Summary
シャーガス病の原因物質である トリパノソーマ・クルジの3つのライフサイクル段階におけるβ-ガラクトシダーゼ活性を測定するハイスループット比色アッセイについて述べる。このアッセイは、トリパノサイド化合物を容易、迅速、かつ再現性のある方法で同定するために使用することができる。
Abstract
トリパノソーマ・クルジ は、ラテンアメリカで公衆衛生上重要な風土病であるシャーガス病(ChD)の原因物質であり、移住の増加により多くの非流行国にも影響を及ぼします。この病気は800万人近くが罹患しており、新規症例は年間5万人と推定されています。1960年代と70年代には、ChD治療のための2つの薬物が導入されました:ニフルチモックスとベンズニダゾール(BZN)。どちらも新生児および疾患の急性期には有効であるが、慢性期には有効ではなく、それらの使用は重要な副作用と関連している。これらの事実は、 T. cruziに対する新薬の探索を強化する緊急の必要性を強調しています。
T. cruzi は、ReduviidaeおよびHemiptera科の血道昆虫ベクターを介して伝達される。哺乳類宿主に入ると、非鞭毛状アマスチゴート型として細胞内で増殖し、血流非複製性感染型であるトリポマスチゴテに分化する。昆虫ベクターの内部では、トリポマスチゴテスはエピマスティゴット段階に変化し、二元核分裂によって増殖する。
本論文では、基質であるクロロフェノールレッドβ-D-ガラクトピラノシド(CPRG)を用いて寄生虫溶解により培養物中に放出される細胞質β-ガラクトシダーゼの活性を測定することに基づくアッセイについて述べる。このために、 T. cruzi Dm28c株にβ-ガラクトシダーゼ過剰発現プラスミドをトランスフェクトし、エピマスチゴテ、トリポマスチゴテ、およびアマスチゴーテの段階における インビトロ 薬理学的スクリーニングに使用した。また、参照薬ベンズニダゾールを用いて、培養エピマスチゴット、アマスチゴットに感染したVero細胞、培養細胞から放出されるトリポマスチゴットの酵素活性を測定する方法についても説明します。この比色アッセイは簡単に実施でき、ハイスループット形式にスケーリングし、他の T. cruzi 株に適用することができます。
Introduction
シャーガス病(ChD)、またはアメリカのトリパノソーマ症は、鞭毛原生動物、トリパノソーマクルジ(T. cruzi)によって引き起こされる寄生虫病です。ChDは、通常診断されていない無症候性または寡占症候性の急性期から始まり、生涯にわたる慢性期が続く。慢性化では、患者の〜30%が感染後数十年後、心筋症、巨消化症候群、またはその両方を含むさまざまな衰弱状態を示し、死亡率は0.2%から20%の範囲である1,2,3。無症候性の慢性患者は、臨床的徴候を有さないかもしれないが、生涯を通じて血清陽性のままである。
推定によると、世界中で約700万人が感染しており、そのほとんどはChDが風土病であるラテンアメリカから来ています。これらの国々では、 T. cruzi は主に感染した血液を吸うトリアトミンバグ(ベクター媒介性伝染)を介して伝染し、寄生虫を含むトリトミン糞便で汚染された食物の摂取による経口伝染によってはそれほど頻繁ではない2。さらに、寄生虫は、シャーガシックな母親から新生児への胎盤を介して、輸血を介して、または臓器移植中に伝達され得る。感染およびヒト移動を獲得するこれらのベクターに依存しない方法は、北米、ヨーロッパ、および一部のアフリカ、東地中海、および西太平洋諸国での症例数の増加によって証明され、この疾患の世界的な広がりに貢献しています4。ChDは、ベクター媒介性伝播が貧困と密接に関連しており、特にラテンアメリカの低所得国では主要な公衆衛生問題であるため、無視された疾患と考えられています。利用可能な治療法はありますが、ラテンアメリカのChDによる死亡率はマラリアを含む寄生虫病の中で最も高いです2。
1960年代後半から1970年代初頭に導入されたChD治療のための2つの登録薬があります:ニフルチモックスとベンズニダゾール5。両方の薬物は、成人、小児、および先天的に感染した新生児、ならびに治癒が通常達成される慢性感染を有する小児における疾患の急性期に有効である。しかし、時間内に治療を受けるのに十分な早期に診断されるのはごくわずかです。最新の臨床試験によると、両方の薬物は成人に重要な制限があり、慢性疾患患者の症状を軽減するのに効果がありません。したがって、この段階での使用は議論の余地があります。他の欠点は、必要な治療期間の延長(60〜90日)および観察される頻繁で重度の有害作用であり、感染者の割合で治療の中止につながる6,7。ChD患者の10%未満が診断を受けており、多くの罹患者が医療へのアクセスがない、またはほとんどない農村部に住んでいるため、治療を受けることができる人はさらに少ないと推定されています8。これらの事実は、特に慢性期において、より効率的で安全で、現場に適用可能な治療を可能にするために、T. cruziに対する新薬を見つける緊急の必要性を強調している。これに関して、より効果的な化合物の開発における別の課題は、インビトロおよびインビボでの薬物有効性を評価するためのシステムの限界である9。
潜在的な薬物標的の同定のためのケミカルバイオロジーおよびゲノムアプローチは、キネトプラスチド寄生虫において使用されてきたが、 T. cruzi において利用可能なゲノムツールは、 T. brucei または Leishmaniaとは対照的に限られている。したがって、トリパノサイド活性を有する化合物のスクリーニングは、ChDに対する新しい化学療法薬候補の探索において依然として最も使用されるアプローチであり、通常、 T. cruzi における創薬は、エピマスチゴート段階に対する in vitroアッセイにおける 新薬の効果を試験することから始めなければならない。何十年もの間、 T. cruzi に対する候補化合物の阻害効果を測定する唯一の方法は、手作業による顕微鏡計数であり、これは手間がかかり、時間がかかり、オペレータに依存していました。さらに、このアプローチは、少数の化合物をアッセイするのには適しているが、大規模な化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニングには受け入れられない。今日、多くの研究は、 インビトロでアッセイされる異なる起源からの膨大な数の化合物の分析から始まり、寄生虫の成長を阻害する能力をテストする。比色法と蛍光法の両方が開発され、これらのアッセイのスループットを向上させ、スクリーニングの客観性を向上させ、プロセス全体の退屈さを軽減します9。
最も広く使用されている比色法の1つは、Bucknetおよび共同研究者10によって最初に記載されたトランスフェクト寄生虫のβ−ガラクトシダーゼ活性に基づくものである。組換え寄生虫によって発現されるβ-ガラクトシダーゼ酵素は、発色基質、クロロフェノールレッドβ-D-ガラクトピラノシド(CPRG)、クロロフェノールレッドを加水分解し、マイクロプレート分光光度計を用いて比色法で容易に測定することができる。したがって、種々の化合物の存在下での寄生虫増殖は、マイクロタイタープレートにおいて同時に評価および定量することができる。この方法は、寄生虫の哺乳類の段階であるエピマスチゴート形態(昆虫ベクター中に存在する)、トリポマスチゴット、および細胞内アマスチゴテスの試験薬物に適用されている。さらに、大腸菌β-ガラクトシダーゼ酵素を発現するためにpBS:CL-Neo-01/BC-X-10プラスミド(pLacZ)10を導入したいくつかの組換えT. cruzi株がすでに入手可能であり(そして新しいものを構築することができる)、同じ化合物に対して等しく振る舞わない可能性のある異なる離散型型単位(DTU)からの寄生虫の評価を可能にする10、11、12、13.この方法は、低スループットおよびハイスループットスクリーニングにおけるT. cruziに対する活性について化合物を評価するために既に首尾よく使用されている12、13。同様のアプローチは、トキソプラズマ・ゴンディイおよびリーシュマニア・メキシカーナを含む他の原生動物寄生虫においても使用されている14,15。
この論文は、β-ガラクトシダーゼを発現する寄生虫を用いて、T. cruziのすべてのライフサイクル段階に対するin vitro薬物スクリーニングのための詳細な方法を記載し、示している。ここで提示するアッセイは、DTU I13由来のT. cruzi Dm28c株をpLacZプラスミド(Dm28c/pLacZ)でトランスフェクションすることによって得られたβ-ガラクトシダーゼ発現T. cruzi株を用いて実施された。さらに、同じプロトコルを他の株に容易に適合させて、化合物間およびT. cruzi株またはDTU間の性能を比較することができます。
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Protocol
注:実験計画全体の概要を 図1に示します。
図1:比色反応の基質としてCPRGを用いたトリパノソーマ・クルジDm28c/pLacZ株のインビトロスクリーニングアッセイの概要。アッセイは、寄生虫を播種し(1)、BZNと共にインキュベートし(2および3)、次いで比色基質を添加する(4)ことからなる。寄生虫が溶解すると、β-ガラクトシダーゼが放出され、CPRGをクロロフェノールレッドに切断する。この色の変化は、分光光度法で測定することができます(5)。データは、BZNの半阻害濃度(IC50)を得るために統計解析ソフトウェアで分析することができる。略語:CPRG=クロロフェノールレッドβ-D-ガラクトピラノシド;BZN = ベンズニダゾール。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
1. 原液の調製
- 培地および溶液の調製
- ヘミン溶液(補足表S1)
- レシピで与えられた順序ですべての成分を50mL遠沈管に加え、数回の反転によって均質化する。
- 0.22 μmのフィルターでろ過して滅菌します。
- 1.5 mLの微量遠心チューブに1 mLのアリコートを調製し、使用時まで-80°Cに保ちます。
- 肝臓注入トリプトース(LIT)培地(補足表S1)
- すべての成分を秤量し、少なくとも700mLの蒸留水を含む1Lビーカー中で室温で均質化するために攪拌する。
- pHを7.2に調整し、蒸留水を入れた1 Lメスシリンダーで容量を900 mLに補充します。ろ過またはオートクレーブ(121°Cで20分間)で滅菌します。
- 100 mLのウシ胎児血清(FCS)、(10%FCS、56°Cで45分間滅菌および熱不活化)、20mLの40%滅菌グルコース溶液(オートクレーブにより滅菌、121°Cで20分間)、および5mLのヘミン溶液(最終濃度5μM)を900mLのLIT培地に添加して培地を補充する。
- ダルベッコの改良イーグル培地(DMEM)を、製造元の指示に従って粉末から調製します。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(補足表S1)
- 1Lビーカー中で室温で溶液を撹拌することによってすべての固体成分を溶解する。
- pHを7.2に調整し、蒸留水で1Lのメスシリンダーで1Lまで水平にし、ろ過またはオートクレーブ(121°C、20分)で滅菌します。
- ヘミン溶液(補足表S1)
- ベンズニダゾール(BZN)原液および希釈液
注:この作業で使用したBZN濃度の範囲は2.5〜80μMであった。- 13mgの薬物を50μLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解して1M BZNの原液を調製する。無菌条件下で、この 1 M BZN ストック溶液から、アッセイするウェル数に十分な最終容量で最終所望の濃度の 2 倍の段階希釈液 (2x 溶液) を調製します。
注: 1 ウェルあたり 100 μL を 10 ~ 20% 超過で計算します。BZN原液およびすべてのBZN希釈液は、培地中の薬物の溶解度が低いため、アッセイに使用する直前に調製しなければならない。 - 160、80、40、20、10、および 5 μM の 2x BZN 希釈液を調製します。
- 1 M BZN 原液を 100 倍希釈 (1 M BZN + 990 μL 培地の 10 μL) で希釈し 、T. cruzi の各ライフサイクルステージに使用する適切な培地で 10 mM 溶液を得た。懸濁液を均質化するために連続的に混合する。
- 10 mM BZN溶液を希釈して、適切な培地で320 μM BZNを調製する:32 μLの10 mM BZN+968 μLの培地。懸濁液を均質化するために連続的に混合する。
- 320 μM BZNを2倍に希釈し、160 μMの濃度(500 μLの320 μM BZN+500 μLの培地)を得た。懸濁液を均質化するために連続的に混合する。得られた各溶液についてこの2倍希釈を繰り返し、80、40、20、10、および5μMの溶液を得た。
- DMSOを未処理対照(100%生存対照)として使用するための適切な培地中で1,000倍に希釈する。
注:エピマスティゴットはDMSOの100倍希釈まで許容するが、Vero細胞はDMSOの1,000倍希釈までしか許容しない。必要に応じて、50%DMSOを有する死亡対照を0%生存条件として含めることができる。
- 13mgの薬物を50μLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解して1M BZNの原液を調製する。無菌条件下で、この 1 M BZN ストック溶液から、アッセイするウェル数に十分な最終容量で最終所望の濃度の 2 倍の段階希釈液 (2x 溶液) を調製します。
- 基質溶液
- CPRGを蒸留水に1mM濃度で溶解する。96ウェルプレートの場合は、4mLの水に2.4mgのCPRGを加える。
注:CPRG溶液はアッセイの直前に調製する必要があります。
- CPRGを蒸留水に1mM濃度で溶解する。96ウェルプレートの場合は、4mLの水に2.4mgのCPRGを加える。
- 溶解溶液
- 1x PBS中のノニオン性非変性洗剤2-[4-(2,4,4-トリメチルペンタン-2-イル)フェノキシ]エタノール( 材料表参照)の2.5% v/v溶液を調製する。アッセイの直前に96ウェルプレートあたり1mLの溶液を調製する。
2. 寄生虫培養の準備
- エピマスティゴート製剤
メモ: T. cruzi Dm28c/pLacZ 回線13 は、このレポート全体で使用されます。- β-ガラクトシダーゼ発現 T. cruziエピ マスティゴテスを、増殖面積25cm2の細胞培養フラスコ(T-25フラスコ)中で28 °Cで軸索的に増殖させる。終濃度200 μg/mLで10%FCS(補足表S1)および硫酸ジェネチシン(G418)を添加したLIT培地で48~72時間ごと(5mL中)継代培養することにより、培養を対数期に維持します。継代培養前にノイバウアーチャンバー内の細胞計数によって寄生虫の成長を定量化する。キャップをしっかりと閉じ、培養フラスコ(通気なし)を28°Cの垂直位置に保ちます。
メモ:G418は、pLacZプラスミドの選択とメンテナンスを保証します。対数期培養物のエピマスチゴート濃度は、Dm28c/pLacZラインに対して1~5×107 個の寄生虫/mLである。 - G418抗生物質を添加したLIT中の対数期培養物から2×105 エピマスティゴット/ mLの懸濁液を調製する。96ウェルマイクロプレートに1ウェルあたり100 μLのエピマスチゴート懸濁液(100 μLのLIT中に20,000エピマスチゴット)を分注し、培地で1ウェルあたり200 μLまで最終容量を構成します。
- β-ガラクトシダーゼ発現 T. cruziエピ マスティゴテスを、増殖面積25cm2の細胞培養フラスコ(T-25フラスコ)中で28 °Cで軸索的に増殖させる。終濃度200 μg/mLで10%FCS(補足表S1)および硫酸ジェネチシン(G418)を添加したLIT培地で48~72時間ごと(5mL中)継代培養することにより、培養を対数期に維持します。継代培養前にノイバウアーチャンバー内の細胞計数によって寄生虫の成長を定量化する。キャップをしっかりと閉じ、培養フラスコ(通気なし)を28°Cの垂直位置に保ちます。
- アマスティゴートの準備
- 老化したエピマスティゴート培養物から得られた自発的なメタサイクリックトリポマスチゴテス(このプロトコールでは7日間)を使用して、2%FCSを添加したDMEMに以前に播種した2〜105個の Vero細胞×T-25フラスコで初期感染を行う。
- ノイバウアーチャンバー内の中環式トリポマスチゴットの数を数え、2%FCSを含む5mLのDMEM中の感染多重度(MOI)10でVero細胞単層に感染させ、37°Cおよび5%CO2 で16時間インキュベートする。フラスコから培地を5mL滅菌ピペットで取り出して残りのトリポマスチゴットを洗浄し、次いで5mLの1x PBSを加えて吸引する。最後に、2%FCSで5mLのDMEMを加え、同じ条件下でインキュベートする。
- 感染したベロ細胞単層から出現するトリポマスチゴテスを使用して、2%FCSを有するDMEM中の2×105 個のベロ細胞を有するT-25フラスコで感染を維持し、毎週新しい感染ボトルを生成する。
注:5〜7日後、トリポマスチゴットが出現し始め、上清に見える。Vero細胞株はG418に耐性がないため、細胞または感染細胞に感染するために使用されるトリポマスチゴットにG418を加えないでください。
- 2% FCSを添加したDMEM中の1×105個の Vero細胞/mLの懸濁液を調製し、96ウェル組織培養プレート(1ウェルあたり10,000細胞)に1ウェルあたり100μLの懸濁液をシードする。37°Cおよび5%CO2で一晩(12〜16時間)インキュベートし、 ウェルの底への細胞接着を確実にします。
- 一晩のインキュベーション後、Vero細胞単層を100μLの滅菌1x PBSで3回すすいでください。 T. cruzi Dm28c/pLacZトリポマスチゴテス(T-25フラスコでの以前の感染から得られた、ステップ2.2.1)を、1ウェルあたり2%FCSを添加したDMEM100μL中10個のMOIで加える(ウェルあたり100,000トリポマスチゴテス)。
- プレートを37°Cおよび5%CO2で6時間インキュベートする。このインキュベーション期間の後、プレートを1x PBSで2回洗浄し、2%FCSを添加したフェノールレッドを含まないDMEMを100μL加える。
注:48時間後(感染後2日後)、細胞質内アマスチゴットが光学顕微鏡で見える。DMEMおよび他の細胞培養培地中のpH指示薬であるフェノールレッドは、CPRGの吸光度測定を妨げる可能性がある。フェノールレッドを含まないDMEMが利用できない場合は、下記のセクション3.2.1に記載されている代替手段を参照してください。
- 老化したエピマスティゴート培養物から得られた自発的なメタサイクリックトリポマスチゴテス(このプロトコールでは7日間)を使用して、2%FCSを添加したDMEMに以前に播種した2〜105個の Vero細胞×T-25フラスコで初期感染を行う。
- トリポマスチゴート製剤
- 2% FCSを添加したDMEM中の1×106個の Vero細胞/mLの懸濁液を調製し、T-25フラスコ内の5mL培地中の800,000細胞を種子とする。37°Cおよび5%CO2で一晩(12〜16時間)インキュベートし、 細胞接着を確実にします。
注: T-75 フラスコの場合、シード 2 ×106 個の細胞を最終容量 15 mL にします。 - インキュベーション後、3mLの滅菌1x PBSで2回すすいでください。 T. cruzi Dm28c/pLacZ トリポマスチゴテスを 2% FCS と共に 5 mL の DMEM に 10 個の MOI で加えます (T-25 フラスコの場合は 8 × 106 個のトリポマスチゴテス)。
注: T-75 フラスコの場合は、2% FCS を含×た 15 mL の DMEM の最終容量に 20 個または 10 個の6 個の トリポマスチゴテスを加えます。 - 37°Cおよび5%CO2で一晩(12〜16時間)インキュベートする。フラスコを3mLの1x PBSで2回洗浄し、2%FCSを添加した5mLの新鮮なDMEMを加える。37°Cおよび5%CO2 で4日間インキュベートする。
- 光学顕微鏡下で上清のトリポマスチゴットを確認してください。ノイバウアーチャンバーでそれらを数えることによってトリポマスチゴテスを定量化する。上清を15mLチューブに集め、7,000 × g で室温で10分間遠心分離する。
- 上清を捨て、ペレットを再懸濁して、2%FCSを添加したフェノールレッドを含まないDMEM中に1×106 トリポマスチゴット/ mLの濃度を得た。種子100 μLのトリポマスチゴート懸濁液(1ウェルあたり100,000トリポマスチゴット)を96ウェルプレートに入れた。
注:フェノールレッドを含まないDMEMが利用できない場合は、セクション3.2.1の以下の代替手段を参照してください。
- 2% FCSを添加したDMEM中の1×106個の Vero細胞/mLの懸濁液を調製し、T-25フラスコ内の5mL培地中の800,000細胞を種子とする。37°Cおよび5%CO2で一晩(12〜16時間)インキュベートし、 細胞接着を確実にします。
3. β-ガラクトシダーゼアッセイ
注:β-ガラクトシダーゼ活性の定量は、寄生虫の数を決定する間接的な方法として使用されます。トリパノシド化合物の存在下で増殖が阻害され、未処理の対照と比較して寄生虫の数が少なくなり、β-ガラクトシダーゼ活性が低下し、したがって吸光度が低下することが予想される。
- 寄生虫をBZNでインキュベートする。
- 96ウェルプレートのエピマスチゴート懸濁液(ステップ2.1から)、アマスチゴテス(感染後2日)(ステップ2.2)、またはトリポマスチゴテス(ステップ2.3)の100 μLに、80、40、20、10、5、および2.5 μMのBZNの最終濃度に達するために、1ウェルあたり対応する2x BZN溶液を100 μL加えます。
- エピマスチゴットを28°Cで72時間インキュベートし、トリポマスチゴットまたは感染したベロ細胞をアマスチゴットと共に37°Cおよび5%CO2で24時間インキュベートする。
注:各薬物濃度は、少なくとも3連で評価されるべきであり、DMSOに感染したベロ細胞のエピマスチゴット、トリポマスチゴット、および感染したベロ細胞の対照培養物を含むべきである(ステップ1.2.2.4を参照)。
- 比色反応
- 処理インキュベーション期間の後、感染したベロ細胞またはトリポマスチゴットがフェノールレッドを含むDMEM中にある場合は、干渉を避けるために100μLの1x PBSで培地を交換してください。100 μL の対応する培地 (または必要に応じて 1x PBS) のみを含む 3 連のブランクウェルを実行します。
注:フェリフェノールレッドを含まないLIT培地またはDMEMの場合、エピマスチゴットの培養液を除去する必要はありません。フェノールレッドを含むDMEMはまだ使用することができます。DMEM単独でブランクウェルを用意してベース吸光度を測定し、データ分析中にこの値を減算します(ステップ3.3。無色のシュナイダーの昆虫培地は、エピマスティゴテスの代替品です。 - 各ウェルに40 μLのCPRG基質溶液および10 μLの洗剤溶液を加え、各ウェルに250 μLの最終容量で終濃度200 μM CPRGおよび0.1%洗剤を得た。
注:CPRG溶液と洗剤は、ウェルあたり50μLの最終容量で一緒に添加することができます。 - 37°Cで2時間インキュベートし、マイクロプレート分光光度計で595nmの吸光度を測定します。
注:予想される色の変化は、β-ガラクトシダーゼ酵素切断時の黄色から赤褐色です(図2A)。インキュベーション時間は最大4時間まで延長することができ、クロロフェノールレッドの吸光度スペクトルは、同様のカーブフィッティングで570〜595nmの間で読み取ることができます(補足図S1A、B)。CPRG基質の存在下で最大24時間のインキュベーションは、同様のカーブフィッティングを示した(補足図S1C)。- モノクロメータセレクタを備えたマイクロプレート分光光度計で、機器ソフトウェアで新しいプロトコルを作成します(補足図S2)。
- 検出方法として [吸光度 ] をクリック|読み取りタイプのエンドポイント |わかりました(補足図S2A)。 読み取りステップを追加し、選択した波長を入力して、「 OK」(補足図S2B)をクリックします。
- プレートレイアウトセクションで、読み取るウェルにマークを付け、[OK]をクリックします(補足図S2C)。プレートを読み取るには、プレートをトレイに挿入し、[プレートの読み取り]をクリックします。値が画面に表示されるのを待ち (補足図 S2D)、スプレッドシートにエクスポートして結果を分析します。
- 処理インキュベーション期間の後、感染したベロ細胞またはトリポマスチゴットがフェノールレッドを含むDMEM中にある場合は、干渉を避けるために100μLの1x PBSで培地を交換してください。100 μL の対応する培地 (または必要に応じて 1x PBS) のみを含む 3 連のブランクウェルを実行します。
- データ分析および培地阻害剤濃度(IC50)計算
- LIT培地、1x PBS、またはフェノールレッドの有無にかかわらずDMEMにCPRG-洗剤溶液を加えたもののみに対応するブランク測定値を差し引く。着色化合物のトリパノイド活性を試験する場合は、使用した薬物の各濃度でLITまたはDMEMで追加のブランクコントロールの吸光度を測定し、各濃度の寄生虫で得られた吸光度値からそれらの値を差し引く。
注: 補足表S2 は、寄生虫を含まないこれらの培地とCPRG洗剤溶液を用いたこのアッセイで得られた典型的な値を示しています。CPRGを添加する前後の差異は有意であるが、寄生虫によるアッセイを妨げない(補足表S2)。 - 統計解析ソフトウェアで、BZNの濃度(μM単位)と595nmの吸光度をxy表にプロットします。BZN 濃度を対数値に変換するには、[分析] ボタンをクリックし、[変換] オプションを選択して x=log(x) オプション|使用して x 値を変換し、[OK] ボタンをクリックします。
- 統計解析ソフトからIC50 値を取得する。
注:IC50 は、未処理の対照と比較して寄生虫の成長を50%減少させる薬物濃度として定義され、曲線に適合するシグモイド関数の変曲点として計算されます。- 統計分析ソフトウェアで、[分析]ボタンをクリックし、xy分析リストで[非線形回帰(カーブフィット)]を選択して、[OK]をクリックします。
- [パラメータ]ウィンドウのモデルタブで、組み込み方程式の線量反応 - 阻害グループで、オプション線量反応法を選択します:log(阻害剤)対応答 - 可変傾き(4つのパラメータ)。他のすべてのタブはデフォルト値のままにします。「OK」をクリックします。
- 統計解析ソフトウェアの結果セクションをクリックして、IC50値、SD、および適合度を見つけます。
- グラフセクションをクリックすると、薬物の対数濃度対吸光度値のxyグラフが見つかります。 カーブフィットを探すと、別の色でグラフ化されます。
メモ:無料のオンラインIC50 計算ツールは、https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator で見つけることができます。
- LIT培地、1x PBS、またはフェノールレッドの有無にかかわらずDMEMにCPRG-洗剤溶液を加えたもののみに対応するブランク測定値を差し引く。着色化合物のトリパノイド活性を試験する場合は、使用した薬物の各濃度でLITまたはDMEMで追加のブランクコントロールの吸光度を測定し、各濃度の寄生虫で得られた吸光度値からそれらの値を差し引く。
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Representative Results
上述のプロトコールに従って、β-ガラクトシダーゼ発現Dm28cエピマスチゴットを、6濃度のBZN(2.5、5、10、20、40、80μM)(または目的の化合物)と共に72時間インキュベートした。この期間の後、CPRG試薬を洗剤と共に添加し、細胞を溶解し、β-ガラクトシダーゼを放出する。CPRGは、β-ガラクトシダーゼによって切断されてクロロフェノール赤色を生成し、黄色から赤みを帯びた色に変化する(図2A)。クロロフェノールレッドは、2時間後にマイクロプレートリーダーで595nmの吸光度を読み取ることにより測定した。XY表を、BZNの対数濃度と595nmでの吸光度でプロットした。プロットは非線形回帰を使用して適合しました(図2B)。この特定の実験において、エピマスチゴテスについて得られたIC50は、文献(表I)16、17から得られたものと同様±、20.59 1.075 μMであった。トリポマスチゴットおよびアマスチゴットについてこの方法を用いた代表的な結果は、以前に13に記載されている。
図2:エピマスチゴート形態Dm28cに対するベンズニダゾールのIC50 値の計算。 (a)CPRGを添加する前(1)、CPRGおよび洗剤の初期添加後(2)、およびCPRGおよび洗剤とのインキュベーション後(3)に異なるBZN濃度(2.5、5、10、20、40、および80μM)で処理したエピマスチゴットを有する96ウェルプレート。(B) Dm28c/pLacZエピマスティゴットの595nmにおけるBZN対吸光度(OD)の対数濃度のXYプロット。プロットは、非線形回帰を使用して適合し、IC50 値を推定しました。各値は、6つの独立した生物学的複製物の平均および標準偏差(エラーバー)を表す。連続する青い線はカーブフィットを表します。略語:CPRG=クロロフェノールレッドβ-D-ガラクトピラノシド;BZN = ベンズニダゾール;OD = 光学密度;C = コントロール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| BZNIC50(μM)発現β-ガラクトシダーゼを発現するDm28cを用いて算出 | 文献に報告されているBZN IC50( μM) | |
| エピマスティゴテス | 17.08 から 20.59 | 11 から 18.72 |
| アマスティゴテス | 2.31 から 3.92 | 1.66 から 4.39 |
| トリポマスチゴテス | 27.07 から 44.74 | 24.68 から 50.72 |
表1:文献17、18で報告されたIC50と比較して、このプロトコルを用いてエピマスチゴット、トリポマスチゴット、およびアマスチゴットについて得られたIC50値の範囲。
補足図S1:吸光度を読み取るためのマイクロプレートリーダーソフトウェアのセットアップ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:異なる時点でのCPRGとのインキュベーション後のトリパノソーマ・クルジのDm28c/pLacZ系統からのエピマスチゴットを用いたβ-ガラクトシダーゼ活性測定(570〜595nmでの光学密度)。 値は、3つの独立した反復の平均値と標準偏差として表されます。色付きの連続線はカーブフィットを表します。(A)200 μM CPRGとの2時間のインキュベーション (B)200 μM CPRGとの4時間のインキュベーション (C)異なる時点(2、4、および24時間)におけるβ-ガラクトシダーゼ活性(570nmでの光学密度)の表現。略語:CPRG=クロロフェノールレッドβ-D-ガラクトピラノシド。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表S1:LIT培地、ヘミン、およびPBSの組成および調製。 略語: LIT = 肝臓注入トリプトース;PBS = リン酸緩衝生理食塩水。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表S2:寄生虫を含まないLITおよびDMEM培地の吸光度測定値。 値は、各媒体の三連として表されます。 メディア 行には、3つの反復の平均値が含まれます。 SD 行には反復の標準偏差値が含まれます。略語: SD = 標準偏差;LIT = 肝注入トリプトース;DMEM = ダルベッコの改良イーグル培地。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この論文は、基質CPRGの存在下で、T. cruzi epimastigotes、trypomastigotes、またはアマスチゴテスに感染した細胞の膜溶解のために放出される細胞質β-ガラクトシダーゼ活性を決定することに基づくアッセイについて記載する。我々は、Bucknerと共著者ら10によって構築されたβ-ガラクトシダーゼ担持プラスミドとのトランスフェクション後に得られた安定な寄生虫株であるT. cruzi Dm28c/pLacZ寄生虫を用いた。このアッセイは、抗トリパノシド化合物12、19、20、21を探索するために用いられてきた。T. cruzi Dm28c/pLacZ株を使用してスクリーニングプロトコルを最適化しました。図 1 に要約されているように、このプロトコルには 4 つの主要なポイントがあります。1つ目は、96ウェルプレートでの寄生虫の播種です。エピマスチゴテスおよびトリポマスチゴテスを計数し、懸濁液から播種する。アマスチゴテスの場合、まずベロ細胞をシードして付着性単層を形成し、次いでトリポマスチゴテスに感染する。アマスティゴテスは48時間後に細胞内に存在する。第二に、所望の濃度で試験される薬物の希釈液を調製し、寄生虫と共にインキュベートする。最後に、第3のステップは、細胞を溶解するためにCPRGおよび洗剤を添加することを含む。CPRGは、寄生虫細胞質からのβ-ガラクトシダーゼ放出時に切断され、クロロフェノールレッドが生成され、分光光度法で測定される。第4の重要なステップは、データ分析、x-yグラフの構築、および得られた曲線のフィッティングを含み、目的の薬物のIC50値を計算する。
T. cruziのすべてのライフサイクル段階に対するin vitroアッセイは、潜在的な新薬の効果を研究するための最初のステップです。これらのアッセイでは、効果は顕微鏡的計数によって評価されますが、これは自動化が困難な時間的、主観的な手順です。比色アッセイによるこの技術の置換は、スクリーニングの客観性を向上させ、また、より少ない時間を要することを可能にする。比色プレートの読み取りは、労働集約的な手動顕微鏡計数に必要な時間とは対照的に、わずか数分しかかからず、潜在的な治療価値を持つ新しい化合物の大規模なライブラリのスクリーニングを容易にします。野生型Dm28c株と比較したβガラクトシダーゼ発現寄生虫(Dm28c/pLacZ)の全体的な類似性に関して、我々は、寄生虫は形態学的に正常であり、同様の増殖速度を有し、ライフサイクル形態内で均等に分化することを決定した。また、得られた薬物検査結果から、野生型Dm28cと微視計数により定量したDm28c/pLacZ線を比較したところ、有意差は認められなかった13。
このプロトコルの1つの制限は、着色培養培地が測定された吸光度を妨げる可能性があることである。この制限を克服するために、フェノールレッドを含まないDMEM(またはRPMI)が推奨されます。DMEMを有するブランク井戸は、このプロトコルにおいて基礎吸光度値として首尾よく使用された。もう1つの制限は、着色薬物を使用する場合の推定干渉であり、これは、化合物をブランクとして媒体を使用して、または570〜595nmの間の吸光度波長を選択して最も低い干渉を与えることによって克服することができる。CPRGは、所与の薬物の存在(着色されているかどうかにかかわらず)によって変化しないため、このアッセイは非常に堅牢です。フェノールレッドまたは着色された薬物を含む培地を使用する場合は、各条件についてブランクコントロールを実行し、寄生虫による測定から得られた吸光度値を差し引いて干渉を回避することが重要です。
T. cruzi trypomastigotesおよびToxoplasma gondiiについて報告されたCPRG溶液の濃度は、100μM10,15である。しかしながら、エピマスチゴットについて報告された最適濃度は200μM11である。このDm28c/pLacZラインでは、エピマスチゴット、トリポマスチゴット、およびアマスチゴットに200μM CPRG溶液を使用し、信頼性の高い結果を得ました。CPRGインキュベーション時間に関しては、エピマスチゴットを基質溶液と共に2時間インキュベートしたときに最良のカーブフィッティングが達成された(R2 = 0.9995)。しかし、R2は非常に類似しており(R2 = 0.9994)、β-ガラクトシダーゼ活性は4時間でウェルあたり6,250-200,000エピマスチゴット(すなわち、62,500-2,000,000エピマスチゴット/mL)の範囲で線形であった(補足図S2)。トリポマスチゴテス13については、ウェル当たり3,150-100,000トリポマスチゴテス(すなわち、31,500-1,000,000トリポマスチゴテス/mL)の線形範囲が報告された13。大きな標準偏差を観察するのを避けるためには、各ウェルに正しい量の寄生虫を播種することが重要です。体積は小さいので、播種前に寄生虫を数えるときは一貫していることが重要です。また、必要に応じて実験条件ごとに3回以上の反復を測定できた。
他の比色スクリーニングアッセイ22とは異なり、その後の操作ステップはここでは必要ではなく、アッセイの再現性および信頼性ならびにデータ収集の速度を増加させる。これは、ChD治療のための候補化合物のハイスループット薬物スクリーニングに適した簡単で迅速で信頼性の高いアッセイであり、他の T. cruzi 株に適用することができます。pLacZプラスミドは、Buckerラボからの要求に応じて入手可能であり、例えばノックアウトラインの耐性株をトランスフェクトして、異なる遺伝的背景の異なる薬物に対するラインの感受性を評価するために使用することができる。留意すべき唯一の重要な点は、ノックアウトプラスミドはpLacZとは異なる抗生物質耐性マーカーを有するべきであるということです。
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Disclosures
著者らには開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
pLacZプラスミドを提供してくれたバックナー博士に感謝します。この研究は、アルゼンチンのAgencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica、Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212)、Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]の支援を受けた。Servier Medical Artは 、図1 (https://smart.servier.com)の制作に使用されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L beaker | Schott Duran | 10005227 | |
| 10 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP211010 | |
| 5 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP010005 | |
| 96-well plates | Corning | 3599 | |
| Benznidazole | Sigma Aldrich | 419656 | N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide |
| Biosafty Cabinet | Telstar | Bio II A/P | |
| Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile | Tarson | 546021 | |
| Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile | Tarson | 546041 | |
| CO2 Incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| CPRG | Roche | 10 884308001 | Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside |
| DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Cientific | 12100046 | Powder |
| DMSO | Sintorgan | SIN-061 | Dimethylsulfoxid |
| Fetal Calf Serum | Internegocios SA | FCS FRA 500 | Sterile and heat-inactivated |
| G418 disulphate salt solution | Roche | G418-RO | stock concentration: 50 mg/mL |
| Glucose D(+) | Cicarelli | 716214 | |
| Graduated cylinder | Nalgene | 3663-1000 | |
| Hemin | Frontier Scientific | H651-9 | |
| KCl | Cicarelli | 867212 | |
| Liver Infusion | Difco | 226920 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Tarson | 500010-N | |
| Microplate Spectrophotometer | Biotek | Synergy HTX | |
| Na2HPO4 | Cicarelli | 834214 | |
| NaCl | Cicarelli | 750214 | |
| Neubauer chamber | Boeco | BOE 01 | |
| Nonidet P-40 | Antrace | NIDP40 | 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol |
| Prism | Graphpad | Statistical Analysis software | |
| Sodium Bicarbonate | Cicarelli | 929211 | NaHCO3 |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Cientific | 75004380 | |
| T-25 flasks | Corning | 430639 | |
| Tryptose | Merck | 1106760500 | |
| Vero cells | ATCC | CRL-1587 |
References
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