Summary
Dimostriamo come stabilire un modello murino di impianto della radice polmonare nell'aorta discendente per simulare la procedura di Ross. Questo modello consente la valutazione a medio/lungo termine del rimodellamento dell'autotrapianto polmonare in posizione sistemica, rappresentando la base dello sviluppo di strategie terapeutiche per favorirne l'adattamento.
Abstract
L'operazione di Ross per la malattia della valvola aortica ha riacquistato nuovo interesse grazie ai suoi eccezionali risultati a lungo termine. Tuttavia, quando impiegato come sostituto della radice indipendente, viene descritta la possibile dilatazione dell'autotrapianto polmonare e il successivo rigurgito aortico. Sono stati proposti diversi modelli animali. Tuttavia, questi sono solitamente limitati a modelli ex-vivo o esperimenti in vivo con modelli animali di grandi dimensioni relativamente costosi. In questo studio, abbiamo cercato di stabilire un modello di roditore di impianto di innesto di arteria polmonare (PAG) in una posizione sistemica. Sono stati inclusi un totale di 39 ratti Lewis adulti. Subito dopo l'eutanasia, la radice polmonare è stata raccolta da un animale donatore (n = 17). I ratti singenici riceventi (n=17) e sham-operated (n=5) sono stati sedati e ventilati. Nel gruppo ricevente, il PAG è stato impiantato con un'anastomosi end-to-end in posizione aortica addominale infra-renale. I ratti operati da Sham hanno subito solo transezione e re-anastomosi dell'aorta. Gli animali sono stati seguiti con studi ecografici seriali per due mesi e analisi istologiche post-mortem. Il diametro pagno mediano in posizione nativa era di 3,20 mm (IQR=3,18-3,23). Al follow-up, il diametro mediano del PAG era di 4,03 mm (IQR = 3,74-4,13) a 1 settimana, 4,07 mm (IQR = 3,80-4,28) a 1 mese e 4,27 mm (IQR = 3,90-4,35) a 2 mesi (p <0,01). La velocità sistolica di picco era di 220,07 mm/s (IQR=210,43-246,41) a 1 settimana, 430,88 mm/s (IQR=375,28-495,56) a 1 mese, e 373,68 mm/s (IQR=305,78-429,81) a 2 mesi (p=0,02) e non differiva dal gruppo a gestione fittizia alla fine dell'esperimento (p=0,5). L'analisi istologica non ha mostrato alcun segno di trombosi endoteliale. Questo studio ha dimostrato che i modelli di roditori possono consentire la valutazione dell'adattamento a lungo termine della radice polmonare a un sistema ad alta pressione. Un impianto pag singenico posizionato sistematicamente rappresenta una piattaforma semplice e fattibile per lo sviluppo e la valutazione di nuove tecniche chirurgiche e terapie farmacologiche per migliorare ulteriormente i risultati dell'operazione Ross.
Introduction
La stenosi congenita della valvola aortica è un sottogruppo di cardiopatia congenita caratterizzata da un'ostruzione del tratto ventricolare sinistro in cui la lesione si trova a livello valvolare. La malformazione colpisce circa 0,04-0,38 per 1000 nati vivi1.
Le opzioni disponibili per la correzione sono molte, ognuna con i suoi vantaggi e svantaggi. Per i pazienti idonei a una correzione biventricolare2, l'approccio può essere finalizzato alla riparazione valvolare (valvulotomia percutanea o chirurgica) o alla sua sostituzione3. Quest'ultimo è preferito quando la valvola aortica è considerata irrecuperabile; tuttavia, le opzioni disponibili sono limitate per i pazienti pediatrici. Infatti, le valvole bioprotesiche non sono indicate per la sostituzione aortica nella popolazione giovane a causa della loro calcificazione precoce4. D'altra parte, la degenerazione nelle valvole meccaniche è considerevolmente più lenta, ma queste richiedono una terapia anticoagulante per tutta la vita5. Inoltre, la principale limitazione di queste protesi è rappresentata dalla mancanza di potenziale di crescita, che predispone i pazienti a ulteriori reinterventi.
Un'opzione terapeutica interessante nella popolazione pediatrica è il trasferimento dell'autotrapianto polmonare nella posizione aortica denominata "operazione di Ross". In questo caso, la valvola polmonare viene quindi sostituita con un omoinnesto (Figura 1)6. Questa procedura può rappresentare la migliore scelta chirurgica per i bambini perché l'autoinnesto polmonare preserva il suo potenziale di crescita e non comporta i rischi della terapia anticoagulante per tutta la vita. Inoltre, la procedura di Ross può essere di grande valore anche nei giovani adulti per evitare una valvola meccanica o biologica, avendo il potenziale per diventare la migliore soluzione chirurgica.
I risultati dopo la sostituzione della valvola aortica con autoinnesto polmonare sono eccellenti, con una sopravvivenza superiore al 98% e buoni risultati a lungo termine7. Studi di letteratura riportano il 93% e il 90% di libertà dalla sostituzione dell'omotrapianto polmonare rispettivamente a 4 e 12 anni8.
Il principale limite di questa procedura è la tendenza dell'autoinnesto a dilatarsi a lungo termine, specialmente se impiegato come sostituto della radice indipendente. Ciò può causare incompetenza valvolare che può richiedere un nuovo intervento. In effetti, lo studio di follow-up più lungo eseguito finora riporta l'assenza di reintervento per la sostituzione dell'autotrapianto dell'88% a 10 anni e del 75% a 20 anni9.
La possibilità di ricreare un'operazione di Ross in ambito sperimentale rappresenta un prerequisito fondamentale per indagare il meccanismo alla base dell'adattamento dell'autoinnesto polmonare alle pressioni sistemiche. Diversi modelli sono stati proposti in passato. Tuttavia, questi sono solitamente limitati a esperimenti ex-vivo o modelli animali in vivo con animali di grandi dimensioni relativamente costosi. In questo studio, abbiamo cercato di stabilire un modello di roditore di impianto di innesto di arteria polmonare (PAG) in posizione sistemica, come radice indipendente.
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per la Cura degli Animali dell'Università di Padova (OPBA, numero di protocollo n° 55/2017) e autorizzate dal Ministero della Salute italiano (Autorizzazione n° 700/2018-PR), in conformità alla Direttiva dell'Unione Europea 2010/63/UE e alla Legge Italiana 26/2014 per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio.
1. Cura degli animali e modello sperimentale
- Assicurarsi che tutti i ratti Lewis siano ottenuti da un'unica azienda (Tabella dei materiali). Mantenere i ratti in strutture convenzionali con libero accesso a cibo e acqua.
- Assicurarsi che il peso dei ratti varia da 320-400 g per il gruppo ricevente e 200-250 g per il gruppo donatore.
2. Protocollo preoperatorio
NOTA: tutte le operazioni devono essere eseguite in condizioni pulite. Utilizzare ratti Lewis adulti maschi e femmine come riceventi e donatori per eseguire un trapianto singenico.
- Eseguire un'iniezione intraperitoneale di tramadolo (5 mg / kg) 15 minuti prima dell'intervento chirurgico.
- Somministrare una singola dose di Gentamicina intramuscolare (5 mg/kg) immediatamente prima dell'intervento chirurgico.
- Per l'induzione dell'anestesia, fornire il 4% di sevoflurano in 1 L/min di ossigeno a una camera di poli(metilmetacrilato) dove è collocato l'animale. Per il mantenimento dell'anestesia, utilizzare il 2,0-2,5% di sevoflurano in 1 L / min di ossigeno durante la procedura.
- Rasare l'animale lungo la linea mediana per 2 cm di larghezza dallo sterno a 1 cm sopra l'area genitale con un rasoio. Quindi, sterilizzare la pelle con una soluzione di iodio.
- Per evitare che l'animale si bagni e per evitare la dispersione del calore durante l'intervento chirurgico, coprire l'animale con un film plastico trasparente.
- Valutare il livello di anestesia prima di eseguire la procedura valutando l'assenza di risposta a uno stimolo nocivo.
3. Operazione del donatore
- Preparazione animale e cuore:
- Posizionare l'animale anestetizzato su un vassoio di sughero con il lato caudale rivolto verso il chirurgo. Eseguire un'incisione xifo-pubica di circa 5-6 cm e ritrarre lateralmente i due lembi muscolocutanei.
- Somministrare un volume di 1 mL di soluzione salina a 4 °C contenente 500 UI di eparina attraverso la vena cava addominale.
- Dopo 1 minuto, tagliare il diaframma da sinistra a destra ed eseguire una toracotomia anteriore per esporre il cuore.
- Raffreddare il cuore pulsante gocciolando soluzione salina a 4 °C.
- Eseguire una pericardiectomia e una timectomia al fine di ottenere una visione completa dell'arco aortico. Rimuovere i tessuti adiposi rimanenti che circondano l'aorta.
- Tagliato ad arco, appena sopra l'origine dell'arteria innominata; tagliare anche quest'ultimo.
- Tagliare la vena cava toracica inferiore (IVC) e inserire una cannula da 22 G per infondere al cuore 20-25 ml di soluzione salina a 4 °C, esercitando una leggera pressione. Interrompere la perfusione quando il cuore smette di battere e il flusso dall'aorta diventa chiaro.
- Espianto PAG:
NOTA: Una raccolta accurata e una delicata manipolazione del PAG sono obbligatorie per ottenere un impianto ottimale nel ricevente. Non toccarlo direttamente con gli strumenti, usa invece tamponi di cotone.- Eseguire uno studio ecografico per valutare il diametro del PA nella sua posizione nativa.
- Inserire un micro-pinza sotto la parete posteriore del vaso e tagliare quest'ultimo utilizzando una microforbice il più vicino possibile alla sua biforcazione per massimizzare la lunghezza del PAG.
- Tenere delicatamente il PA con la microforza ad anello e separarlo dal ventricolo destro con le forbici a micro-molla. Raccogli il PAG, incluso un po 'di muscolo ventricolare destro.
- Preparazione PAG:
- Posizionare il PAG su una garza inumidita con soluzione salina fredda sul tavolo operatorio e ispezionare il recipiente al microscopio operatorio.
- Tagliare qualsiasi abbondante tessuto circostante, lasciando solo 1 mm di muscolo ventricolare. Impostare la lunghezza della nave a 5 mm.
4. Impianto di innesto di arteria polmonare (PAG)
- Preparazione dell'animale ricevente:
- Posizionare l'animale anestetizzato su un vassoio di sughero con il lato caudale rivolto verso il chirurgo.
- Eseguire un'incisione longitudinale mediana e utilizzare due mini riavvolgitori per mantenere aperto l'addome.
- Estrarre l'intestino con due tamponi di cotone e coprirlo con una garza imbevuta di soluzione salina a 39 °C che consente la visualizzazione dell'area retroperitoneale con esposizione dell'aorta addominale infra-renale (AA).
NOTA: Durante l'intervento chirurgico, è importante inumidire occasionalmente l'intestino utilizzando una siringa contenente soluzione salina a 39 °C per prevenire l'ipotermia, una condizione critica comune nei roditori. - Rimuovere il peritoneo parietale posteriore tra le due arterie renali e la biforcazione iliaca usando due tamponi di cotone e rimuovere il tessuto adiposo intorno all'AA infrarenale. Lasciare solo una piccola porzione di grasso sopra l'AA, per facilitare la manipolazione sulla nave.
- Separare l'AA dall'IVC. Per eseguire questa procedura, in primo luogo, passare una pinza curva dietro la parete aortica posteriore e utilizzarla per aprire un passaggio tra AA e IVC. Quindi, utilizzare una sutura di seta 2-0 per creare un anello attorno all'AA, al fine di sollevare la nave e separare l'AA dall'IVC. Ligare qualsiasi arteria lombare derivante dall'AA infrarenale con sutura di seta 6/0 e dividerla.
- Ruotare l'animale di 90° in senso antiorario, posizionando la testa sul lato sinistro dell'operatore. L'AA ora giaceva orizzontalmente nel campo microscopico.
- Utilizzare due clip Yasargil per bloccare l'AA infrarenale e posizionarle a una distanza di 1,5 cm l'una dall'altra. Eseguite il transetto dell'AA nel punto medio tra le due clip.
- Irrigare le due estremità dei vasi con eparina (1 UI/mL) in soluzione salina per rimuovere eventuali coaguli. Rimuovere eventuali detriti avventiziali dalle navi.
- Impianto PAG:
- Posizionare il PAG tra le due estremità, con l'estremità ventricolare verso la porzione cranica dell'animale.
- Utilizzare una sutura in polipropilene 10-0 per eseguire due punti singoli di riferimento che collegano il PG all'AA. Eseguire la procedura su entrambe le estremità del PAG posizionando la sutura sui lati opposti della circonferenza del vaso.
- Eseguire un'anastomosi end-to-end tra PAG e AA, iniziando con l'estremità distale. Utilizzare una delle due estremità della sutura di riferimento distale per l'anastomosi posteriore utilizzando una sequenza da destinatario a innesto out-in/in-out per eseguire una sutura in esecuzione di circa sei punti.
- Una volta che la sutura raggiunge il punto di riferimento prossimale, eseguire un doppio mezzo intoppo completato da un nodo quadrato usando la sutura e una delle due estremità della sutura del punto di riferimento prossimale. Applicare pinze per zanzare in gomma alle suture per fornire trazione.
- Eseguire la stessa anastomosi sulla parete anteriore. Eseguire l'intera procedura all'estremità prossimale del PAG. Prestare particolare attenzione quando si esegue l'anastomosi prossimale per evitare di includere qualsiasi foglietto illustrativo nella linea di sutura.
- Rilasciare prima la clip distale per lasciare che il PAG sia riempito di sangue retrogrado (flusso a bassa pressione) al fine di controllare l'anastomosi. Ripara qualsiasi perdita di sangue con una singola sutura. Una volta valutata l'anastomosi distale, eseguire la stessa procedura all'estremità prossimale.
- Fasi finali dell'operazione sul destinatario:
- Valutare la pervietà del PAG e applicare due strisce di spugna di gelatina sulle linee di sutura su entrambi i lati del PAG (se necessario). Esercitare una leggera pressione per alcuni secondi con due tamponi di cotone per aiutare l'emostasi.
- Spostare l'intestino nella cavità addominale e chiudere le pareti con una sutura corrente in polipropilene 4/0.
5. Procedura operata da Sham
- Eseguire una preparazione identica dell'animale come precedentemente illustrato per i ratti riceventi.
- Tagliare l'AA infra-renale, a metà strada tra l'origine delle arterie renali e iliache.
- Riapprossimare le due estremità dell'AA utilizzando un'anastomosi end-to-end, come descritto in precedenza. Rimuovere le due clip ed eseguire una procedura di emostasi accurata.
- Riposizionare l'intestino e chiudere la parete addominale a strati, come per gli animali riceventi.
6. Assistenza postoperatoria e follow-up
- Somministrare una soluzione salina calda (5 ml) nel tessuto sottocutaneo della schiena dell'animale per l'idratazione. Posizionare il topo sotto una lampada riscaldante e monitorarlo visivamente fino al risveglio, che di solito richiede fino a 5 minuti dopo l'arresto dell'anestesia. Collocare l'animale in una gabbia a una temperatura ambiente di 22-24 °C, con accesso immediato e illimitato al cibo e all'acqua.
- Somministrare tramadolo intramuscolare (5 mg/kg) per l'analgesia postoperatoria due volte al giorno per le prime 48 ore dopo l'intervento chirurgico. Successivamente, monitorare lo stato di salute del ricevente e il peso corporeo ogni giorno, su base regolare.
- Follow-up: Durante il follow-up, eseguire studi ecografici seriati a una settimana, un mese e due mesi per valutare la funzione PAG. Durante questi studi, misurare il diametro del vaso, la velocità sistolica di picco (PSV) e la velocità diastolica finale. Misurare questi parametri all'interno del PAG e a livello di AA prossimale e distale.
- Eutanasizzare gli animali dopo due mesi di follow-up mediante applicazione di CO2 per alcuni minuti, e poi espiantare il PAG, che sarà sottoposto ad analisi istopatologica.
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Representative Results
Un totale di 39 ratti Lewis adulti sono stati inclusi in questo studio: 17 animali sono stati utilizzati come donatori di PAG, 17 animali come riceventi e 5 come finti (gruppo di controllo) (Tabella 1). I ratti maschi erano 22 (56%) e le femmine 17 (44%); questi ultimi sono stati utilizzati solo nel gruppo dei donatori.
Nessun evento fatale si è verificato durante l'operazione con una sopravvivenza del 100%. Durante il follow-up, due animali del gruppo di trapianto hanno avuto un esito fatale, rispettivamente a 12 e 51 giorni; il tasso di sopravvivenza alla fine dello studio era del 91% (Tabella 1).
Il peso mediano dei ratti era di 387 g (intervallo interquartile, QIR, 358-394 g) per il gruppo ricevente e di 328 g (IQR=304-337 g) per il gruppo donatore. A una settimana dall'intervento, il peso mediano era di 363 g (IQR = 350-376 g) con una diminuzione del 6% rispetto al peso preoperatorio. Gli animali hanno riacquistato il loro peso entro il primo mese di follow-up (mediana 387 g, IQR 369-392 g), con un peso finale a due mesi di 397 g (IQR = 391-402 g) (Figura 2).
Il tempo mediano di follow-up è stato di 62,5 giorni (IQR = 60-68 giorni) nel gruppo trapianto e 62 giorni (IQR = 61-67 giorni) nel gruppo sham-operated (p = 0,68).
Il diametro mediano preoperatorio del PA nella sua posizione nativa era di 3,20 mm (IQR = 3,18-3,23 mm). Il diametro mediano del PAG era di 4,03 mm (IQR = 3,74-4,13 mm) a una settimana, 4,07 mm (IQR = 3,80-4,28 mm) a un mese e 4,27 mm (IQR = 3,90-4,35 mm) a due mesi (Figura 3A). Si tratta di un aumento del 25,9%, 27,2% e 33,5% rispetto al diametro in posizione nativa, rispettivamente. L'aumento del diametro è stato significativamente diverso quando si confronta il valore nella posizione nativa e il valore a una settimana (p = 0,003), mentre nessun aumento significativo è stato trovato durante i seguenti studi. Il diametro dell'aorta nel gruppo azionato da sham era di 1,41 mm (IQR = 1,35-1,62 mm) a una settimana e 1,41 mm (IQR = 1,29-1,70 mm) a due mesi. Il PSV mediano al livello del PAG era di 220,07 mm/s (IQR=210,43-246,41 mm/s) a una settimana, 430,88 mm/s (IQR=375,28-495,56 mm/s) a un mese e 373,68 mm/s (IQR=305,78-429,81 mm/s) a due mesi. Rispetto al gruppo sham-operated, è stata riscontrata una differenza significativa nel PSV a una settimana (mediana 419,12 mm/s, IQR=408,42-561,32 mm/s; p<0,001), mentre nessuna differenza è stata trovata alla fine dello studio (392,92 mm/s, IQR=305,89-514,27 mm/s; p=0,5) (Figura 3B).
Alla fine dello studio, l'analisi istologica non ha mostrato segni di trombosi endoteliale e la calcificazione della parete non era significativa nella maggior parte dei casi (Figura 4).
Figura 1: Immagine rappresentativa dell'operazione Ross. La foto mostra le fasi dell'operazione Ross. A) valvola aortica ed espianto radicale; (B) Trasposizione dell'autotrapianto dell'arteria polmonare in posizione aortica; (C) Sostituzione dell'autoinnesto dell'arteria polmonare con un omoinnesto. A: valvola aortica e radice; H: omoinnesto; P: valvola polmonare e radice. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Decorso temporale del peso corporeo nel gruppo trapiantato. Il grafico mostra il decorso nel tempo del peso del ratto nel gruppo di trapianto. I valori sono espressi come intervallo mediano e interquartile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Variazione del diametro e della velocità sistolica di picco nell'innesto dell'arteria polmonare. I grafici mostrano la variazione del diametro (A) e della velocità sistolica di picco (B) all'interno dell'innesto dell'arteria polmonare durante le valutazioni ecografiche seriate. I valori sono espressi come intervallo mediano e interquartile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Valutazione microscopica del PAG. L'immagine mostra il PAG dopo l'espianto (A). B) valutazione radiografica; (C) Colorazione di ematossilina ed eosina, ingrandimento originale 12,5x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| VARIABILE | TRAPIANTARE | DONATORI | GESTITO DA SHAM | TOTALE |
| Numero di eventi | 17 | 17 | 5 | 39 |
| Eventi fatali in chirurgia | 0 | // | 0 | 0 |
| Eventi fatali durante il follow-up (%) | 2 | // | 0 | 2 (91) |
| Peso in chirurgia* | 387 (358-394) | 327,5 (303-337) | 389 (321-404) |
Tabella 1: Caratteristiche e risultati dello studio. *I valori sono espressi come intervallo mediano e interquartile.
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Discussion
La sostituzione della valvola aortica con la radice polmonare autologa (operazione di Ross) rappresenta un'opzione interessante per la riparazione della stenosi della valvola aortica congenita a causa del profilo favorevole e della potenziale crescita dell'autoinnesto10. Il principale limite a questa procedura è la potenziale dilatazione della neovalvola aortica, che predispone allo sviluppo di rigurgito a lungo termine. La possibilità di caratterizzare le modificazioni sull'arteria polmonare dopo l'esposizione a pressioni sistemiche potrebbe rappresentare la base per comprendere le cause del fallimento dell'autotrapianto polmonare. Per questo motivo, abbiamo sviluppato un modello sperimentale di impianto singenico di PAG in posizione sistemica in un modello di roditore
La tecnica chirurgica riportata è sicura, efficace e riproducibile. Le piccole dimensioni degli animali che sono stati utilizzati semplificano la gestione chirurgica e postoperatoria. Questo ci ha permesso di ottenere un modello utile con materiali limitati e spese per gli animali. I ratti di Lewis sono stati scelti perché, come ceppo inbred, questi ratti sono isogenici, con oltre il 99% dei loro alleli fissi. Pertanto, sono un modello appropriato per lo studio del trapianto di valvole polmonari tra animali. Abbiamo deciso di impostare un endpoint di due mesi per lo studio perché i dati della letteratura indicano un rapporto 1:11 tra giorni umani e ratti11. Pertanto, possiamo supporre che il nostro tempo di follow-up corrisponda a circa cinque anni, il che ci consente di valutare l'adattamento PAG nel periodo di medio-lungo termine.
I nostri risultati iniziali hanno mostrato un rapido aumento del diametro pag e una diminuzione del PVS misurato al suo livello entro la prima settimana dopo l'impianto. Successivamente, è stato osservato un parziale plateau dell'aumento del diametro. Possiamo ipotizzare che la diminuzione del PSV osservata nel breve periodo possa essere correlata all'aumento del diametro pag, causando una decelerazione del flusso sanguigno nel PAG stesso.
Ulteriori studi volti a indagare la modifica della PAG in una posizione sistemica dopo endpoint di follow-up più brevi aiuteranno a chiarire l'evoluzione di questo adattamento nel tempo. Un possibile sviluppo futuro di questo modello utilizzando diverse strategie per modulare il disadattamento PAG potrebbe eventualmente prevenirne la dilatazione e, quindi, migliorare i risultati dopo l'intervento di Ross. Queste strategie possono essere un trattamento farmacologico, come il controllo della pressione (cioè l'utilizzo di ACE-inibitori o bloccanti del recettore dell'angiotensina II) terapie antiossidanti, o un contenimento meccanico alla dilatazione pag con un rinforzo esterno (come recentemente proposto da alcuni autori12).
Alcuni passaggi critici nella procedura dovrebbero essere eseguiti con particolare attenzione. In primo luogo, è fondamentale includere la giusta quantità di muscolo ventricolo destro durante la raccolta dell'arteria polmonare. Infatti, quando si conserva troppo tessuto muscolare, aumenta il rischio di fuoriuscita dell'anastomosi, mentre una quantità insufficiente di muscoli potrebbe predisporre a danni ai foglietti della valvola. Quando si esegue l'anastomosi prossimale end-to-end tra PA e AA, si deve prestare particolare attenzione a non includere i foglietti della valvola per evitare di influenzare il loro raggio di movimento. Infine, un'adeguata emostasi è fondamentale per evitare un'eccessiva perdita di sangue che potrebbe compromettere il decorso postoperatorio.
Una riduzione di peso fino al 6% è considerata accettabile durante il follow-up. Tuttavia, gli animali dovrebbero riguadagnare il loro peso iniziale entro il primo mese di follow-up e continuare ad aumentare il loro peso in seguito. Se un mancato raggiungimento del peso iniziale è associato all'evidenza di una tendenza al rialzo può anche essere considerato un indice di benessere animale. D'altra parte, qualsiasi riduzione del peso superiore al 6% e qualsiasi mancato raggiungimento del peso iniziale a un mese con una tendenza al ribasso dovrebbero sollevare preoccupazioni per le potenziali cattive condizioni degli animali.
Il principale suggerimento tecnico per i ricercatori che si avvicinano a questo modello è l'uso della sutura continua per eseguire l'anastomosi end-to-end. Mentre i libri di testo di microchirurgia suggeriscono l'uso di punti separati per questo tipo di anastomosi, preferiamo la sutura continua perché stringe meglio la radice polmonare. Oltre a questo, abbiamo osservato che in questo modo è più facile ridurre la potenziale discrepanza con l'aorta ricevente, che è ancora presente nonostante l'uso di un animale più piccolo per la raccolta delle radici polmonari.
Altri modelli animali per lo studio del sovraccarico della pressione radicale polmonare sono già stati descritti nella letteratura corrente. Questi di solito coinvolgono bande PA13. Nonostante l'effettivo aumento della pressione a monte, questi modelli non riproducono completamente una procedura di Ross. In effetti, la prima limitazione è un'elevata variabilità nel sovraccarico di pressione che dipende da quanto è stretta la benda rispetto al diametro PA. Per questi motivi, il sovraccarico polmonare potrebbe non sempre riflettere le effettive pressioni sistemiche. La conservazione della radice polmonare nella sua posizione nativa rappresenta la seconda limitazione dei modelli di banding PA. In una procedura di Ross il PA perde tutte le connessioni vascolari e nervose che possono influenzare il suo ulteriore adattamento alle pressioni sistemiche.
La comunità scientifica ha inoltre già descritto alcuni modelli animali di trasposizione eterotopica della PA in posizione sistemica. Tuttavia, tutti questi modelli prevedono l'uso di animali di taglia grande come agnelli o pecore14,15. Questi animali potrebbero senza dubbio semplificare sotto alcuni aspetti la procedura chirurgica fornendo la possibilità di eseguire una vera e propria procedura di Ross. Tuttavia, la necessità di un bypass cardiopolmonare e la necessità di più persone coinvolte nella gestione chirurgica e postoperatoria aumenta enormemente i costi, limitando così l'uso di questo modello su larga scala. Inoltre, modelli animali di piccole dimensioni, come i ratti, consentirebbero di eseguire una numerosa casistica, riducendo così la variabilità e consentendo diversi endpoint temporali nonché la possibilità di confrontare più gruppi.
Sebbene fornisca la possibilità di valutare la modifica della radice PA a pressioni sistemiche come nel funzionamento di Ross, questo modello presenta alcune limitazioni. Il limite principale è l'impossibilità di eseguire una vera e propria operazione di Ross con distacco e reimpianto delle arterie coronarie. Tuttavia, per i nostri scopi questa era solo una limitazione minore in quanto lo studio si è concentrato sulla parete polmonare. La pressione nell'aorta addominale infrarenale differisce da quella dell'aorta ascendente, limitando così il confronto con l'operazione di Ross per quanto riguarda il movimento dei lembi valvolari; tuttavia, ancora una volta il nostro obiettivo principale era la radice PA come primum movens del fallimento PAG. Inoltre, l'uso di roditori può avere alcune limitazioni legate a una diversa scala di pressione sistemica rispetto agli animali di grandi dimensioni. Tuttavia, questa differenza è proporzionale alle pressioni a cui è sottoposta la radice nativa.
In conclusione, il presente studio ha dimostrato che un impianto di PAG singenico posizionato sistematicamente in un modello di roditore rappresenta una piattaforma semplice e fattibile per lo sviluppo e la valutazione di nuove tecniche chirurgiche e terapie farmacologiche per migliorare ulteriormente i risultati dell'operazione Ross.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Lo studio è stato finanziato dal bilancio integrato per la ricerca interdipartimentale (BIRD) 2019.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride | Monico SpA | AIC 030805105 | Two bottles of 100 mL. The cold one (4°C) for flushing the harvesting organ; the warm one (39°C) for moistening, and rehydration of the recipient |
| 7.5% Povidone-Iodine | B Braun | AIC 032151211 | |
| Barraquer | Aesculap | FD 232R | Straight micro needle holder for the vascular anastomoses |
| Castroviejo needle holder | Not available | J 4065 | To close the animal |
| Clip applying forceps | Rudolf Medical | RU 3994-05 | For clip application |
| Cotton swabs | Johnson & Johnson Medical SpA | N/A | Supermarket product. Sterilized |
| Curved micro jeweller forceps | Rudolf Medical | RU 4240-06 | Used to pass sutures underneath the vases. |
| Depilatory cream | RB healthcare | N/A | Supermarket product |
| Electrocautery machine | LED SpA | Surton 200 | |
| Fine scissors | Rudolf Medical | RU 2422-11 | For opening the abdomen (recipient) |
| Fine-tip curved Vannas micro scissors | Aesculap | OC 497R | Only for preparing the pulmonary root, cut the lumbar vases and the 10/0 Prolene |
| Fluovac Isoflurane/Halotane Scavanger unit | Harvard Apparatus Ltd | K 017041 | Complete of anesthesia machine, anesthesia tubing, induction chamber and scavenger unit with absorbable filter |
| Gentamycin | MSD Italia Srl | AIC 020891014 | Antibiotic. Single dose, 5 mg/kg intramuscular, administered during surgery |
| Heparin | Pharmatex Italia Srl | AIC 034692044 | 500 IU into the recipient abdominal vena cava |
| I.V. Catheter | Smiths Medical Ltd | 4036 | 20G |
| Insulin Syringe, 1 mL | Fisher Scientific | 14-841-33 | To inject heparin in the harvesting animal and to flush the sectioned aorta in the recipient |
| Jeweler bipolar forceps | GIMA SpA | 30665 | 0.25 mm tip. For electrocautery of very small vases |
| Lewis rats (LEW/HanHsd) | Envigo RMS SRL, San Pietro al Natisone, Udine, Italy | 86104M | Male or female, weighing 200-250 g (pulmonary root harvesting animals) and 320-400 g (recipients) |
| Micro-Mosquito | Rudolf Medical | RU 3121-10 | In number of four, with tips covered with silicon tubing. To keep in traction the Prolene suture during anastomosis |
| Operating microscope | Leica Microsystems | M 400-E | Used with 6x, 10x and 16x in-procedure interchangeable magnifications |
| Perma-Hand silk 2-0 | Johnson & Johnson Medical SpA | C026D | To lift the aorta |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Prolene 10-0 | Johnson & Johnson Medical SpA | W2790 | Very fine non-absorbable suture, with a BV75-3 round bodied needle, for the vascular anastomoses |
| Retractors | Not any | N/A | Two home-made retractors |
| Ring tip micro forceps | Rudolf Medical | RU 4079-14 | For delicate manipulation |
| Sevoflurane | AbbVie Srl | AIC 031841036 | Mixed with oxygen, for inhalatory anesthesia |
| Spring type micro scissors | Rudolf Medical | RU 2380-14 | Straight; 14 cm long |
| Standard aneurysm clips | Rudolf Medical | RU 3980-12 | Two clips (7.5 mm; 180 g; 1.77 N) to close the aorta |
| Sterile gauze of non-woven fabric material | Luigi Salvadori SpA | 26161V | 7.5x7.5 cm, four layers |
| Straight Doyen scissors | Rudolf Medical | RU/1428-16 | For use to the donor |
| Straight micro jeweller forceps | Rudolf Medical | RU 4240-04 | 10.5 cm long. Used throughout the anastomosis |
| Syringes | Artsana SpA | N/A | 20 mL (for the harvesting animal) and 5 mL (for the recipient). For saline flushing and dipping |
| TiCron 4-0 | Covidien | CV-331 | For closing muscles and skin |
| Tissue forceps V. Mueller | McKesson | CH 6950-009 | Used for skin and muscles |
| Tramadol | SALF SpA | AIC 044718029 | Analgesic. Single dose, 5 mg/kg intramuscular |
| Virgin silk 8-0 | Johnson & Johnson Medical SpA | W818 | For arterial branch ligation |
References
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