Summary
Este estudo relata uma nova abordagem para medir múltiplos parâmetros funcionais mitocondriais com base na citometria de fluxo e dupla coloração com dois repórteres fluorescentes ou anticorpos para detectar alterações no volume mitocondrial, potencial de membrana mitocondrial, nível de espécies reativas de oxigênio, composição da cadeia respiratória mitocondrial e DNA mitocondrial.
Abstract
As mitocôndrias são importantes na fisiopatologia de muitas doenças neurodegenerativas. Alterações no volume mitocondrial, no potencial de membrana mitocondrial (MMP), na produção mitocondrial de espécies reativas de oxigênio (ROS) e no número de cópias do DNA mitocondrial (mtDNA) são frequentemente características desses processos. Este relatório detalha uma nova abordagem baseada em citometria de fluxo para medir múltiplos parâmetros mitocondriais em diferentes tipos de células, incluindo células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) e células neurais e gliais derivadas de iPSC. Essa estratégia baseada em fluxo usa células vivas para medir o volume mitocondrial, os níveis de MMP e ROS, bem como células fixas para estimar componentes da cadeia respiratória mitocondrial (MRC) e proteínas associadas ao mtDNA, como o fator de transcrição mitocondrial A (TFAM).
Ao co-coloração com repórteres fluorescentes, incluindo MitoTracker Green (MTG), éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE) e MitoSox Red, mudanças no volume mitocondrial, MMP e ROS mitocondrial podem ser quantificadas e relacionadas ao conteúdo mitocondrial. A dupla coloração com anticorpos contra subunidades do complexo MRC e translocase da membrana mitocondrial externa 20 (TOMM20) permite a avaliação da expressão da subunidade MRC. Como a quantidade de TFAM é proporcional ao número de cópias de mtDNA, a medição de TFAM por TOMM20 fornece uma medição indireta de mtDNA por volume mitocondrial. Todo o protocolo pode ser realizado dentro de 2-3 h. É importante ressaltar que esses protocolos permitem a mensuração de parâmetros mitocondriais, tanto no nível total quanto no nível específico por volume mitocondrial, utilizando citometria de fluxo.
Introduction
As mitocôndrias são organelas essenciais presentes em quase todas as células eucarióticas. As mitocôndrias são responsáveis pelo fornecimento de energia, produzindo trifosfato de adenosina (ATP) através da fosforilação oxidativa e atuam como intermediários metabólicos para a biossíntese e o metabolismo. As mitocôndrias estão profundamente envolvidas em muitos outros processos celulares importantes, como a geração de EROs, a morte celular e a regulação intracelular do Ca2+. A disfunção mitocondrial tem sido associada a várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP), a doença de Alzheimer (DA), a doença de Huntington (DH), a ataxia de Friedreich (FRDA) e a esclerose lateral amiotrófica (ELA)1. Acredita-se que o aumento da disfunção mitocondrial e a anormalidade do mtDNA também contribuam para o envelhecimento humano 2,3.
Vários tipos de disfunção mitocondrial ocorrem em doenças neurodegenerativas, e alterações no volume mitocondrial, despolarização da MMP, produção de ERO e alterações no número de cópias do mtDNA são comuns 4,5,6,7. Portanto, a capacidade de medir essas e outras funções mitocondriais é de grande importância ao estudar os mecanismos da doença e testar potenciais agentes terapêuticos. Além disso, diante da falta de modelos animais que repliquem fielmente as doenças neurodegenerativas humanas, o estabelecimento de sistemas de modelos in vitro adequados que recapitulem a doença humana nas células cerebrais é um passo importante para uma maior compreensão dessas doenças e o desenvolvimento de novas terapias 2,3,8,9.
As iPSCs humanas podem ser usadas para gerar várias células cerebrais, incluindo células neuronais e não neuronais (ou seja, células gliais), e danos mitocondriais associados à doença neurodegenerativa foram encontrados em ambos os tipos celulares 3,10,11,12,13. Métodos apropriados para diferenciação de iPSC em linhagens neurais e gliais estão disponíveis14,15,16. Essas células fornecem uma plataforma única para humanos / pacientes para modelagem de doenças in vitro e triagem de medicamentos. Além disso, como estes são derivados de pacientes, os neurônios derivados de iPSC e as células gliais fornecem modelos de doença que refletem o que está acontecendo em humanos com mais precisão.
Até o momento, poucos métodos convenientes e confiáveis para medir múltiplos parâmetros funcionais mitocondriais em iPSCs, particularmente neurônios vivos e células gliais, estão disponíveis. O uso da citometria de fluxo fornece ao cientista uma ferramenta poderosa para medir parâmetros biológicos, incluindo a função mitocondrial, em células individuais. Este protocolo fornece detalhes para a geração de diferentes tipos de células cerebrais, incluindo células-tronco neurais (NSCs), neurônios e astrócitos gliais de iPSCs, bem como novas abordagens baseadas em citometria de fluxo para medir múltiplos parâmetros mitocondriais em diferentes tipos de células, incluindo iPSCs e células neurais e gliais derivadas de iPSC. O protocolo também fornece uma estratégia de co-coloração para o uso de citometria de fluxo para medir o volume mitocondrial, MMP, nível de ROS mitocondrial, complexos MRC e TFAM. Ao incorporar medidas de volume ou massa mitocondrial, esses protocolos também permitem a medição do nível total e do nível específico por unidade mitocondrial.
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Protocol
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais e a Tabela Suplementar S1 para obter receitas de todas as mídias e soluções usadas neste protocolo.
1. Diferenciação de iPSCs humanas em NCSs, neurônios dopaminérgicos (DA) e astrócitos
- Preparar placas revestidas de matriz.
- Descongele um frasco para injetáveis de 5 ml de matriz no gelo durante a noite. Diluir 1 mL de matriz com 99 mL de F-12 (Advanced DMEM/F12) de Advanced Dulbecco (Advanced DMEM/F12) a frio (concentração final de 1%). Fazer alíquotas de 1 ml e armazená-las a -20 °C.
- Descongele a solução da matriz a 4 °C (mantenha-a fria) e revestir 6 poços (1 mL por poço em uma placa de 6 poços).
- Colocar a placa revestida de matriz numa incubadora de ar humidificada a 5%de CO 2/95% a 37 °C durante 1 h. Retire a placa da incubadora e deixe-a se equilibrar à temperatura ambiente (RT).
NOTA: Recomenda-se usar a placa dentro de 3 dias após o revestimento. No entanto, a placa revestida pode ser armazenada por até 2 semanas a 4 °C. Apenas lembre-se de tirá-lo e deixá-lo aquecer para RT antes de usar. Para armazenamento prolongado, adicione 1 mL de meio de cultura iPSC à placa revestida para evitar a secagem da matriz.
- Descongelamento de iPSCs
- Pré-aqueça as placas revestidas de matriz a RT ou na incubadora a 37 °C durante 20-30 min. Pré-aqueça a quantidade necessária de meio de cultura iPSC no RT.
- Misture 6 mL de meio de cultura iPSC pré-aquecido com 12 μL de inibidor de Y-27632 ROCK para obter uma concentração final de 10 μM.
- Descongelar parcialmente o frasco para injetáveis congelado de iPSCs a 37 °C em banho-maria até que permaneça um pequeno pedaço de gelo.
- Adicione lentamente 1 mL de meio de cultura iPSC pré-aquecido com 12 μL de inibidor de ROCK gota a gota às células. Transfira o conteúdo líquido do frasco para injetáveis com iPSCs gota a gota para um poço de uma placa pré-revestida de 6 poços usando uma pipeta de 5 mL.
- Mova a placa em direções perpendiculares para misturar o conteúdo do poço e retornar a placa para a incubadora. Trocar o meio de cultura iPSC após 24 h após a lavagem com solução salina tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços).
NOTA: Não adicione inibidor de ROCK a alimentações subsequentes. Altere o meio de cultura iPSC diariamente.
- Subcultura de iPSCs
- Pré-aqueça as placas revestidas de matriz a RT ou na incubadora a 37 °C durante 20-30 min. Pré-aqueça a quantidade necessária de meio de cultura iPSC no RT.
- Aspirar o meio de cultura das placas que contêm as células. Enxaguar as iPSCs com DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços).
- Adicione EDTA (0,5 mM) (1 mL por poço em uma placa de 6 poços). Incubar as placas a 37 °C até que as bordas das colônias comecem a levantar do poço (geralmente 3-5 min). Aspirar o EDTA.
- Adicione o meio de cultura iPSC pré-aquecido (4 mL por poço em uma placa de 6 poços) e desprenda com força as colônias de iPSC usando uma pipeta estéril de 10 mL uma vez. Não pipete para cima e para baixo, pois isso pode quebrar aglomerados de células em células únicas.
- Transfira o conteúdo de cada poço para dois poços individuais em uma placa de 6 poços revestida de matriz (2 mL por poço em uma placa de 6 poços) e incube a 37 °C. Não gere bolhas na suspensão durante a pipetagem.
NOTA: Agite a placa suavemente antes de a manter na incubadora. A proporção de divisão pode ser de 1:2 (um poço em 2 novos poços) para 1:4 (um poço em 4 novos poços). - Substitua o meio diariamente até que as colônias atinjam 60% de confluência com bom tamanho e conexões.
- Indução neural e geração de progenitores neurais
- Prepare 500 mL de Meio Quimicamente Definido (MDL), 500 mL de Meio de Indução Neural (NIM) e 500 mL de meio livre de soro de células-tronco neurais (NSC SF).
- Lave as células com DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços) e adicione NIM (3 mL por poço em uma placa de 6 poços). Configure como Dia 0.
- Substitua o NIM (3 mL por poço em uma placa de 6 poços) no Dia 1, Dia 3 e Dia 4 e observe sob a microscopia diariamente.
- No Dia 5, desprenda as rosetas neurais em cultura de suspensão, conforme descrito abaixo.
- Lave uma vez suavemente com DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços). Adicione a colagenase IV (1 mL por poço em uma placa de 6 poços) e mantenha em uma incubadora por 1 min. Aspirar a colagenase IV e lavar uma vez com DPBS (1x) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços) suavemente.
- Adicione 2 mL de NSC SF Medium por poço a uma placa de 6 poços. Desprenda as células raspando os fundos dos poços desenhando grades usando uma ponta de pipeta de 200 μL.
- Recolha a suspensão celular da placa de 6 poços num prato não aderente de 10 cm. Perfazer o volume para 12 mL com NSC SF Medium.
- Agite o prato não aderente a 65-85 rpm em um agitador orbital em uma incubadora para evitar a agregação.
- Diferenciação de neurônios DA
- No Dia 7, adicione 12 mL de MDL suplementado com fator de crescimento de fibroblastos de 100 ng/mL-8b (FGF-8b) e coloque o prato no agitador orbital na incubadora.
- Nos dias 8-13, troque o meio a cada 2 dias e observe sob a microscopia diariamente.
- No Dia 14, adicione 12 mL de MDL suplementado com 100 ng/mL de FGF-8b e 1 μM de purmorfamina (PM). Coloque o prato no agitador orbital na incubadora.
- Nos dias 15-20, mude o meio a cada 2 dias e observe as células sob a microscopia diariamente.
- Passe mecanicamente as esferas usando pontas de 1000 μL para quebrar as esferas maiores.
NOTA: A proporção pode ser de 1:2 (um prato em 2 pratos novos).
- Cessação da diferenciação
- Revestir uma placa de 6 poços ou tampas com Poly-L-Ornithine (PLO) e laminina conforme descrito abaixo.
- Revestir uma placa de 6 poços com 1 mL de OLP por poço e incubar a placa a 37 °C por 20 min. Aspirar a solução PLO.
- Esterilize a placa sob UV por 20 min. Lave os poços duas vezes com DPBS (1x) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços).
- Adicionar 5 μg/ml de solução de laminina (1 ml por alvéolo numa placa de 6 poços) ao alvéolo e incubar a 37 °C durante 2 h. Aspirar a laminina e lavar os poços brevemente com DPBS (1x) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços) uma vez antes do revestimento.
- Recolher todas as esferas (a partir do passo 1.5.5) em tubos de 50 ml e completar com DPBS (1x). Gire a 300 × g por 5 min. Aspirar o sobrenadante.
- Incubar com 2 ml de reagente de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) durante 10 min a 37 °C em banho-maria seguido de trituração suave com uma pipeta de 200 μL (20-50 vezes dependendo do tamanho das esferas, evitando a formação de bolhas).
- Neutralizar o reagente de dissociação celular com 2 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e centrifugar o tubo cônico de 50 mL contendo as células a 300 × g por 5 min no RT. Aspirar o sobrenadante.
- Adicione 1 mL de MDL suplementado com 10 ng/mL de Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF) e 10 ng/mL Fator neurotrófico derivado da linhagem celular glial (GDNF) para ressuspender os pellets celulares pipetando suavemente para cima e para baixo para obter suspensões unicelulares.
- Aspirar a solução de laminina da placa (etapa 1.6.1.3), lavar brevemente com DPBS (1x) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços) e semear as células (a partir da etapa 1.6.5) nas placas pré-revestidas ou folhas de cobertura em 3 mL de MDL suplementado com 10 ng/mL de BDNF e 10 ng/mL de GDNF. Alimente as células a cada 4 dias.
NOTA: As culturas diferenciadoras podem ser mantidas por muitas semanas até 3 meses. A morfologia neural geralmente aparece após 2 semanas de término e pode ser usada para análises a jusante a partir desse ponto. BDNF e GDNF não são necessários para a cultura para manutenção mais longa (até 2 meses).
- Revestir uma placa de 6 poços ou tampas com Poly-L-Ornithine (PLO) e laminina conforme descrito abaixo.
- Geração de NSC
- Placas matriciais de revestimento.
- Recolha todas as esferas neurais (geradas a partir do passo 1.4) em tubos de 50 ml e recarregue com DPBS (1x) (livre de Ca2+/Mg2+). Gire a 300 × g por 5 min. Aspirar os sobrenadantes.
- Incubar os pellets com 2 mL de reagente de dissociação celular por 10 min a 37 °C em banho-maria, seguido de trituração suave com pipeta de 200 μL (20-50 vezes dependendo do tamanho das esferas, evitando a formação de bolhas).
- Neutralizar com 2 mL de DMEM com FBS a 10% e centrifugar os tubos cônicos de 50 mL contendo as células a 300 × g por 5 min no RT. Aspirar os sobrenadantes. Ressuspenda os pellets celulares pipetando suavemente para cima e para baixo para obter suspensões unicelulares.
- Aspirar a solução matricial de uma placa pré-revestida e semear as células nas placas pré-revestidas em meio NSC SF (3 mL por poço em uma placa de 6 poços). Alimente as células a cada 2-3 dias e divida as células quando confluentes.
NOTA: A partir deste estágio, os NSCs podem ser expandidos e congelados.
- Diferenciação de astrócitos da glia
- Diferenciação de astrócitos a partir de NSCs
- Preparar 500 mL de Meio de Diferenciação de Astrócitos.
- NSCs de sementes em placas/coberturas revestidas com poli-D-lisina (PDL) com meio NSC SF.
- No dia seguinte, lave as células com DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-livre) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços) e adicione o Meio de Diferenciação de Astrócitos (3 mL por poço em uma placa de 6 poços). Configure como Dia 0.
- Observe os NSCs ao microscópio diariamente e substitua o Meio de Diferenciação de Astrócitos (3 mL por poço em uma placa de 6 poços) a cada 2 dias dos Dias 1 a 27.
- Maturação de astrócitos
- Prepare o Meio de Maturação de Astrócitos.
- No dia 28, lave as células com DPBS (1x) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços) e adicione o Meio de Maturação de Astrócitos (3 mL por poço em uma placa de 6 poços).
- No dia 29 em diante, observe as células ao microscópio diariamente e substitua o Meio de Maturação de Astrócitos (3 mL por poço em uma placa de 6 poços) a cada 2 dias.
- Após um mês de maturação, expanda as células e criopreserve-as a partir desta fase.
Observação : durante esta fase, o número de células aumentará. Ao dividir as células, as coberturas revestidas com PDL não são necessárias para a cultura.
- Diferenciação de astrócitos a partir de NSCs
2. Caracterização celular por imunocitoquímica e coloração por imunofluorescência
- No final do período de cultura, transfira as coberturas com as células para uma placa de 12 poços.
Enxaguar as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS) (1x) duas vezes e incubar por 10 min em Paraformaldeído (PFA) a 4% (0,5 mL por poço em uma placa de 12 poços) no RT.
NOTA: A amostra fixa pode ser coberta com 2 mL de PBS (1x) e armazenada a 4 °C até que seja necessária a imunocoloração. O PFA é tóxico e é suspeito de causar câncer. Evite a exposição da pele e dos olhos e trabalhe sob um exaustor químico. - Bloquear e permeabilizar as células e incubar com tampão bloqueador contendo PBS (1x), Triton X-100 a 0,3% e soro caprino normal a 10% por 1 h no RT.
- Incubar com anticorpos primários em tampão de bloqueio durante a noite a 4 °C: iPSCs de coloração com fator de transcrição anti-octamero ligado 4 (Oct4) e antígeno embrionário anti-estágio específico-4 (SSEA4), NSCs com região anti-determinante de sexo Y box-2 (Sox2) e anti-Nestina, esferas neurais com box-6 anti-pareado (Pax6) e anti-Nestina, astrócitos com proteína ácida fibrilar antiglial (GFAP) e proteína anti-ligação ao cálcio S100 β (S100β) e neurônios DA com anti-tirosina hidroxilase (TH), anti-β III Tubulina (Tuj 1), anti-Sinaptofisina e anti-PSD-95 (0,5 mL de solução primária de anticorpos por poço em uma placa de 12 poços; consulte a Tabela de Materiais para detalhes).
- Lave as amostras com PBS (1x) três vezes durante 10 minutos cada com balanço suave.
- Incubar com solução de anticorpos secundários (1:800 em tampão de bloqueio, 0,5 mL de solução de anticorpo secundário Alexa Fluor por poço em uma placa de 12 poços) por 1 h no RT com balanço suave.
- Incubar as células com Hoechst 33342 (1:5.000, 0,5 ml por poço numa placa de 12 poços) em PBS (1x) durante 15 min a RT para marcar os núcleos.
- Monte as células com meio de montagem e seque durante a noite no RT para obter imagens sob um microscópio de fluorescência no escuro. Consulte a Figura Suplementar S1 para as configurações e parâmetros do microscópio.
3. Medição da citometria de fluxo do volume mitocondrial, MMP e ROS mitocondrial em células vivas
- Sesite as células separadamente em 4 poços em uma placa de 6 poços até que as células atinjam 50% a 60% de confluência. Rotule esses quatro poços como #1, #2, #3 e #4.
- Ao final do período de cultura, preparar 5 soluções individuais de coloração (500 μL por poço em uma placa de 6 poços) da seguinte forma: #1 único meio de cultura (para o poço #1 contendo apenas células para controle); #2-1 contendo FCCP (100 μM); #2-2 contendo FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) em meio de cultura; #3 contendo TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) em meio de cultura; #4 contendo MitoSox Red (10 μM) + MTG (150 nM) em PBS (1x) com 10% FBS. Consulte a Figura 1A, a Tabela Suplementar S2 e a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre esses compostos e a configuração da citometria de fluxo.
NOTA: Use o meio de cultura para preparar a solução de coloração. Aqueça o meio e o PBS (1x) no RT antes de usar. O FCCP é tóxico; prevenir a exposição da pele e dos olhos e trabalhar sob um exaustor químico. - Aspirar o meio do poço #2 e adicionar a solução #2-1 (somente FCCP). Incubar as células a 37 °C durante 10 minutos.
- Aspirar o meio dos poços #2 e #3 e adicionar a solução #2-2 (FCCP + TMRE + MTG) no poço #2 e a solução #3 (TMRE + MTG) no #3. Incubar as células a 37 °C durante 45 min.
- Aspirar o meio do poço #4 e adicionar a solução #4 (MitoSox Red + MTG). Incubar as células a 37 °C durante 15 minutos.
- Aspirar o meio de todos os poços. Lave com PBS (1x) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços). Descole as células usando 1 mL de reagente de dissociação celular (1 mL por poço em uma placa de 6 poços) a 37 °C por 5 min. Neutralizar o reagente de dissociação celular em 1 mL de DMEM com FBS a 10% (2 mL por poço em uma placa de 6 poços).
- Coletar o conteúdo de todos os poços em tubos cônicos de 15 mL. Centrifugar os tubos a 300 × g durante 5 min. Lave os pellets com PBS (1x) uma ou duas vezes.
- Aspirar os sobrenadantes, mas deixar aproximadamente 100 μL nos tubos. Ressuscite os pellets celulares em 300 μL de PBS (1x). Transfira as células para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Mantenha os tubos no escuro em RT.
- Analise as células usando um citômetro de fluxo (com uma configuração de laser 3 azul e 1 vermelho). Detecte MTG no filtro 1 (FL1) usando um filtro passa-banda 530/30, TMRE no filtro 2 (FL2) usando o filtro passa-banda 585/40 e MitoSox Red no filtro 3 (FL3) usando um filtro passa-banda 510/580.
4. Medição da citometria de fluxo de subunidades complexas MRC e TFAM em células fixas
- No final do período de cultura, desprenda as células (~106) adicionando o reagente de dissociação celular; em seguida, pellet e coletar as células em um tubo de 15 mL. Lavar as células por centrifugação com PBS (1x) duas vezes por centrifugação a 300 × g durante 5 min.
- Fixar as células em PFA a 1,6% (1 mL de PFA a 1,6% em um tubo de 15 mL) no RT por 10 min. Lavar as células por centrifugação com PBS (1x) duas vezes por centrifugação a 300 × g durante 5 min.
- Permeabilizar as células com metanol gelado a 90% (1 mL de metanol a 90% em um tubo de 15 mL) a -20 °C por 20 min.
- Bloquear as amostras em tampão de bloqueio contendo 0,3 M de glicina, 5% de soro caprino e 1% de albumina sérica bovina (BSA) - Fração V em PBS (1x) (1 mL de tampão de bloqueio em um tubo de 15 mL). Lavar as células por centrifugação com PBS (1x) duas vezes (como no passo 3.7).
- Incubar as células com os seguintes anticorpos primários por 30 min: anti-NDUFB10 (1:1.000) para medição da subunidade do complexo I, subunidade A da flavoproteína do complexo anti-succinato desidrogenase (SDHA, 1:1.000) para medição da subunidade do complexo II e anti-COX IV (1:1.000) para medição da subunidade do complexo IV e anticorpo anti-TFAM conjugado com Alexa Fluor 488 (1:400). Colorir o mesmo número de células separadamente com o anticorpo anti-TOMM20 conjugado com Alexa Fluor 488 (1:400) por 30 min (1 mL de solução de anticorpo primário em um tubo de 15 mL; consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre os anticorpos).
- Lavar as células com PBS (1x) uma vez com centrifugação a 300 × g durante 5 min. Adicione anticorpos secundários (1:400) em tubos de NDUFB10, SDHA e COX IV e incube as células com essas soluções por 30 min.
- Lavar as células com PBS (1x) uma vez por centrifugação a 300 × g durante 5 min. Aspirar os sobrenadantes, deixando aproximadamente 100 μL nos tubos. Ressuscite os pellets celulares em 300 μL de PBS (1x). Transfira as células para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL mantidos no escuro no gelo.
- Analise as células no citômetro de fluxo (com uma configuração de laser 3 azul e 1 vermelho). Detecte sinais no filtro 1 (FL1) usando um filtro passa-banda 530/30. Consulte a Figura Suplementar S2 para as configurações e parâmetros do microscópio.
5. Aquisição e análise da citometria de fluxo
- Use o tubo de controle não corado para definir os gráficos de dispersão da área de dispersão frontal (FSC-A) e da área de dispersão lateral (SSC-A) com base no tamanho e na complexidade da população celular analisada. Consulte a Figura Suplementar S2 para as configurações e parâmetros do microscópio.
Observação : configure controles não manchados para tipos de célula individuais. - Use os tubos de controle sem coloração para selecionar as portas positivas e use tubos de controle de cor única para compensar a sobreposição espectral de fluorescência entre MTG (fluoróforo-1 [FL-1]) e TMRE (FL-2) na citometria de fluxo multicolorida. Use o controle de isotipo para controle negativo para monitorar a coloração de fundo em amostras MRC e TFAM. Use o tubo FCCP como um controle de despolarização para coloração TMRE.
- Retirar detritos estranhos para selecionar células vivas e o gating principal do gráfico de dispersão para frente e para o lado (Figura 2A). Duplicatas de saída de porta usando um gráfico de densidade de altura de dispersão frontal (FSC-H) versus (vs.) FSC-A para excluir duplicatas e também construir um gráfico de altura de dispersão lateral (SSC-H) versus SSC-A (Figura 2A).
- Aquisição de dados (citômetro de fluxo)
- Usando as amostras não coradas ou isotipadas como um controle negativo, crie uma porta acima da população principal dos eventos de célula única enquanto visualiza o SSC-A e os vários filtros (FL1, FL2, FL3, FL4) (Figura 1B e Figura 2B).
- Análise de dados (software CFlow)
- Copie a posição dos portões nas amostras de células coradas e registre a quantidade de células coradas positivamente para a coloração positiva.
- Para cada subpopulação celular, selecione um gráfico de histograma e analise a intensidade de fluorescência mediana (IFM) dos diferentes canais filtrantes (FL1, FL2, FL3, FL4) (eixo x).
- Calcule os níveis de TMRE subtraindo a IFM de FL2 de células tratadas com FCCP #2 da IFM de FL2 de amostras coradas com TMRE #3 em um histograma, como na Eq (1) abaixo.
Níveis de TMRE = IFM de FL2 de amostras coradas com TMRE n.º 3 - IFM de FL2 de células tratadas com FCCP n.º 2 (1) - Calcular os valores específicos de MMP e ROS mitocondrial por MFI em TMRE ou MitoSox Red, dividindo o indicador de volume mitocondrial MTG.
- Calcule o valor específico para subunidade complexa e TFAM usando MFI em expressão complexa ou TFAM, dividindo o indicador de volume mitocondrial TOMM20.
- Calcule os níveis de TMRE subtraindo a IFM de FL2 de células tratadas com FCCP #2 da IFM de FL2 de amostras coradas com TMRE #3 em um histograma, como na Eq (1) abaixo.
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Representative Results
Uma descrição esquemática do método de diferenciação e das estratégias de citometria de fluxo é mostrada na Figura 3. As iPSCs humanas são diferenciadas em rosetas neurais e, em seguida, levantadas em cultura de suspensão para diferenciação em esferas neurais. As esferas neurais são ainda mais diferenciadas e amadurecidas em neurônios DA. As esferas neurais são dissociadas em células únicas para gerar astrócitos gliais, revestidas em monocamadas como NSCs e, em seguida, diferenciadas em astrócitos. Este protocolo fornece as estratégias necessárias para a aquisição e análise das amostras por citometria de fluxo para a medição de MMP, volume mitocondrial, níveis de ROS mitocondrial, níveis de expressão de subunidades complexas MRC e TFAM (uma medida indireta do número relativo de cópias de mtDNA). Especificamente, a co-coloração com repórteres fluorescentes, TMRE e MTG, foi usada para detectar e quantificar alterações na MMP e no volume mitocondrial. A co-coloração com MitoSox Red e MTG permite a medição da produção de ROS mitocondrial em células vivas. A coloração com anticorpos contra subunidades do complexo MRC juntamente com o TOMM20 permite a avaliação do MRC e a coloração do TFAM e do TOMM20 para avaliação indireta do número de cópias do mtDNA. É importante ressaltar que o MTG e o TOMM20 permitem a medição por volume mitocondrial, neutralizando a influência do volume mitocondrial sobre esses parâmetros.
Os neurônios DA são gerados a partir de iPSCs através da inibição dupla do SMAD e expostos ao FGF-8b e ao agonista do ouriço sônico (SHH) PM, como mostra a Figura 4A. As iPSCs humanas são semeadas em meio de cultura iPSC em placas revestidas de matriz. Quando as células atingem 50% a 80% de confluência, o meio é alterado para NIM usando um MDL suplementado com SB431542, inibidor de AMPK, Composto C e N-acetilcisteína por 5 dias. Após 5 dias, as iPSCs (Figura 4B, a) progridem para um estágio epitelial neural exibindo estruturas claras de rosetas neurais (Figura 4B, b). No dia 5, as esferas neurais são geradas levantando o epitélio neural em cultura de suspensão e cultivando-os em meio NSC SF em um agitador orbital dentro da incubadora. Esferas redondas e bem definidas são mostradas na Figura 4B, c. No dia 7, o meio é transformado em MDL suplementado com 100 ng/mL de FGF-8b. No dia 14, o meio é trocado para o MDL suplementado com 100 ng/mL de FGF-8b e 1 μM PM. No dia 21, as esferas são dissociadas em neurônios DA em uma monocamada, dissociando-as em células únicas e cultivando-as em MDL suplementado com 10 ng/mL de BDNF e 10 ng/mL de GDNF em PLO e placas/coberturas revestidas de laminina. Neurônios (Figura 4B, e) amadurecidos por 15-30 dias são usados para medições funcionais mitocondriais.
Os NSCs são produzidos dissociando esferas neurais em células únicas e, em seguida, replatando-as em monocamadas para gerar astrócitos. Esses NSCs apresentam uma aparência clássica de progenitor neural (Figura 4B, d). Os NSCs nesta fase podem ser prontamente expandidos e bancados para uso posterior. Para iniciar a diferenciação de astrócitos, os NSCs são banhados em coberturas revestidas de PDL em meio NSC SF. No dia seguinte, o meio é transformado em meio de diferenciação de astrócitos por 28 dias. Após 28 dias, os astrócitos diferenciados são ainda mais amadurecidos em meio de maturação de astrócitos. Nesta fase, os astrócitos devem apresentar morfologia em forma de estrela (Figura 4B, f), e essas células podem ser expandidas e depositadas para uso posterior, incluindo avaliação funcional mitocondrial.
Durante a diferenciação, a identidade celular é confirmada usando coloração por imunofluorescência. Na Figura 5A, a imunocoloração mostra que as iPSCs expressam os marcadores pluripotentes específicos, SSEA4 e Oct4. A Figura 5B mostra que as esferas neurais exibem coloração positiva de Nestin e Pax6, enquanto a Figura 5C mostra que NSCs derivadas de iPSC em monocamadas exibem coloração positiva de Nestin e Sox2. Para identificar os neurônios DA, as células são coradas com o marcador neural β III Tubulina (Tuj 1) e o marcador neuronal DA tirosina hidroxilase (TH) (Figura 6B). Além disso, os neurônios DA apresentam coloração para os marcadores sinápticos, sinaptofisina e PSD-95, confirmando suas conexões sinápticas funcionais (Figura 5B). A imunocoloração de astrócitos derivados de iPSC mostra a expressão dos marcadores de astrócitos, proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e proteína de ligação ao cálcio S100 β (S100β).
A investigação da função mitocondrial em neurônios e astrócitos diferenciados usando citometria de fluxo é realizada conforme descrito acima nas seções 3 e 4 do protocolo. Utilizou-se citômetro de fluxo para aquisição dos dados e CFlow Sampler para análise dos dados, como mostra a Figura 1B.
A Figura 2 demonstra o método de controle de células únicas vivas. Células mortas e detritos celulares são excluídos usando um gráfico FSC vs. SSC (Figura 2A, a). Os duplicados de células são excluídos usando um gráfico FSC-H vs. FSC-A (Figura 2A, b) seguido por um gráfico SSC-H vs. SSC-A (Figura 2A, c). A fluorescência de fundo é adequadamente avaliada se a população negativa de um determinado tipo de célula for comparada com a população positiva dentro desse mesmo tipo de célula (Figura 2B, a). Para amostras de MMP, o tratamento das células com FCCP elimina a interferência do potencial de membrana mitocondrial e da coloração TMRE (Figura 2B, b).
Essas abordagens citométricas de fluxo têm sido usadas para estudar neurônios DA gerados a partir das iPSCs humanas portadoras de mutação (s) na subunidade catalítica da DNA polimerase mitocondrial, POLG (W748S), e compará-las com amostras livres de doença geradas a partir de fibroblastos Detroit 551. Como relatado anteriormente4, este estudo também demonstrou diminuição da MMP e aumento dos níveis específicos de ROS mitocondrial em neurônios POLG DA (Figura 7). No entanto, o volume mitocondrial, a MMP total e o nível de ROS mitocondrial total permaneceram inalterados. Na Figura 8, os resultados mostram uma diminuição nos níveis específicos do complexo I, níveis mais baixos de TFAM total e específico, mas níveis específicos de complexo II semelhantes em neurônios DA mutantes em comparação com os controles.
Essa abordagem também foi utilizada para estudar astrócitos gerados a partir das mesmas linhagens de iPSC. Como relatado anteriormente7 e mostrado na Figura 9, os resultados mostram que os astrócitos mutantes com PALG apresentaram menor MMP total e específica, mas volume mitocondrial e ROS mitocondrial semelhantes em comparação com os controles, bem como níveis diminuídos de complexos específicos I e IV (Figura 10). No entanto, não houve alterações nos níveis totais dos complexos I e IV e nenhuma alteração nos níveis total e específico do complexo II nos astrócitos POLG. No geral, esses dados sugerem que a análise citométrica de fluxo de múltiplos parâmetros mitocondriais fornece uma aproximação de primeira etapa que é valiosa na avaliação da função mitocondrial em células como iPSCs e seus derivados neurais e gliais.
Figura 1: Configuração para citometria de fluxo. (A) MMP, volume mitocondrial e coloração de ROS mitocondrial; (B) um exemplo de aquisição de dados em um citômetro de fluxo C6. Abreviaturas: MMP = potencial de membrana mitocondrial; ROS = espécies reativas de oxigênio; FCCP = cianeto de carbonila p-trifluorometoxifenilhidrazona; TMRE = éster etílico de tetrametilrodamina; MTG = MitoTracker Verde. Consulte também a Tabela Suplementar S2. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estratégias de Gating. (A) Aquisição de dados; (B) os histogramas da fluorescência com coloração MTG e TMRE em células vivas. Abreviaturas: SSC-A = área de dispersão lateral; FSC-A = área de dispersão para a frente; SSC-H = altura de dispersão lateral; FSC-H = altura de dispersão para a frente; FL#-A = área do fluoróforo #; MTG = MitoTracker Verde; FCCP = cianeto de carbonila p-trifluorometoxifenilhidrazona; TMRE = éster etílico de tetrametilrodamina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representação esquemática do fluxo de trabalho do protocolo. Abreviaturas: DA = dopaminérgico; MMP = potencial de membrana mitocondrial; ROS = espécies reativas de oxigênio; NDUFB 10 = NADH: Subunidade 10 da ubiquinona oxidorredutase; SDHA = subunidade A de flavoproteína do complexo succinato desidrogenase; COX IV = citocromo c oxidase complexo IV; mtDNA = DNA mitocondrial; TFAM = fator de transcrição mitocondrial A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Diferenciação de iPSC. (A) Fluxograma e (B) imagens representativas para as células de diferentes estágios durante a diferenciação, incluindo iPSCs (a), roseta neural (b), esferas neurais (c), NSCs (d), neurônios DA (e) e astrócitos (f). Barras de escala = 25 μm. Abreviaturas: iPSC = célula-tronco pluripotente induzida; NSC = célula-tronco neural; DA = dopaminérgico; SFM = meio livre de soro; MDL = meio quimicamente definido; FGF-8b = fator de crescimento de fibroblastos-8b; PM = purmoramina; BDNF = fator neurotrófico derivado do cérebro; GDNF = fator neurotrófico derivado da linhagem celular glial; OLP = poli-L-ornitina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagens confocais representativas de iPSCs e seus derivados neurais. (A) Imunocoloração de SSEA4 (vermelho) e Oct4 (verde) em iPSCs. (B) Imunocoloração de Nestin (vermelho) e Pax6 (verde) em esferas de neurônios derivadas de iPSC. (C) Imunocoloração de Nestin (vermelho) e Sox2 (verde) em NSCs derivados de iPSC. Os núcleos são corados com DAPI (azul). Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: iPSCs = células-tronco pluripotentes induzidas; NSCs = células-tronco neurais; SSEA4 = antígeno embrionário específico do estágio-4; Oct4 = fator de transcrição de ligação ao octamero 4; Pax6 = caixa pareada-6; Sox2 = região determinante do sexo Y caixa-2; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Imagens confocais representativas dos astrócitos derivados da iPSC e neurônios DA. (A) Imunocoloração da GFAP (vermelho) e S100β (verde) em astrócitos derivados da iPSC. (B) Imunocoloração do marcador de linhagem neural TH (verde), Tuj 1 (vermelho) e marcador funcional neural Sinaptofisina (verde) e PSD-95 (vermelho) em neurônios DA derivados de iPSC. Os núcleos são corados com DAPI (azul). Barras de escala = 25 μm. Abreviaturas: iPSCs = células-tronco pluripotentes induzidas; GFAP = proteína glial fibrilar ácida; S100β = β proteica ligadora de cálcio S100; Tuj 1 = β III Tubulina; PSD-95 = proteína de densidade pós-sináptica 95; DA = dopaminérgico; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Análise citométrica de fluxo para neurônios DA derivados de um clone de iPSCs de pacientes com POLG e um clone de iPSCs de controle Detroit 551. (A) Volume mitocondrial medido por MTG, (B) MMP total medido por TMRE, (C) nível específico de MMP calculado por TMRE/MTG total, (D) ROS mitocondrial total medido por MitoSox Red e (E ) nível de EROs mitocondriais específicas calculado pelo total de MitoSox Red/MTG. Os dados apresentados como média ± erro padrão da média (MEV) para o número de amostras (n ≥ 3 por clone). Dados analisados e produzidos utilizando o software GraphPad Prism. O teste U de Mann-Whitney foi utilizado para avaliar a significância estatística das variáveis. A significância é denotada para P < 0,05. *P < 0,05; ns, não significativo. Abreviaturas: DA = dopaminérgico; POLG = subunidade gama da DNA polimerase; iPSCs = células-tronco pluripotentes induzidas; MMP = potencial de membrana mitocondrial; ROS = espécies reativas de oxigênio; MTG = MitoTracker Verde; TMRE = éster etílico de tetrametilrodamina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Análise citométrica de fluxo para astrócitos derivados de um clone de iPSCs de pacientes com POLG e um clone de iPSCs de controle Detroit 551. (A) Volume mitocondrial medido por MTG, (B) MMP total medido por TMRE, (C) nível específico de MMP calculado por TMRE/MTG total, (D) ROS Rmitocondrial total S medido por MitoSox Red, e (E ) nível de EROs mitocondriais específicas calculado pelo total de MitoSox Red/MTG. Os dados apresentados como média ± erro padrão da média (MEV) para o número de amostras (n ≥ 3 por clone). Dados analisados e produzidos utilizando o software GraphPad Prism. O teste U de Mann-Whitney foi utilizado para avaliar a significância estatística das variáveis. A significância é denotada para P < 0,05. *P < 0,05; ns, não significativo. Abreviaturas: POLG = subunidade gama da DNA polimerase; iPSC = célula-tronco pluripotente induzida; MMP = potencial de membrana mitocondrial; ROS = espécies reativas de oxigênio; MTG = MitoTracker Verde; TMRE = éster etílico de tetrametilrodamina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Análise citométrica de fluxo para neurônios DA derivados de um clone de iPSCs de pacientes com POLG e um clone de iPSCs de controle Detroit 551. (A) Complexo total I medido pelo NDUFB10, (B) nível do complexo I específico calculado pelo total do NDUFB10/TOMM20, (C) total do complexo II medido pelo SDHA, (D) nível específico do complexo II calculado pelo total do SDHA/TOMM20, (E) TFAM total medido pelo TFAM e (F) nível específico do TFAM calculado pelo total do TFAM/TOMM20. Os dados apresentados como média ± erro padrão da média (EPM) para o número de amostras (n ≥ 3 por clone). Dados analisados e produzidos utilizando o software GraphPad Prism. O teste U de Mann-Whitney foi utilizado para avaliar a significância estatística das variáveis. A significância é denotada para P < 0,05. *P < 0,05; ns, não significativo. Abreviaturas: DA = dopaminérgico; POLG = subunidade gama da DNA polimerase; iPSC = célula-tronco pluripotente induzida; NDUFB10 = NADH: Subunidade 10 da ubiquinona oxidorredutase; TOMM20 = translocase da membrana mitocondrial externa 20; SDHA = subunidade A de flavoproteína do complexo succinato desidrogenase; TFAM = fator de transcrição mitocondrial A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Análise citométrica de fluxo para astrócitos derivados de um clone de iPSCs de pacientes com POLG e um clone de iPSCs de controle Detroit 551. (A) Complexo total I medido por NDUFB10, (B) nível específico de complexo I calculado pelo total de NDUFB10/TOMM20, (C) total do complexo II medido pelo SDHA, (D) nível específico do complexo II calculado pelo total de SDHA/TOMM20, (E) complexo IV total medido por COX IV, (F) nível IV de complexo específico calculado por COX IV/TOMM20, (G) TFAM total medido por TFAM e (H) nível específico de TFAM calculado por TFAM/TOMM20 total. Os dados apresentados como média ± erro padrão da média (EPM) para o número de amostras (n ≥ 3 por clone). Dados analisados e produzidos utilizando o software GraphPad Prism. O teste U de Mann-Whitney foi utilizado para avaliar a significância estatística das variáveis. A significância é denotada para P < 0,05. *P < 0,05; ** P < 0,01; ns, não significativo. Abreviaturas: POLG = subunidade gama da DNA polimerase; iPSC = célula-tronco pluripotente induzida; NDUFB10 = NADH: Subunidade 10 da ubiquinona oxidorredutase; TOMM20 = translocase da membrana mitocondrial externa 20; SDHA = subunidade A de flavoproteína do complexo succinato desidrogenase; TFAM = fator de transcrição mitocondrial A; COX IV = citocromo c oxidase complexo IV. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura Suplementar S1: Configurações do microscópio de fluorescência a laser confocal e etapas para a obtenção de imagens. (A) Escolha a ferramenta Configuração e selecione o tipo de laser correto do laser atual disponível e defina sua potência. (B) Escolha Acquire-Acquisition Mode-SEQ e selecione o modo de foto de comprimento de onda de fluorescência correspondente no banco de dados. (C) Escolha Sequential Scan-Load e importe o modo correspondente. (D) Escolha a lente objetiva 40x e adicione dropwise. (E) Parâmetros de configuração específicos para tirar fotos em diferentes comprimentos de onda. (F) Defina os parâmetros da foto, visualize e salve a foto. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar S2: Etapas e configurações para citometria de fluxo. (A) Abra o software Cflow, escolha a ferramenta Arquivo e selecione Abrir arquivo ou modelo CFlow. (B) Configure 40000 eventos e selecione o portão que contém apenas as células individuais ativas no painel Limites de execução. Escolha Velocidade média no painel Fluidics. (C) Escolha o gráfico FSC-A vs. FSC-A (a) para configurar o gating principal. Escolha FSC-A vs. FSC-H plot (b) e SSC-A vs. SSC-H plot (c) para excluir duplicatas. Escolha os filtros correspondentes, como FL1 ou FL2, e use FL1-A vs. FSC-A plot (d) ou FL2-A vs. FSC-A plot para desenhar os eventos positivos ao executar as células não coradas. (D) Configure os mesmos parâmetros, visualize, execute as amostras manchadas e salve a foto. Consulte também a Tabela Suplementar S2. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar S1: Receitas de mídia e solução. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela Suplementar S2: Configuração para coloração citométrica de fluxo. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
Aqui estão os protocolos para gerar neurônios e astrócitos derivados de iPSC e avaliar múltiplos aspectos da função mitocondrial usando citometria de fluxo. Esses protocolos permitem a conversão eficiente de iPSCs humanas em neurônios e astrócitos gliais e a caracterização detalhada da função mitocondrial, principalmente em células vivas. Os protocolos também fornecem uma estratégia baseada em citometria de fluxo de cocoloração para adquirir e analisar múltiplas funções mitocondriais, incluindo volume, MMP e níveis de ROS mitocondrial em células vivas e complexos MRC e TFAM em células fixas. Especificamente, esses protocolos permitem estimar os níveis total e específico por volume mitocondrial. Embora essa estratégia detecte disfunção mitocondrial em uma doença mitocondrial conhecida (POLG) em neurônios e astrócitos DA, essas técnicas são aplicáveis a qualquer tipo de célula e doença. Além disso, o protocolo é robusto e reprodutível. Vários estudos anteriores aplicaram com sucesso este protocolo para analisar as alterações mitocondriais em fibroblastos, iPSCs, NSCs, neurônios DA e astrócitos 2,3,13,17.
Existem alguns pontos críticos a serem considerados ao executar este protocolo. Para garantir uma diferenciação consistente e de alta eficiência, é fundamental iniciar a conversão com iPSCs de alta qualidade (células contendo <5% de células diferenciadas). Embora outras mídias definidas comercialmente disponíveis possam ser alternativas válidas, este estudo não abordou as alternativas. Como a composição média e as diferenças clonais das linhagens de iPSC podem influenciar tanto a proliferação da população de células iniciais quanto a eficiência da diferenciação, a adaptação desse protocolo a outros meios de manutenção provavelmente exigirá otimização.
A relação entre a fluorescência do MTG e da MMP já foi estudada anteriormente3. Isso é importante, pois a fluorescência do MTG é relatada como independente de18 e sensível à MMP 19,20. Em estudos anteriores em que as iPSCs foram tituladas com diferentes concentrações de TMRE e co-coradas com MTG de 150 nM, o nível de MTG permaneceu o mesmo em concentrações mais baixas de TMRE (5-100 nM), enquanto uma diminuição do sinal de MTG foi observada para concentrações mais altas de TMRE (acima de 100 nM). Portanto, TMRE de 100 nM e MTG de 150 nM foram escolhidos para medir a MMP específica. Como essa relação pode ser específica da célula, a correlação entre a fluorescência do MTG e da MMP deve ser avaliada antes de usar a coloração dupla MTG e TMRE para medir a MMP.
A densidade celular também pode influenciar a função mitocondrial e o metabolismo celular. Neste estudo, foram observadas alterações dependentes da densidade celular na MMP, o que também foi demonstrado em outros estudos21. Portanto, é importante escolher uma densidade celular semelhante em todas as amostras - não muito alta ou baixa - para minimizar a variação ao estabelecer o protocolo de cocoloração para diferentes tipos de células. Em comparação com outros ensaios baseados em microscopia, a citometria de fluxo tem as vantagens de velocidade e reprodutibilidade ao analisar um grande número de células. Na análise de imagens microscópicas, o viés dos pesquisadores distorcerá os resultados até certo ponto, o que não é um problema ao usar a citometria de fluxo. Além disso, a análise de citometria de fluxo requer menos de um milhão de células, e a análise de uma amostra leva apenas alguns minutos, o que significa que dezenas de amostras podem ser analisadas em 1-2 h. Esta técnica também pode ser aplicada a uma ampla variedade de tipos de células, incluindo aquelas de outras doenças neurodegenerativas, e deve, portanto, ser útil para entender mecanismos e testar potenciais terapêuticas em diferentes doenças neurodegenerativas.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Centro de Imagem Molecular e ao Núcleo de Citometria de Fluxo da Universidade de Bergen, na Noruega. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do Conselho Norueguês de Pesquisa (número de subvenção: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat e do Conselho de Bolsas de Estudo da China (número do projeto: 201906220275).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-Oct4 | Abcam | ab19857, RRID:AB_445175 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-SSEA4 | Abcam | ab16287, RRID:AB_778073 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Sox2 | Abcam | ab97959, RRID:AB_2341193 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Pax6 | Abcam | ab5790, RRID:AB_305110 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Nestin | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927, RRID:AB_627994 | Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-GFAP | Abcam | ab4674, RRID:AB_304558 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-S100β conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab196442, RRID:AB_2722596 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; |
| anti-TH | Abcam | ab75875, RRID:AB_1310786 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Tuj 1 | Abcam | ab78078, RRID:AB_2256751 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Synaptophysin | Abcam | ab32127, RRID:AB_2286949 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-PSD-95 | Abcam | ab2723, RRID:AB_303248 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab198308 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488 | Santa Cruz Biotechnology | Cat# sc-17764 RRID:AB_628381 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-NDUFB10 | Abcam | ab196019 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-SDHA | Abcam | ab137040 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-COX IV | Abcam | ab14744, RRID:AB_301443 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control. |
| Activin A | PeproTech | 120-14E | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| ABM Basal Medium | Lonza | CC-3187 | Basal medium for astrocyte culture |
| AGM SingleQuots Supplement Pack | Lonza | CC-4123 | Supplement for astrocyte culture |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | CDM ingredient |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Basal medium for dilute Geltrex |
| Bovine Serum Albumin | Europa Bioproducts | EQBAH62-1000 | Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | DA neurons medium ingredient |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer | BD Biosciences, USA | ||
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermo Fisher Scientific | 11905031 | CDM ingredient |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G | Leica Microsystems, Germany | ||
| Corning non-treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430589 | Suspension culture |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Used for a variety of cell culture wash |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565018 | Astrocyte differentiation basal Medium |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| Essential 8 Basal Medium | Thermo Fisher Scientific | A1516901 | Basal medium for iPSC culture |
| Essential 8 Supplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Supplement for iPSC culture |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0314 | Supplement for NSC culture |
| FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Supplement for NSC culture |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12103C | Medium ingredient |
| FGF-basic | PeproTech | 100-18B | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| FCCP | Abcam | ab120081 | Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining |
| Fluid aspiration system BVC control | Vacuubrand, Germany | ||
| Formaldehyde (PFA) 16% | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Cell fixation |
| Geltrex | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Used for attachment and maintenance of human iPSCs |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Supplement for NSC culture |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | DA neurons medium ingredient |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Used for blocking buffer |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31765027 | Basal medium for CDM |
| Heregulin beta-1 human | Sigma-Aldrich | SRP3055 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | Stain the nuclei for confocal image |
| Heracell 150i CO2 Incubators | Fisher Scientific, USA | ||
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 21980032 | Basal medium for CDM |
| Insulin | Roche | 1376497 | CDM ingredient |
| InSolution AMPK Inhibitor | Sigma-Aldrich | 171261 | Neural induction medium ingredient |
| Insulin-like Growth Factor-I human | Sigma-Aldrich | I3769 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| KnockOut DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Basal medium for NSC culture |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | ||
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | CDM ingredient |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | Used for mitochondrial volume indicator |
| MitoSox Red | Thermo Fisher Scientific | M36008 | Used for mitochondrial ROS indicator |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | Neural induction medium ingredient |
| N-2 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Used for blocking buffer |
| Orbital shakers - SSM1 | Stuart Equipment, UK | ||
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7405 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Purmorphamine | STEMCELL Technologies | 72204 | Promotes DA neuron differentiation |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting the coverslip for confocal image |
| PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | Used for a variety of wash |
| Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein | R&D Systems | 423-F8-025/CF | Promotes DA neuron differentiation |
| SB 431542 | Tocris Bioscience | TB1614-GMP | Neural Induction Medium ingredient |
| StemPro Neural Supplement | Thermo Fisher Scientific | A10508-01 | Supplement for NSCs culture |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Cell dissociation reagent |
| Transferrin | Roche | 652202 | CDM ingredient |
| TRITON X-100 | VWR International | 9002-93-1 | Used for cells permeabilization in immunostaining assays |
| TMRE | Abcam | ab113852 | Used for mitochondrial membrane potential staining |
| Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments | Grant Instruments, USA |
References
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