Summary
Den blötlagda pärlanalysen innefattar riktad leverans av testreagens vid vilken utvecklingspunkt som helst för att studera regleringen av celldifferentiering och morfogenes. Ett detaljerat protokoll, tillämpligt på alla försöksdjursmodeller, för beredning av tre olika typer av blötlagda pärlor och implantering av dessa i interdigit av ett kycklingembryo presenteras.
Abstract
En mängd genetiska program aktiveras under embryonal utveckling som orkestrerar celldifferentiering för att generera en häpnadsväckande mångfald av somatiska celler, vävnader och organ. Den exakta aktiveringen av dessa genetiska program regleras av morfogener, diffusibla molekyler som styr cellödet vid olika tröskelvärden. Att förstå hur genetisk aktivering samordnar morfogenes kräver studier av lokala interaktioner som utlöses av morfogener under utvecklingen. Användningen av pärlor som blötläggs i proteiner eller läkemedel implanterade i distinkta regioner i embryot gör det möjligt att studera specifika molekylers roll vid upprättandet av siffror och andra utvecklingsprocesser. Denna experimentella teknik ger information om kontrollen av cellinduktion, cellöde och mönsterbildning. Således är denna blöta pärlanalys ett extremt kraftfullt och värdefullt experimentellt verktyg som är tillämpligt på andra embryonala modeller.
Introduction
Genombrott i de molekylära mekanismer som styr genuttryck under embryonal utveckling har gjort det möjligt för oss att förstå hur cellödet bestäms. Engagemang för olika cellinjer sker när celler börjar molekylärt uttryck av transkriptionsfaktorer1. Detta uttrycksmönster är mycket koordinerat i rum och tid och styr därmed formning, positionering och mönstrande av celler, vävnader och organ 1,2,3,4,5. Embryonal induktion är den process genom vilken celler är engagerade i specifika släkter genom att upprätta hierarkier som begränsar cellernas potential, som till och med inkluderar genereringen av den grundläggande kroppsplanen som sker med Spemann-arrangören 6,7. Blastopore dorsal lip inducerar en andra embryonal axel i ett värdembryo 8,9. Idag, med hjälp av ympning och andra klassiska experiment i kombination med molekylära tillvägagångssätt, är det känt att olika transkriptionsfaktorer och tillväxtfaktorer fungerar för att styra embryonal induktion i Spemann-arrangören10. Således är experimentell manipulation ett viktigt verktyg för att förstå celldifferentiering, morfogenes och mönstrade processer under embryogenesen.
Intressant nog, i embryonala system där vävnadstransplantation är svår eller när inducerarna redan är välkända, används bärare för att leverera molekyler (t.ex. proteiner, kemikalier, toxiner etc.) för att reglera celldifferentiering, morfogenes och till och med mönstran. Ett sådant bärarsystem innefattar implantering av pärlor som blötläggs i en specifik molekyl i någon experimentell modellorganism vid vilken utvecklingstidpunkt som helst för att bestämma effekten av nämnda reagens eller styra differentieringen av nämnda modell. Till exempel, genom att implantera retinsyra (RA) -blötlagda pärlor i kycklingvingens lemknopp, visade Cheryl Tickle et al. (1985) att RA inducerar uttrycket av sonisk igelkott i zonen för polariserande aktivitet (ZPA)11,12. Samma experimentella strategi användes för att upptäcka att RA kontrollerar asymmetrin hos somiter och celldöd i lemknoppen under sifferutveckling och i andra embryonala extremitetsregioner 13,14,15. Andra faktorer, främst proteiner (t.ex. fibroblasttillväxtfaktorer [FGF], transformerande tillväxtfaktor-beta [TGF-ß]) har använts för att inducera lemmar i tidiga embryons flanker respektive nya siffror i den interdigitala regionen, respektive 16,17,18,19,20,21 . Dessa experiment bevisar kraften och nyttan av denna teknik för att bestämma stadiet av engagemang eller kompetens hos vävnader eller grupper av celler som utsätts för molekylerna.
I detta protokoll fungerade kycklingbenet vid sifferbildningsstadiet som den experimentella modellen för att presentera steg för steg hur man förbereder och implanterar de blötlagda pärlorna. Detta experimentella verktyg är dock inte begränsat till denna applikation utan kan utnyttjas i alla experimentella djurmodeller och vilken tidspunkt som helst in vitro och in vivo för att studera induktion, differentiering, celldöd och mönstran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna forskning granskades och godkändes av Institutional Review Board for the Care and Use of Laboratory Animals vid Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Mexiko).
1. Ägginkubation och embryostaging
OBS: Befruktade hönsägg kan erhållas från lokala gårdar. Befruktade Vita Leghorn kycklingägg används oftast. Förvara de nygödslade kycklingäggen vid 15 °C i upp till 1 vecka före inkubation.
- Inkubera de befruktade kycklingäggen vertikalt med den spetsiga sidan nedåt i en fuktad inkubator vid 38 ° C och 70% relativ fuktighet tills de når 28 HH-steget (cirka 5,5 dagar enligt Hamilton och Hamburger, 1951)22. Rotera äggen under inkubationen för att förhindra att embryot fäster vid skalmembranet.
OBS: Valet av utvecklingsstadium informeras av de experimentella målen. I detta fall är 28 HH-steget optimalt för interdigit pärlimplantation för att inducera en ektopisk siffra eller främja celldöd. - Ta bort äggen från inkubatorn, torka dem med 70% etanol och låt dem lufttorka. Desinficera arbetsområdet, mikroskop och instrument med 70% etanol.
- Ljus ägget för att identifiera blodkärl och lokalisera embryot. Kassera ägg som inte har ett embryo.
- Använd änden av icke-tandade pincett, öppna ett fönster i cirka fem ägg genom att knacka på den trubbiga änden av ett ägg och ta bort en 1 cm2 sektion av skalet med tången.
- Överför ägget till en kartong eller plasthållare och placera det under stereomikroskopet. Ta bort luftmembranet genom att punktera och dra ut det med fina kirurgiska pincett. Ta bort någon liten bit äggskal som kan komma i kontakt med embryot.
OBS: Luftmembranet är det vita, ogenomskinliga membranet som observeras omedelbart efter fönsterning av ägget. - Observera under mikroskopet medan du öppnar fostersäcken något och riva den med de fina kirurgiska tångarna. Var försiktig så att du inte skadar vaskulaturen i det korioallantoiska membranet.
OBS: Amnion är det transparenta membranet som nära omger embryot som kapslar in det i fostervätska. - Steg embryon i ovo för att avgöra om de befinner sig i önskat stadium. Embryon i tidigare skeden kan återföras till inkubatorn efter tätning av äggskalfönstret med tejp.
2. Beredning av pärlor
OBS: Beroende på det experimentella syftet och behandlingen i fråga kan alternativa pärltyper (t.ex. Affi-Gel, AG1-X2, heparin) vara mer lämpliga. Affi-Gel-pärlor är optimala för proteiner (t.ex. TGF-ß1), medan heparinspadderlor är idealiska för tillväxtfaktorer (t.ex. FGF, WNT) och AG1-X2-pärlor för kemikalier som solubiliseras i organiska lösningsmedel (t.ex. DMSO).
- Affi-Gel och heparin pärlberedning
- Skär en kvadrat parafilm för att passa en 45 mm petriskål. Placera parafilmen över botten av petriskålen för att täcka den och fixera den på botten av petriskålen genom att trycka på varje toppunkt med änden av icke-tandade pincett. Avsätta.
- Använd en pipett eller spatel, överför pärlorna till ett mikrocentrifugrör och tvätta dem två gånger i 1x PBS genom sedimentering och pipettering.
- Överför ~ 40-50 pärlor med en mikropipett till mitten av den parafilmade petriskålen från steg 1.
- Använd mikroskopet och välj ~ 30 Affi-Gel eller heparinplånlor ~ 100 μm i diameter för användning. Använd ett mikroskop okular reticle för att dimensionera pärlorna eller använd den tredje interdigiten av ett HH 28-embryo som referens; pärlan måste vara mindre än interdigiten.
- Ta försiktigt bort så mycket av överskottet av PBS som omger pärlorna som möjligt och blötlägg dem i 2-5 μL av behandlingslösningen. Se till att lösningen helt täcker pärlor.
- Parallellt bereda kontroll pärlor genom blötläggning i en lösning som innehåller samma mängd fordon som används i den experimentella behandlingslösningen.
OBS: Koncentrationerna måste beräknas för varje behandling enligt experimentet. Använd lämplig personlig skyddsutrustning vid hantering av potentiellt skadliga reagenser. - Inkubera pärlorna i lösningen i 30 minuter vid rumstemperatur. För att förhindra att pärlorna torkar ut under inkubationen, pipettera några droppar 1x PBS eller vatten runt pärlorna för att befukta den lokala atmosfären och täcka skålen med parafilm för att sakta avdunstningen.
- Lägg petriskålen på is och implantera pärlorna inom samma dag.
- AG 1-X2 pärlberedning
- Skär en kvadrat parafilm för att passa en 45 mm petriskål. Täck botten av petriskålen med parafilm och fäst genom att trycka på varje toppunkt med änden av icke-tandade pincett. Avsätta.
- Använd en spatel för att överföra AG 1-X2-pärlorna till ett mikrocentrifugrör. Tillsätt 30-50 μL av behandlingslösningen vid önskad slutlig koncentration.
- Parallellt inkubera kontrollfläckarna i en lösning med fordonet ensamt, framställt utan den experimentella kemikalien eller proteinet av intresse.
- Inkubera pärlorna i 20 minuter medan du långsamt skakar i rumstemperatur. Vik in mikrocentrifugrören med folie för att skydda mot ljus under all inkubation, med tanke på att många av dessa molekyler är ljuskänsliga
- Ta bort så mycket av lösningen som möjligt med en pipett och fläck med 2% fenolrött upplöst i vatten vid rumstemperatur i 2 min med mild omrörning i en virvel.
OBS: Färgning av de transparenta AG 1-X2-pärlorna underlättar deras implantation i embryot. - Ta bort 2% fenolrött och tvätta pärlorna två gånger i 1x PBS för att ta bort överflödigt färgämne.
- Överför ~ 40-50 AG 1-X2-pärlor med en mikropipettspets till mitten av den parafilmtäckta petriskålen tillagad i steg 1 och blötlägg dessa i 5 μL 1x PBS. Under mikroskopet väljer du cirka 30 pärlor som är ~ 100 μm diameter stora. Kassera de oanvända pärlorna.
- Pärlor är redo att implanteras. Se till att pärlorna är nedsänkta i PBS under hela implantationen genom att pipettera några droppar 1x PBS eller vatten runt pärlorna för att befukta den lokala atmosfären och / eller täcka skålen med parafilm för att sakta avdunstningen.
3. Embryomanipulation och interdigitimplantation
- Innan du manipulerar embryon, ordna två stereomikroskop bredvid varandra på en bänkskiva. Den ena är för embryomanipulation och pärlimplantation, och den andra är för att hålla de behandlade pärlorna redo att implanteras i embryot.
- Använd icke-tandade pincett, skapa ett fönster i de återstående äggen som beskrivs i ägginkubation och embryostagingssektion.
- Under mikroskopet öppnar du fostersäcken genom att riva fostermembranet med fina kirurgiska pincett nära höger bakben endast med den mängd som behövs för att utföra proceduren (dvs så lite som möjligt).
- Använd fina pincett, håll embryot vid fosterhinnan för att exponera höger bakben. Använd en fin volframnål, gör ett hål centrerat i det distala mesta av bakbenets tredje interdigit.
- Utan att släppa embryot och den exponerade bakbenet, ta en behandlad pärla från det andra mikroskopet med hjälp av en av spetsarna på pincetten. Tången måste vara i öppet läge för att en pärla ska fästa vid tångspetsen.
- Överför pärlan till kycklingembryot nära bakbenet och placera den ovanpå interdigithålet.
- Stäng tången för att applicera tryck på pärlan tills den kommer in i hålet.
- Släpp embryot och försegla äggskalfönstret med tejp.
- Sätt tillbaka äggen till inkubatorn tills de har nått det önskade skedet. Upprepa proceduren tills det önskade antalet manipulerade embryon har uppnåtts. Det är absolut nödvändigt att se till att pärlorna inte torkar ut när som helst.
OBS: För att observera ett fullständigt ektopiskt finger, inkubera i ~ 72 timmar efter pärlimplantation. Däremot uttrycks tidiga differentieringsgener (t.ex. Sox9) ~ 30 minuter efter implantationen av en TGF-ß1-blöt pärla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använda blötlagda pärlor för att utvärdera cellbeteende i den embryonala kycklingbenet
För att säkerställa effekten av denna analys måste pärlan placeras konsekvent och exakt på rätt plats; i detta fall den distala mest av den tredje interdigiten under den apikala ektodermala åsen AER (figur 1A). Denna positionering gör det möjligt för molekylen i fråga att sprida sig lika genom den interdigitala vävnaden. Dessutom innehåller zonen under AER odifferentierade celler som lätt svarar på behandling. För att utvärdera effekterna på celldifferentiering kan embryon färgas med Alcian blå och Alizarin röd för att bevisa bildandet av skelettelement (Figur 1B). Den blötlagda pärlanalysen är också väl lämpad för utvärdering av celldöd med neutralt rött (figur 1C) och genreglering genom in situ-hybridisering (figur 1D). Skalstången är inställd på 250 μm.
Figur 1: Pärlimplantation i den interdigitala vävnaden i kycklinglemmen.( A) Rätt plats för den blötlagda pärlan under AER i en 28 HH bakben. (B) Alcianblå och Alizarin röd skelettfärgning bevisar bildandet av en ektopisk siffra inducerad 4 dagar efter implantation av en TGF-ß1-blöt pärla. (C) Neutral röd färgning markerar celldödsinduktion (pilspets) 24 timmar efter implantation av en RA-indränkt pärla i den interdigitala vävnaden vid 28 HH-steget. (D) Sox9 in situ hybridisering 4 timmar efter att en TGF-ß1-blöt pärla implanterats. Skalstången är inställd på 250 μm. Bilderna som visas i B och C är tagna från Díaz-Hernández et al.23,24. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den största fördelen med det experimentella verktyget som beskrivs i detta protokoll är att kunna kontrollera tid och plats för exponeringen för pärlor som blötläggs i en given experimentell molekyl. Att kombinera rätt positionering med exakt utvecklingstiming ger enorma möjligheter att studera celldifferentieringsprocesser. Att utföra dessa experiment i odifferentierad vävnad gör det möjligt att undersöka de första avgörande händelserna i cellulär härstamning. Att till exempel placera en TGFß-blöt pärla i den interdigitala vävnaden i embryonala lemmar 28 HH resulterar i bildandet av en ektopisk siffra i vilken en molekylär kaskad utlöses som inducerar det genetiska uttrycket av mastergenen Sox925. Anmärkningsvärt organiserar den inducerade broskvävnaden också i en siffra med falanxbildning.
Intressant nog utlöser RA celldöd i samma interdigitala region genom att reglera genuttrycket av benmorfogenetiska proteiner som riktar cellödet hos odifferentierade celler mot celldöd10. Därför kan celldifferentiering, celldöd, morfogenes och mönstran undersökas samtidigt i samma region av ett embryo och skräddarsys för alla regioner och genetiska vägar av intresse 8,9.
De element som är avgörande för framgången med detta protokoll inkluderar att aldrig låta de blötlagda pärlorna torka ut (dvs de måste alltid förbli våta). Att välja lämpliga pärlor är också viktigt: Affi-Gel och heparin pärlor är för proteiner, medan AG1-X2 är för kemikalier upplösta i organiska lösningsmedel. En annan kritisk punkt är koncentrationen av molekylen i lösningen som används för att blötlägga pärlorna, som vanligtvis är 1000 gånger mer koncentrerad än vad som skulle användas för in vitro-studier . Ändå är ett besvär med denna metod att den slutliga koncentrationen av molekyler som frigörs från de blötlagda pärlorna är okänd, liksom frisättningshastigheten. I protokollet nämns att pärlor-100 μm diameter är bekvämare att använda. Tänk på detta när lemmar manipuleras. Viktigast av allt måste pärlornas diameter väljas enligt implantationszonen och konsekvent bibehållas i varje embryo. En liten variation i pärlstorlek mellan experimenten kommer dock sannolikt inte att påverka resultaten.
Sammanfattningsvis beror potentialen hos den blöta pärlanalysen som beskrivs här endast på forskarens fantasi. Detta protokoll kan tillämpas på alla försöksdjur, cellkulturer eller organotypiska odlingsmodeller, inklusive organoider. Dessutom är detta protokoll ett användbart, enkelt pedagogiskt verktyg för att lära eleverna grundläggande utvecklingsbiologiska begrepp och tekniska färdigheter genom att öva denna experimentella manipulation i utvecklingsbiologiska klasser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [bidragsnummer IN211117 och IN213314] och Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [bidragsnummer 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] som tilldelades JC-M. JC M-L fick ett postdoktoralt stipendium från Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887). Författarna uppskattar hjälp av Lic. Lucia Brito från Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM i beredningsreferenserna till detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
- Stapornwongkul, K. S., Vincent, J. P. Generation of extracellular morphogen gradients: the case for diffusion. Nature Reviews Genetics. 22 (6), 393-411 (2021).
- Rogers, K. W., Schier, A. F. Morphogen gradients: from generation to interpretation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 377-407 (2011).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. Dynamic patterning by morphogens illuminated by cis-regulatory studies. Development. 148 (2), 196113 (2021).
- Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), (2019).
- Marín-Llera, J. C., Garciadiego-Cázares, D., Chimal-Monroy, J. Understanding the cellular and molecular mechanisms that control early cell fate decisions during appendicular skeletogenesis. Frontiers in Genetics. 10, 977 (2019).
- Gurdon, J. B.
- Bouwmeester, T. The Spemann-Mangold organizer: the control of fate specification and morphogenetic rearrangements during gastrulation in Xenopus. International Journal of Developmental Biology. 45 (1), 251-258 (2001).
- Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86 (4), 589-598 (1996).
- Cho, K. W., Blumberg, B., Steinbeisser, H., De Robertis, E. M. Molecular nature of Spemann's organizer: the role of the Xenopus homeobox gene goosecoid. Cell. 67 (6), 1111-1120 (1991).
- Thisse, B., Thisse, C. Formation of the vertebrate embryo: Moving beyond the Spemann organizer. Seminars in Cell & Development Biology. 42, 94-102 (2015).
- Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids. Analytical Biochemistry. 142 (2), 542-555 (1984).
- Tickle, C., Lee, J., Eichele, G. A quantitative analysis of the effect of all-trans-retinoic acid on the pattern of chick wing development. Developmental Biology. 109 (1), 82-95 (1985).
- Vermot, J., Pourquié, O. Retinoic acid coordinates somitogenesis and left-right patterning in vertebrate embryos. Nature. 435 (7039), 215-220 (2005).
- Rodriguez-Leon, J., et al. Retinoic acid regulates programmed cell death through BMP signalling. Nature Cell Biology. 1 (2), 125-126 (1999).
- Rodriguez-Guzman, M., et al. Tendon-muscle crosstalk controls muscle bellies morphogenesis, which is mediated by cell death and retinoic acid signaling. Developmental Biology. 302 (1), 267-280 (2007).
- Cohn, M. J., Izpisúa-Belmonte, J. C., Abud, H., Heath, J. K., Tickle, C. Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos. Cell. 80 (5), 739-746 (1995).
- Ohuchi, H., et al. An additional limb can be induced from the flank of the chick embryo by FGF4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 209 (3), 809-816 (1995).
- Abu-Elmagd, M., Goljanek Whysall, K., Wheeler, G., Münsterberg, A. Sprouty2 mediated tuning of signalling is essential for somite myogenesis. BMC Medical Genomics. 8, Suppl 1 8 (2015).
- Gañan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Merino, R., et al. Morphogenesis of digits in the avian limb is controlled by FGFs, TGFbetas, and noggin through BMP signaling. Developmental Biology. 200 (1), 35-45 (1998).
- Montero, J. A., Lorda-Diez, C. I., Gañan, Y., Macias, D., Hurle, J. M. Activin/TGFbeta and BMP crosstalk determines digit chondrogenesis. Developmental Biology. 321 (2), 343-356 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Díaz-Hernández, M. E., Bustamante, M., Galván-Hernández, C. I., Chimal-Monroy, J. Irx1 and Irx2 are coordinately expressed and regulated by retinoic acid, TGFβ and FGF signaling during chick hindlimb development. PLoS One. 8 (3), 58549 (2013).
- Díaz-Hernández, M. E., Rios-Flores, A. J., Abarca-Buis, R. F., Bustamante, M., Chimal-Monroy, J. Molecular control of interdigital cell death and cell differentiation by retinoic acid during digit development. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 138-157 (2014).
- Chimal-Monroy, J., et al. Analysis of the molecular cascade responsible for mesodermal limb chondrogenesis: Sox genes and BMP signaling. Developmental Biology. 257 (2), 292-301 (2003).
