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Behavior

Drosophila Comportamiento de evitación pasiva como nuevo paradigma para estudiar el aprendizaje asociativo aversivo

Published: October 15, 2021 doi: 10.3791/63163
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physiology, East Carolina University

ERRATUM NOTICE

Summary

Este trabajo describe un paradigma conductual simple que permite el análisis del aprendizaje asociativo aversivo en moscas de la fruta adultas. El método se basa en suprimir el comportamiento geotaxis negativo innato debido a la asociación formada entre un contexto ambiental específico y una descarga eléctrica.

Abstract

Este protocolo describe un nuevo paradigma para analizar el aprendizaje asociativo aversivo en moscas adultas (Drosophila melanogaster). El paradigma es análogo al comportamiento de evitación pasiva en roedores de laboratorio en el que los animales aprenden a evitar un compartimento donde previamente han recibido una descarga eléctrica. El ensayo aprovecha la geotaxis negativa en moscas, que se manifiesta como un impulso de subir cuando se colocan en una superficie vertical. La configuración consiste en compartimentos superiores e inferiores orientados verticalmente. En la primera prueba, una mosca se coloca en un compartimento inferior desde donde generalmente sale dentro de 3-15 s, y entra en el compartimiento superior donde recibe una descarga eléctrica. Durante la segunda prueba, 24 h después, la latencia aumenta significativamente. Al mismo tiempo, el número de choques disminuye en comparación con el primer ensayo, lo que indica que las moscas formaron memoria a largo plazo sobre el compartimento superior. Las grabaciones de latencias y número de choques podrían realizarse con un contador de conteo y un cronómetro o con un dispositivo simple basado en Arduino. Para ilustrar cómo se puede utilizar el ensayo, aquí se caracterizó el comportamiento de evitación pasiva de D. melanogaster y D. simulans masculino y femenino. La comparación de latencias y el número de choques reveló que tanto D. melanogaster como D. simulans vuelan de manera eficiente aprendieron el comportamiento de evitación pasiva. No se observaron diferencias estadísticas entre las moscas macho y hembra. Sin embargo, los hombres fueron un poco más rápidos al ingresar al compartimento superior en el primer ensayo, mientras que las mujeres recibieron un número ligeramente mayor de choques en cada ensayo de retención. La dieta occidental (WD) deterioró significativamente el aprendizaje y la memoria en las moscas macho, mientras que el ejercicio de vuelo contrarrestó este efecto. En conjunto, el comportamiento de evitación pasiva en las moscas ofrece un ensayo simple y reproducible que podría usarse para estudiar los mecanismos básicos de aprendizaje y memoria.

Introduction

El aprendizaje y la memoria es un mecanismo de adaptación evolutivamente antiguo al medio ambiente, conservado desde Drosophila (D.) hasta el humano1. La mosca de la fruta es un organismo modelo robusto para estudiar los principios fundamentales del aprendizaje y la memoria, ya que ofrece una amplia gama de poderosas herramientas genéticas para diseccionar los mecanismos moleculares intrínsecos2. Los estudios pioneros de cribado genético, que identificaron los genes rutabaga3, amnesiac4 y dunce5 críticos para el aprendizaje y la memoria2, aprovecharon el condicionamiento olfativo ya que las moscas de la fruta dependen de su agudo sentido del olfato para encontrar comida, parejas potenciales y evitar depredadores6.

El condicionamiento olfativo se ha convertido en un paradigma popular para estudiar el mecanismo del aprendizaje y la memoria, gracias a la introducción del laberinto en T olfativo por Tully y Quinn7,8. Posteriormente, se han propuesto otros métodos para medir diversos tipos de aprendizaje y memoria, entre ellos el condicionamiento visual9, el acondicionamiento del cortejo10, el ensayo de supresión de fototaxis aversivo11 y el condicionamiento de exposición a avispas12. Sin embargo, la mayoría de estos ensayos tienen una configuración compleja que debe ser construida a medida en un taller universitario o comprada a través de un proveedor. El paradigma aquí descrito se basa en un simple ensayo conductual para estudiar el aprendizaje asociativo aversivo en moscas que se puede ensamblar fácilmente con unos pocos suministros disponibles.

El paradigma descrito es equivalente a la conducta de evitación pasiva (o inhibitoria) en ratones y ratas de laboratorio en la que los animales aprenden a evitar un compartimento donde previamente han recibido descarga eléctrica del pie13. En los múridos, el procedimiento se basa en su evitación innata de la luz brillante y la preferencia por las zonas más oscuras14. En el primer ensayo, el animal se coloca en el compartimento brillante, desde donde el animal sale rápidamente, entrando en un compartimento oscuro, donde se administra una descarga eléctrica para el pie. Por lo general, un solo ensayo es suficiente para formar una memoria sólida a largo plazo, lo que resulta en un aumento significativo de la latencia 24 h más tarde. La latencia se utiliza entonces como índice de la capacidad del animal para recordar la asociación entre el estímulo aversivo y el entorno específico15.

Este trabajo describe un procedimiento análogo utilizando D. como sistema modelo que ofrece varias ventajas sobre los modelos de roedores, incluyendo la rentabilidad, el mayor tamaño de la muestra, la ausencia de supervisión regulatoria y el acceso a poderosas herramientas genéticas16,17. El procedimiento se basa en el comportamiento negativo de la geotaxis, que se manifiesta en la necesidad de las moscas de subir cuando se colocan en una superficie vertical18. La configuración consta de dos cámaras verticales. En el primer ensayo, una mosca de la fruta se coloca en un compartimento inferior. Desde allí, generalmente sale dentro de 3-15 s, entrando en el compartimiento superior donde recibe una descarga eléctrica. Durante una prueba de 1 minuto, algunas moscas pueden volver a entrar ocasionalmente en el compartimento superior, lo que resulta en una descarga eléctrica adicional. Durante la fase de prueba, 24 h después, la latencia aumenta significativamente. Al mismo tiempo, el número de choques disminuye en comparación con el primer día, lo que indica que las moscas formaron memoria asociativa aversiva sobre el compartimento superior. La latencia, el número de choques y la duración y frecuencia de los combates de aseo se utilizan para analizar el comportamiento animal y la capacidad de formar y recordar la asociación entre el estímulo aversivo y el entorno específico. Los resultados representativos revelan que la exposición a la dieta occidental (WD) afecta significativamente el comportamiento de evitación pasiva en las moscas macho, lo que sugiere que el WD afecta profundamente el comportamiento y la cognición de la mosca. Por el contrario, el ejercicio de vuelo alivió el efecto negativo del WD, mejorando el comportamiento de evitación pasiva.

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Protocol

1. Preparación de aparatos de evitación pasiva

  1. Perfore un orificio de 4 mm perpendicular a la superficie de la pared del tubo de cultivo de polipropileno de 14 ml y a 8 mm del fondo del tubo.
    NOTA: Utilice un taladro eléctrico y una broca de 5/32 para obtener los mejores resultados.
  2. Usando un cuchillo utilitario de acero, corte la parte superior del tubo de cultivo de polipropileno de 14 ml para crear un fragmento inferior de tubo de 45 mm de largo. El fragmento inferior sirve como compartimento inferior.
  3. Corte la punta de la punta de la pipeta azul de 1.000 μL con una hoja de afeitar de un solo borde para que la abertura sea lo suficientemente ancha para el paso de una sola mosca. Corta la parte estrechante de la punta azul para crear un fragmento de 12 mm. Inserte este fragmento firmemente en un orificio de 4 mm del compartimento inferior. Esto se utiliza como muelle de carga para transferir las moscas.
  4. Corte una pieza de 15 mm de tubo de vinilo transparente de 5/8" ID (ver Tabla de Materiales) para crear un acoplamiento. Inserte el compartimento superior e inferior en el acoplamiento desde extremos opuestos para unir de forma segura el compartimento inferior al compartimento superior.
  5. Con una abrazadera ajustable de 2 puntas, fije el conjunto a un soporte vertical. Oriente el conjunto verticalmente con el tubo de choque como compartimento superior.
  6. Conecte los cables del tubo de descarga a un estimulador eléctrico (consulte la Tabla de materiales) para administrar descargas eléctricas. La duración del período de entrenamiento es de 1 min.
    NOTA: Para facilitar la observación, coloque un trozo de papel blanco detrás del tubo de choque para que sirva como fondo blanco del aparato. Coloque una lámpara con una bombilla suave equivalente a 75 W sobre el compartimiento de choque. Coloque una lámpara de lupa de brazo ajustable frente a la configuración. Una representación del aparato de evitación pasiva se muestra en la Figura 1.

2. Preparación de las moscas para el procedimiento de evitación pasiva

  1. Inmovilizar moscas D. melanogaster o D. simulans de 3-4 días de edad utilizando bloques helados y transferirlas a viales individuales con alimentos 24 h antes del experimento (1 mosca por vial) siguiendo el procedimiento descrito anteriormente19.
    NOTA: Los experimentos descritos aquí compararon hombres de 3-4 días de edad vs. moscas hembra en D. melanogaster y D. simulans.
  2. Antes de los experimentos de comportamiento, codifique todos los viales. Para esto, asigne a cada grupo una letra, por ejemplo, "A", "B", "C", etc., y cada uno vuele un número. Revele este código solo después de que todos los datos hayan sido registrados y analizados. Use al menos 20 moscas por genotipo o tratamiento para contrarrestar las variaciones individuales.
    NOTA: Realizar los experimentos y análisis "a ciegas" permite excluir un sesgo en la evaluación del rendimiento de la mosca y el análisis de datos.

3. Realización de la primera prueba

  1. Utilizando un aspirador de boca de mosca (ver Tabla de Materiales) descrito anteriormente20, transfiera suavemente una mosca desde el vial individual al compartimento inferior a través de la base de carga. Succiona suavemente una mosca en el aspirador bucal aspirando aire. Deposite la mosca soplando ligeramente en el muelle de carga.
    NOTA: Evite estresar al animal durante la captura y la carga.
  2. Inmediatamente después de cargar la mosca en el compartimento inferior, inicie un temporizador de 1 minuto y un cronómetro.
    NOTA: El cronómetro se utiliza para medir latencias y contador para contar el número de choques.
  3. Presione el cronómetro para registrar la primera latencia cuando la mosca entra en el tubo de choque colocando todas las patas en la rejilla. Encienda el estimulador para administrar una descarga eléctrica a la mosca. Los parámetros de estimulación son 120 voltios, 1000 ms de duración, 1 pulso/s (PPS), duración del tren 2000 ms.
  4. Administre choques adicionales si la mosca vuelve a entrar en el tubo de choque. Registre el número de choques recibidos durante un ensayo de 1 minuto con un contador de conteo o un contador basado en Arduino (consulte la Tabla de materiales). Si utiliza el contador basado en Arduino, siga los pasos a continuación.
    NOTA: Se puede utilizar un dispositivo opcional basado en Arduino AKM-007 (consulte la Tabla de materiales) para medir el tiempo, la latencia, el número de choques y la frecuencia y duración de los combates de aseo para cada animal presionando y soltando los botones correspondientes en el dispositivo. Los botones del dispositivo se asignan para medir la latencia, administrar y registrar el número de choques y medir la frecuencia y la duración de los combates de aseo.
    1. Pulse el botón Inicio en el paso 3.2., y pulse el botón Shock en el paso 3.3.
    2. Para registrar la duración de una pelea de aseo, presione el botón de aseo al comienzo de una pelea de aseo en el dispositivo y suelte este botón al final de la pelea de aseo.
      NOTA: Los combates de aseo se midieron a lo largo de 1 minuto de prueba. El aseo extensivo podría ser indicativo de estrés animal21,22. El dispositivo basado en Arduino guarda todos los datos como archivo CSV en una tarjeta de memoria.
  5. Al final de una prueba de 1 minuto, transfiera suavemente la mosca a un vial individual. Anote la latencia, el número de choques recibidos y cualquier cambio notable en el comportamiento.
  6. Limpie el compartimento inferior y el compartimento de choque con etanol al 70%, limpie con un pañuelo de limpieza sin pelusa (consulte la Tabla de materiales) y séquelo con el secador de pelo. Repita la prueba con la siguiente mosca.
  7. Después de los experimentos de comportamiento, limpie el compartimiento inferior con agua y detergente inodoro. Limpie el compartimento inferior y el compartimento de choque con etanol al 70% y séquelo al aire durante la noche.

4. Realización del segundo ensayo

  1. Realice el segundo ensayo repitiendo el procedimiento descrito anteriormente (paso 3) 24 h más tarde. Pruebe las moscas en la misma secuencia que en el día anterior.

5. Análisis de los resultados

  1. Calcule la latencia promedio, el número promedio de choques y la duración de los combates de aseo para el ensayo 1 y el ensayo 2 para cada grupo experimental de animales. Realizar la prueba t de student para la comparación de dos grupos o ANOVA para comparaciones múltiples con análisis post-hoc utilizando la prueba de Tukey23.

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Representative Results

La evitación pasiva se estudió en D. melanogaster (Cantón-S) y D. simulans. Los experimentos compararon las latencias y el número de shocks recibidos entre ensayos consecutivos. Inicialmente, los experimentos se realizaron con moscas macho D. melanogaster de 3-4 días de edad. Las moscas se mantuvieron en la dieta estándar de formulación de Bloomington en un ambiente climatizado a 24 ° C bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h, 70% de humedad y densidad de población controlada. La densidad se controló manteniendo constantes las condiciones de reproducción para todos los grupos. 15 machos y 15 hembras fueron criados durante 48 h en una botella a 24 °C, 70% de humedad y un ciclo de luz de 12 h para generar la descendencia. El comportamiento de evitación pasiva en una mosca de la fruta se estudió en cuatro ensayos de 2 minutos espaciados 24 h de diferencia. Los ensayos se realizaron a la misma hora del día. Una mosca se aspiró suavemente desde un vial individual durante un ensayo y se transfirió al compartimento inferior a través de un muelle de carga (Figura 1). Los experimentos revelaron que D. melanogaster podía aprender y memorizar con éxito el comportamiento de evitación pasiva. En el primer ensayo, la mosca ingenua entraría en el compartimento superior en promedio dentro de los 16 s (16.15±2.64) y a menudo volvería a entrar en él, recibiendo en promedio 2 choques (2.18±0.19). Durante los ensayos consecutivos, la latencia aumentaría significativamente mientras que el número de descargas disminuiría, lo que indica que las moscas aprendieron la asociación entre el compartimento superior y una descarga eléctrica (Tabla 1, Figura 2 A, B). El análisis de la distribución de frecuencias mostró que la geotaxis negativa es una poderosa motivación. Durante el primer ensayo, la mayoría de las moscas ingenuas entrarían en el compartimento superior dentro de 5-15 s (contenedor 10, Figura 2C) y recibirían 1-3 choques (Figura 2D). En contraste, la mayoría de las moscas no entrarían en el compartimiento superior en el cuarto ensayo y, en consecuencia, no recibirían ningún choque (Figura 2E, F).

Para verificar que el ensayo de evitación pasiva funciona en otras especies de moscas de la fruta, los experimentos se repitieron en moscas macho y hembra D.simulans mantenidas en las mismas condiciones de alojamiento que las moscas melanogaster descritas anteriormente. La duración del ensayo se redujo a 1 min. La distribución de frecuencia para latencias mostró claramente que si la mosca no entra en el compartimento superior dentro de los 60 s en el primer ensayo, generalmente no entra en absoluto (Figura 3C). El número de ensayos se redujo a tres, ya que los experimentos descritos anteriormente demostraron de manera confiable que incluso un solo ensayo era suficiente para que una mosca formara asociaciones aversivas. D. simulans machos y hembras moscas fueron eficaces en el aprendizaje del comportamiento de evitación pasiva, como se desprende de los datos en los gráficos y tablas (Figura 3, Figura 4; y Tabla 2, Tabla 3).

La comparación de latencias y el número de shocks entre hombres y mujeres no reveló diferencias estadísticamente significativas (Figura 5 A,B). Sin embargo, las moscas macho fueron un poco más rápidas al entrar en el compartimento superior en el primer ensayo, mientras que las hembras recibieron un número ligeramente mayor de choques en cada ensayo (Figura 4A, B). La diferencia fue particularmente evidente en los gráficos que ilustran las distribuciones de frecuencia (Figura 4C-F). La distribución de frecuencia de latencias en el tercer ensayo indicó que la mayoría de las moscas ingresaron al compartimento superior dentro de 7.5-12.5 s (Figura 4E). La distribución de frecuencia para el número de choques en el tercer ensayo muestra que las moscas hembras recibieron en promedio 1-2 choques en el último ensayo (Figura 4F).

La duración total del comportamiento de aseo también se registró durante los ensayos. El comportamiento de aseo de las moscas consiste en el movimiento coordinado repetido de las patas delanteras y traseras que barren las alas, la cabeza y el cuerpo24. El autoaseo, también conocido como auto grooming, se ha relacionado previamente con el estrés conductual en moscas24, roedores de laboratorio25 y humanos22. Por lo tanto, los estudios sobre el comportamiento de autoaseo pueden proporcionar información sobre los comportamientos relacionados con la ansiedad26. El análisis de la duración total de los combates de aseo durante los ensayos de evitación pasiva reveló que el autoaseo aumentó significativamente en las moscas hembra en los ensayos dos y tres (Figura 5C, Tabla 4).

La creciente evidencia sugiere una asociación entre la DM alta en calorías y el deterioro del rendimiento cognitivo27. Experimentalmente, el WD produce efectos adversos sobre la función cerebral mitocondrial, la neurogénesis y la plasticidad sináptica28,29,30. Un estudio reciente documentó que el WD aumenta los triglicéridos y acorta la vida útil en D., mientras que el ejercicio de vuelo contrarresta el efecto perjudicial del WD31. Para comenzar a explorar los efectos del WD y el ejercicio de vuelo en el comportamiento de evitación pasiva, las moscas macho de D. simulans fueron sometidas a 5 días de WD, ejercicio de vuelo o una combinación de WD y ejercicio de vuelo de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente31. El WD, que contiene 15% de Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, aceite de palma roja, 15% de sacarosa y 0.1M de NaCl, se preparó como se publicó en otra parte31. El ejercicio de vuelo se realizó en grupos de sesenta moscas macho alojadas en tambores de plástico transparente de 1 galón atados a una plataforma horizontal unida a un motor eléctrico y operadas por un temporizador. El ejercicio se realizó diariamente durante 7 h durante 5 días como se publicó anteriormente31. Al final del régimen de dieta y ejercicio de 5 días, las moscas se clasificaron en viales individuales bajo anestesia fría y se sometieron a dos ensayos de comportamiento de evitación pasiva. Los experimentos mostraron que el WD aumenta el número de choques recibidos en los ensayos uno y dos y disminuye la latencia en el ensayo dos, lo que indica que el WD afecta significativamente el aprendizaje asociativo aversivo en moscas (Figura 6, Tabla 5). También hubo una tendencia a la baja en el número de choques en el segundo ensayo en un grupo con la combinación de WD y ejercicio, lo que sugiere que el ejercicio puede mitigar el impacto de la sobrecarga calórica.

Figure 1
Figura 1: Ensayo esquemático que ilustra la evitación pasiva. Las dimensiones del compartimento inferior son de 45 mm de longitud y 17 mm de diámetro exterior. Las dimensiones del compartimento superior son de 80 mm de longitud y 18 mm de diámetro exterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Comportamiento de evitación pasiva en machos de D. melanogaster . (A) Latencia (s) promedio por prueba. El gráfico muestra que las latencias aumentan significativamente con el número de ensayos. El número de moscas se indica en cada barra. B) Un número medio de shocks recibidos por ensayo. El gráfico muestra que el número de shocks disminuye significativamente con el número de ensayos. (C) Distribución de frecuencia que muestra el número de moscas dentro de un contenedor de latencias en el primer ensayo. Los números en el eje x son centros bin. Los contenedores son intervalos (0-5 s, 5-15 s, 15-25 s, etc.). El gráfico indica que la mayoría de las moscas entran en el compartimento superior dentro de 5-15 s. (D) Distribución de frecuencia que muestra el número de moscas dentro de un contenedor de choques en el primer ensayo. Los números en el eje x son centros bin. El gráfico indica que la mayoría de las moscas reciben 1-3 choques en el primer ensayo. Pocas moscas no entraron en el compartimento de choque en la primera prueba y recibieron cero choques. Se excluyeron de los ensayos posteriores. (E) Distribución de frecuencias que muestra el número de moscas dentro de un contenedor de latencias en el cuarto ensayo. El gráfico indica que la mayoría de las moscas no entran en el compartimento superior. F) Distribución de frecuencias que muestra el número de moscas dentro de un contenedor de choques en el cuarto ensayo. El gráfico muestra que la mayoría de las moscas reciben 0 choques en el último ensayo. Abreviaturas: ns- nonsignificant, *- P<0.05, **- P<0.01, ***-P<0.001, ****- P<0.0001. ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Comportamiento de evitación pasiva en D. simulans machos . (A) Latencia (s) promedio por prueba. El gráfico muestra que las latencias aumentan significativamente con el número de ensayos. B) Un número medio de shocks recibidos por ensayo. El gráfico muestra que el número de shocks disminuye significativamente con el número de ensayos. (C) Distribución de frecuencia que muestra el número de moscas dentro de un contenedor de latencias en el primer ensayo. El gráfico indica que la mayoría de las moscas entran en el compartimento superior dentro de 2.5-12.5 s. Los números en el eje x son los centros de contenedores. (D) Distribución de frecuencia que muestra el número de moscas dentro de un contenedor de choques en el primer ensayo. El gráfico indica que la mayoría de las moscas reciben 1-3 choques en el primer ensayo. (E) Distribución de frecuencia que muestra el número de moscas dentro de un contenedor de latencias en el tercer ensayo. El gráfico indica que la mayoría de las moscas no entran en el compartimento superior. F) Distribución de frecuencias que muestra el número de moscas dentro de un contenedor de choques en el tercer ensayo. El gráfico muestra que la mayoría de las moscas reciben 0 choques en el último ensayo. Abreviaturas: *- P<0.05, ****- P<0.0001. ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Comportamiento de evitación pasiva en D. simulans hembras. (A) Latencia (s) promedio por prueba. El gráfico muestra que las latencias aumentan significativamente con el número de ensayos. B) Un número medio de shocks recibidos por ensayo. El gráfico muestra que el número de shocks disminuye significativamente con el número de ensayos. (C) Distribución de frecuencia que muestra el número de moscas dentro de un contenedor de latencias en el primer ensayo. El gráfico indica que la mayoría de las moscas entran en el compartimento superior dentro de 2.5-12.5 s. Los números en el eje x son los centros de contenedores. (D) Distribución de frecuencia que muestra el número de moscas dentro de un contenedor de choques en el primer ensayo. El gráfico indica que la mayoría de las moscas reciben 2 choques en el primer ensayo. (E) Distribución de frecuencia que muestra el número de moscas dentro de un contenedor de latencias en el tercer ensayo. El gráfico indica que la mayoría de las moscas ingresan al compartimento superior dentro de 7.5-12.5 s. (F) Distribución de frecuencia que muestra el número de moscas dentro de un contenedor de choques en el tercer ensayo. El gráfico muestra que la mayoría de las moscas hembra recibieron 1-2 choques en el último ensayo. Abreviaturas: **- P<0.01, ***-P<0.001, ****- P<0.0001. ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Comparación de la evitación pasiva y el comportamiento de aseo en D. simulans machos y hembras. (A) Latencia (s) promedio por prueba. El gráfico no muestra diferencias estadísticamente significativas entre hombres y mujeres en las latencias. B) Un número medio de shocks recibidos por ensayo. El gráfico no muestra diferencias estadísticamente significativas entre hombres y mujeres en el número de shocks recibidos. (C) La duración total de los combates de aseo en los ensayos 1-3. Si bien no hubo diferencias estadísticamente significativas entre machos y hembras, las moscas hembra mostraron una disminución considerable en el comportamiento de aseo durante los ensayos 2 y 3 en comparación con el ensayo 1. Abreviaturas: *- P<0.05. ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Efecto del WD sobre D. simulans el comportamiento pasivo de evitación del hombre. (A) Latencia (s) promedio por prueba. El gráfico muestra que el WD aumentó significativamente la latencia en los grupos WD y WDE. B) Un número medio de shocks recibidos por ensayo. El gráfico muestra un aumento estadísticamente significativo en el número de choques recibidos por las moscas en el WD en los ensayos 1 y 2. Curiosamente, el ejercicio de vuelo negó significativamente el efecto del WD de acuerdo con la prueba t de Student. Abreviaturas: CD- dieta de control, CDE- dieta de control con ejercicio, WD- dieta occidental, WDE- dieta occidental con ejercicio. *- P<0.05, **- P<0.01. ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. #- P<0.05, Prueba t del estudiante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ensayos Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3 Juicio 4
Latencia (s) 16.15±2.64 49.08±6.2 64,72±6,8 102.1±12.1
Choques 2.18±0.19 1.41±0.29 0,76±0,25 0,33±0,22
Múltiples comparaciones de Latencia de Tukey entre ensayos Resumen Valor de P ajustado
1 contra 2 **** <0.0001
1 contra 3 **** <0.0001
1 contra 4 **** <0.0001
2 contra 3 Ns 0.2043
2 contra 4 **** <0.0001
3 contra 4 ** 0.0099
Shocks Las múltiples comparaciones de Tukey entre ensayos Resumen Valor de P ajustado
1 contra 2 Ns 0.0646
1 contra 3 *** 0.0004
1 contra 4 **** <0.0001
2 contra 3 Ns 0.2569
2 contra 4 * 0.0253
3 contra 4 Ns 0.694

Tabla 1: Efecto del entrenamiento sobre la evitación de descargas eléctricas en machos con D. melanogaster. Los datos de latencias y choques recibidos se presentan como medias ± SEM. ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey.

Ensayos Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3
Latencia (s) 10.16±0.78 22.64±2.1 30,63±2,69
Choques 2.36±0.13 1.84±0.17 1.24±0.14
Múltiples comparaciones de Latencia de Tukey entre ensayos Resumen Valor de P ajustado
1 contra 2 **** <0.0001
1 contra 3 **** <0.0001
2 contra 3 * 0.0229
Shocks Las múltiples comparaciones de Tukey entre ensayos Resumen Valor de P ajustado
1 contra 2 * 0.0166
1 contra 3 **** <0.0001
2 contra 3 * 0.0172

Tabla 2: Efecto del entrenamiento sobre la evitación de descargas eléctricas en machos D. simulans . Los datos de latencias y choques recibidos se presentan como medias ± SEM. ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey.

Ensayos Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3
Latencia (s) 12.07±0.89 20,98±2,63 23.20±2.16
Choques 2.65±0.12 1.98±0.12 1.49±0.11
Múltiples comparaciones de Latencia de Tukey entre ensayos Resumen Valor de P ajustado
1 contra 2 ** 0.0023
1 contra 3 **** <0.0001
2 contra 3 ** 0.0028
Shocks Las múltiples comparaciones de Tukey entre ensayos Resumen Valor de P ajustado
1 contra 2 **** <0.0001
1 contra 3 **** <0.0001
2 contra 3 *** 0.0003

Tabla 3: Efecto del entrenamiento en la evitación de descargas eléctricas en hembras de D. simulans . Los datos de latencias y choques recibidos se presentan como medias ± SEM. ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey.

Ensayos Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3
Aseo (s) masculino (s) 14.42±1.02 18.47±2.82 18.23±2.75
Aseo (s) de la mujer 9.15±1.39 14.03±2.26 15.50±2.38
Comparaciones múltiples de Tukey entre los ensayos masculinos Resumen Valor de P ajustado
1 contra 2 Ns 0.4384
1 contra 3 Ns 0.4873
2 contra 3 Ns 0.9971
Comparaciones múltiples de Tukey entre mujeres de ensayos Resumen Valor de P ajustado
1 contra 2 * 0.0299
1 contra 3 * 0.0426
2 contra 3 Ns 0.8481

Tabla 4: Efecto de la evitación pasiva en el comportamiento de aseo de D. simulans. Los datos se presentan como medios ± SEM. ANOVA unidireccional con las pruebas de comparaciones múltiples de Tukey.

Latencias Prueba 1 Prueba 2
CD 16.26±2.28 45.85±4.09
CDE 15.28±2.75 33.59±5.19
ENANA BLANCA 13.49±1.58 28.33±3.7
WDE (en inglés) 13.00±1.95 30.23±3.79
Latencia Comparaciones múltiples de Tukey entre grupos Prueba 1 Resumen Valor de P ajustado
CD vs. CDE Ns 0.9916
CD vs. WD Ns 0.7369
CD vs. WDE Ns 0.6475
CDE vs. WD Ns 0.9523
CDE vs. WDE Ns 0.9122
WD vs. WDE Ns 0.9981
Latencia Comparaciones múltiples de Tukey entre grupos Prueba 2 Resumen Valor de P ajustado
CD vs. CDE Ns 0.2785
CD vs. WD ** 0.0082
CD vs. WDE * 0.0283
CDE vs. WD Ns 0.8578
CDE vs. WDE Ns 0.9594
WD vs. WDE Ns 0.9844
Choques Prueba 1 Prueba 2
CD 1.95±0.21 0,94±0,4
CDE 2.0±0.28 1.0±0.23
ENANA BLANCA 3.05±0.26 2.36±0.41
WDE (en inglés) 2.49±0.24 1.36±0.23
Shocks Comparaciones múltiples de Tukey entre grupos Ensayo 1 Resumen Valor de P ajustado
CD vs. CDE Ns 0.9992
CD vs. WD ** 0.005
CD vs. WDE Ns 0.3765
CDE vs. WD Ns 0.0523
CDE vs. WDE Ns 0.6446
WD vs. WDE Ns 0.3268
Shocks Comparaciones múltiples de Tukey entre grupos Ensayo 2 Resumen Valor de P ajustado
CD vs. CDE Ns 0.9996
CD vs. WD * 0.0194
CD vs. WDE Ns 0.8246
CDE vs. WD * 0.0122
CDE vs. WDE Ns 0.9306
WD vs. WDE Ns 0.1508

Tabla 5: Efecto de la WD y el ejercicio en la evitación de descargas eléctricas en D. simulans machos . Los datos de latencias y choques recibidos se presentan como medias ± SEM. ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Abreviaturas: CD- dieta de control, CDE- dieta de control con ejercicio, WD- dieta occidental, WDE- dieta occidental con ejercicio.

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Discussion

Evitar los estímulos amenazantes es una característica crucial del comportamiento adaptativo en varias especies, desde C. elegancia hasta humana32. Los procedimientos de aprendizaje de evitación, que generalmente implican el escape de un evento aversivo, son tareas conductuales comúnmente utilizadas para investigar los procesos de aprendizaje y memoria en roedores de laboratorio13 desde la década de 197032. En los procedimientos de evitación activa, un estímulo indiferente o señal condicionada (CS) es seguido por un evento aversivo o señal incondicionada (US), que los animales aprenden a evitar realizando una tarea conductual específica. En los procedimientos de evitación pasiva, un animal necesita evitar la aversiva US asociando un comportamiento previamente castigado con un contexto ambiental específico33. Las latencias más largas de la prueba de retención que indican una mejor memoria sugieren que el animal desarrolló una representación detallada de la experiencia de entrenamiento13. El entrenamiento de evitación pasiva consiste en un solo ensayo; sin embargo, los mecanismos cerebrales que subyacen a la adquisición de esta tarea son complejos a medida que el animal aprende a asociar diversas piezas de información, incluidos los estímulos ambientales, espaciales-posicionales y aversivos13. La alteración de estos estímulos permite estudiar los tipos de memoria episódica y contextual13.

El paradigma descrito aquí adoptó el comportamiento de evitación pasiva en roedores a mosca adulta como un sistema modelo. Si bien se han desarrollado varios procedimientos para estudiar el aprendizaje y la memoria en moscas, incluidos el acondicionamiento olfativo7,8, visual9 y cortejo10, estos ensayos consumen bastante tiempo y requieren una configuración compleja. El protocolo descrito aquí es un ensayo conductual simple para estudiar el aprendizaje aversivo asociativo en moscas, que consta de ensayos de 1 minuto y se puede configurar fácilmente con algunos suministros disponibles. El protocolo potencialmente permite la manipulación adicional de las señales ambientales, con la adición de estímulos olfativos, visuales y otros estímulos contextuales, cambiando los colores o patrones geométricos para el compartimiento inferior o agregando señales olfativas en la tapa de la cámara superior. Además, este ensayo se puede adaptar fácilmente para estudiar la memoria a corto plazo, la memoria a medio plazo y la memoria resistente a la anestesia mediante la manipulación de intervalos entre ensayos y el sometimiento de moscas a anestesia.

El ensayo funcionó igualmente bien en moscas macho y hembra de D. melanogaster y D. simulans, demostrando que el paradigma podría adaptarse a diferentes especies de D. Los cambios en el comportamiento de las moscas caracterizados por un aumento de las latencias y una disminución del número de shocks fueron estadísticamente significativos en el segundo ensayo y se fortalecerían con los ensayos posteriores. Curiosamente, si las moscas ingenuas se habituaran al aparato sin descarga eléctrica, entrarían en el compartimento superior un poco más rápido en la segunda y tercera pruebas. Sin embargo, la disminución de las latencias no fue estadísticamente significativa (datos no mostrados). No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los sexos, aunque las moscas hembra tuvieron latencias algo más largas y recibieron ligeramente más choques. Esta diferencia podría deberse a una combinación de factores, incluida la incapacidad de las hembras para asociar el choque con el compartimento superior, una geotaxis más fuerte o posiblemente porque las hembras son ligeramente más grandes y lentas que los machos. La duración total de los combates de aseo fue significativamente menor en el segundo y tercer ensayo en moscas hembras, lo que establece un paralelismo entre D. y los comportamientos similares a la ansiedad de los roedores26.

Curiosamente, como se muestra en las Figuras 3E y 4E, las latencias en el tercer ensayo se dividieron en dos extremos (menos de 30 s y 60 s). Estas diferencias, sin embargo, no se observaron en el 4º ensayo, lo que indica que la mayoría de las moscas finalmente adquirieron la tarea (Figura 2E). Si bien las razones exactas de las diferencias individuales en el desarrollo de tareas de evitación pasiva no están claras, las poblaciones naturales pueden contener polimorfismo y mutaciones que influyen en el aprendizaje y la memoria3,5,34,35. Un estudio reciente mostró que el polimorfismo en el locus de forrajeo (para) que codifica una proteína quinasa dependiente de cGMP (PKG) podría mediar estrategias alternativas en el aprendizaje del comportamiento de forrajeo34. Las moscas con el alelo "rover" y mayor actividad tienen una mejor memoria a corto plazo, mientras que las moscas con el alelo "sitter" y el comportamiento sedentario muestran una mejor memoria a largo plazo34.

El ensayo reveló que el WD perjudicó significativamente el aprendizaje y la memoria en las moscas, lo que fue evidente por latencias más cortas y recibir más choques en el segundo ensayo. El mayor número de descargas en el primer ensayo después del WD podría indicar déficits en la memoria a corto plazo y una falla en hacer asociaciones entre un contexto ambiental específico y una descarga eléctrica. Curiosamente, los ejercicios de vuelo mitigaron parcialmente el efecto negativo del WD ya que las moscas WDE habían recibido significativamente menos choques en el segundo ensayo. Esto sugiere que el ejercicio de vuelo podría revertir el impacto de la sobrecarga metabólica y mejorar el rendimiento cognitivo. Estos datos están respaldados por nuestra observación previa sobre los efectos beneficiosos del ejercicio de vuelo sobre la fisiología, la reproducción y el comportamiento de la mosca31.

Uno de los pasos críticos en el protocolo descrito es transferir las moscas del vial individual a la cámara inferior. Las moscas estresadas entrarían en el compartimento superior demasiado rápido o no entrarían en absoluto. Las moscas que no entraron en el compartimento superior en el primer ensayo aún podían ingresar al compartimento superior después de ser transferidas de nuevo a un vial individual y recibir un descanso de 5 minutos. Sin embargo, es mejor excluir estas moscas del experimento. La edad de la mosca es otro factor crucial ya que la geotaxis negativa se volvió significativamente más débil en las moscas de 30 días de edad (datos no mostrados). Por lo tanto, más moscas no entrarían en la cámara alta en el primer ensayo y serían excluidas del experimento.

La ventaja del ensayo descrito es que es una tarea de comportamiento simple que produce datos reproducibles tanto en D. melanogaster como en D. simulans moscas macho y hembra. El ensayo podría ayudar al estudio de los mecanismos básicos subyacentes al aprendizaje y las deficiencias de la memoria resultantes de diversas manipulaciones genéticas, farmacológicas y dietéticas. Además, dado que los ensayos de retención se pueden realizar en diferentes momentos después del entrenamiento inicial, la memoria a corto, mediano y largo plazo podría interrogarse por separado.

También hay limitaciones potenciales con esta tarea de un solo ensayo, incluida la variabilidad entre sujetos y las diferencias de edad (discutidas anteriormente). El aprendizaje y la memoria también podrían estar influenciados por diversos factores, incluyendo el estado conductual en el momento del aprendizaje, las manipulaciones experimentales y las respuestas al estrés36. Dado que los Estados Unidos se dan en el compartimento con una rejilla de cobre, la entrada de animales a veces es difícil de evaluar a menos que los haces fotográficos y las cámaras infrarrojas puedan instalarse para el seguimiento de video en el futuro.

Tomado en conjunto, el ensayo presentado aquí es un procedimiento simple, confiable y reproducible que permite estudiar los mecanismos de memoria. Podría abrir nuevas vías para el análisis detallado de la consolidación de la memoria en moscas, incluidas las interacciones gen-fármaco, tanto en aspectos contextuales como episódicos de la memoria.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado en partes por NIH R15ES029673 (AKM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bloomington Formulation diet Nutri-Fly  66-112 Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA
1000 µL Blue tip Fisher NC9546243
17 x 100 mm 14 mL polypropylene culture tube VWR  60818-689
Aduino-based Automatic Kontrol Module In-house AKM-007 This unit is optional. Complete description, schematics, wiring diagram and a code are provided at the ECU Digital Market - https://digitalmarket.ecu.edu/akmmodule
Dual-Display 2-Channel  Digital Clock/Timer Digi-Sense AO-94440-10 https://www.amazon.com/Cole-Parmer-AO-94440-10-Dual-Display-2-Channel-Jumbo-Digit/dp/B00PR0809G/ref=sr_1_5?dchild=1&keywords=Dual-Display+timer+jumbo&qid=1627660660&sr=
8-5#customerReviews
Electronic Finger Counter N/A N/A https://www.amazon.com/gp/product/B01M8IRK6F/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Fisherbrand Sparkleen 1 Detergent Fisher Scientific 04-320-4
Fly mouth aspirator In-house Prepared as described in reference 19.
Grass S88 stimulator N/A N/A Could be replaced with any stimulator which can provide described parameters
Kim-wipes Fisher Scientific 06-666 Kimberly-Clark Professional 34120
Metal block for fly immobilization In-house 4 x 13 x 23.5cm aluminum block
Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, Red Palm Oil Nutiva N/A https://www.amazon.com/Nutiva-Certified-Cold-Filtered-Unrefined-Ecuadorian/dp/B00JJ1E83G/ref=sxts_rp_s1_0?cv_ct_cx=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&dchild=1&keywords=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&pd_rd_i=B00JJ1E83G&pd_
rd_r=f35e9d2f-afe4-44b6-afc2-1c9cd705be18&pd_rd_w=
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p=c6bde456-f877-4246-800f-44405f638777&pf
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Shock tube CelExplorer TMA-201 https://www.celexplorer.com/product_detail.asp?id=217&MainType=110&SubType=8
Stopwatch Accusplit A601XLN https://www.amazon.com/gp/product/B0007ZGZYI/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Transparent vinyl tubing (3/4” OD, 5/8” ID) Lowes Avaiable from Lowes

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Tags

Comportamiento Número 176 Evitación pasiva aprendizaje aversivo aprendizaje asociativo memoria Drosophila dieta occidental ejercicio de vuelo

Erratum

Formal Correction: Erratum: Drosophila Passive Avoidance Behavior as a New Paradigm to Study Associative Aversive Learning
Posted by JoVE Editors on 02/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Drosophila Passive Avoidance Behavior as a New Paradigm to Study Associative Aversive Learning. The Representative Results and Discussion sections were updated.

In the Representative Results, the legend for Figure 5 was updated from:

Figure 5: Comparison of passive avoidance and grooming behavior in D. simulans males and females. (A) Average latency (s) per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the latencies. (B) An average number of received shocks per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the number of received shocks. (C) The total duration of grooming bouts in trials 1-3. While there were no statistically significant differences between males and females, the female flies showed a considerable increase in grooming behavior during trials 2 and 3 compared to trial 1. Abbreviations: *- P<0.05. One-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.

to:

Figure 5: Comparison of passive avoidance and grooming behavior in D. simulans males and females. (A) Average latency (s) per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the latencies. (B) An average number of received shocks per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the number of received shocks. (C) The total duration of grooming bouts in trials 1-3. While there were no statistically significant differences between males and females, the female flies showed a considerable decrease in grooming behavior during trials 2 and 3 compared to trial 1. Abbreviations: *- P<0.05. One-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.

In the Discussion, the third paragraph was updated from:

The assay worked equally well in D. melanogaster and D. simulans male and female flies, demonstrating that the paradigm could be adapted to different D. species. The changes in fly behavior characterized by increased latencies and decreased number of shocks were statistically significant in the second trial and would strengthen with subsequent trials. Interestingly, if naïve flies were habituated to the apparatus without electric shock, they would enter the upper compartment a little faster on the second and the third trials. However, the decrease in latencies was not statistically significant (data not shown). No statistically significant differences were observed between sexes, although female flies had somewhat longer latencies and received slightly more shocks. This difference could be due to a combination of factors, including females' failure to associate the shock with the upper compartment, a stronger geotaxis, or possibly because females are slightly larger and slower than males. The total duration of grooming bouts was significantly higher in the second and third trials in female flies, which draws a parallel between D. and rodent anxiety-like behaviors26.

to:

The assay worked equally well in D. melanogaster and D. simulans male and female flies, demonstrating that the paradigm could be adapted to different D. species. The changes in fly behavior characterized by increased latencies and decreased number of shocks were statistically significant in the second trial and would strengthen with subsequent trials. Interestingly, if naïve flies were habituated to the apparatus without electric shock, they would enter the upper compartment a little faster on the second and the third trials. However, the decrease in latencies was not statistically significant (data not shown). No statistically significant differences were observed between sexes, although female flies had somewhat longer latencies and received slightly more shocks. This difference could be due to a combination of factors, including females' failure to associate the shock with the upper compartment, a stronger geotaxis, or possibly because females are slightly larger and slower than males. The total duration of grooming bouts was significantly lower in the second and third trials in female flies, which draws a parallel between D. and rodent anxiety-like behaviors26.

<em>Drosophila</em> Comportamiento de evitación pasiva como nuevo paradigma para estudiar el aprendizaje asociativo aversivo
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Pak, E. S., Murashov, A. K.… More

Pak, E. S., Murashov, A. K. Drosophila Passive Avoidance Behavior as a New Paradigm to Study Associative Aversive Learning. J. Vis. Exp. (176), e63163, doi:10.3791/63163 (2021).

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