Summary
يتم وصف نموذج الفأر من التهاب البنكرياس الحاد الوخيم هنا. الإجراء المعروض هنا سريع جدا وبسيط ويمكن الوصول إليه ، مما قد يسمح بدراسة الآليات الجزيئية والتدخلات العلاجية المختلفة في التهاب البنكرياس الحاد بطريقة مريحة.
Abstract
يتزايد انتشار التهاب البنكرياس الحاد (AP) ، وخاصة التهاب البنكرياس الحاد الوخيم (SAP) ، في الفئات العمرية الأصغر سنا سنويا. ومع ذلك ، هناك نقص في العلاجات الفعالة في الممارسة السريرية الحالية. مع سهولة الوصول إلى السلالات المعدلة وراثيا والضربة القاضية وصغر حجمها ، مما يسمح بالحد الأدنى من جرعات الأدوية المطلوبة للتقييم في الجسم الحي ، يفضل وجود نموذج تجريبي راسخ في الفئران لأبحاث AP. علاوة على ذلك ، فإن SAP المستحث من خلال توروكولات الصوديوم (TC) هو حاليا أحد النماذج الأكثر استخداما والأفضل تميزا. تم التحقيق في هذا النموذج للعلاجات الجديدة والأحداث الجزيئية المحتملة أثناء عملية AP. هنا ، نقدم جيل نموذج الماوس AP باستخدام توروكولات الصوديوم وحقنة دقيقة بسيطة محلية الصنع. علاوة على ذلك ، نقدم أيضا منهجية لعلم الأنسجة والاختبارات المصلية اللاحقة.
Introduction
التهاب البنكرياس الحاد (AP) هو التهاب حاد في البنكرياس يتميز بانسداد قناة البنكرياس الرئيسية مع انتفاخ القناة اللاحق والهضم الذاتي للبنكرياس بواسطة الإنزيمات المنشطة بشكل غير طبيعي. وتشمل مظاهره السريرية الالتهاب الموضعي أو الجهازي ، وآلام البطن ، وارتفاع أميلاز المصل1،2. وفقا لتصنيف الشدة 3 ، يمكن أن يظهر AP في أشكال خفيفة ومعتدلة وحادة ، ومن بينها ، التهاب البنكرياس الحاد الوخيم (SAP) هو الحالة الأكثر إثارة للقلق بسبب ارتفاع معدل الوفيات لأكثر من 30٪ 4. في الولايات المتحدة ، يعد AP أحد الأسباب الأكثر شيوعا لدخول المستشفى ، حيث يؤثر على أكثر من 200000 مريض5. علاوة على ذلك ، فإن AP ، وخاصة SAP ، تتزايد سنويا وتؤثر على الفئات العمرية الأصغر سنا6. ومع ذلك ، هناك نقص في خيارات العلاج الفعالة في الممارسة السريرية الحالية6,7. لذلك ، من الضروري استكشاف الآليات الجزيئية المشاركة في AP ، وبالتالي تسهيل تحسين العلاج.
هناك حاجة إلى نماذج حيوانية تجريبية راسخة لدراسة الآليات المشاركة في AP وتقييم فعالية طرق العلاج المختلفة. مع سهولة الوصول إلى السلالات المعدلة وراثيا والضربة القاضية وصغر حجمها ، مما يقلل من جرعات الأدوية المطلوبة للتقييم في الجسم الحي ، تفضل الفئران لأبحاث AP. لذلك ، تم تطوير العديد من نماذج AP في الفئران8,9.
من خلال العمل من نموذج الفئران التهاب البنكرياس الخفيف الناجم عن خلال إعطاء caerulein10 عن طريق الوريد ، طور Niederau et al. نموذج فأر SAP مقدم مع نخر الخلايا الأسينية الناجم عن استخدام نفس الدواء وطريق الحقن 11. على الرغم من أن هذا النموذج يمتلك العديد من المزايا ، بما في ذلك عدم الغزو ، والحث السريع ، والاستنساخ الواسع ، وقابلية التطبيق ، فإن العيب الرئيسي هو أنه يتم تطوير شكل خفيف فقط من AP في معظم الحالات ، مما يحد من أهميته السريرية. يعتبر الكحول أحد العوامل المسببة الرئيسية ل AP. ومع ذلك ، أفاد Foitzik et al. أنه يسبب إصابة البنكرياس فقط عندما يقترن بعوامل أخرى ، مثل فرط تحفيز الإفرازات الخارجية 12. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن نماذج AP التي يسببها الكحول تم تطويرها عبر طرق إدارة مختلفة ، وتم الإبلاغ عن جرعات المخدرات 13،14،15 ، إلا أن عيبها الرئيسي هو صعوبة إعادة إنتاجها. الإدارة داخل الصفاق من L-أرجينين يمكن أيضا أن تحفز AP في الفئران16; ومع ذلك ، فإن أهميته السريرية المنخفضة تعيق تطبيقه. تم اقتراح Taurocholate ، وهو ملح صفراوي ، لأول مرة من قبل Creutzfeld et al. في عام 1965 لإحداث حالة تشبه AP البشري عن طريق ضخ قناة البنكرياس 17. على الرغم من وجود خلافات بشأن أهميته السريرية في الفيزيولوجيا المرضية18,19 ، إلا أن التهاب البنكرياس الناجم عن التوروكولات لا يزال نموذجا لا غنى عنه ل SAP.
نظرا لأن هذا النموذج سهل الإدراك وفعال أيضا في الفئران ، فهو الآن أحد أكثر نماذج AP استخداما للحيوانات الصغيرة في دراسات الجسم الحي. استخدم Perides et al. توروكولات الصوديوم (TC) للحث على SAP في الفئران20 ، مما يوفر رؤى لفهم علم الأمراض. جنبا إلى جنب مع تقنيات التعديل الوراثي ، سمح لنا هذا النموذج بتأكيد العديد من الجينات المحددة المشاركة في AP. على سبيل المثال ، أظهر Bicozo et al. أن ضربة قاضية من جين CD38 محمية ضد نموذج من التهاب البنكرياس بالتسريب TC وعزوا الآليات إلى التغيرات في إشارات Ca2+ داخل الخلايا21. قام Fanczal et al. بالتحقيق في الآثار الفسيولوجية لتعبير TRPM2 في الغشاء البلازمي للخلايا الأسينار والقنوات البنكرياسية للفئران ، وأظهر انخفاض شدة SAP الناجم عن TC في الفئران القاضية TRPM22. علاوة على ذلك ، يوفر هذا النموذج أيضا طريقة بسيطة وفعالة لاختبار العديد من الأدوية الجديدة في الجسم الحي. على سبيل المثال ، مكنت هذه الطريقة من التحقق من صحة الآثار العلاجية للكافيين23 ، وحمض dehydrocholic 24 ، ومضادات الأكسدة المختلفة ومضادات التخثر 25,26. يوضح هذا الدليل تعدد استخدامات نموذج SAP الناجم عن TC. وعلى الرغم من أن ويتل وآخرون وصفوا نموذجا مماثلا للماوس27، فإن الافتقار إلى التفاصيل بشأن إجراءات التنفيذ يمكن أن يؤدي إلى عدم القدرة على استنساخ النتائج. في هذه المقالة ، نركز على الطرق التي تستخدم حقنة مجهرية بسيطة محلية الصنع وندرس SAP الناجم عن TC ، وبالتالي توفير إرشادات ممكنة ليس فقط لمزيد من الدراسة للإمراض وعلاج AP ، ولكن أيضا لطريقة تجريبية قابلة للتكيف تماما للعديد من المواد الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب التي شملت الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة سوشو. تم إجراء جميع العمليات الجراحية تحت التخدير الكامل. لم تستخدم المسكنات لتجنب التدخل في المسار الطبيعي للمرض وفقا للأدبيات السابقة28,29. كما تم منح الموافقة على عدم وجود مسكن من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة سوشو.
1. التحضير
- قم بسرعة فأر من النوع البري C57BL/6 قبل 8-12 ساعة من الجراحة.
- تحضير 5٪ (ث / v) محلول TC (93 ملليمتر) مخفف إلى 0.9٪ كلوريد الصوديوم. تصفية الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
- قم بتعقيم الأدوات والمواد الجراحية ، بما في ذلك الملقط والمقص وحامل الشفرة وحامل الإبرة ومشبك مرقئ الدم والمشابك الوعائية والستائر المعقمة ، باستخدام معقم ضغط عند درجة حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إعداد حقنة صغيرة محلية الصنع. للقيام بذلك ، قم بتثبيت طرف الأنسولين القابل للتصرف يدويا وطرف ماصة بلاستيكية لفترات طويلة على حقنة ميكرولتر مسطحة بطرف 25 ميكرولتر. تعقيم من خلال التشعيع.
2. التخدير والتحضير قبل الجراحة
- يزن ذكور C57BL / 6 من النوع البري من عمر 6 إلى 8 أسابيع (حوالي 21-23 جم). حث التخدير العام عن طريق الحقن داخل الصفاق من محلول الصوديوم بنتوباربيتال 1٪ بجرعة 50 ملغ / كغ.
- ثبت الماوس في وضع الاستلقاء على لوحة مسطحة من الرغوة المشععة باستخدام الشريط.
- قم بإعداد منطقة التشغيل لكل عن طريق إزالة الفراء الخاص به باستخدام كريم إزالة الشعر من مستوى عملية الخناق وصولا إلى خط توصيل العمود الفقري الحرقفي العلوي الأمامي الثنائي ، مع الجانبين الأيسر والأيمن الموازي لخط الإبط الأمامي.
- إعداد حقل جراحي معقم مع التركيز بشكل خاص على المنطقة الجراحية ، التي تتكون من المنطقة المعدة على الحيوان ومقدمة الجراح.
- تطهير سطح الطاولة.
- نظف موقع الشق باستخدام تطبيقات متعددة لمحلول الفرك الجراحي. امسح الجلد مرتين إلى ثلاث مرات باستخدام 0.5٪ من اليود واتركه يجف لمدة 1-2 دقيقة في كل مرة.
- قم بتغطية الماوس بستائر معقمة.
3. الإجراء الجراحي
ملاحظة: يصور الشكل 1 تشريح ومورفولوجيا بنكرياس الفأر قبل وبعد الحقن الرجعي ل TC في القناة الصفراوية البنكرياسية عن طريق الحقن المجهري.
- قم بعمل شق متوسط في البطن بطول 2 إلى 3 سم تقريبا.
- حدد موقع الاثني عشر من اليسار إلى اليمين على طول المعدة. اسحب الاثني عشر برفق إلى الخارج وإلى الجانب الأيسر باستخدام ملقط جراحي وقطعة قطن منقوعة بمطهر لفضح البنكرياس والقناة الصفراوية البنكرياسية وحليمة الاثني عشر. احرص على عدم إصابة جدار الأمعاء أو الأوعية ذات الصلة.
- استخدم 8-0 خيوط للمرور عبر الاتصال بين الاثني عشر والبنكرياس حول الحليمة ، وسحبها إلى الجانب الأيسر من جسم الفأر لإصلاح الاثني عشر.
- اسحب الجلد والحافة السفلية للكبد برفق جانبا. قم بتثبيت القناة الكبدية المشتركة ، مع التأكد من عدم تثبيت الوريد البابي أو البنكرياس. مشبك القناة الصفراوية البنكرياسية القريبة.
- اخترق الحاقن الدقيق في القناة الصفراوية البنكرياسية البعيدة بأثر رجعي. إصلاح طرف الإبرة بالقرب من حليمة الاثني عشر مع مشبك. غرس 10 ميكرولتر من 5٪ TC في قناة البنكرياس بمعدل 5 ميكرولتر / دقيقة.
- حافظ على القناة الصفراوية البنكرياسية مغلقة لمدة 5 دقائق لتحقيق ضغط مستقر. ثم ، اسحب الحاقن الدقيق وقم بإزالة المشابك.
- استعادة الاثني عشر إلى الوضع التشريحي الأصلي والتحقق من النزيف.
- أغلق الجرح ب 6-0 خيوط وقم بتطهيره بنسبة 0.5٪ من اليودوفور.
4. التعافي وإدارة ما بعد الجراحة
- استعادة الحيوانات من التخدير على وسادة حرارية 37 درجة مئوية. لا ترسل الحيوانات التي يتم تشغيلها إلى غرفة ما بعد الجراحة الزمنية حتى تستيقظ جميع الحيوانات.
- إدارة 0.8 مل من 0.9٪ المالحة تحت الجلد وببطء لمكملات السوائل.
- راقب الحيوانات بعد العملية الجراحية لحالتها العامة وعلامات العدوى أو المرض.
5. الاختبار المصلي وتقييم الأنسجة
- في 24 ساعة بعد العملية ، قم بتخدير الفئران بالصوديوم البنتوباربيتال باستخدام نفس الجرعة وطريق الحقن.
- اجمع كل الدم من الشريان الأورطي البطني (حوالي 0.8 مل لكل ماوس) وقم بالدوران عند 1500 × جم لمدة 15 دقيقة لعزل المصل لمزيد من الاختبارات.
- جمع أنسجة البنكرياس.
- افتح التجويف الصدري لجمع أنسجة الرئة.
- قم بقياس مؤشرات وظائف الكيمياء الحيوية من المصل، بما في ذلك الأميليز والليباز ووظائف الكبد (ألانين ترانساميناس (ALT) وترانساميناس الأسبارتات (AST))، ووظائف الكلى (اليوريا والكرياتين)، باستخدام مجموعات تجارية وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
- تجانس أنسجة الرئة والبنكرياس وقياس مستوى الميلوبيروكسيديز (MPO) باستخدام مجموعة تجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- افتح التجويف الصدري وقم بفتح 20 مل من المياه المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) مرتين ، ثم اجمع البنكرياس. انغمس في محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ لمدة 24 ساعة. تجفيف في سلسلة من تركيزات الكحول وتضمينها في البارافين.
- استخدم ميكروتوم لإعداد 5 ميكرومتر من أقسام أنسجة البنكرياس السميكة.
- إجراء تلطيخ H & E للتقييم النسيجي للبنكرياس.
- تقييم الدرجات المرضية وفقا للمعايير التي اقترحها شميدت وآخرون.30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من خلال اتباع التعليمات المذكورة أعلاه بعناية ، حصلنا على متوسط مدة الجراحة حوالي 40 دقيقة. كانت الفئران غير نشطة قليلا وفقدت حوالي 0.5-1.75 جم و 0.85-1.85 جم و 0.5-4.73 جم من الوزن عند 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة بعد العملية ، على التوالي (الشكل 2).
من وقت الانتهاء من الجراحة إلى 24 ساعة بعد العملية ، مع تطور المرض ، أصبحت الفئران غير نشطة وأظهرت استجابات وإجراءات بطيئة.
كانت معدلات البقاء على قيد الحياة للفئران الضابطة و SAP 100٪ (8/8) و 72.7٪ (8/11) ، على التوالي ، في 72 ساعة بعد العملية (الشكل 3).
وفقا لتلطيخ H & E (الشكل 4) والنتيجة المرضية (الشكل 5) النتائج من أقسام البنكرياس ، يمكن ملاحظة الوذمة الواضحة (النتيجة: 3.14 ± 0.51 مقابل 0.10 ± 0.08) ، والالتهاب (النتيجة: 1.41 ± 0.81 مقابل 0) ، والنخر (النتيجة: 3.03 ± 0.77 مقابل 0) من أنسجة البنكرياس في الفئران SAP بالنسبة للفئران الضابطة. وفي الوقت نفسه ، لم يتم العثور على تغييرات كبيرة في النزيف (النتيجة: 0.125 ± 0.31 مقابل 0) في كلتا المجموعتين من الفئران ، مما أدى إلى ارتفاع كبير في مجموع درجات علم الأمراض في فئران SAP (النتيجة: 7.72 ± 1.61 مقابل 0.10 ± 0.08).
علاوة على ذلك ، مقارنة بالفئران الضابطة ، زادت مستويات الأميليز بشكل كبير ([46,740.32 ± 12,801.30] U / L مقابل [3,324.40 ± 753.66] U / L ، p < 0.001) ، الليباز ([545.02 ± 356.28] U / L مقابل [18.32 ± 25.22] U / L ، p < 0.05) ، والبنكرياس والرئة MPO (البنكرياس: [5.18 ± 3.26] U / g مقابل [0.71 ± 0.41] U / g ، p < 0.05 ؛ الرئة: [11.70 ± 1.31] تم العثور على U / g مقابل [1.56 ± 0.45] U / g ، p < 0.001) في فئران SAP (الشكل 6).
بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع الفئران الضابطة ، أظهرت فئران SAP ضعفا في وظائف الكبد والكلى ، كما هو موضح في المؤشرات التالية: ALT ([164.36 ± 47.66] U / L مقابل [77.15 ± 31.06] U / L ، p < 0.001) ، AST ([222.35 ± 82.13] U / L مقابل [116.61 ± 64.79] U / L ، p < 0.01) ، نيتروجين اليوريا في الدم (BUN) ([37.59 ± 16.36] mM مقابل [14.80 ± 3.74] mM ، p < 0.001) والكرياتينين ([40.33 ± 11.53] μM مقابل [28.66 ± 4.53] μM ، p < 0.01) (الشكل 7).
الشكل 1. تشريح ومورفولوجيا البنكرياس الفأر قبل وبعد الحقن الرجعي لتوروكولات الصوديوم (TC) في القناة الصفراوية البنكرياسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. المسار الزمني لتغيرات الوزن للتحكم (n = 8) والتهاب البنكرياس الحاد الوخيم (n = 11) الفئران. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (SD). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. رصد منحنى البقاء على قيد الحياة للتحكم (n = 8) والتهاب البنكرياس الحاد الوخيم (n = 11) الفئران. تمثل الأرقام باللونين الأزرق والأحمر أعداد الفئران الباقية على قيد الحياة في نقطة زمنية محددة في مجموعتي التحكم و SAP ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. علم الأنسجة المرضي لأقسام البنكرياس من السيطرة والتهاب البنكرياس الحاد الوخيم (SAP) الفئران. يشير السهم الأسود إلى تسلل الخلايا الالتهابية ، ويشير السهم الأحمر إلى النزيف ، ويشير المثلث الأسود المقلوب إلى نخر الأسينار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. درجات علم الأنسجة. درجات الأنسجة (بما في ذلك الوذمة والنخر والالتهاب والنزيف والدرجات الإجمالية) لقسم البنكرياس من الفئران الضابطة والتهاب البنكرياس الحاد الوخيم (SAP). تمثل كل نقطة سوداء النتيجة المقابلة من ماوس واحد. ns: ليست كبيرة. ** ص < 0.01 ؛ ص < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. التقييم المصلي للأميلاز والليباز وتحديد نشاط البنكرياس والرئة الميلوبيروكسيديز (MPO). تم العثور على مستويات متزايدة بشكل كبير من الأميليز والليباز والبنكرياس والرئة MPO في الفئران SAP بالنسبة للفئران الضابطة. نقطة سوداء واحدة تمثل ماوس واحد. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (SD). * ص < 0.05 ؛ ص < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7. مؤشرات وظائف الكبد (ALT: ألانين أمينوترانسفيراز ، و AST: أسبارتات أمينوترانسفيراز) ومؤشرات وظائف الكلى (الكرياتينين و BUN: نيتروجين اليوريا في الدم) ، في السيطرة والتهاب البنكرياس الحاد الوخيم (SAP) الفئران. تم العثور على مستويات متزايدة بشكل كبير من ALT و AST و BUN والكرياتينين في فئران SAP بالنسبة للفئران الضابطة. نقطة سوداء واحدة تمثل ماوس واحد. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (SD). * ص < 0.05 ؛ ** ص < 0.01 ؛ ص < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد نموذج SAP الناجم عن TC أداة بحث ممتازة. كما هو موضح في هذه الدراسة ، يتم تحقيق هذا النموذج بسهولة كبيرة في المختبرات العامة دون استخدام أجهزة محددة. عند استخدامه بالاقتران مع علم الأنسجة والتحليل الكيميائي الحيوي ، فإنه يوفر نهجا من حيث التكلفة (كواشف غير مكلفة) وموفرا للوقت (نافذة زمنية 24 ساعة) لتحفيز وتقييم AP. يوفر ضبط تركيز TC أيضا إمكانية إنتاج AP خفيف ومعتدل. كما استخدم Perides et al. TC للحث على SAP في الفئران 20 ، وكان الفرق الرئيسي هو أنهم استخدموا مضخة لضخ TC ، التي قد توفر جرعة تسريب أكثر دقة.
وفقا لتجربتنا ، خلال العملية الجراحية لإنشاء النموذج ، شملت أهم العوامل التعرض الكامل للقناة الصفراوية البنكرياسية ، والثقب السلس للحاقن الدقيق ، وحقن TC في القناة الصفراوية البنكرياسية وقناة البنكرياس بسرعة ثابتة نسبيا. يجب إيلاء الاهتمام للنقاط التالية أثناء الجراحة. أولا ، يجب سحب الاثني عشر بلطف لتجنب تطبيق القوة المفرطة ، مما قد يؤدي إلى نخر الاثني عشر. تقع فتحة القناة الصفراوية البنكرياسية على طول الحافة الداخلية للاثني عشر (وتسمى أيضا حليمة الاثني عشر) ، ويمكن تحديد موقع القناة الصفراوية البنكرياسية في وقت لاحق. إذا نجحت ، يجب تحديد الحليمة البيضاء الاثني عشر والأنابيب التي تشكل القناة الصفراوية البنكرياسية وتمر عبر البنكرياس على شكل ورقة. التعرض الكافي للقناة الصفراوية البنكرياس يجب أن يسهل الإجراءات اللاحقة. ثانيا ، يجب تطبيق قوة سحب معتدلة عند تثبيت الاثني عشر على الجانب الأيسر السفلي من الماوس الموضوعة في وضع الاستلقاء باستخدام الغرز ، وبالتالي استقامة القناة الصفراوية البنكرياسية دون فقدان التوتر. يمكن أن تؤدي قوى السحب المفرطة وغير الكافية إلى تمزيق جدار الاثني عشر وعدم كفاية التعرض للقناة الصفراوية البنكرياسية ، على التوالي ، مما قد يؤثر سلبا على الثقب اللاحق. يوصى بزاوية رأسية لضمان ثقب سلس عند تثبيت الاثني عشر على الجانب الأيسر السفلي باستخدام الغرز. ثم ، أثناء الثقب ، تأكد من أن اتجاه الثقب مواز لاتجاه القناة الصفراوية البنكرياسية. عند الثقب ، يجب توجيه المستوى المائل لطرف الإبرة إلى الأسفل للمرور عبر جدار الاثني عشر ومن ثم الدخول إلى القناة الصفراوية البنكرياسية ، مع التأكد من استخدام القوة المناسبة لتجنب ثقب القناة الصفراوية البنكرياسية. بعد ثقب ناجح ، لا ينبغي الشعور بأي مقاومة عند دخول القناة الصفراوية البنكرياسية ، ويجب الشعور بتوتر جدار القناة الصفراوية البنكرياسية عند هز طرف الإبرة بلطف. أخيرا ، أثناء الإجراء ، يجب أن يبقى الاثني عشر رطبا بمحلول ملحي طبيعي دافئ للحفاظ على نشاطه.
ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها أيضا بعض القيود. أولا ، قد تتأثر قابلية التكرار بردود فعل مختلفة على TC من كل ماوس. لذلك ، يمكن إجراء مقارنة مقترنة للنتائج المقابلة من كل ماوس لتقليل هذه التأثيرات. ثانيا ، إصابة الحليمة الاثني عشر هي ظاهرة شائعة أثناء عملية الثقب ، والتي يمكن أن تسبب أيضا التهاب البنكرياس الحاد. لذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى وقت تدريب أطول لتطوير المهارات الجراحية الكافية لتحقيق طريقة النمذجة هذه. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحفاظ على حجم مناسب للفئران يمكن أن يكون مفيدا لضمان النتائج الجراحية.
على الرغم من هذه القيود ، يعد هذا النموذج أحد النماذج الأكثر استخداما والأفضل تميزا حتى الآن لتحفيز AP والتحقيق في العلاجات الجديدة والأحداث الجزيئية المحتملة أثناء عملية AP. وفقا للدراسات السابقة ، تم وصف SAP المستحث من خلال TC أيضا بأنه مناسب لتقييم العلاج المستهدف لأن الشدة التي تحققت مع هذا النموذج تشبه المرض البشري ويمكن استنساخها بسهولة. تم الإبلاغ عن تدخل كيرسيتين لتخفيف الضرر المرضي البنكرياسي واللفائفي في نموذج SAP هذا عن طريق تثبيط TLR4 / MyD88 / p38 MAPK وتنشيط إجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ERS)31. يمكن أن تؤدي إدارة CM4620 ، وهو مانع قناة Orai1 انتقائي ، إلى تقليل شدة نموذج SAP هذا بشكل كبير ؛ وقد تبين أن الوقاية من تنشيط التربسينوجين، وموت الخلايا الأسينارية، وNF-κB، والعامل النووي لتنشيط الخلايا التائية المنشطة (NFAT) والاستجابات الالتهابية تعمل كآليات أساسية32. بالإضافة إلى TC ، حمض taurolithocholic 3-sulfate (TLCS) هو حمض الصفراء الآخر الذي يستخدم بشكل متكرر في تحريض AP. وكما استعرض بيترسن وآخرون.33، فإن تركيزات أيون الكالسيوم المرتفعة التي يسببها TLCS في الخلايا الأسينار يمكن أن تؤثر ليس فقط على إنتاج الميتوكوندريا داخل الخلايا، ولكن أيضا على الخلايا الأخرى (الأسينار والنجمية والبلاعم) الموجودة في البنكرياس عن طريق إفراز أيون الكالسيوم؛ في حين أن TC قد يمارس ضررا غير مباشر على الخلايا الأسينارية من خلال تأثيره على الخلايا النجمية المحيطة بالأسينار.
لذلك ، يوفر نموذج SAP الناجم عن TC رؤى ممتازة حول التسبب في AP وهو أداة ذات صلة عالية للتحقق من صحة الأدوية الجديدة قبل السريرية. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف هذا النموذج مع الحيوانات الكبيرة لمواصلة تقييم الآثار غير السارة وغير المتوقعة الناتجة عن علاجات علاج AP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
نحن ممتنون للدعم المقدم من المنح التالية: منحة بحثية انتقالية من NCRCH [2020WSA01] ، ومنحة علمية KJXW من لجنة سوتشو للصحة للعلماء الشباب [KJXW2020002] ، وخطة العلوم والتكنولوجيا لمدينة سوتشو (SKY2021038 و SKJY2021050) ، ومنحة من تطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو (PAPD) ، وخطة البحث الأولية والتنمية الاجتماعية لمقاطعة جيانغسو (BE2018659).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% iodophor | Shanghai Likang Disinfectant | 310102 | 4 mL/mouse |
| 0.9% sodium chloride | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10019318 | 0.8 mL/mouse |
| 1% Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 0.2 -0.25 mL/mouse |
| 25 μL flat tip Microliter syringe | Gaoge, Shanghai | A124019 | |
| 4% Paraformaldehyde | Beyotime, Nantong, China | P0099-500ml | |
| 5% sodium taurocholate (TC) | Aladdin | S100834-5g | 10 μL/SAP mouse |
| 6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle) | Cheng-He | 20093 | |
| 75% alcohol | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10009218 | 4 mL/mouse |
| 8-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (3/8 circle) | Cheng-He | 19064 | |
| ALT Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | ALT0012 | |
| Amylase Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AMY0012 | |
| Angled small bulldog clamp with 12 mm jaw (3 cm) | Cheng-He | HC-X022 | |
| aspen shavings or shreds for mouse bedding | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | VR03015 | |
| AST Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AST0012 | |
| Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay Kit | EPNK, Anhui, China | BUN0011 | |
| C57BL/6 mouse | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | 213 | |
| Creatine Assay Kit | EPNK, Anhui, China | CRE0012 | |
| Feature microtome blade | Beyotime, Nantong, China | E0994 | |
| Hemostatic Forceps (9.5 cm, Curved) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | JC3901 | |
| Lipase Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A054-2-1 | |
| Microtome | Leica biosystem, Germany | RM2245 | |
| Mindray biochemistry analyzer | Mindray, Shenzhen, China | BS-420 | |
| MPO Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A044-1-1 | |
| Normal mouse chow | Trophic, Nantong, China | LAD 1000 | |
| Phosphate buffered saline | Beyotime, Nantong, China | C0221A | |
| Straight micro-bulldog clamp with 5 mm jaw (1.5 cm) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | W40130 | |
| Straight or curved forceps (11.0 cm) | Cheng-He | HC-X091A or HC-X090A | |
| Straight Scissors (10.0 cm) | Cheng-He, Ningbo, China | HC-J039102 | |
| Thermo Scientific Centrifuge | Thermo Scientific, USA | Multifuge X1R |
References
- Lee, P. J., Papachristou, G. I. New insights into acute pancreatitis. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (8), 479-496 (2019).
- Mandalia, A., Wamsteker, E. J., DiMagno, M. J. Recent advances in understanding and managing acute pancreatitis. F1000Research. 7, 959 (2018).
- Banks, P. A., et al. Classification of acute pancreatitis-2012: revision of the Atlanta classification and definitions by international consensus. Gut. 62 (1), 102-111 (2013).
- Munir, F., et al. Advances in immunomodulatory therapy for severe acute pancreatitis. Immunology Letters. 217, 72-76 (2020).
- Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143 (5), 1179-1187 (2012).
- Hines, O. J., Pandol, S. J.
- James, T. W., Crockett, S. D. Management of acute pancreatitis in the first 72 hours. Current Opinion in Gastroenterology. 34 (5), 330-335 (2018).
- Silva-Vaz, P., et al. Murine models of acute pancreatitis: a critical appraisal of clinical relevance. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2794 (2019).
- Hyun, J. J., Lee, H. S.
- Renner, I. G., Wisner, J. R., Rinderknecht, H. Protective effects of exogenous secretin on ceruletide-induced acute pancreatitis in the rat. Journal of Clinical Investigation. 72 (3), 1081-1092 (1983).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5), 1192-1204 (1985).
- Foitzik, T., et al. Exocrine hyperstimulation but not pancreatic duct obstruction increases the susceptibility to alcohol-related pancreatic injury. Archives in Surgery. 129 (10), 1081-1085 (1994).
- Schneider, L., Dieckmann, R., Hackert, T., Gebhard, M. M., Werner, J. Acute alcohol-induced pancreatic injury is similar with intravenous and intragastric routes of alcohol administration. Pancreas. 43 (1), 69-74 (2014).
- Huang, W., et al. Fatty acid ethyl ester synthase inhibition ameliorates ethanol-induced Ca2+-dependent mitochondrial dysfunction and acute pancreatitis. Gut. 63 (8), 1313-1324 (2014).
- Sun, J., et al. NRF2 mitigates acute alcohol-induced hepatic and pancreatic injury in mice. Food and Chemical Toxicology. 121, 495-503 (2018).
- Kui, B., et al. New insights into the methodology of L-arginine-induced acute pancreatitis. PLoS One. 10 (2), 0117588 (2015).
- Creutzfeldt, W., Schmidt, H., Horbach, I. Studies on the effects of a trypsin inhibitor (Trasylol) on Enzyme activities and morphology in taurocholate and calciphylaxis pancreatitis of the rat (a contribution to the pathogenesis of pancreatitis). Klin Wochenschr. 43, 15-22 (1965).
- Liu, Z. H., et al. A simple taurocholate-induced model of severe acute pancreatitis in rats. World Journal of Gastroenterology. 15 (45), 5732-5739 (2009).
- Cavdar, F., et al. Controversial issues in biliary pancreatitis: when should we perform MRCP and ERCP. Pancreatology. 14 (5), 411-414 (2014).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
- Orabi, A. I., et al. Cluster of differentiation 38 (CD38) mediates bile acid-induced acinar cell injury and pancreatitis through cyclic ADP-ribose and intracellular calcium release. Journal of Biological Chemistry. 288 (38), 27128-27137 (2013).
- Fanczal, J., et al. TRPM2-mediated extracellular Ca(2+) entry promotes acinar cell necrosis in biliary acute pancreatitis. Journal of Physiology. 598 (6), 1253-1270 (2020).
- Huang, W., et al. Caffeine protects against experimental acute pancreatitis by inhibition of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-mediated Ca2+ release. Gut. 66 (2), 301-313 (2017).
- Zhang, X., et al. Dehydrocholic acid ameliorates sodium taurocholate-induced acute biliary pancreatitis in mice. Biology and Pharmaceutical Bulletin. 43 (6), 985-993 (2020).
- Hagiwara, S., et al. Antithrombin III prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Pancreas. 38 (7), 746-751 (2009).
- Hagiwara, S., et al. Danaparoid sodium prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Shock. 32 (1), 94-99 (2009).
- Wittel, U. A., et al. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 36 (2), 9-21 (2008).
- Barlass, U., et al. Morphine worsens the severity and prevents pancreatic regeneration in mouse models of acute pancreatitis. Gut. 67 (4), 600-602 (2018).
- Wu, D., et al. A systematic review of NSAIDs treatment for acute pancreatitis in animal studies and clinical trials. Clinical Research in Hepatology and Gastroenterology. 44, 100002 (2020).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Annals in Surgery. 215 (1), 44-56 (1992).
- Junyuan, Z., et al. Quercetin protects against intestinal barrier disruption and inflammation in acute necrotizing pancreatitis through TLR4/MyD88/p38MAPK and ERS inhibition. Pancreatology. 18 (7), 742-752 (2018).
- Waldron, R. T., et al. The Orai Ca(2+) channel inhibitor CM4620 targets both parenchymal and immune cells to reduce inflammation in experimental acute pancreatitis. Journal of Physiology. 597 (12), 3085-3105 (2019).
- Petersen, O. H., Gerasimenko, J. V., Gerasimenko, O. V., Gryshchenko, O., Peng, S. The roles of calcium and ATP in the physiology and pathology of the exocrine pancreas. Physiological Reviews. 101 (4), 1691-1744 (2021).
