alla presenza della cella tra l'elettrodo impostato scende all'uscita (6). La differenza nelle due cadute di corrente dovute alla grandezza di impedenza della cella pre / post applicazione dell'impulso di elettroporazione è chiamata corrente di permeabilizzazione ed è indicata come ΔIP. Una volta che la cella esce dal volume tra gli elettrodi, la linea di base si stabilizza e il sistema ritorna alla modalità di rilevamento della cella (1). Dopo che un numero predeterminato di celle è stato elettroporato, viene testato il successivo impulso di elettroporazione a più alta energia (fare riferimento alla Tabella 1 per le impostazioni dell'impulso). Per ogni impulso di elettroporazione testato, viene determinato un "grado medio di permeabilizzazione della membrana". Questo valore è calcolato come Δ IP/ΔIC. Una volta testato ogni impulso di elettroporazione predeterminato, il Δ IP/ΔIC viene tracciato rispetto alla densità di energia elettrica applicata (σ x E 2 x t), dove σ è la conduttività della soluzione (S/cm), E è l'intensità del campo elettrico (kV/cm) e t è la durata dell'impulso (ms). Fare riferimento alla Figura 5 per la mappa di permeabilizzazione della membrana cellulare per le cellule HEK293 utilizzata in questo esempio.

Tabella 1: Parametri dell'impulso di elettroporazione. Per questo studio, sono stati scelti impulsi di elettroporazione tali che il flusso di carica (σ×E×t) rimanga costante, dove σ è la conduttività della soluzione ( S / cm), E è l'intensità del campo elettrico (kV / cm) e t è la durata dell'impulso (ms). Il risultato è uno spettro dell'energia elettrica a impulsi applicata. Vengono forniti esempi del ciclo di lavoro richiesto (c.c.) per ottenere i parametri di impulso specificati per un aumento del 5× e del 10× della portata iniziale (rilevamento a cella singola). Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figure 4
Figura 4: Permeabilizzazione di membrane monocellulari - Funzionamento dell'algoritmo. (In alto) Registrazione elettrica di una serie di rilevamenti a cella singola / applicazioni a impulsi (indicati dai picchi acuti di corrente). (In basso) Funzionamento del sistema per il rilevamento e il pulsare di una singola cella. (1) Il sistema rileva continuamente una variazione della corrente, tramite un calcolo della pendenza punto per punto. (2) Viene rilevata una forte diminuzione della pendenza, indicativa dell'ingresso di una cella tra gli elettrodi e attiva l'applicazione a impulsi controllata dal computer. (3) Viene determinata una caduta di corrente (ΔIC) proporzionale alla dimensione della cella. (4) L'impulso di elettroporazione viene applicato alla cella in transito, causando un artefatto di rilevamento nel segnale elettrico (scatola grigia). (5) L'amplificatore lock-in torna al monitoraggio della cella mentre si riblocca nella cella in transito. (6) La cella esce dal set di elettrodi, causando un altro picco di magnitudo minore nella corrente (Δ IC > (I 6 - I5)). La differenza nelle misurazioni dell'impedenza è dovuta alla formazione dei pori attraverso la membrana cellulare isolata. Questa variazione di corrente è chiamata corrente di permeabilizzazione (ΔIP). Viene calcolato il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare (Δ IP/ΔIC). La linea di base si stabilizza e il sistema ritorna alla modalità di rilevamento (1). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Si osserva una correlazione distinta tra l'energia elettrica applicata e il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare (Figura 5), con l'esistenza di una regione di transizione in cui si verifica un sostanziale aumento del grado di permeabilizzazione della membrana cellulare. A tal fine, viene selezionato un impulso con energia elettrica che supera questa regione di transizione per la fase ad alta produttività del processo di micro-elettroporazione (Figura 6). In questo esperimento, l'impulso di 1,8 kV/cm: 670 μs è stato determinato come "ottimale". Come descritto in dettaglio nella sottosezione 10.3 del protocollo, la portata del sistema viene aumentata e il generatore di funzioni impostato per emettere continuamente un impulso con un impulso impostato e un ciclo di lavoro (fare riferimento alla Tabella 1 per le impostazioni degli impulsi per portate di 1,5 μL/min e 3,0 μL/min) per garantire che 1 impulso venga applicato a ciascuna cella in transito. In questo studio, la portata è stata aumentata di 5x, quindi la larghezza dell'impulso è stata impostata a 50 ms (corrispondente al tempo di transito della cella) con un ciclo di lavoro (DC) del 2,7%.

Figure 5
Figura 5: Mappatura della permeabilizzazione della membrana cellulare HEK293 -Δ Ip/ ΔIc rispetto all'energia elettrica. I dati elettrici (Δ IP/ ΔIC) sono rappresentati come media ± SEM. Condizioni di pulsazione (da sinistra a destra) - 0,4 kV/cm: 3 ms, 0,8 kV/cm: 1,5 ms, 1,0 kV/cm: 1,2 ms, 1,2 kV/cm: 1 ms, 1,8 kV/cm: 0,67 ms, 2,4 kV/cm: 0,5 ms. Si osserva una chiara correlazione tra il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare e la densità di energia elettrica dell'impulso applicato. Per questo ciclo di sperimentazione, la condizione di impulso di 1,8 kV/cm: 0,67 ms è stata selezionata come impulso di elettroporazione "ottimale" per il modulo ad alta produttività. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Flusso di lavoro del processo di elettroporazione controllata da feedback basato sulla popolazione cellulare. Per iniziare, viene programmata una portata iniziale (Q0) per consentire l'interrogazione elettrica a livello di singola cella. Un numero programmabile di celle viene pulsato ad ogni condizione di impulso di elettroporazione predeterminata (da E 0/t0 a E N/tN), con l'energia elettrica applicata che aumenta ad ogni iterazione delle applicazioni di impulsi di elettroporazione. Dopo il completamento dell'impulso di energia elettrica più elevato incluso nello studio, E N/tN, viene tracciata la curva di permeabilizzazione della membrana cellulare e viene determinato l'impulso di elettroporazione ottimale per la popolazione cellulare in prova. Il sistema passa alla modalità a throughput elevato, in cui la portata viene aumentata althroughput Q e vengono omesse le fasi di interrogazione a cella singola che limitano la velocità. Il treno di impulsi ottimale verrà applicato continuamente E opt / t opt a d.c.opt in modo tale che ogni cella in transito riceverà un singolo impulso di elettroporazione basato sul tempo di transito della cella e sul ciclo di lavoro della larghezza dell'impulso (d.c.). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Dopo 24 ore di recupero post-elettroporazione, le cellule sono state visualizzate per determinare l'efficienza di elettro-trasfezione (eTE). Come descritto nella sottosezione 11.2 del protocollo, l'eTE è stato determinato come il numero totale di cellule che esprimono GFP normalizzato al numero totale di cellule colorate con DRAQ5. L'eTE per l'impulso di 1,8 kV/cm: 670 μs è stato determinato essere ~70% (Figura 7A). Per evidenziare l'importanza del sistema di mappare con precisione il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare e selezionare un'energia di impulso di elettroporazione sufficientemente elevata durante la transizione alla modalità ad alta produttività, è stata esplorata anche la condizione di impulso 0,4 kV/cm: 3 ms in termini di eTE (Figura 7B). In questo caso, l'eTE risultante a 24 ore era inferiore al 5%.

Figure 7
Figura 7: Efficienza elettro-Transfezione-GFP espressione a 24 h. Le cellule HEK293 sono state incubate a 37 °C per 24 ore dopo esperimenti di micro-elettroporazione. Tutte le cellule sono state colorate con DRAQ5 (rosso) e l'efficienza di elettro-trasfezione (eTE) è stata determinata in base al rapporto tra le cellule che esprimono GFP (verde) e il numero totale di cellule (rosso). La vitalità cellulare non è stata valutata come metrica di esito in questo studio. (A) Immagine rappresentativa, impilata a fluorescenza 4× delle cellule HEK293 trasfettate con successo tramite un impulso di 1,8 kV/cm: 670 μs che mostra eTE di circa il 70%. (B) Immagine rappresentativa, impilata a fluorescenza 4× di cellule HEK293 trasfettate senza successo tramite un impulso di 0,4 kV/cm: 3 ms che mostra eTE << 5%. Barra scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare 1: Schema CAD 2-dimensionale. Il dispositivo di microelettroporazione è costituito da un microcanale dritto largo 100 μm con ingresso di 1 mm di diametro e uscita di 3 mm di diametro. Ogni traccia di elettrodo è larga 100 μm e il set di elettrodi comprende la regione di elettroporazione del dispositivo, che è lunga 300 μm. L'altezza 3-dimensionale del micro-canale è controllata dallo spessore del fotoresist. In questo lavoro, l'altezza del dispositivo era di 20 μm. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

La metodologia presentata all'interno di questo protocollo si concentra principalmente sulla microfabbricazione di un dispositivo microfluidico che viene poi integrato in una configurazione sperimentale di elettroporazione specializzata. Il termine "ricetta", che viene spesso utilizzato quando si descrivono le specifiche del processo di microfabbricazione, suggerisce l'importanza di seguire / ottimizzare ogni fase per fabbricare con successo un dispositivo funzionante. Tuttavia, alcune fasi critiche all'interno del processo, quando non ottimizzate, come il tempo / energia di esposizione ai raggi UV, i tassi / durate di sputtering PVD e le impostazioni del generatore di plasma di ossigeno, possono essere problematici sia per il processo di fabbricazione che per la corretta esecuzione degli esperimenti di elettroporazione. La risoluzione dei problemi del processo di fabbricazione viene eseguita principalmente tramite tentativi ed errori o un design sperimentale di progettazione di esperimenti più controllato. Inoltre, esistono tecniche di microfabbricazione alternative, come Deep Reactive Ion Etching (DRIE), che possono essere sostituite per eseguire le diverse fasi all'interno del protocollo (ad esempio, utilizzando una struttura di stampaggio incisa DRIE per eseguire il processo di litografia morbida). Inoltre, l'ottimizzazione delle ricette e la progettazione / fabbricazione di dispositivi può richiedere molto tempo per i principianti sul campo. Tuttavia, una volta che il processo di microfabbricazione è stato sviluppato con successo, l'ingegnere / scienziato ha la libertà di progettare un dispositivo adatto alle sue esigenze specifiche.

A tal fine, il dispositivo descritto all'interno di questo protocollo è stato sviluppato per espandere il nostro precedente lavoro32. Ciò ha comportato l'utilizzo del rilevamento elettrico di permeabilizzazione della membrana a membrana a singola cellula, ma in modo più elevato. La configurazione sperimentale descritta all'interno richiede la necessità di attrezzature specializzate, cioè amplificatori lock-in, che possono essere rari al laboratorio di ricerca standard e quindi limitare il potenziale raggio d'azione e adattabilità di questa tecnica. Tuttavia, un dispositivo di elettroporazione microfluidica "nudo" può essere implementato seguendo questo protocollo, richiedendo solo un generatore di funzioni e possibilmente un amplificatore di tensione per generare gli impulsi di elettroporazione.

Tuttavia, questa piattaforma di micro-elettroporazione si distingue da altre tecnologie di elettroporazione a cella singola. La capacità di rilevare e ottimizzare elettricamente i parametri di elettroporazione su una sospensione a cella singola in un ambiente a flusso continuo è davvero innovativa. Il lavoro futuro prevede l'ottimizzazione degli altri importanti parametri sperimentali relativi ai risultati positivi dell'elettroporazione (vedi Figura 1) per migliorare ulteriormente l'efficacia complessiva di questa piattaforma. Ulteriori saggi di vitalità e metabolici saranno sviluppati e implementati per valutare eventuali effetti negativi a valle associati alla piattaforma di micro-elettroporazione. Inoltre, il design microfluidico può continuare ad essere migliorato per ottenere un maggiore rendimento cellulare, come è stato dimostrato da altri gruppi40. Dopo aver affrontato queste preoccupazioni, questa tecnologia ha il potenziale per essere adottata nel processo di produzione della terapia cellulare per eseguire la consegna genica e / o l'editing genetico, poiché questa metodologia è altamente suscettibile sia a un processo chiuso che automatizzato.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno finanziario della National Science Foundation (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) e della formazione universitaria del Dipartimento dell'Istruzione degli Stati Uniti in aree emergenti di precisione e medicina personalizzata (P200A150131) per finanziare lo studente laureato J.J.S. sulla borsa di studio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
150-mm diameter petri dishes VWR 25384-326 step 6.1.1 to secure wafer
24-well tissue culture plates VWR 10062-896 step 10.3.6 to plate electroporated cells
33220A Waveform/Function generator Agilent step 9.2.3 electroporation pulse generator
4'' Si-wafers University Wafer subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication
6-well tissue culture plates VWR 10062-892 step 8.1.8 to plate cells
Acetone Fisher Scientific A18-4 step 2.1.2 for cleaning and  step 5.1 photoresist lift-off
Allegra X-22R Centrifuge Beckman Coulter steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells
AutoCAD 2018 Autodesk subsection 1.1. to design transparency masks
Buffered oxide etchant 10:1 VWR 901621-1L subsection 3.1 for HF etching
CCD Monochrome microscope camera Hamamatsu Orca 285 C4742-96-12G04 step 11.2.3. for imaging
CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP PCO subsection 9.3 part of the experimental setup
Conductive Epoxy CircuitWorks CW2400 subsection 7.6. for wire attachement
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-70C step 8.1.4. for cell centrifuging
Dektak 3ST Surface Profilometer Veeco (Sloan/Dektak) step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry
Disposable biopsy punch, 0.75 mm Robbins Instruments RBP075 step 6.2.3 for inlet access
Disposable biopsy punch, 3 mm Robbins Instruments RBP30P step 6.2.3 for outlet access
DRAQ5 abcam ab108410 step 11.2.2. for live cell staining
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium ThermoFisher Scientific 11885084 step 8.1.2. part of media composition
E3631A Bipolar Triple DC power supply Agilent step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup
Eclipse TE2000-U Inverted  Microscope Nikon  subsection 9.3. part of the experimental setup
EVG620 UV Lithography System EVG  step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure
Fetal Bovine Serum Neuromics FBS001 step 8.1.2. part of media composition
FS20 Ultrasonic Cleaner Fisher Scientific subsection 5.1. for photoresist lift-off
Glass Media Bottle with Cap, 100mL Fisher Scientific FB800100 step 8.2.1. for buffer storage
Glass Media Bottle with Cap, 500mL Fisher Scientific FB800500 step 8.1.2.for media storage
HEK-293 cell line ATCC CRL-1573 subsection 8.1 for cell culturing
HEPES buffer solution Sigma Aldrich 83264-100ML-F step 8.2.1 part of electroporation buffer composition
Hexamethyldisilazane Sigma Aldrich 379212-25ML step 2.2.3 adhesion promoter
HF2LI Lock-in Amplifier Zurich Instruments subsection 9.2 part of the experimental setup
HF2TA Current amplifier Zurich Instruments subsection 9.2 part of the experimental setup
Isopropyl Alcohol Fisher Scientific A459-1 step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS
IX81 fluorescence microscope Olympus step 11.2.3 for imaging
L-Glutamine Solution Sigma Aldrich G7513-20ML step 8.1.2. part of media composition
M16878/1BFA 22 gauge wire AWC B22-1 subsection 7.5 for device fabrication
Magnesium chloride Sigma Aldrich 208337-100G step 8.1.2 part of electroporation buffer composition
MF 319 Developer Kayaku Advanced Materials 10018042 step 2.2.9. photoresist developer
Microposit S1818 photoresist Kayaku Advanced Materials 1136925 step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning
Microscope slides, 75 x 25 mm VWR 16004-422 step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate
Model 2350 High voltage amplifier TEGAM 2350 step 9.2.5. part of the experimental setup
National Instruments LabVIEW National Instruments data acquisition
Needle, 30G x 1 in BD Scientific 305128 step 10.1.1. part of the system priming
PA90 IC OPAMP Power circuit Digi-key 598-1330-ND Part of the custom circuit
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P4458-20ML step 8.1.2. part of media composition
Plasmid pMAX-GFP Lonza VCA-1003 step 8.3.4. for intracellular delivery
Plastic tubing, 0.010'' x 0.030" VWR 89404-300 step 10.1.2. for system priming
Platinum targets Kurt J. Lesker subsection 4.2. for physical vapor deposition
Potassium chloride Sigma Aldrich P9333-500G step 8.2.1. part of electroporation buffer composition
Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump Harvard Apparatus MA1 70-2213 step 10.1.4. for system priming
PVD75 Physical vapor deposition system Kurt J. Lesker subsection 4.1. for physical vapor deposition
PWM32 Spinner System Headway Research steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist
PX-250 Plasma treatment system March Instruments subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding
SDG1025 Function/Waveform generator Siglent step 9.2.2. part of the experimental setup
Sodium hydroxide Sigma Aldrich S8045-500G step 8.2.1. part of electroporation buffer composition
SU-8 2010 negative photoresist Kayaku Advanced Materials Y111053 step 2.1.7. for microfluidic channel patterning
SU-8 developer Microchem Y010200 step 2.1.12. for photoresist developing
Sucrose Sigma Aldrich S7903-1KG step 8.2.1. part of electroporation buffer composition
Sylgard 184 elastomer kit Dow Corning 3097358-1004 step 6.2.1  10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent
Syringe, 1 ml BD Scientific 309628 step 8.3.4. part of system priming
SZ61 Stereomicroscope System Olympus subsection 7.3. for channel and electrode alignment
Tissue Culture Treated T25 Flasks Falcon 353108 step 8.1.2 for cell culturing
Titanium targets Kurt J. Lesker subsection 4.2. for physical vapor deposition
Transparency masks CAD/ART Services steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma Aldrich 448931-10G step 6.1.2. for wafer silanization
Trypsin-EDTA solution Sigma Aldrich T4049-100ML steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting

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References

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