Summary
El ensayo de perla empapada implica la entrega dirigida de reactivo de prueba en cualquier punto de tiempo de desarrollo para estudiar la regulación de la diferenciación celular y la morfogénesis. Se presenta un protocolo detallado, aplicable a cualquier modelo animal experimental, para preparar tres tipos diferentes de perlas remojadas e implantarlas en el interdigito de un embrión de pollo.
Abstract
Una multitud de programas genéticos se activan durante el desarrollo embrionario que orquesta la diferenciación celular para generar una asombrosa diversidad de células, tejidos y órganos somáticos. La activación precisa de estos programas genéticos está regulada por morfógenos, moléculas difusibles que dirigen el destino celular a diferentes umbrales. Comprender cómo la activación genética coordina la morfogénesis requiere el estudio de las interacciones locales desencadenadas por los morfógenos durante el desarrollo. El uso de perlas empapadas en proteínas o fármacos implantados en distintas regiones del embrión permite estudiar el papel de moléculas específicas en el establecimiento de dedos y otros procesos de desarrollo. Esta técnica experimental proporciona información sobre el control de la inducción celular, el destino celular y la formación de patrones. Por lo tanto, este ensayo de cuentas empapadas es una herramienta experimental extremadamente poderosa y valiosa aplicable a otros modelos embrionarios.
Introduction
Los avances en los mecanismos moleculares que controlan la expresión génica durante el desarrollo embrionario nos han permitido comprender cómo se determina el destino celular. El compromiso con diferentes linajes celulares ocurre una vez que las células comienzan la expresión molecular de los factores de transcripción1. Este patrón de expresión está altamente coordinado en el espacio y el tiempo y, por lo tanto, dirige la formación, el posicionamiento y el patrón de células, tejidos y órganos 1,2,3,4,5. La inducción embrionaria es el proceso por el cual las células se comprometen con linajes específicos estableciendo jerarquías que restringen la potencialidad de las células, que incluso incluyen la generación del plan corporal básico como ocurre con el organizador de Spemann 6,7. El labio dorsal blastoporo induce un segundo eje embrionario en un embrión huésped 8,9. Hoy en día, con la ayuda del injerto y otros experimentos clásicos combinados con enfoques moleculares, se sabe que diferentes factores de transcripción y factores de crecimiento funcionan para dirigir la inducción embrionaria en el organizador de Spemann10. Por lo tanto, la manipulación experimental es una herramienta importante para comprender la diferenciación celular, la morfogénesis y los procesos de modelado durante la embriogénesis.
Curiosamente, en los sistemas embrionarios donde el trasplante de tejidos es difícil o cuando los inductores ya son bien conocidos, los portadores se utilizan para entregar moléculas (por ejemplo, proteínas, productos químicos, toxinas, etc.) para regular la diferenciación celular, la morfogénesis e incluso los patrones. Uno de estos sistemas portadores consiste en implantar perlas empapadas en una molécula específica en cualquier organismo modelo experimental en cualquier punto de tiempo de desarrollo para determinar el efecto de dicho reactivo o dirigir la diferenciación de dicho modelo. Por ejemplo, al implantar perlas empapadas en ácido retinoico (AR) en el brote de la extremidad del ala de pollo, Cheryl Tickle et al. (1985) demostraron que la AR induce la expresión del erizo sónico en la zona de actividad polarizante (ZPA)11,12. La misma estrategia experimental se utilizó para descubrir que la AR controla la asimetría de los somitas y la muerte celular en el brote de la extremidad durante el desarrollo de los dedos y en otras regiones embrionarias de las extremidades 13,14,15. Otros factores, principalmente proteínas (por ejemplo, factores de crecimiento de fibroblastos [FGF], factor de crecimiento transformante beta [TGF-ß]) se han utilizado para inducir extremidades en los flancos de embriones tempranos y nuevos dígitos en la región interdigital, respectivamente 16,17,18,19,20,21 . Estos experimentos evidencian el poder y la utilidad de esta técnica para determinar la etapa de compromiso o competencia de tejidos o grupos de células expuestas a las moléculas.
En este protocolo, la extremidad del pollito en la etapa de formación de dedos sirvió como modelo experimental para presentar paso a paso cómo preparar e implantar las cuentas empapadas. Sin embargo, esta herramienta experimental no se limita a esta aplicación, sino que puede ser explotada en cualquier modelo animal experimental y cualquier punto de tiempo in vitro e in vivo para estudiar la inducción, la diferenciación, la muerte celular y el modelado.
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Protocol
Esta investigación fue revisada y aprobada por la Junta de Revisión Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Ciudad de México, México).
1. Incubación de óvulos y estadificación embrionaria
NOTA: Los huevos de gallina fertilizados se pueden obtener de granjas locales. Los huevos de gallina fertilizados de White Leghorn son los más utilizados. Guarde los huevos de gallina recién fertilizados a 15 °C durante un máximo de 1 semana antes de la incubación.
- Incubar los huevos de gallina fertilizados verticalmente con el lado puntiagudo hacia abajo en una incubadora humidificada a 38 °C y 70% de humedad relativa hasta que alcancen la etapa de 28 HH (aproximadamente 5,5 días según Hamilton y Hamburger, 1951)22. Gire los huevos durante la incubación para evitar que el embrión se adhiera a la membrana de la cáscara.
NOTA: La elección de la etapa de desarrollo se basa en los objetivos experimentales. En este caso, la etapa de 28 HH es óptima para la implantación de perlas interdigit para inducir un dedo ectópico o promover la muerte celular. - Retire los huevos de la incubadora, rocíelos con etanol al 70% y déjelos secar al aire. Desinfecte el área de trabajo, los microscopios y los instrumentos con etanol al 70%.
- Vela el huevo para identificar los vasos sanguíneos y localizar el embrión. Deseche los óvulos que no tengan un embrión.
- Usando el extremo de pinzas sin dientes, abra una ventana en alrededor de cinco huevos golpeando el extremo romo de un huevo y retire una sección de 1 cm2 de la cáscara con las pinzas.
- Transfiera el huevo a un cartón o soporte de plástico y colóquelo debajo del estereomicroscopio. Retire la membrana de aire perforándola y sacándola con fórceps quirúrgicos finos. Retire cualquier pequeño trozo de cáscara de huevo que pueda entrar en contacto con el embrión.
NOTA: La membrana de aire es la membrana blanca y opaca observada inmediatamente después de la ventana del huevo. - Observe bajo el microscopio mientras abre ligeramente el saco amniótico, rasgándolo con las finas pinzas quirúrgicas. Tenga cuidado de no dañar la vasculatura de la membrana corioalantoica.
NOTA: El amnios es la membrana transparente que rodea estrechamente el embrión que lo encapsula en líquido amniótico. - Estadifica los embriones in ovo para determinar si están en la etapa deseada. Los embriones en etapas anteriores se pueden devolver a la incubadora después de sellar la ventana de la cáscara del huevo con cinta adhesiva.
2. Preparación de cuentas
NOTA: Dependiendo del objetivo experimental y el tratamiento en cuestión, los tipos alternativos de perlas (por ejemplo, Affi-Gel, AG1-X2, heparina) pueden ser más adecuados. Las perlas de Affi-Gel son óptimas para las proteínas (por ejemplo, TGF-ß1), mientras que las perlas de heparina son ideales para los factores de crecimiento (por ejemplo, FGF, WNT) y las perlas AG1-X2 para productos químicos solubilizados en disolventes orgánicos (por ejemplo, DMSO).
- Preparación de perlas de Affi-Gel y heparina
- Corta un cuadrado de parafilm para que quepa una placa de Petri de 45 mm. Coloque la parapelícula en la parte inferior de la placa de Petri para cubrirla y fíjela al fondo de la placa de Petri empujando cada vértice usando el extremo de pinzas no dentadas. Reservar.
- Usando una pipeta o espátula, transfiera las perlas a un tubo de microcentrífuga y lávelas dos veces en 1x PBS sedimentando y pipeteando.
- Transfiera ~ 40-50 cuentas con una micropipeta al centro de la placa de Petri parafilmada desde el paso 1.
- Usando el microscopio, seleccione ~ 30 cuentas de Affi-Gel o heparina ~ 100 μm de diámetro para su uso. Use una retícula ocular de microscopio para dimensionar las cuentas o use el tercer interdigit de un embrión HH 28 como referencia; la cuenta debe ser más pequeña que el interdigit.
- Retire cuidadosamente la mayor cantidad posible del exceso de PBS que rodea las perlas y sumérjalas en 2-5 μL de la solución de tratamiento. Asegúrese de que la solución cubra completamente las cuentas.
- En paralelo, prepare las perlas de control remojando en una solución que contenga la misma cantidad de vehículo que se utiliza en la solución de tratamiento experimental.
NOTA: Las concentraciones deben calcularse para cada tratamiento de acuerdo con el experimento. Utilice el equipo de protección personal adecuado cuando manipule reactivos potencialmente dañinos. - Incubar las perlas en la solución durante 30 min a temperatura ambiente. Para evitar que las perlas se sequen durante la incubación, pipetee unas gotas de 1x PBS o agua alrededor de las perlas para humidificar la atmósfera local y cubra el plato con parafilm para retardar la evaporación.
- Coloque la placa de Petri sobre hielo e implante las cuentas dentro del mismo día.
- Preparación de perlas AG 1-X2
- Corta un cuadrado de parafilm para que quepa una placa de Petri de 45 mm. Cubra la parte inferior de la placa de Petri con parafilm y fije empujando cada vértice usando el extremo de pinzas no dentadas. Reservar.
- Use una espátula para transferir las perlas AG 1-X2 a un tubo de microcentrífuga. Añadir 30-50 μL de la solución de tratamiento a la concentración final deseada.
- En paralelo, incubar las perlas de control en una solución con el vehículo solo, preparado sin el químico experimental o la proteína de interés.
- Incubar las perlas durante 20 minutos mientras se agitan lentamente a temperatura ambiente. Envolver los tubos de la microcentrífuga con papel de aluminio para protegerlos de la luz durante toda la incubación, dado que muchas de estas moléculas son sensibles a la luz.
- Retire la mayor cantidad posible de la solución con una pipeta y manche con rojo fenol al 2% disuelto en agua a temperatura ambiente durante 2 min con agitación suave en un vórtice.
NOTA: Teñir las perlas transparentes AG 1-X2 facilita su implantación en el embrión. - Retire el rojo fenol al 2% y lave las perlas dos veces en 1x PBS para eliminar cualquier exceso de tinte.
- Con una punta de micropipeta, transfiera ~ 40-50 cuentas AG 1-X2 al centro de la placa de Petri cubierta de parapelícula preparada en el paso 1 y sumérjalas en 5 μL de 1x PBS. Bajo el microscopio, seleccione alrededor de 30 cuentas que tengan un tamaño de ~ 100 μm de diámetro. Deseche las cuentas no utilizadas.
- Las cuentas están listas para implantarse. Asegúrese de que las perlas estén sumergidas en el PBS durante toda la implantación mediante el pipeteo de unas gotas de 1x PBS o agua alrededor de las perlas para humidificar la atmósfera local y / o cubrir el plato con parafilm para retardar la evaporación.
3. Manipulación embrionaria e implantación interdigit
- Antes de manipular los embriones, coloque dos estereomicroscopios uno al lado del otro en una mesa de trabajo. Uno es para la manipulación de embriones y la implantación de perlas, y el otro es para mantener las cuentas tratadas listas para implantar en el embrión.
- Usando fórceps no dentados, cree una ventana en los huevos restantes como se describe en la sección de incubación de huevos y estadificación de embriones.
- Bajo el microscopio, abra el saco amniótico rasgando la membrana amniótica con fórceps quirúrgicos finos cerca de la extremidad posterior derecha solo por la cantidad necesaria para realizar el procedimiento (es decir, lo menos posible).
- Usando fórceps finos, sostenga el embrión por la membrana amniótica para exponer la extremidad posterior derecha. Usando una aguja de tungsteno fina, haga un agujero centrado en la parte distal del tercer interdigito de la extremidad posterior.
- Sin liberar el embrión y la extremidad posterior expuesta, tome una cuenta tratada del otro microscopio usando una de las puntas de las pinzas. Los fórceps deben estar en la posición abierta para que una cuenta se adhiera a la punta de los fórceps.
- Transfiera la cuenta al embrión de pollito cerca de la extremidad posterior y colóquela en la parte superior del orificio intermedio.
- Cierre las pinzas para aplicar presión a la cuenta hasta que entre en el orificio.
- Suelte el embrión y selle la ventana de la cáscara del huevo con cinta adhesiva.
- Devuelva los huevos a la incubadora hasta que hayan alcanzado la etapa requerida. Repita el procedimiento hasta que se alcance el número requerido de embriones manipulados. Es imperativo asegurarse de que las cuentas no se sequen en ningún momento.
NOTA: Para observar un dedo ectópico completo, incube durante ~ 72 h después de la implantación de la perla. En contraste, los genes de diferenciación temprana (por ejemplo, Sox9) se expresan ~ 30 minutos después de la implantación de una cuenta empapada de TGF-ß1.
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Representative Results
Uso de perlas empapadas para evaluar el comportamiento celular en la extremidad embrionaria del pollito
Para asegurar la eficacia de este ensayo, la cuenta debe colocarse de manera consistente y precisa en la ubicación correcta; en este caso, la mayor parte distal del tercer interdigit debajo de la cresta ectodérmica apical AER (Figura 1A). Este posicionamiento permite que la molécula en cuestión se propague por igual por todo el tejido interdigital. Además, la zona debajo del AER contiene células indiferenciadas que responden fácilmente al tratamiento. Para evaluar los efectos sobre la diferenciación celular, los embriones pueden teñirse con azul alciano y rojo alizarín para evidenciar la formación de elementos esqueléticos (Figura 1B). El ensayo de perla empapada también es adecuado para evaluar la muerte celular con rojo neutro (Figura 1C) y la regulación génica por hibridación in situ (Figura 1D). La barra de escala se establece en 250 μm.
Figura 1: Implantación de perlas en el tejido interdigital de la extremidad del pollito.( A) La ubicación correcta para la cuenta empapada debajo del AER en una extremidad posterior de 28 HH. (B) La tinción esquelética azul alciano y rojo alizarín evidencia la formación de un dedo ectópico inducido 4 días después de implantar una cuenta empapada de TGF-ß1. (C) La tinción roja neutra marca la inducción de la muerte celular (punta de flecha) 24 h después de implantar una cuenta empapada de AR en el tejido interdigital en la etapa de 28 HH. (D) Hibridación in situ de Sox9 4 h después de implantar una cuenta empapada de TGF-ß1. La barra de escala se establece en 250 μm. Las imágenes mostradas en B y C fueron tomadas de Díaz-Hernández et al.23,24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La principal ventaja de la herramienta experimental detallada en este protocolo es poder controlar el tiempo y la ubicación de la exposición a las perlas empapadas en una molécula experimental determinada. La combinación del posicionamiento correcto con un tiempo de desarrollo preciso proporciona enormes posibilidades para estudiar los procesos de diferenciación celular. La realización de estos experimentos en tejido indiferenciado permite investigar los primeros eventos cruciales en el linaje celular. Por ejemplo, la colocación de una cuenta empapada de TGFß en el tejido interdigital de las extremidades embrionarias 28 HH da como resultado la formación de un dedo ectópico en el que se desencadena una cascada molecular que induce la expresión genética del maestro gen Sox925. Sorprendentemente, el tejido del cartílago inducido también se organiza en un dedo con formación de falange.
Curiosamente, la AR desencadena la muerte celular en la misma región interdigital al regular la expresión génica de las proteínas morfogenéticas óseas que dirigen el destino celular de las células indiferenciadas hacia la muerte celular10. Por lo tanto, la diferenciación celular, la muerte celular, la morfogénesis y el patrón pueden investigarse simultáneamente en la misma región de un embrión y adaptarse a cualquier región y vía genética de interés 8,9.
Los elementos cruciales para el éxito de este protocolo incluyen nunca dejar que las cuentas empapadas se sequen (es decir, siempre deben permanecer húmedas). Además, la selección de las perlas apropiadas es esencial: las perlas de Affi-Gel y heparina son para proteínas, mientras que AG1-X2 son para productos químicos disueltos en solventes orgánicos. Otro punto crítico es la concentración de la molécula contenida en la solución utilizada para remojar las perlas, que generalmente es 1000 veces más concentrada de lo que se usaría para estudios in vitro . Sin embargo, un inconveniente de este método es que se desconoce la concentración final de moléculas liberadas de las perlas empapadas, así como la velocidad de liberación. En el protocolo se menciona que las cuentas de 100 μm de diámetro es más conveniente para su uso. Considere esto cuando las extremidades son manipuladas. Lo más importante es que el diámetro de las perlas debe seleccionarse de acuerdo con la zona de implantación y mantenerse constantemente en cada embrión. Sin embargo, una ligera variación en el tamaño de la perla entre los experimentos no es probable que afecte los resultados.
En conclusión, el potencial del ensayo de cuentas empapadas descrito aquí depende solo de la imaginación del investigador. Este protocolo se puede aplicar a cualquier animal experimental, cultivo celular o modelo de cultivo organotípico, incluidos los organoides. Además, este protocolo es una herramienta educativa útil y directa para enseñar a los estudiantes conceptos básicos de biología del desarrollo y habilidades técnicas mediante la práctica de esta manipulación experimental en las clases de biología del desarrollo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [números de subvención IN211117 e IN213314] y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [número de subvención 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] otorgado a JC-M. JC M-L recibió una beca postdoctoral del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887). Los autores agradecen la ayuda del Lic. Lucía Brito del Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM en la preparación de referencias de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
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