בידוד תאי אנדותל רשתית מורין לריצוף הדור הבא
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאי אנדותל רשתית לאחר הלידה הממוטבת לתפוקת התאים, טוהר וכדאיות. תאים אלה מתאימים לגישות ריצוף מהדור הבא.
Abstract
השיפורים האחרונים בריצוף הדור הבא קידמו את הידע של חוקרים בביולוגיה מולקולרית ותאית, כאשר מספר מחקרים חשפו פרדיגמות חדשניות בביולוגיה של כלי הדם. יישום שיטות אלה על מודלים של התפתחות כלי הדם דורש אופטימיזציה של טכניקות בידוד תאים מרקמות עובריות ולאחר הלידה. תפוקת התאים, הכדאיות והטוהר צריכים כולם להיות מקסימליים כדי להשיג תוצאות מדויקות וניתנות לשחזור מגישות ריצוף מהדור הבא. מודל כלי הדם ברשתית של עכברים ילודים משמש חוקרים לחקר מנגנונים של התפתחות כלי דם. חוקרים השתמשו במודל זה כדי לחקור מנגנונים של אנגיוגנזה ומפרט גורל עורקי-ורידי במהלך היווצרות כלי דם והבשלתם. יישום טכניקות ריצוף מהדור הבא כדי לחקור את מודל התפתחות כלי הדם ברשתית דורש אופטימיזציה של שיטה לבידוד תאי אנדותל ברשתית שממקסמת את תפוקת התאים, את הכדאיות ואת הטוהר. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד, עיכול וטיהור של רקמת רשתית מורין באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS). התוצאות מצביעות על כך שאוכלוסיית תאי האנדותל CD31+/CD45 המטוהרת על ידי FACS מועשרת מאוד לביטוי גנים של תאי אנדותל ואינה מציגה שינוי בכדאיות במשך 60 דקות לאחר FACS. כלולות תוצאות מייצגות של גישות ריצוף מהדור הבא על תאי אנדותל שבודדו בשיטה זו, כולל ריצוף RNA בתפזורת וריצוף RNA חד-תאי, המוכיחות כי שיטה זו לבידוד תאי אנדותל ברשתית תואמת ליישומי ריצוף מהדור הבא. שיטה זו של בידוד תאי אנדותל ברשתית תאפשר טכניקות ריצוף מתקדמות כדי לחשוף מנגנונים חדשים של התפתחות כלי הדם.
Introduction
יכולת התפוקה הגבוהה של ריצוף חומצות גרעין באמצעות גישות ריצוף מהדור הבא קידמה מאוד את הידע של החוקרים בביולוגיה מולקולרית ותאית. טכניקות מתקדמות אלה כוללות ריצוף RNA של תעתיק שלם, ריצוף DNA של אזורים ממוקדים לזיהוי פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs), ריצוף DNA של גורמי שעתוק מאוגדים בריצוף מיצוי חיסוני של כרומטין (ChIP), או אזורי כרומטין פתוחים ב- Assay לריצוף כרומטין נגיש לטרנספוזאז (ATAC), וריצוף RNA חד-תאי1 . בביולוגיה של כלי הדם, התקדמות זו אפשרה לחוקרים להבהיר מנגנונים מורכבים של התפתחות ומחלות, יחד עם הבחנה בין דפוסי ביטוי גנים לאורך רצף של פנוטיפים משתנים 2,3. ניסויים עתידיים יכולים להגדיר מנגנונים מורכבים על ידי שילוב ריצוף הדור הבא עם מודלים מוערכים של התפתחות כלי דם, אך השיטות להכנת דגימות צריכות להיות תואמות לטכניקות הריצוף המתקדמות.
האיכות, הדיוק והשכפול של גישות ריצוף מהדור הבא תלויים בשיטת הכנת הדגימה. בעת בידוד תת-קבוצה של תאים או יצירת תרחיפים חד-תאיים מרקמות, שיטות עיכול וטיהור אופטימליות חיוניות למקסום מספר התא, הכדאיות והטוהר של אוכלוסיית התאים 4,5. זה דורש איזון בשיטת העיכול: עיכול חזק נחוץ כדי לשחרר תאים מהרקמה ולקבל מספיק תאים עבור גישות במורד הזרם, אבל הכדאיות התא תושפע לרעה אם העיכול חזק מדי 6,7. בנוסף, טוהר אוכלוסיית התאים נחוץ לתוצאות חזקות ולניתוח מדויק של נתונים, שניתן להשיג באמצעות FACS. זה מדגיש את החשיבות של אופטימיזציה של שיטות בידוד תאים כדי ליישם ריצוף הדור הבא על מודלים מבוססים של התפתחות כלי הדם.
מודל מאופיין היטב לחקר התפתחות כלי הדם הוא מודל התפתחות כלי הדם ברשתית. כלי הדם ברשתית מורין מתפתחים לאחר הלידה במקלעת שטחית דו-ממדית, עם הנבטה אנגיוגנית ראשונית מעצב הראייה הנראית ביום שלאחר הלידה (P)3, חזית אנגיוגנית עם תאי גבעול וקצה והבשלה ראשונית של כלי הדם הנראית לעין ב-P6, והבשלה של מקלעת כלי הדם הנראית לאחר P9 8,9. במהלך השיפוץ של מקלעת כלי הדם הראשונית, תאי האנדותל עוברים אפיון לכיוון פנוטיפים עורקיים, נימיים וורידיים בכלי דם שונים כדי ליצור רשת מחזור דם10,11. לכן, שיטה זו מאפשרת לחוקרים לדמיין היווצרות מקלעת כלי דם אנגיוגנית ומפרט עורקי-ורידי אנדותל והתבגרות בנקודות זמן שונות במהלך ההתפתחות9. בנוסף, מודל זה מספק שיטה לחקירת ההשפעות של מניפולציה מהונדסת על אנגיוגנזה והתפתחות מקלעת כלי הדם, אשר יושמה לחקר התפתחות כלי הדם, מומים עורקיים-ורידיים וניאו-וסקולריזציה המושרה על ידי חמצן 12,13,14,15,16 . על מנת לשלב גישות ריצוף מהדור הבא עם מודל פיתוח כלי הדם ברשתית, יש צורך בפרוטוקול אופטימלי לבידוד תאי אנדותל מרקמת הרשתית.
פרוטוקול זה מתאר שיטה אופטימלית לעיכול רקמת רשתית מעכברים ב-P6 כדי למקסם את תפוקת התאים, טוהר וכדאיות. רקמת הרשתית מבודדת מעכברי P6, מתעכלת במשך 20 דקות, מוכתמת חיסונית עבור CD31 ו-CD45, ומטוהרת באמצעות FACS כדי לבודד תרחיף של תא בודד של תאי אנדותל תוך כשעתיים וחצי (איור 1A). נמצא כי תאי אנדותל אלה שומרים על כדאיות גבוהה במשך 60 דקות לאחר הבידוד17, מה שמאפשר הכנה לספרייה לשיטות ריצוף מהדור הבא. בנוסף, תוצאות מייצגות מסופקות עבור תוצאות בקרת איכות ובקרת איכות של FACS משתי שיטות ריצוף נפרדות מהדור הבא המשתמשות בפרוטוקול בידוד זה: ריצוף RNA שלם של תעתיק וריצוף RNA של תא יחיד. שיטה זו מאפשרת להשתמש בגישות ריצוף מהדור הבא בשילוב עם מודל כלי הדם ברשתית כדי להבהיר מנגנונים חדשים של התפתחות כלי הדם.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאי אנדותל מרקמת רשתית מורין לאחר הלידה, אשר עברה אופטימיזציה למספר תאים גבוה, טוהר וכדאיות. טוהר התאים מתקבל על ידי בידוד FACS של אוכלוסיות תאי אנדותל מתרחיף חד-תאי מעוכל על ידי CD31+/CD45- אימונוסטינינג. איכות הבידוד מכמתת במבחנים לכדאיות על ידי צביעה כחולה של טריפא…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תודה למתקן הציטומטריה של זרימת ייל, למתקן הליבה של ציטומטריה של זרימה באוניברסיטת וירג’יניה, למרכז ייל לאנליזה גנומית, ולליבת ניתוח הגנום והטכנולוגיה של אוניברסיטת וירג’יניה על המאמץ, המומחיות והייעוץ שלהם בתרומה לניסויים המוצגים. מחקר זה מומן על ידי מענקי NIH ל- N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) ו- K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).
Materials
| 2 mL Eppendorf safe-lock tubes | USA Scientific | 4036-3352 | |
| 5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| 60 mm Non TC-treated Culture Dish | Corning | 430589 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control | BD Biosciences | 553932 | |
| BD FACSChorus Software | BD Biosciences | FACSCHORUS | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | FACSMELODY | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | 234115 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3548 | |
| D-Glucose | Gibco | A2494001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 12-711-9AM | |
| Dissecting Pan Wax | Carolina | 629100 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dissection Stereo Microscope M165 FC | Leica | M165FC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-052 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 22364120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fine dissection forceps | Fine Science Tools | 11250-00 | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630130 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | 11695067772 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath | Fisher Scientific | FSGPD20 | |
| Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated | ThermoFisher | 75002477 | |
| SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5120 | |
| Trypan Blue Solution | ThermoFisher | 15250061 | |
| V450 Rat Anti-Mouse CD45 | BD Biosciences | 560501 | |
| V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560457 |
References
- Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).
- Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).
- Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).
- Potter, A. S., Potter, S. S., S, Dissociation of tissues for single-cell analysis. Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).
- Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq. Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).
- Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
- Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D’Amore, P. Characterization of vascular development in the mouse retina. Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).
- Crist, A., Young, C., Meadows, S. Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina. Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).
- dela Paz, N. G., D’Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).
- Fang, J. S., Hirschi, K. K. Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification. F1000Res. 8, (2019).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Ruiz, S., et al. A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10. Scientific Reports. 6, 37366 (2016).
- Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).
- Ola, R., et al. SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2. Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).
- Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).
- Hulspas, R., O’Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).
- Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
- Green, M. R., Sambrook, J. Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).
- Liu, L., Shi, G. P. CD31: beyond a marker for endothelial cells. Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).
- Zarkada, G., et al. Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation. Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).
- Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells. Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).
- Benedito, R., et al. The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis. Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).
- Daneman, R., et al. Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).
- Okabe, K., et al. Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina. Cell. 159 (3), 584-596 (2014).
- Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).
- Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice. Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).
- Ma, W., et al. Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization. eLife. 8, 42049 (2019).
- Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).
- Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation. Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).
- Larrivee, B., et al. ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway. Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).
- Wythe, J. D., et al. ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification. Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).
- Davis, D. M., Purvis, J. E. Computational analysis of signaling patterns in single cells. Seminars in Cell and Developmental Biology. , 35-43 (2015).
- Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
- Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).
- Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).
