Summary
浸泡的磁珠测定涉及在任何发育时间点靶向递送测试试剂，以研究细胞分化和形态发生的调节。提出了适用于任何实验动物模型的详细方案，用于制备三种不同类型的浸泡珠子并将其植入鸡胚的间位中。
Abstract
在胚胎发育过程中，许多遗传程序被激活，这些程序协调细胞分化，以产生惊人的体细胞，组织和器官的多样性。这些遗传程序的精确激活是由形态原调节的，形态原是可扩散分子，在不同的阈值指导细胞命运。要了解基因激活如何协调形态发生，需要研究发育过程中由形态发生触发的局部相互作用。使用浸泡在蛋白质中的珠子或植入胚胎不同区域的药物可以研究特定分子在建立手指和其他发育过程中的作用。该实验技术提供有关细胞诱导，细胞命运和模式形成的控制的信息。因此，这种浸泡的珠子测定是一种非常强大和有价值的实验工具，适用于其他胚胎模型。
Introduction
在胚胎发育过程中控制基因表达的分子机制的突破使我们能够了解细胞命运是如何决定的。一旦细胞开始转录因子1的分子表达，就会对不同的细胞谱系做出承诺。这种表达模式在空间和时间上高度协调，从而指导细胞，组织和器官的塑造，定位和图案化1，2，3，4，5。胚胎诱导是通过建立限制细胞潜力的层次结构来使细胞致力于特定谱系的过程，其中甚至包括像Spemann组织者6，7那样产生基本的身体计划。胚孔背唇在宿主胚胎8，9中诱导第二胚胎轴。今天，借助嫁接和其他经典实验结合分子方法，已知不同的转录因子和生长因子在Spemann组织器10中具有指导胚胎诱导的功能。因此，实验操作是了解胚胎发生过程中细胞分化，形态发生和图案化过程的重要工具。
有趣的是，在组织移植困难的胚胎系统中，或者当诱导剂已经众所周知时，载体用于递送分子（例如，蛋白质，化学物质，毒素等）以调节细胞分化，形态发生甚至图案化。一种这样的载体系统涉及在任何发育时间点将浸泡在特定分子中的珠子植入任何实验模型生物体中，以确定所述试剂的效果或指导所述模型的分化。例如，通过将视黄酸（RA）浸泡的珠子植入鸡翅肢芽中，Cheryl Tickle等人（1985）证明RA诱导声波刺猬在极化活性区（ZPA）11，12中的表达。使用相同的实验策略发现RA控制了在手指发育过程中肢体芽中体细胞和细胞死亡的不对称性，并在其他胚胎肢体区域控制13，14，15。其他因素，主要是蛋白质（例如，成纤维细胞生长因子[FGF]，转化生长因子β[TGF-ß]）已被用于诱导早期胚胎侧腹和新指的肢体，分别为16，17，18，19，20，21.这些实验证明了该技术在确定暴露于分子的组织或细胞组的承诺阶段或能力方面的强大功能和实用性。
在该协议中，在手指形成阶段的雏鸡肢体作为实验模型，逐步展示如何准备和植入浸泡的珠子。然而，该实验工具不限于此应用，而是可以在任何实验动物模型和 任何体外 和体内时间点 中 利用，以研究诱导，分化，细胞死亡和图案化。
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Protocol
这项研究由墨西哥国立自治大学（墨西哥国立自治大学）生物医学研究所实验室动物护理和使用机构审查委员会（墨西哥国立自治大学）审查和批准。
1. 卵子孵化和胚胎分期
注意：受精鸡蛋可以从当地农场获得。受精白里窝那鸡蛋是最常用的。在孵化前将新鲜受精的鸡蛋在15°C下储存长达1周。
- 在38°C和70%相对湿度的加湿培养箱中，将受精的鸡蛋垂直孵育，尖头面朝下，直到它们达到28 HH阶段（根据Hamilton和Hamburger，1951年，约5.5天）22。在孵化过程中旋转卵子，以防止胚胎粘附在壳膜上。
注意：发育阶段的选择取决于实验目的。在这种情况下，28 HH期是诱导异位手指或促进细胞死亡的指间珠植入的最佳选择。 - 从孵化器中取出种蛋，用70%乙醇擦拭，然后让它们风干。用70%乙醇对工作区域，显微镜和仪器进行消毒。
- 蜡烛卵识别血管并定位胚胎。丢弃没有胚胎的卵子。
- 使用非齿镊子的末端，通过敲击卵的钝端在大约五个卵中打开一个窗口，并用镊子取出1厘米2 的壳。
- 将鸡蛋转移到纸箱或塑料支架中，并将其放在立体显微镜下。通过穿刺并用精细的手术镊子将其拉出来去除空气膜。取出任何可能接触胚胎的小块蛋壳。
注意：空气膜是在打开鸡蛋后立即观察到的白色不透明膜。 - 在显微镜下观察，同时稍微打开羊膜囊，使用精细的手术镊子撕裂它。注意不要损伤绒毛膜的脉管系统。
注意：羊膜是紧邻胚胎的透明膜，将其封装在羊水中。 - 将胚胎 分期在卵子中 以确定它们是否处于所需的阶段。早期阶段的胚胎可以在用胶带密封蛋壳窗口后返回培养箱。
2. 磁珠制备
注意：根据实验目的和所讨论的治疗，替代磁珠类型（例如，Affi-Gel，AG1-X2，肝素）可能更合适。Affi-Gel 磁珠是蛋白质（例如 TGF-ß1）的最佳选择，而肝素磁珠是生长因子（例如 FGF、WNT）和 AG1-X2 磁珠的理想，适用于在有机溶剂（例如 DMSO）中溶解的化学品。
- 亲和凝胶和肝素磁珠制备
- 切一块正方形的石蜡膜以适合45毫米的培养皿。将伞膜穿过培养皿的底部以覆盖它，并使用非齿状镊子的末端推动每个顶点，将其固定在培养皿的底部。留。
- 使用移液器或刮刀，将微球转移到微量离心管中，并通过沉降和移液在1x PBS中洗涤两次。
- 从步骤1中将〜40-50个带有微量移液管的珠子转移到parafilm培养皿的中心。
- 使用显微镜，选择〜30个阿菲凝胶或肝素珠直径〜100μm使用。使用显微镜目镜光罩来调整珠子的大小或使用HH 28胚胎的第三个数字间作为参考;磁珠必须小于数字间。
- 小心地去除珠子周围尽可能多的多余PBS，并将其浸泡在2-5μL的处理溶液中。确保解决方案完全覆盖珠子。
- 同时，通过将浸泡在含有与实验处理溶液中使用的相同量的载体的溶液中来制备控制珠。
注意：需要根据实验计算每次处理的浓度。处理可能有害的试剂时，请使用适当的个人防护装备。 - 在室温下将珠子在溶液中孵育30分钟。为了防止珠子在孵育过程中变干，请在磁珠周围移液几滴1x PBS或水，以加湿局部大气，并用parafilm覆盖培养皿以减缓蒸发。
- 将培养皿放在冰上，并在同一天内植入珠子。
- AG 1-X2 磁珠制备
- 切一块正方形的石蜡膜以适合45毫米的培养皿。用伞膜覆盖培养皿的底部，并使用非齿镊子的末端推动每个顶点。留。
- 使用刮刀将AG 1-X2磁珠转移到微量离心管中。以所需的最终浓度加入30-50μL处理溶液。
- 同时，将对照珠单独与载体一起在溶液中孵育，在没有感兴趣的实验化学品或蛋白质的情况下制备。
- 将珠子孵育20分钟，同时在室温下缓慢摇动。用箔片包裹微量离心管，以便在所有孵育过程中防止光线照射，因为其中许多分子对光敏感
- 使用移液管除去尽可能多的溶液，并用2%酚红在室温下溶解在水中2分钟，并在涡流中轻度搅拌。
注意：对透明的AG 1-X2珠子进行染色有助于它们在胚胎中的植入。 - 除去2%酚红，并在1x PBS中洗涤珠子两次，以除去任何多余的染料。
- 使用微量移液管尖端，将〜40-50 AG 1-X2珠子转移到步骤1中制备的副膜覆盖的培养皿的中心，并将其浸泡在5μL1x PBS中。在显微镜下，选择大约30个直径约为100μm的珠子。丢弃未使用的珠子。
- 珠子已准备好植入。确保珠子在整个植入过程中浸没在PBS中，方法是在珠子周围移液几滴1x PBS或水，以加湿局部大气和/或用parafilm覆盖培养皿以减缓蒸发。
3. 胚胎操作和指间植入
- 在操纵胚胎之前，在台式上布置两个相邻的立体显微镜。一个用于胚胎操作和珠子植入，另一个用于维持已处理的珠子准备植入胚胎。
- 使用无齿镊子，在剩余的卵子中创建一个窗口，如卵子孵化和胚胎分期部分所述。
- 在显微镜下，用右后肢附近的精细手术镊子撕裂羊膜，仅按完成手术所需的量（即尽可能少）来打开羊膜囊。
- 使用细镊子，通过羊膜握住胚胎以暴露右后肢。使用细钨针，在后肢第三指间的远端（最大部分）做一个孔。
- 在不释放胚胎和暴露的后肢的情况下，使用镊子的尖端之一从另一个显微镜中取出一个经过处理的珠子。镊子必须处于打开位置，一个磁珠才能粘附在镊子尖端上。
- 将珠子转移到后肢附近的雏鸡胚胎中，并将其放置在指间孔的顶部。
- 关闭镊子以对珠子施加压力，直到其进入孔中。
- 释放胚胎并用胶带密封蛋壳窗口。
- 将种蛋放回孵化器，直到它们达到所需的阶段。重复该过程，直到达到所需的操纵胚胎数量。必须确保珠子在任何时候都不会变干。
注意：要观察完整的异位手指，请在珠子植入后孵育约72小时。相反，早期分化基因（例如， Sox9）在植入TGF-ß1浸泡的磁珠后约30分钟表达。
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Representative Results
使用浸泡的珠子评估胚胎雏鸡肢体中的细胞行为
为了确保该测定的功效，必须将磁珠一致且精确地放置在正确的位置;在这种情况下，在顶端外胚层脊AER下方的第三指间的远端大部分（图1A）。这种定位允许所讨论的分子在整个指间组织中均匀分布。此外，AER下方的区域包含未分化的细胞，这些细胞很容易对治疗有反应。为了评估对细胞分化的影响，可以用Alcian蓝和茜素红染色胚胎，以证明骨骼元素的形成（图1B）。浸泡珠测定也非常适合用中性红（图1C）评估细胞死亡和通过 原位 杂交进行基因调控（图1D）。比例尺设置为 250 μm。
图1：珠子植入雏鸡肢体的指间组织。A）在28 HH后肢中AER下方浸泡的珠子的正确位置。 （B）阿尔西安蓝和茜素红骨骼染色证明在植入TGF-ß1浸泡珠子4天后诱导异位手指的形成。（C）在28 HH阶段将RA浸泡的珠子植入指间组织24小时后，中性红色染色标记细胞死亡诱导（箭头）。（D）植入TGF-ß1浸泡的磁珠4 h后 ，Sox9原位 杂交。比例尺设置为 250 μm。 B 和 C 中所示的图像取自Díaz-Hernández等人，23，24。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该协议中详述的实验工具的主要优点是能够控制暴露于浸泡在给定实验分子中的磁珠的时间和位置。将正确的定位与精确的发育时间相结合，为研究细胞分化过程提供了巨大的可能性。在未分化的组织中进行这些实验可以研究细胞谱系中的第一个关键事件。例如，将TGFß浸泡的珠子放在胚胎肢体28 HH的指间组织中会导致异位手指的形成，其中触发分子级联，诱导主 Sox925的遗传表达。值得注意的是，诱导的软骨组织也组织成指骨形成的手指。
有趣的是，RA通过调节骨形态发生蛋白的基因表达来触发同一指间区域的细胞死亡，这些蛋白质将未分化细胞的细胞命运引向细胞死亡10。因此，可以在胚胎的同一区域同时研究细胞分化，细胞死亡，形态发生和模式形成，并针对感兴趣的任何区域和遗传途径进行定制8，9。
该协议成功的关键因素包括永不让浸泡的珠子变干（即，它们必须始终保持湿润）。此外，选择合适的磁珠也至关重要：Affi-Gel和肝素磁珠用于蛋白质，而AG1-X2用于溶解在有机溶剂中的化学品。另一个关键点是用于浸泡磁珠的溶液中所含分子的浓度，其浓度通常比用于 体外 研究的浓度高1000倍。然而，这种方法的不便之处在于，从浸泡的珠子中释放的分子的最终浓度以及释放速度是未知的。在方案中提到，磁珠-100μm直径使用更方便。在操纵四肢时考虑这一点。最重要的是，必须根据植入区选择磁珠的直径，并始终保持在每个胚胎中。然而，实验之间磁珠尺寸的微小变化不太可能影响结果。
总之，这里概述的浸泡珠测定的潜力仅取决于研究人员的想象力。该方案可应用于任何实验动物、细胞培养或有机细胞培养模型，包括类器官。此外，该协议是一种有用，直接的教育工具，通过在发育生物学课程中练习这种实验操作来教授学生基本的发育生物学概念和技术技能。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了墨西哥国立自治大学（DGAPA）[拨款编号IN211117和IN213314]和授予JC-M的全国科学与技术大会（CONACyT）[授予1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia]的支持。JC M-L获得了国家科学与技术委员会（CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887）的博士后奖学金。作者感谢Lic的帮助。来自墨西哥国立自治大学生物医学研究所的Lucia Brito在本手稿的准备参考中。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
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