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Bioengineering

पेपर-आधारित टोहोल्ड स्विच डायग्नोस्टिक्स के विकास और रोगी सत्यापन के लिए डिजाइन टू कार्यान्वयन अध्ययन

Published: June 17, 2022 doi: 10.3791/63223
Automatic Translation
*1, *1,2, *1, 3,4, 1, 1, 1, 1, 1, 3,4, 2, 1,5
1Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto, 2Laboratory of Virology and Experimental Therapy (LAVITE), Department of Virology, Aggeu Magalhães Institute (IAM), Oswaldo Cruz Foundation (Fiocruz), 3Department of Biomedical Engineering, Boston University, 4Molecular Biology, Cell Biology & Biochemistry Program, Graduate School of Arts and Sciences, Boston University, 5Department of Mechanical and Industrial Engineering, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

विकेंद्रीकृत, कम लागत और उच्च क्षमता वाले निदान तक पहुंच जिसे विकेंद्रीकृत परीक्षण के लिए समुदाय में तैनात किया जा सकता है, वैश्विक स्वास्थ्य संकटों का मुकाबला करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह पांडुलिपि बताती है कि वायरल आरएनए अनुक्रमों के लिए पेपर-आधारित निदान कैसे बनाया जाए जिसे पोर्टेबल ऑप्टिकल रीडर के साथ पता लगाया जा सकता है।

Abstract

कम बोझ वाले आणविक निदान तक पहुंच जिसे परीक्षण के लिए समुदाय में तैनात किया जा सकता है, तेजी से महत्वपूर्ण है और समाजों और आर्थिक स्थिरता की भलाई के लिए सार्थक व्यापक प्रभाव है। हाल के वर्षों में तेजी से, कम लागत वाले आणविक निदान की आवश्यकता को पूरा करने के लिए कई नए इज़ोटेर्मल नैदानिक तौर-तरीके उभरे हैं। हमने मच्छर जनित जीका और चिकनगुनिया वायरस के निदान सहित टोहोल्ड स्विच-आधारित डायग्नोस्टिक्स के विकास और रोगी सत्यापन के माध्यम से इस प्रयास में योगदान दिया है, जिसने गोल्ड-स्टैंडर्ड रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-क्वांटिटेटिव पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) आधारित परख के बराबर प्रदर्शन प्रदान किया है। ये निदान विकसित करने और निर्माण करने के लिए सस्ती हैं, और उनके पास कम संसाधन वातावरण को नैदानिक क्षमता प्रदान करने की क्षमता है। यहां प्रोटोकॉल जीका वायरस का पता लगाने के लिए स्विच-आधारित परख के विकास के लिए आवश्यक सभी कदम प्रदान करता है। लेख पाठकों को चरणबद्ध नैदानिक विकास प्रक्रिया के माध्यम से ले जाता है। सबसे पहले, जीका वायरस के जीनोमिक अनुक्रम ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके उम्मीदवार स्विच के कम्प्यूटेशनल डिज़ाइन के लिए इनपुट के रूप में काम करते हैं। इसके बाद, सिंथेटिक आरएनए अनुक्रमों के साथ अनुभवजन्य स्क्रीनिंग और नैदानिक संवेदनशीलता के अनुकूलन के लिए सेंसर की असेंबली दिखाई गई है। एक बार पूरा होने के बाद, सत्यापन आरटी-क्यूपीसीआर के समानांतर रोगी के नमूनों के साथ किया जाता है, और एक उद्देश्य-निर्मित ऑप्टिकल रीडर, प्लम। यह काम मानव स्वास्थ्य, कृषि और पर्यावरण निगरानी में अनुप्रयोगों के लिए कम लागत वाले टोहोल्ड स्विच-आधारित सेंसर के विकास के लिए शोधकर्ताओं को एक तकनीकी रोडमैप प्रदान करता है।

Introduction

आरटी-क्यूपीसीआर अपनी उत्कृष्ट संवेदनशीलता और विशिष्टता के कारण नैदानिक निदान के लिए स्वर्ण मानक तकनीक बनी हुई है। हालांकि अत्यधिक मजबूत, विधि महंगे, विशेष उपकरणों और अभिकर्मकों पर निर्भर करती है जिन्हें तापमान-नियंत्रित वितरण और भंडारण की आवश्यकता होती है। यह विश्व स्तर पर गुणवत्ता निदान की पहुंच के लिए महत्वपूर्ण बाधाएं प्रस्तुत करता है, विशेष रूप से रोग के प्रकोप के समय में और उन क्षेत्रों में जहां अच्छी तरह से सुसज्जित प्रयोगशालाओं तकपहुंच सीमित है। यह ब्राजील में 2015/2016 के जीका वायरस के प्रकोप के दौरान देखा गया था। आरटी-क्यूपीसीआर परीक्षण प्रदान करने के लिए केवल पांच केंद्रीकृत प्रयोगशालाएं उपलब्ध होने के कारण, महत्वपूर्ण बाधाएं हुईं, जिससे निदान तक पहुंच सीमित हो गई। यह पेरी-शहरी सेटिंग्स में व्यक्तियों के लिए विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण था, जो प्रकोप 3,4 से अधिक गंभीर रूप से प्रभावित थे। डायग्नोस्टिक्स तक पहुंच में सुधार करने के प्रयास में, प्रोटोकॉल एक मंच दिखाता है जिसे कम-संसाधन सेटिंग्स में विकेंद्रीकृत, कम लागत और उच्च क्षमता वाले निदान प्रदान करने की क्षमता के साथ विकसित किया गया है। इसके एक भाग के रूप में, एक नैदानिक खोज पाइपलाइन स्थापित की गई थी, पेपर-आधारित सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली 5,6 के साथ इज़ोटेर्मल प्रवर्धन और सिंथेटिक आरएनए स्विच-आधारित सेंसर को युग्मित करना।

सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) सिस्टम, विशेष रूप से ई कोलाई आधारित सेल-मुक्त सिस्टम, पर्यावरण निगरानी7,8 से रोगज़नक़ निदान 5,6,9,10,11,12 तक बायोसेंसिंग अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक आकर्षक मंच है . प्रतिलेखन और अनुवाद के लिए आवश्यक घटकों को शामिल करते हुए, सीएफपीएस सिस्टम में पूरे सेल बायोसेंसर पर महत्वपूर्ण फायदे हैं। विशेष रूप से, संवेदन एक सेल की दीवार तक सीमित नहीं है और, सामान्य तौर पर, वे डिजाइन में मॉड्यूलर, बायोसेफ, सस्ती हैं, और पोर्टेबल उपयोग के लिए फ्रीज-सुखाया जा सकता है। कागज या वस्त्र जैसे सब्सट्रेट्स पर फ्रीज-ड्राई जीन सर्किट-आधारित प्रतिक्रियाओं की क्षमता, परिवहन, कमरे के तापमान5 पर दीर्घकालिक भंडारण और यहां तक कि पहनने योग्य तकनीक13 में शामिल करने में सक्षम बनाती है।

पिछले काम से पता चला है कि ई कोलाई सेल-मुक्त प्रणालियों का उपयोग कई विश्लेषणों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, पारा जैसे विषाक्त धातु, टेट्रासाइक्लिन 7,14 जैसे एंटीबायोटिक्स, अंतःस्रावी-विघटनकारी रसायन15,16, हिप्पुरिक एसिड17, रोगज़नक़ से जुड़े कोरम सेंसिंग अणु 9,18 और कोकीन 17, और गामाब्यूटिरेट (जीएचबी) 19 जैसे अवैध पदार्थ . न्यूक्लिक एसिड के अनुक्रम-विशिष्ट पहचान के लिए, रणनीतियों ने अधिकांश भाग के लिए इज़ोटेर्मल प्रवर्धन तकनीकों के साथ युग्मित स्विच-आधारित बायोसेंसर के उपयोग पर भरोसा किया है। टोहोल्ड स्विच सिंथेटिक राइबोरेग्यूलेटर हैं (जिसे बाकी पाठ में केवल 'स्विच' भी कहा जाता है) जिसमें एक हेयरपिन संरचना होती है जो राइबोसोमल बाइंडिंग साइट (आरबीएस) और स्टार्ट कोडन को अनुक्रमित करके डाउनस्ट्रीम अनुवाद को अवरुद्ध करती है। उनके लक्ष्य ट्रिगर आरएनए के साथ बातचीत पर, हेयरपिन संरचना से राहत मिलती है और एक रिपोर्टर ओपन रीडिंग फ्रेम का बाद मेंअनुवाद सक्षम होता है।

इज़ोटेर्मल प्रवर्धन का उपयोग आणविक निदान21 के रूप में भी किया जा सकता है; हालांकि, ये विधियां निरर्थक प्रवर्धन के लिए प्रवण हैं, जो विशिष्टता को कम कर सकती हैं और इस प्रकार आरटी-क्यूपीसीआर 22 से नीचे परीक्षण की सटीकता हो सकती है। यहां रिपोर्ट किए गए काम में, स्विच-आधारित सेंसर के अपस्ट्रीम इज़ोटेर्मल प्रवर्धन का उपयोग संयुक्त सिग्नल प्रवर्धन प्रदान करने के लिए किया गया था जो न्यूक्लिक एसिड (फेम्टोमोलर से एटोमोलर) का नैदानिक रूप से प्रासंगिक पता लगाने में सक्षम बनाता है। दो विधियों की यह जोड़ी दो अनुक्रम-विशिष्ट चौकियों को भी प्रदान करती है, जो संयोजन में, उच्च स्तर की विशिष्टता प्रदान करती हैं। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, पिछले काम ने जीका6, इबोला5, नोरोवायरस10 जैसे वायरस का पता लगाने के साथ-साथ रोगजनक बैक्टीरिया जैसे सी डिफिसाइल23 और एंटीबायोटिक प्रतिरोधी टाइफाइड12 का पता लगाया है। हाल ही में, कोविड-19महामारी 11,12,13 के लिए सुलभ निदान प्रदान करने के प्रयासों में सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने के लिए सेल-फ्री टोहोल्ड स्विच का प्रदर्शन किया गया है।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल जीका वायरस का पता लगाने के लिए सेल-फ्री, पेपर-आधारित सिंथेटिक टोहोल्ड स्विच परख के विकास और सत्यापन को रेखांकित करता है, सिलिको बायोसेंसर डिजाइन में, असेंबली और अनुकूलन चरणों के माध्यम से, रोगी के नमूनों के साथ क्षेत्र सत्यापन के लिए। प्रोटोकॉल जीका वायरल आरएनए के लिए विशिष्ट आरएनए टोहोल्ड स्विच-आधारित सेंसर और आइसोथर्मल प्रवर्धन प्राइमरों के सिलिको डिजाइन के साथ शुरू होता है। यद्यपि कई आइसोथर्मल प्रवर्धन विधियां मौजूद हैं, यहां प्रतिक्रिया में मौजूद वायरल आरएनए लक्ष्य की एकाग्रता को बढ़ाने के लिए न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन (एनएएसबीए) का उपयोग किया गया था, जिससे चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया गया था। व्यावहारिक रूप से, आइसोथर्मल प्रवर्धन विधियों में एक निरंतर तापमान पर काम करने का लाभ होता है, जिससे थर्मल साइकिलर्स जैसे विशेष उपकरणों की आवश्यकता समाप्त हो जाती है, जो आम तौर पर केंद्रीकृत स्थानों तक सीमित होते हैं।

इसके बाद, ओवरलैप एक्सटेंशन पीसीआर के माध्यम से रिपोर्टर कोडिंग अनुक्रमों के साथ सिंथेटिक टोहोल्ड स्विच सेंसर को इकट्ठा करने की प्रक्रिया, और सिंथेटिक आरएनए का उपयोग करके सेल-मुक्त प्रणालियों में इष्टतम प्रदर्शन के लिए सिंथेटिक टोहोल्ड स्विच सेंसर की जांच का वर्णन किया गया है। जीका वायरस सेंसर के इस सेट के लिए, हमने β-गैलेक्टोसिडेस एंजाइम को एन्कोडिंग करने वाले लैकजेड जीन का चयन किया है, जो एक रंगीन सब्सट्रेट, क्लोरोफेनॉल रेड-β-डी-गैलेक्टोपाइरानोसाइड (सीपीआरजी) को छोड़ने में सक्षम है, ताकि पीले से बैंगनी रंग में परिवर्तन हो सके जिसे आंखों द्वारा या प्लेट रीडर के साथ पता लगाया जा सकता है। एक बार शीर्ष प्रदर्शन करने वाले सिंथेटिक स्विच की पहचान हो जाने के बाद, सबसे अच्छी संवेदनशीलता प्रदान करने वाले सेटों को खोजने के लिए सिंथेटिक आरएनए का उपयोग करके संबंधित लक्ष्य अनुक्रम के न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित आइसोथर्मल प्रवर्धन के लिए प्राइमरों की स्क्रीनिंग की प्रक्रिया का वर्णन किया गया है।

अंत में, नैदानिक मंच का प्रदर्शन लैटिन अमेरिका (चित्रा 1) में साइट पर मान्य है। नैदानिक नैदानिक सटीकता निर्धारित करने के लिए, रोगियों से जीका वायरस के नमूनों का उपयोग करके पेपर-आधारित सेल-मुक्त परख की जाती है; समानांतर में तुलना के लिए एक स्वर्ण मानक आरटी-क्यूपीसीआर परख किया जाता है। कलरमेट्रिक सेल-फ्री परख की निगरानी करने के लिए, हम उन क्षेत्रों में परिणामों की ऑन-साइट मात्रा का निर्धारण सक्षम करते हैं जहां थर्मल साइकिलर्स उपलब्ध नहीं हैं। पोर्टेबल, कम लागत, उपयोगकर्ता के अनुकूल, मल्टीमॉडल (प्लम; इसके बाद पोर्टेबल प्लेट रीडर के रूप में संदर्भित) नामक हाथ से इकट्ठे प्लेट रीडर को भी यहां पेश कियागया है। प्रारंभ में सेल-मुक्त सिंथेटिक टोहोल्ड स्विच डायग्नोस्टिक्स के लिए एक साथी उपकरण के रूप में विकसित, पोर्टेबल प्लेट रीडर उच्च-थ्रूपुट तरीके से परिणामों को इनक्यूबेट करने और पढ़ने का एक सुलभ तरीका प्रदान करता है, जो उपयोगकर्ताओं के लिए एकीकृत, कंप्यूटर दृष्टि-आधारित सॉफ्टवेयर विश्लेषण प्रदान करता है।

Figure 1
चित्रा 1: पेपर-आधारित सेल-फ्री टोहोल्ड स्विच प्रतिक्रियाओं का उपयोग करके रोगी के नमूनों के परीक्षण के लिए वर्कफ़्लो। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 

Protocol

मानव प्रतिभागियों से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को नैतिक मानकों और प्रासंगिक दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया जाना है, जिसमें हेलसिंकी के विश्व चिकित्सा संघ घोषणा द्वारा स्थापित मानव विषयों से जुड़े चिकित्सा अनुसंधान के लिए नैतिक सिद्धांत शामिल हैं। इस अध्ययन को लाइसेंस प्रोटोकॉल संख्या सीएएई: 80247417.4.0000.5190 के तहत मानव अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। नैदानिक नमूनों के लिए फियोक्रूज-पीई संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा इस अध्ययन में शामिल सभी रोगियों की सूचित सहमति को माफ कर दिया गया था।

नोट: प्लम डिवाइस को बाद में 'पोर्टेबल प्लेट रीडर' के रूप में संदर्भित किया जाएगा।

1. न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन प्राइमरों का कम्प्यूटेशनल डिजाइन

  1. जीनोमिक अनुक्रम को एनसीबीआई/न्यूक्लियोटाइड ब्लास्ट 25,26 में डालकर प्रवर्धन के लिए उम्मीदवार क्षेत्रों के एक सेट की पहचान करने के लिए जीका जीनोम को स्कैन करें जो लगभग200 न्यूक्लियोटाइड (एनटी) से 300 एनटी लंबाई के हैं। संदर्भ आरएनए अनुक्रमों (refseq_rna) के खिलाफ जीनोम की तुलना करें और उन साइटों की खोज करें जो अत्यधिक संरक्षित रहते हैं और मानव जीनोम के साथ होमोलॉजी नहीं करते हैं (अन्य ब्लास्ट पैरामीटर अपरिवर्तित रहते हैं)। सिंथेटिक टोहोल्ड स्विच को डिजाइन करने के लिए कम से कम दो साइटों का चयन करें।
  2. प्रत्येक उम्मीदवार प्रवर्धन क्षेत्र के लिए आगे और रिवर्स न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन प्राइमरों के जोड़े उत्पन्न करने के लिए Deiman et al.27 के चयन मानदंडों का उपयोग करें। संक्षेप में, प्राइमरों को डिजाइन करने के लिए इन मानदंडों का पालन करें: (1) 40% -60% के बीच जीसी सामग्री; (2) 41 डिग्री सेल्सियस से ऊपर डीएनए पिघलने के तापमान के साथ लंबाई में 20 से 24 एनटी; (3) चार या अधिक समान न्यूक्लियोटाइड का कोई रन नहीं; (4) अंतिम 3 'न्यूक्लियोटाइड एक ए आधार है; (5) कम प्राइमर द्वितीयक संरचना और डिमर गठन की संभावना। प्रत्येक लक्ष्य क्षेत्र के लिए स्क्रीन 8-10 प्राइमर जोड़े (अनुशंसित)।
  3. टी7 आरएनए पोलीमरेज़ (आरएनएपी) का उपयोग करके एम्प्लिकॉन केप्रतिलेखन की अनुमति देने के लिए फॉरवर्ड प्राइमरों के 5'छोर पर टी7 प्रमोटर अनुक्रम एएटीटीसीटीएजी एजीएजीजी (टी7 प्रमोटर अनुक्रम रेखांकित) वाले उपसर्ग अनुक्रम को संलग्न करें। एक डीएनए संश्लेषण कंपनी से डीएनए ऑलिगोस के रूप में प्राइमरों का आदेश दें।

2. टोहोल्ड स्विच का कम्प्यूटेशनल डिजाइन

  1. वेबसाइट29 पर निर्देशों के आधार पर NUPACK28 संस्करण 3.2 (न्यूक्लिक एसिड डिज़ाइन सूट) स्थापित करें। प्रोग्रामिंग भाषा (अनुशंसित) के रूप में यूनिक्स ऑपरेटिंग सिस्टम और MATLAB (संख्यात्मक कंप्यूटिंग प्लेटफ़ॉर्म) का उपयोग करें।
  2. चरण 1.1 में टोहोल्ड स्विच डिजाइन के लिए रुचि के रोगज़नक़ के लिए विशिष्ट लक्ष्य अनुक्रमों (जैसे, वायरल जीनोम) की पहचान करें। चरण 1.2 में उत्पन्न न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित एम्प्लिकॉन से जीका लक्ष्य अनुक्रम चुनें।
    नोट: व्यवहार में, उपयोगकर्ताओं की आवश्यकताओं के आधार पर या तो न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन प्राइमर या सिंथेटिक टोहोल्ड स्विच को पहले डिजाइन और परीक्षण किया जा सकता है। यदि रुचि के विशेष लक्ष्य क्षेत्र पहले से ही स्थापित किए गए हैं (उदाहरण के लिए, मौजूदा प्रकाशनों या नैदानिक प्रोटोकॉल से), टोहोल्ड स्विच डिजाइन और स्क्रीनिंग पहले हो सकती है, इसके बाद न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन प्राइमरों के लिए डिजाइन और स्क्रीनिंग हो सकती है। यदि कोई स्थापित लक्ष्य क्षेत्र नहीं हैं, तो प्राइमर प्रवर्धन दक्षता के लिए चयन करते समय पसंद के लक्ष्यों को कम करने के लिए पूर्ण जीनोम के खिलाफ पहले स्क्रीन न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन प्राइमर। यदि रोगज़नक़ के लिए कई अनुक्रम उपलब्ध हैं, तो न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन प्राइमरों को डिजाइन करना सबसे अच्छा है जो अत्यधिक संरक्षित क्षेत्रों (पूरे जीनोम की जांच के बजाय) पर ध्यान केंद्रित करते हैं।
  3. डाउनलोड करें और कंप्यूटर पर आवश्यक MATLAB सॉफ़्टवेयर स्थापित करें।
  4. सॉफ्टवेयर में न्यूक्लिक एसिड डिज़ाइन सूट फ़ंक्शंस को बुलाने की अनुमति देने के लिए पर्यावरण चर सेट करें। ऐसा करने के लिए, सॉफ़्टवेयर खोलें, और उसके बाद डिफ़ॉल्ट कार्य फ़ोल्डर में कोई startup.m फ़ाइल खोलें (या बनाएँ)। इसके बाद, स्टार्टअप.एम फ़ाइल में कोड की निम्नलिखित पंक्तियों की प्रतिलिपि बनाएं और अंत में, पीएटीएच में न्यूक्लिक एसिड डिज़ाइन सूट बिनरी वाले फ़ोल्डर जोड़ें:
    Nupackinstall = '/उपयोगकर्ता/[user_name]/.../nupack3.2.2';
    setenv ('NUPACKINSTAL', NUPACKINSTALL);
    setenv ('PATH',[getenv('PATH'), sprintf (':%s/build/bin', NUPACKINSTAL)]);
  5. संख्यात्मक कंप्यूटिंग प्लेटफ़ॉर्म सॉफ़्टवेयर खोलें और डिज़ाइन सॉफ़्टवेयर फ़ोल्डर पर नेविगेट करें। https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN पर सुलभ डिज़ाइन एल्गोरिदम चलाएँ।
  6. इनपुट सबफ़ोल्डर में स्थित design_input_file.csv में लक्ष्य अनुक्रमों को इनपुट करें। इनपुट में नाम, बाहरी अनुक्रम, आंतरिक अनुक्रम, तापमान, आउटपुट नाम और आउटपुट अनुक्रम शामिल हैं जैसा कि तालिका 1 में परिभाषित किया गया है। यदि लक्ष्य के लिए अभी तक कोई प्राइमिंग साइट निर्धारित नहीं की गई है, तो आंतरिक और बाहरी अनुक्रमों को समान रखें। डिजाइन प्रक्रिया के दौरान रिपोर्टर के केवल पहले 29 एनटी पर विचार किया जाएगा। समाप्त होने पर, अद्यतन स्प्रेडशीट सहेजें और बंद करें।
    नोट: आउटपुट अनुक्रम रिपोर्टर प्रोटीन का अनुक्रम है जिसे परख (जैसे, लैकजेड) के लिए उपयोग करने की योजना बनाई गई है। आंतरिक और बाहरी अनुक्रमों को निर्दिष्ट करना यह सुनिश्चित करता है कि एल्गोरिदम सिंथेटिक टोहोल्ड स्विच उत्पन्न नहीं करेगा जो प्राइमरों में से किसी के साथ ओवरलैप होता है। यह भी सुनिश्चित करता है कि परख अपनी विशिष्टता में सुधार करने के लिए जीका जीनोम में तीन अद्वितीय साइटों को पहचानती है।
  7. डिज़ाइन फ़ंक्शन के लिए उपयोग करने के लिए पैरामीटर का चयन करें: toehold_switch_design_run (num_designs, input_file, विकल्प)। पैरामीटर मान इस प्रकार भरें:
    1. num_designs - सॉफ्टवेयर द्वारा प्रत्येक लक्ष्य आउटपुट के लिए शीर्ष डिजाइनों की संख्या। डिफ़ॉल्ट 6 है और आवश्यकतानुसार बदला जा सकता है (प्रत्येक लक्ष्य के लिए न्यूनतम छह डिज़ाइन अनुशंसित हैं)।
    2. input_file - यह पैरामीटर उस फ़ाइल का नाम निर्दिष्ट करता है जो इनपुट अनुक्रम जानकारी प्रदान करता है। डिफ़ॉल्ट मान 'design_input_file.csv' है और आवश्यकतानुसार बदला जा सकता है।
    3. निम्नलिखित विकल्पों में से चुनें - (1) श्रृंखला ए और श्रृंखला बी: टोहोल्ड स्विच का संस्करण जो कोड उत्पन्न करेगा। श्रृंखला बी टोहोल्ड स्विच उत्पन्न करने के लिए श्रृंखला बी को 1 और श्रृंखला ए को 0 पर सेट करें, जो जीका वायरस डायग्नोस्टिक6 में उपयोग किया जाने वाला प्रारूप है; (2) समानांतर: डिजाइनों की गणना करने के लिए कई कोर का उपयोग करने के लिए 1 पर सेट; अन्यथा, 0 पर सेट करें; (3) एंटीसेंस: टोहोल्ड स्विच उत्पन्न करने के लिए 1 पर सेट करें जो लक्ष्य इनपुट के एंटीसेंस अनुक्रम (यानी, रिवर्स पूरक) को संकरित करता है; अन्यथा, 0 पर सेट करें।
  8. चयनित पैरामीटर का उपयोग करके डिज़ाइन फ़ंक्शन चलाएँ: toehold_switch_design_run (num_designs, input_file, विकल्प). एल्गोरिथ्म तब रुचि के लक्ष्यों के लिए टोहोल्ड स्विच डिज़ाइन उत्पन्न करना शुरू कर देगा।
  9. डिजाइन पूरा होने पर, .csv प्रारूप स्प्रेडशीट के रूप में final_designs फ़ोल्डर में शीर्ष टोहोल्ड स्विच डिज़ाइन अनुक्रम और संबंधित लक्ष्य अनुक्रमों का पता लगाएं। एल्गोरिथ्म द्वारा उत्पन्न टोहोल्ड स्विच डीएनए अनुक्रमों में 5 'अंत में टी 7 प्रमोटर अनुक्रम और 3 ' अंत में संरक्षित 21 एनटी लिंकर अनुक्रम एएसीसीटीजीसीजीसीजीसीएएएजीएएजी शामिल होगा।
  10. परिणामी टॉप टोहोल्ड स्विच डिज़ाइन अनुक्रमों को एनसीबीआई-ब्लास्ट पर डालकर और अनुक्रम होमोलॉजी की जांच करके अन्य सामान्य वायरस के खिलाफ स्क्रीन करें। 40% होमोलॉजी या उससे कम के साथ अनुक्रम स्वीकार करें।
  11. डीएनए ऑलिगोस के रूप में टोहोल्ड स्विच हेयरपिन अनुक्रमों का आदेश दें और बाद में उन्हें रिपोर्टर जीन के साथ पूरी तरह कार्यात्मक स्विच में इकट्ठा करें। पसंद के रिपोर्टर प्रोटीन के आधार पर बाद के सेंसर असेंबली के लिए आवश्यक पीसीआर प्राइमर ऑर्डर करें।

प्राचल परिभाषा
नाम आउटपुट टोहोल्ड स्विच अनुक्रमों के वांछित नाम।
बाहरी अनुक्रम प्रवर्धन से निर्मित पूर्ण NASBA प्रतिलेख।
आंतरिक अनुक्रम प्राइमर बाइंडिंग साइटों को छोड़कर बाहरी अनुक्रम। यह बाहरी अनुक्रम से मेल खाता है लेकिन प्रतिलेख के उन हिस्सों को शामिल नहीं करता है जो आगे और पीछे प्राइमरों से जुड़ते हैं।
तापमान आरएनए संरचनाओं की गणना करने के लिए एल्गोरिदम द्वारा उपयोग किया जाने वाला तापमान।
आउटपुट का नाम आउटपुट जीन का नाम (उदाहरण के लिए lacZ, gfp)।
आउटपुट अनुक्रम आउटपुट जीन का अनुक्रम।

तालिका 1: टोहोल्ड स्विचडिज़ाइन सॉफ़्टवेयर में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक पैरामीटर की परिभाषा।

3. पीसीआर द्वारा टोहोल्ड स्विच का निर्माण

नोट: ये चरण ओवरलैप एक्सटेंशन पीसीआर द्वारा LacZ toehold स्विच के निर्माण का वर्णन करते हैं। यहां, डीएनए ऑलिगो का उपयोग फॉरवर्ड प्राइमर के रूप में किया जाता है और टी 7 टर्मिनेटर का उपयोग रिवर्स प्राइमर के रूप में किया जाता है। हम लैकजेड जीन (एडजीन: 75006) के लिए एक टेम्पलेट के रूप में पीसीओएलाड्यूट-लैकजेड प्लास्मिड का उपयोग करते हैं। संबंधित अनुक्रम वाले किसी भी अन्य डीएनए टेम्प्लेट को टेम्प्लेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, बशर्ते कि टी 7 टर्मिनेटर अंतिम निर्माण में शामिल हो।

  1. एक बार वाणिज्यिक प्रदाता से सिंथेटिक डीएनए ऑलिगोस प्राप्त हो जाने के बाद, न्यूक्लियस-मुक्त पानी में 10 μM की एकाग्रता पर सिंथेटिक डीएनए और रिवर्स प्रवर्धन प्राइमर के समाधान तैयार करें। तालिका 2 के अनुसार बर्फ पर पीसीआर ट्यूबों में प्रतिक्रियाओं को इकट्ठा करें।
    नोट: पीसीआर वॉल्यूम को आवश्यकतानुसार स्केल किया जा सकता है। एक अतिरिक्त प्लास्मिड हटाने के चरण या पृष्ठभूमि LacZ सिग्नल की आवश्यकता से बचने के लिए pCOLADuet-LacZ डीएनए टेम्पलेट की न्यूनतम मात्रा (0.1-1 ng) का उपयोग करें। उच्च डीएनए टेम्पलेट मात्रा के लिए, अवशिष्ट प्लास्मिड टेम्पलेट को हटाने के लिए डीपीएनआई प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट के साथ पीसीआर का पालन करें।
  2. तालिका 3 में सूचीबद्ध साइकिल िंग स्थितियों का पालन करते हुए, प्रतिक्रियाओं को थर्मल साइकिलर में रखें। एक अगारोस जेल पर पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण करें (चित्रा 2; पूरक प्रोटोकॉल और30 देखें)।
  3. एक स्पिन कॉलम-आधारित पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार, डीएनए को न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 15-30 μL में ले जाएं। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए की मात्रा निर्धारित करें।

घटक आयतन एकाग्रता
5X Q5 प्रतिक्रिया बफर 10 μL 1x
10 mM dNTPs 1 μL 200 μM
10 एमएम फॉरवर्ड प्राइमर (सिंथेटिक स्विच डीएनए एफडब्ल्यू) 2.5 μL 0.5 μM
10 mM रिवर्स प्राइमर (T7 टर्मिनेटर RV) 2.5 μL 0.5 μM
टेम्पलेट डीएनए (pCOLADuet-LacZ) परिवर्तनशील <1 ng
क्यू 5 उच्च-निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ 0.5 μL 0.02 U/μL
न्यूक्लियस मुक्त पानी to 50 μL -

तालिका 2: टोहोल्ड स्विच बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले पीसीआर घटक।

क़दम तापमान समय
प्रारंभिक विकृतीकरण 98 °C 30 s
35 चक्र विकृतीकरण 98 °C 10 s
एनीलिंग 60 °C 20 s
विस्तार 72 °C 1.45 मिनट
अंतिम विस्तार 72 °C 5 मिनट
पकड 4 °C -

तालिका 3: पीसीआर द्वारा टोहोल्ड स्विच के निर्माण के दौरान उपयोग की जाने वाली साइकिल चलाने की स्थिति।

4. सिंथेटिक आरएनए लक्ष्य (ट्रिगर) की तैयारी

  1. आणविक जीव विज्ञान डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, सिंथेटिक ट्रिगर आरएनए टेम्प्लेट (चरण 1.1 में चयनित) को अपस्ट्रीम टी 7 प्रमोटर अनुक्रम को शामिल करने के लिए संशोधित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि पूर्ण टेम्पलेट छोटा रहे (<200 बीपी)। ट्रिगर अनुक्रम प्राइमर को बढ़ाने के लिए आगे और रिवर्स प्राइमर डिज़ाइन करें (ऑलिगो अनुक्रमों के लिए कृपया पूरक प्रोटोकॉल देखें)।
  2. अनुक्रमों को डीएनए ऑलिगोस के रूप में क्रमबद्ध करें। एक बार प्राप्त होने के बाद, न्यूक्लियस मुक्त पानी में सिंथेटिक ट्रिगर डीएनए और प्रवर्धन प्राइमरों को 10 μM तक पुनर्गठित करें। तालिका 2 के अनुसार बर्फ पर पतली दीवार ट्यूबों में संबंधित पीसीआर को इकट्ठा करें और टेम्पलेट डीएनए के रूप में ट्रिगर डीएनए अल्ट्रामर (0.1 μM की अंतिम एकाग्रता) के 0.5 μL का उपयोग करें।
  3. प्रतिक्रियाओं को थर्मल साइकिलर में रखें और तालिका 3 में सूचीबद्ध साइकिल िंग स्थितियों का उपयोग करें। 15 सेकंड के विस्तार समय का उपयोग करें। चरण 3.3 और पूरक प्रोटोकॉल में वर्णित ट्रिगर पीसीआर उत्पादों की गुणवत्ता का आकलन करें और शुद्ध करें।
    नोट: प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए, कॉलम-शुद्ध ट्रिगर पीसीआर उत्पादों का उपयोग सीधे प्रारंभिक टोहोल्ड स्विच स्क्रीनिंग के लिए भी किया जा सकता है।

5. चयनित ट्रिगर अनुक्रमों का इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन

  1. तालिका 4 के अनुसार बर्फ पर प्रतिक्रिया घटकों को इकट्ठा करें।
  2. 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस परइनक्यूबेट आई एन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (आईवीटी) प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें, इसके बाद टेम्पलेट डीएनए को हटाने के लिए डीनेस आई उपचार किया गया। DNase I चरण के लिए, न्यूक्लियस-मुक्त पानी का 70 μL, 10x DNase I बफर का 10 μL, और DNase I (RNase-मुक्त) का 2 μL जोड़ें, और 15 मिनट के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करें। यदि तुरंत चरण 5.4 पर आगे नहीं बढ़ता है, तो 50 mM EDTA के अतिरिक्त DNase I को निष्क्रिय करें और 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी निष्क्रियता।
  3. वैकल्पिक चरण: पूरक प्रोटोकॉल में वर्णित आरएनए गुणवत्ता का आकलन करने के लिए आईवीटी उत्पादों पर पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (जैसे, यूरिया-पेज) विश्लेषण करें।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार कॉलम-आधारित आरएनए क्लीनअप किट का उपयोग करके ट्रिगर आईवीटी उत्पादों को शुद्ध करें, और फिर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री का उपयोग करके आरएनए एकाग्रता और शुद्धता की मात्रा निर्धारित करें। आरएनए की दाढ़ता और प्रतिलिपि संख्या /μL निर्धारित करने के निर्देशों के लिए पूरक प्रोटोकॉल देखें।
घटक आयतन एकाग्रता
10X प्रतिक्रिया बफर 1.5 μL 0.75x
25 mM NTP मिश्रण 6 μL 7.5 mM
टेम्पलेट ट्रिगर डीएनए X μL 1 μg
टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ मिक्स 1.5 μL -
न्यूक्लियस मुक्त पानी X μL To 20 μL

तालिका 4: चयनित ट्रिगर अनुक्रमों का इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (आईवीटी)।

6. स्विच की प्रारंभिक जांच

नोट: यह खंड सेल-मुक्त, पेपर-आधारित टोहोल्ड स्विच प्रतिक्रियाओं को सेट करने से जुड़े चरणों का वर्णन करता है, और उच्च प्रदर्शन वाले टोहोल्ड स्विच के लिए स्क्रीन कैसे करें। चरण 6.10 में उपयोग किए गए बीएसए अवरुद्ध फिल्टर पेपर को पूरक प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में पहले से तैयार किया जाना चाहिए।

  1. 1 एमएल न्यूक्लियस मुक्त पानी में 25 मिलीग्राम पाउडर को घोलकर एक सीपीआरजी स्टॉक समाधान तैयार करें। समाधान को हर समय बर्फ पर रखें और दीर्घकालिक उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. सेट अप करने के लिए प्रतिक्रियाओं की संख्या निर्धारित करें। मूल्यांकन किए गए प्रत्येक टोहोल्ड स्विच के लिए, मास्टर मिश्रण से उत्पन्न होने वाले किसी भी पृष्ठभूमि संकेत के लिए नो टेम्प्लेट कंट्रोल (कोई स्विच नहीं और कोई लक्ष्य आरएनए-अन्यथा सेल-फ्री अलोन कंट्रोल के रूप में जाना जाता है) शामिल करें। लक्ष्य आरएनए की अनुपस्थिति में पृष्ठभूमि स्विच रिसाव या ऑफ दर का आकलन करने के लिए केवल स्विच नियंत्रण शामिल करें।
  3. तालिका 5 में सूचीबद्ध मानक प्रोटोकॉल के अनुसार बर्फ पर समाधान ए, समाधान बी, आरएनएस अवरोधक और सीपीआरजी के सेल-मुक्त प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण को इकट्ठा करें।
    नोट: यहां वर्णित चरण एक मास्टर मिश्रण के लिए हैं जो 1.8 μL प्रतिक्रियाओं के तीन प्रतियों के सेट के लिए पर्याप्त होगा, जिसमें 10% मात्रा जोड़ी गई है। स्क्रीन किए गए टोहोल्ड स्विच की संख्या के आधार पर मास्टर मिक्स वॉल्यूम को आवश्यकतानुसार समायोजित किया जाना चाहिए।
  4. प्रत्येक तीन प्रतियों की सेल-मुक्त प्रतिक्रिया के लिए, मास्टर मिश्रण को एक पीसीआर ट्यूब में वितरित करें, सभी ट्यूबों को बर्फ पर रखें। सेल-मुक्त अकेले नियंत्रण के रूप में अलग रखी गई ट्यूब के लिए, न्यूक्लियस-मुक्त पानी को 5.84 μL की अंतिम मात्रा में जोड़ें, ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं, और सेंट्रीफ्यूज को संक्षेप में मिलाएं। शेष ट्यूबों के लिए, पीसीआर शुद्ध टोहोल्ड स्विच डीएनए को 33 एनएम की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।
  5. अकेले स्विच नियंत्रण के रूप में अलग रखी गई ट्यूबों के लिए, न्यूक्लियस-मुक्त पानी को 5.84 μL की अंतिम मात्रा में जोड़ें। टोहोल्ड स्विच और लक्ष्य आरएनए संयोजन का परीक्षण करने के लिए अलग रखी गई ट्यूबों के लिए, इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड लक्ष्य आरएनए को 1 μM की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। फिर, न्यूक्लियस-मुक्त पानी को 5.84 μL की अंतिम मात्रा में जोड़ें। ऊपर और नीचे पाइप करके सभी प्रतिक्रियाओं को अच्छी तरह से मिलाएं, और संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. 384-अच्छी तरह से काले, स्पष्ट तल वाली प्लेट पर प्रतिक्रिया कुओं के आसपास के कुओं में 30 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी जोड़ें। यह प्रयोग के दौरान वाष्पीकरण को कम करता है और प्रजनन क्षमता में सुधार करता है।
    नोट: पोर्टेबल प्लेट रीडर डिवाइस का उपयोग करते समय, प्लेट के ऊपर एक पीसीआर पन्नी रखें, और अपनी प्रतिक्रिया के लिए इच्छित कुओं को काटने के लिए एक सटीक चाकू का उपयोग करें, साथ ही साथ चार कोने के कुओं में से प्रत्येक। पीसीआर पन्नी पोर्टेबल प्लेट रीडर कैमरा को खाली कुओं से ओवरएक्सपोजर से रोकती है।
  7. 2 मिमी बायोप्सी पंच और चिमटी का उपयोग करके, बीएसए-अवरुद्ध फ़िल्टर पेपर डिस्क को काटें और उन्हें प्रतिक्रिया कुओं में या तो पंच निकालकर या चिमटी का उपयोग करके रखें (बीएसए-अवरुद्ध फ़िल्टर पेपर तैयार करने के लिए पूरक प्रोटोकॉल देखें)। 384-वेल प्लेट में फिल्टर पेपर डिस्क पर प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब से 1.8 μL वॉल्यूम वितरित करें, सभी नमूनों के साथ-साथ 384-वेल प्लेट को हर समय बर्फ पर रखें।
    नोट: पोर्टेबल प्लेट रीडर डिवाइस का उपयोग करते समय, 384-वेल प्लेट के चार कोनों में से प्रत्येक में 1.8 μL CPRG (0.6 mg / mL) जोड़ें। सीपीआरजी से पीला रंग छवि विश्लेषण में डिजिटल मल्टीवेल प्लेट टेम्पलेट के संरेखण के लिए पोर्टेबल प्लेट रीडर को पैटर्न पहचान प्रदान करता है। वाष्पीकरण को रोकने के लिए पीसीआर फिल्म के साथ प्लेट के कुओं को कवर करें।
  8. प्लेट को प्लेट रीडर में रखें, 130 मिनट के लिए हर मिनट 37 डिग्री सेल्सियस पर ओडी570 पढ़ें।

घटक आयतन प्रति प्रतिक्रिया अंतिम एकाग्रता
समाधान A 2.38 μL 40%
समाधान B 1.78 μL 30%
RNase अवरोधक 0.03 μL 0.5% v/v
CPRG (25 mg/mL) 0.14 μL 0.6 मिलीग्राम /
Toehold Switch X μL 33 nM
लक्ष्य आरएनए X μL 1 μM
न्यूक्लियस मुक्त पानी to 5.94 μL -
कुल मात्रा: 5.94 μL

तालिका 5: PURExpress सेल-मुक्त प्रतिलेखन-अनुवाद प्रतिक्रिया घटक।

7. उच्च प्रदर्शन वाले टोहोल्ड स्विच की पहचान करना

नोट: यह खंड वर्णन करता है कि आगे बढ़ने के लिए सबसे अच्छा प्रदर्शन करने वाले टोहोल्ड स्विच का चयन करने के लिए चरण 6 से डेटा का विश्लेषण कैसे करें।

  1. पहले पृष्ठभूमि ओडी570 अवशोषण को सामान्य करके डेटा विश्लेषण शुरू करें। ऐसा करने के लिए, उन प्रतिक्रियाओं के ओडी570 मापों को घटाएं जिनमें अन्य ओडी570 मापों से कोई स्विच या लक्ष्य आरएनए (यानी, सेल-मुक्त अकेले कुएं) नहीं हैं।
  2. तीन-बिंदु चलती औसत का उपयोग करके सामान्यीकृत डेटा को चिकना करें और प्रत्येक कुएं के न्यूनतम मूल्य को शून्य में समायोजित करें। टोहोल्ड स्विच 27 बी, 33 बी और 47 बी के लिए एकत्र किए गए सामान्यीकृत टाइम-कोर्स डेटा के उदाहरण के लिए चित्रा 3 देखें।
  3. इस संसाधित डेटा का उपयोग करके, टोहोल्ड स्विच और लक्ष्य और अकेले कुओं के बीच रंग परिवर्तन की दर (यानी, समय के साथ ओडी570 में परिवर्तन) में अंतर निर्धारित करके गुना परिवर्तन (या ऑन / ऑफ अनुपात) की गणना करें (अनुपात की गणना के लिए पूरक प्रोटोकॉल देखें; चित्र 4)।
  4. आगे के लक्षण वर्णन के लिए उच्चतम ऑन /ऑफ फोल्ड परिवर्तन वाले स्विच का चयन करें। सबसे कम फोल्ड परिवर्तन प्रदर्शित करने वाले खराब प्रदर्शन वाले टोहोल्ड स्विच को छोड़ दें।

8. न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन प्राइमर स्क्रीनिंग और संवेदनशीलता

नोट: निम्नलिखित चरणों में, पहले कार्यात्मक आइसोथर्मल प्रवर्धन प्राइमरों के लिए एक स्क्रीन की जाती है, और फिर सिंथेटिक आरएनए के प्रति μL लक्ष्य आरएनए प्रतियों की संख्या निर्धारित करके उनकी संवेदनशीलता का आकलन किया जाता है जो किसी दिए गए टोहोल्ड स्विच इज़ोटेर्मल प्रवर्धन के साथ युग्मित होने पर विश्वसनीय रूप से पता लगा सकता है। आइसोथर्मल प्रवर्धन के बाद, सफल न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन प्राइमर सेट की पहचान करने के लिए सेल-मुक्त प्रतिक्रियाएं करें। हालांकि, पहले उम्मीदवार प्राइमर सेट के पूल को संकीर्ण करने के लिए न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं पर पॉलीक्रिलामाइड या अगारोस जैल चलाना अधिक लागत प्रभावी हो सकता है। उस स्थिति में, न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन प्राइमर सेट जो उपयुक्त एम्प्लिकॉन आकार पर जेल पर एक बैंड उत्पन्न करते हैं, उन्हें बाद में सेल-मुक्त स्क्रीनिंग के लिए शॉर्टलिस्ट किया जा सकता है।

  1. न्यूक्लियस-मुक्त पानी में सभी फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर सेट का 25 μM स्टॉक समाधान बनाएं ( पूरक प्रोटोकॉल देखें)। न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं और बाद में सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं की संख्या निर्धारित करें जिन्हें स्थापित करने की आवश्यकता है। यह टोहोल्ड स्विच और संबंधित प्राइमर सेट की संख्या पर निर्भर करेगा।
    नोट: प्राइमरों की स्क्रीनिंग करते समय, प्राइमर से जुड़े गैर-विशिष्ट प्रवर्धन के कारण उत्पन्न होने वाली किसी भी पृष्ठभूमि कलाकृतियों के लिए प्रत्येक प्राइमर सेट के लिए कोई टेम्पलेट नियंत्रण शामिल करना महत्वपूर्ण है।
  2. निम्नानुसार एक 5 μL प्रतिक्रिया सेट करें (आवश्यकतानुसार इसे स्केल करें)। बर्फ पर सभी अभिकर्मकों को पिघलाएं। तालिका 6 के अनुसार प्रतिक्रिया बफर, न्यूक्लियोटाइड मिश्रण और आरएनएस अवरोधक के एक प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण को इकट्ठा करें। जब तक सफेद अवक्षेप घुलनशील न हो जाए, तब तक ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं, और फिर पीसीआर ट्यूबों में एलिकोट वितरित करें।
    1. यदि मास्टर मिश्रण न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन प्राइमरों की स्क्रीनिंग के लिए है, तो पहले मास्टर मिश्रण से प्राइमरों को बाहर करें (मास्टर मिश्रण के 2.55 μL वितरित करें)। अन्यथा, यदि प्राइमर संवेदनशीलता विश्लेषण करते हैं, तो प्राइमरों को मास्टर मिक्स में शामिल किया जा सकता है (इस मामले में 2.75 μL एलिकोट वितरित करते हैं)। विकृतीकरण और संतुलन चरणों के बाद एंजाइम मिश्रण जोड़ें।
  3. यदि स्क्रीनिंग न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन प्राइमर हैं, तो उपयुक्त ट्यूबों में आगे और पीछे प्राइमर जोड़ें। थर्मल साइकिलर पर, तालिका 7 में वर्णित इनक्यूबेशन प्रोटोकॉल सेट करें।
  4. 2 pM या लगभग 106 प्रतियां / μL पर न्यूक्लियस-मुक्त पानी या 1 μL लक्ष्य ट्रिगर आरएनए का 1 μL जोड़ें, तदनुसार ट्यूबों को लेबल करना सुनिश्चित करें। कोमल पाइपिंग द्वारा मिलाएं और संक्षेप में ट्यूबों को घुमाएं।
    नोट: प्राइमर सेट स्क्रीनिंग के लिए, लक्ष्य ट्रिगर आरएनए की एकाग्रता का उपयोग करें जो आइसोथर्मल प्रवर्धन विधि का पता लगाने की निचली सीमा पर अतिक्रमण नहीं करने के लिए पर्याप्त है, फिर भी यदि कोई प्रवर्धन नहीं होता है तो पैर की अंगुली स्विच की सक्रियता प्रदान करने के लिए पर्याप्त नहीं है।
  5. ट्यूबों को थर्मल साइकिलर में ले जाएं और इनक्यूबेशन शुरू करें। 12 मिनट के बाद, ट्यूबों को हटा दें और प्रत्येक ट्यूब में एंजाइम मिश्रण के 1.25 μL जोड़ें। ट्यूबों को ऊपर और नीचे करके मिलाएं और संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: इस बिंदु पर, ट्यूबों को कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है; हालांकि, एंजाइम मिश्रण को ट्यूबों में जोड़े जाने तक बर्फ पर रखा जाना चाहिए।
  6. ट्यूबों को थर्मल साइकलर पर वापस करें, 1 घंटे की प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए 41 डिग्री सेल्सियस होल्ड स्टेप को छोड़ दें इनक्यूबेशन।
    नोट: इनक्यूबेशन बाद, प्रतिक्रियाओं को उसी दिन प्रसंस्करण के लिए बर्फ पर रखा जा सकता है या बाद में प्रसंस्करण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज किया जा सकता है।
  7. प्राइमर प्रदर्शन का आकलन करने के लिए पेपर-आधारित सेल-फ्री टोहोल्ड स्विच प्रतिक्रियाओं को इकट्ठा करने के लिए चरण 6.2-6.7 और तालिका 8 का पालन करें। चरण 7.1-7.2 और चित्रा 3 में वर्णित डेटा का विश्लेषण करें।
    नोट: पहले उल्लिखित नियंत्रणों के अलावा, प्रतिक्रिया से उत्पन्न होने वाले किसी भी पृष्ठभूमि संकेत के लिए नकारात्मक नियंत्रण को शामिल करना भी महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, नो-एनएएसबीए प्रवर्धन नियंत्रण के रूप में लक्ष्य आरएनए के स्विच और 2 पीएम (अंतिम एकाग्रता) के साथ एक नियंत्रण भी शामिल करना महत्वपूर्ण है।
  8. संवेदनशीलता विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने के लिए उम्मीदवार प्राइमर जोड़े की पहचान करें। प्राइमर जोड़े का चयन इस आधार पर किया जाता है कि इनक्यूबेटेड प्रतिक्रिया के अतिरिक्त के बाद टोहोल्ड स्विच सक्रियण होता है या नहीं। यदि आवश्यक हो, तो प्राइमर स्क्रीन को अधिक प्राइमर संयोजनों के साथ दोहराएं।
  9. हर समय बर्फ पर आरएनए नमूने रखते हुए, न्यूक्लियस-मुक्त पानी में लक्ष्य आरएनए का निम्नलिखित सीरियल कमजोर पड़ने वाला सेट बनाएं: 104, 103, 102,10 1, और10 0 आरएनए प्रतियां / प्राइमर सेट संवेदनशीलता निर्धारित करने के लिए परिणामों के उदाहरण के लिए चित्रा 5 देखें।
    नोट: आदर्श रूप से, चयनित टोहोल्ड स्विच और प्राइमर जोड़ी को आरएनए (स्टॉक समाधान एकाग्रता) के प्रति μL कम से कम 1-100 लक्ष्य आरएनए प्रतियों का पता लगाना चाहिए।
  10. जैविक तीन प्रतियों में न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन संवेदनशीलता प्रयोग दोहराएं। यह कदम रोगी के नमूनों के साथ प्रयोगों में जाने से पहले परिणामों की प्रजनन क्षमता की पुष्टि करने का कार्य करता है।
  11. वैकल्पिक: दीर्घकालिक उपयोग के लिए और परिवहन के लिए स्विच डीएनए का एक विश्वसनीय स्रोत रखने के लिए, चयनित स्विच अनुक्रम (ओं) को किसी भी पारंपरिक क्लोनिंग विधि का उपयोग करके प्लास्मिड में क्लोन करें। इसी तरह, लक्ष्य ट्रिगर आरएनए अनुक्रम को भंडारण के लिए पसंद के प्लास्मिड में भी क्लोन किया जा सकता है।
घटक प्रति अभिक्रिया आयतन अंतिम एकाग्रता
NASBA प्रतिक्रिया बफर 1.67 μL 1x
NASBA न्यूक्लियोटाइड मिश्रण 0.833 μL 1x
25 μM फॉरवर्ड प्राइमर 0.1 μL 0.5 μM
25 μM रिवर्स प्राइमर 0.1 μL 0.5 μM
RNase अवरोधक (40 U/ 0.05 μL 0.4 U/μL
लक्ष्य आरएनए 1 μL
NASBA एंजाइम मिश्रण 1.25 μL 1x
कुल आयतन 5 μL

तालिका 6: NASBA प्रतिक्रिया घटक।

क़दम तापमान समय
विकृतीकरण 65 °C 2 मिनट
संतुलन 41 °C 10 मिनट
पकड 41 °C ∞
इनक्यूबेशन 41 °C 1 घंटे
पकड 4 °C -

तालिका 7: NASBA के लिए प्रतिक्रिया की स्थिति।

घटक आयतन प्रति प्रतिक्रिया अंतिम एकाग्रता
समाधान A 2.38 μL 40%
समाधान B 1.78 μL 30%
RNase अवरोधक 0.03 μL 0.5% v/v
CPRG (25 mg/mL) 0.14 μL 0.6 मिलीग्राम /
Toehold Switch X μL 33 nM
लक्ष्य आरएनए (यदि लागू हो) X μL 1 μM
NASBA (यदि लागू हो) 0.85 μL 1:7
न्यूक्लियस मुक्त पानी to 5.94 μL -
कुल मात्रा: 5.94 μL

तालिका 8: पेपर-आधारित सेल-मुक्त प्रतिक्रिया घटक।

9. रोगी के नमूने संग्रह और वायरल आरएनए निष्कर्षण

नोट: यह खंड रोगी के नमूने एकत्र करने और आरएनए शुद्धिकरण किट का उपयोग करके आरएनए निकालने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। नीचे दिए गए प्रोटोकॉल का उपयोग परिधीय रक्त से सीरम प्राप्त करने के लिए किया जाता है। इस अध्ययन में उपयोग किए गए नमूने ब्राजील के परनामबुको राज्य में बुखार, एक्सेंथेमा, आर्थ्राल्जिया, या अर्बोवायरस संक्रमण के अन्य संबंधित लक्षणों को पेश करने वाले रोगियों से एकत्र किए गए थे।

  1. संदिग्ध आर्बोवायरस संक्रमित रोगियों से परिधीय रक्त के नमूने एकत्र करें। एक मानक सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करके वेनिपंक्चर (संपूर्ण रक्त ट्यूब) करें। नमूना ट्यूबों को एक अनाम कोड और नमूना संग्रह की तारीख के साथ लेबल करें।
  2. 10 मिनट के लिए सीरम को 2,300 x g पर अलग करने के लिए रक्त को सेंट्रीफ्यूज करें। पिपेट का उपयोग करके, सीरम (200 μL) के एलिकोट तैयार करें जिसका उपयोग 1.5 एमएल ट्यूबों में आरएनए निष्कर्षण के लिए किया जाएगा।
    नोट: यदि नमूना संग्रह के तुरंत बाद आरएनए निष्कर्षण करना संभव नहीं है, तो सीरम नमूने डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जाने चाहिए।
  3. पिपेट 560 μL तैयार बफर एवीएल (वायरल लाइसिस बफर) जिसमें वाहक आरएनए 1.5 एमएल ट्यूब में होता है। ट्यूब में बफर एवीएल / वाहक आरएनए मिश्रण में सीरम का 140 μL जोड़ें। 15 सेकंड के लिए पल्स-भंवर द्वारा मिलाएं।
  4. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर ट्यूब के तल पर सामग्री एकत्र करने के लिए नमूने को संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें। नमूने में 560 μL इथेनॉल (96% -100%) जोड़ें और 15 सेकंड के लिए पल्स-भंवर द्वारा मिलाएं। मिश्रण के बाद, ट्यूब के निचले भाग में सामग्री एकत्र करने के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. रिम को गीला किए बिना स्पिन-कॉलम में चरण 9.4 से समाधान के 630 μL को सावधानीपूर्वक जोड़ें। इस चरण के बाद, कैप बंद करें, और 1 मिनट के लिए 6,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। स्पिन-कॉलम को एक साफ 2 एमएल संग्रह ट्यूब में रखें और छानने वाले उपयोग किए गए संग्रह ट्यूब को छोड़ दें।
  6. सावधानी से स्पिन-कॉलम खोलें और चरण 9.5 दोहराएं। सावधानी से स्पिन-कॉलम खोलें और बफर एडब्ल्यू 1 (वॉश बफर 1) के 500 μL जोड़ें। कैप बंद करें, और सेंट्रीफ्यूज 1 मिनट के लिए 6,000 x g पर। स्पिन-कॉलम को एक साफ 2 एमएल संग्रह ट्यूब में रखें और छानने वाले उपयोग किए गए संग्रह ट्यूब को छोड़ दें।
  7. सावधानी से स्पिन-कॉलम खोलें और बफर एडब्ल्यू 2 (वॉश बफर 2) के 500 μL जोड़ें। 3 मिनट के लिए 20,000 x g पर कैप और सेंट्रीफ्यूज बंद करें। स्पिन-कॉलम को एक साफ 2 एमएल संग्रह ट्यूब में रखें, और छानने वाले उपयोग किए गए संग्रह ट्यूब को छोड़ दें।
  8. अवशिष्ट बफर एडब्ल्यू 2 द्वारा संदूषण से बचने के लिए, जो डाउनस्ट्रीम एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं में समस्याएं पैदा कर सकता है, स्पिन-कॉलम को एक साफ 2 एमएल संग्रह ट्यूब में रखें और निस्पंदित के साथ उपयोग किए गए संग्रह ट्यूब को छोड़ दें। 1 मिनट के लिए 20,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  9. स्पिन-कॉलम को एक साफ 1.5 एमएल ट्यूब में रखें और छानने के साथ उपयोग किए गए संग्रह ट्यूब को छोड़ दें। सावधानी से स्पिन-कॉलम खोलें और कमरे के तापमान के बराबर बफर एवीई (क्षालन बफर) के 60 μL जोड़ें। इस चरण के बाद, टोपी को बंद करें, और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  10. 1 मिनट के लिए 6,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज। इल्यूटेड आरएनए को तब समानांतर में एनएएसबीए और आरटी-क्यूपीसीआर के लिए इनपुट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  11. निकाले गए रोगी आरएनए के 1 μL का उपयोग करके न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन और पेपर-आधारित सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं को करने के लिए चरण 8.3 से 8.11 का पालन करें, नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं को शामिल करना सुनिश्चित करें। प्रतिक्रियाओं के बाद, 384-वेल रिएक्शन प्लेट तैयार करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर पोर्टेबल प्लेट रीडर डिवाइस में परख चलाएं ( पूरक प्रोटोकॉल में विवरण देखें)।
    नोट: सुसंस्कृत जीका वायरस से निकाले गए 104 और 102 पीएफयू / एमएल की दो आरएनए सांद्रता का उपयोग नैदानिक सत्यापन के दौरान सभी प्रयोगों के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है। पहले उल्लिखित नियंत्रणों के अलावा, ट्रिगर (10 एनजी / एएल) को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल करना भी महत्वपूर्ण है।
  12. प्रत्येक प्रयोग के अंत में, प्रैटेबल प्लेट रीडर से कच्चे डेटा (.csv फ़ाइल) को ऑनलाइन एक सुरक्षित डेटाबेस में अपलोड किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, पोर्टेबल प्लेट रीडर एक रिपोर्ट उत्पन्न करता है जो दर्शाता है कि नमूने जीका वायरस के लिए सकारात्मक या नकारात्मक हैं (चित्रा 6); इनक्यूबेशन के दौरान प्राप्त सभी ग्राफ़ के उदाहरणों के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें (चित्रा 7)।
    नोट: उपयोगकर्ता यूएसबी के माध्यम से पोर्टेबल प्लेट रीडर से अपने कंप्यूटर पर फ़ाइलों को स्थानांतरित कर सकते हैं।

10. पोर्टेबल प्लेट रीडर डिवाइस

  1. पोर्टेबल प्लेट रीडर डिवाइस (चित्रा 8) का उपयोग पारंपरिक प्लेट रीडर24 के विकल्प के रूप में किया जा सकता है। प्रोटोकॉल और प्रतिनिधि परिणामों के लिए, अनुपूरक प्रोटोकॉल देखें।

11. जीका वायरस का पता लगाने के लिए आरटी-क्यूपीसीआर

नोट: यह खंड रोगी के नमूनों से जीका वायरस का पता लगाने के लिए आरटी-क्यूपीसीआर करने के चरणों को रेखांकित करता है ( पूरक प्रोटोकॉल देखें)।

  1. संदूषण से बचने के लिए, आरटी-क्यूपीसीआर घटकों को प्रवर्धन प्रक्रिया (जैसे, क्लीन-हुड) से अलग क्षेत्र में इकट्ठा करें। आरटी-क्यूपीसीआर बफर, एंजाइम, और प्राइमर / प्रोब को बर्फ या कोल्ड-ब्लॉक पर रखें। इसके बाद, तालिका 9 के अनुसार बर्फ पर 384-वेल प्लेट में प्रतिक्रियाओं को जोड़ें।
    नोट: नकारात्मक (निष्कर्षण नियंत्रण और गैर-टेम्पलेट नियंत्रण [एनटीसी]) और सकारात्मक नियंत्रण (104 पीएफयू / एमएल) सभी प्रयोगों के लिए अनुशंसित हैं।
  2. अभिकर्मकों को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ने के बाद, प्रतिक्रिया को ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं (भंवर न करें), और प्रत्येक कुएं में 6.5 μL वितरित करें। तीन प्रतियों में प्रत्येक आरएनए टेम्पलेट का 3.5 μL जोड़ें।
  3. प्लेट के शीर्ष पर एक पीसीआर फिल्म रखें। 2 मिनट के लिए 600 x g पर 384-वेल प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. तालिका 10 में उल्लिखित निम्नलिखित साइकिलिंग स्थितियों का उपयोग करके प्लेट को आरटी-क्यूपीसीआर मशीन में रखें। परिणामों का विश्लेषण करने के लिए, आरटी-क्यूपीसीआर मशीन डिजाइन और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और स्वचालित सीमा और आधार रेखा पर विचार करें (पूरक प्रोटोकॉल में विवरण देखें)।
घटक आयतन एकाग्रता
2एक्स क्वांटीनोवा प्रोब आरटी-पीसीआर मास्टर मिक्स 5 μL 1 X
100 μM फॉरवर्ड प्राइमर 0.08 μL 0.8 μM
100 μM रिवर्स प्राइमर 0.08 μL 0.8 μM
25 μM Probe 0.04 μL 0.1 μM
क्वांटीनोवा आरओएक्स संदर्भ डाई 0.05 μL 1 X
क्वांटीनोवा प्रोब आरटी मिक्स 0.1 μL 1 X
टेम्पलेट आरएनए 3.5 μL -
न्यूक्लियस मुक्त पानी to 10 μL -

तालिका 9: रोगी के नमूनों से जीका वायरस का पता लगाने के लिए रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्र-सीडीसी यूएसए प्रोटोकॉल के आधार पर जीका वायरस आरएनए को बढ़ाने के लिए आरटी-क्यूपीसीआर घटक।

क़दम तापमान समय
रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन 45 °C 15 मिनट
पीसीआर प्रारंभिक सक्रियण चरण 95 °C 5 मिनट
45 चक्र विकृतीकरण 95 °C 5 s
संयुक्त एनीलिंग/एक्सटेंशन 60 °C 45 s

तालिका 10: आरटी-क्यूपीसीआर के लिए साइकिल चलाने की स्थिति।

Representative Results

कम्प्यूटेशनल डिजाइन पाइपलाइन के बाद, पीसीआर द्वारा तीन टोहोल्ड स्विच का निर्माण किया गया था। पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 2) का उपयोग करके किया गया था। 3,000 बीपी के आसपास एक स्पष्ट बैंड की उपस्थिति, मोटे तौर पर एक टोहोल्ड स्विच के साथ युग्मित लैकजेड जीन का आकार, आमतौर पर एक सफल प्रतिक्रिया को इंगित करता है। वैकल्पिक रूप से, बैंड, एकाधिक बैंड, या गलत आकार के बैंड के बिना एक लेन, एक असफल पीसीआर को इंगित करती है। असफल पीसीआर के मामले में, प्रतिक्रिया की स्थिति और / या प्राइमर अनुक्रमों को अनुकूलित किया जाना चाहिए।

इकट्ठे किए गए टोहोल्ड स्विच को प्रत्येक सेंसर को उसके संबंधित इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड ट्रिगर आरएनए (चित्रा 3) के खिलाफ मूल्यांकन करने के लिए जांच की गई थी। जबकि सभी तीन सेंसर ने एक बढ़ी हुई ओडी570 अवशोषण प्रदर्शित की, स्विच 27 बी (चित्रा 3 ए) में सबसे तेज ऑन-रेट था। स्विच 33 बी और, कुछ हद तक, 47 बी ने लक्ष्य ट्रिगर आरएनए की अनुपस्थिति में ओडी570 अवशोषण में वृद्धि दिखाई, यह दर्शाता है कि इन स्विचों में कुछ पृष्ठभूमि गतिविधि या रिसाव होता है (चित्रा 3 बी, सी) - एक विशेषता जो उम्मीदवार सेंसर में वांछित नहीं है क्योंकि यह विशिष्टता को कम कर सकती है। उच्चतम ऑन /ऑफ सिग्नल अनुपात वाले सेंसर को अधिक स्पष्ट रूप से पहचानने के लिए, ओडी570 अवशोषण के गुना परिवर्तन की गणना की गई (पूरक सूचना अनुभाग 5 देखें) और प्लॉट किया गया (चित्रा 4)। इस विश्लेषण से, यह स्पष्ट है कि स्विच 27 बी सेंसर है जिसमें लगभग 60 के ऑन / ऑफ अनुपात के साथ सबसे अच्छा प्रदर्शन है।

शीर्ष प्रदर्शन करने वाले टोहोल्ड स्विच (27 बी) की संवेदनशीलता का मूल्यांकन तब एनएएसबीए प्रतिक्रिया के साथ युग्मित होने पर टोहोल्ड स्विच को सक्रिय करने के लिए आवश्यक सबसे कम आरएनए एकाग्रता का निर्धारण करके किया गया था। ग्राफ से पता चलता है कि शीर्ष प्रदर्शन करने वाले जीका सेंसर प्रति 1.24 अणुओं (~ 2 एएम के बराबर) के रूप में कम सांद्रता में आरएनए का पता लगा सकते हैं। चित्र 5)।

स्विच 27 बी की पहचान और सत्यापन के बाद, सेंसर सामग्री ब्राजील के परनामबुको राज्य के रेसिफ में टीम के सदस्यों को वितरित की गई थी। ब्राजील में, जीका वायरस डायग्नोस्टिक प्लेटफॉर्म की नैदानिक नैदानिक सटीकता का मूल्यांकन तुलना के लिए आरटी-क्यूपीसीआर के समानांतर जीका वायरस रोगी के नमूनों का उपयोग करके किया गया था। पेपर-आधारित जीका डायग्नोस्टिक प्लेटफॉर्म को मान्य करने के लिए, पोर्टेबल प्लेट रीडर का उपयोग किया गया था, जो पेपर-आधारित सेंसर के कलरमेट्रिक आउटपुट को इनक्यूबेट करने और पढ़ने में सक्षम है। पीले से बैंगनी रंग में परिवर्तन का उपयोग सकारात्मक नमूने की पहचान करने के लिए किया जाता है, जबकि एक नकारात्मक नमूना पीला रहता है (चित्रा 6)। पोर्टेबल प्लेट रीडर (चित्रा 8) द्वारा उत्पन्न परिणामों की कल्पना करने के लिए एक अतिरिक्त विकल्प समय के साथ प्रत्येक पेपर-आधारित प्रतिक्रिया के लिए वर्णमिति प्रतिक्रिया को प्लॉट करना है। नमूनों को तीन प्रतियों में परीक्षण किया गया था और जो दहलीज (1 पर सेट लाल रेखा) से अधिक थे, उन्हें सकारात्मक माना गया था, जबकि सीमा से नीचे के नमूनों को नकारात्मक माना गया था (चित्रा 6 और चित्रा 7)।

अंत में, जीका वायरस संक्रमण के निदान के लिए वर्तमान स्वर्ण मानक विधि के साथ जीका टोहोल्ड स्विच सेंसर के नैदानिक प्रदर्शन का मूल्यांकन और तुलना करने के लिए, सभी रोगी नमूनों का आरटी-क्यूपीसीआर के समानांतर परीक्षण किया गया था। आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा जीका वायरस का पता लगाने के लिए दो प्रतिनिधि रोगी नमूनों के प्रवर्धन प्लॉट का तीन प्रतियों में परीक्षण किया गया था (चित्रा 9)। नमूने को सकारात्मक माना जाता है जब चक्र सीमा (सीटी) मान ≤38 होता है; लाल रेखा एक सकारात्मक नमूने को इंगित करती है और नीली रेखा जीका वायरस के लिए एक नकारात्मक नमूना इंगित करती है।

Figure 2
चित्रा 2: पीसीआर उत्पादों की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन। पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण 1एक्स टीएई में 1% अगारोस जेल पर किया जाता है, जो 90 मिनट के लिए 80 वी पर चलता है। एक एकल स्पष्ट बैंड आमतौर पर एक सफल प्रतिक्रिया को इंगित करता है। लेन 1: 1 केबी डीएनए सीढ़ी; लेन 2-4: 27 बी स्विच डीएनए, 33 बी ट्रिगर डीएनए, और 47 बी ट्रिगर डीएनए, क्रमशः। बाईं ओर की संख्याएं बीपी में बैंड आकार का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: पेपर-आधारित जीका सेंसर के लिए तीन टोहोल्ड स्विच प्रोटोटाइप। तीन पेपर-आधारित आरएनए टोहोल्ड स्विच सेंसर के प्रदर्शन को 130 मिनट से अधिक के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मापा गया था। प्रत्येक ग्राफ में दो निशान होते हैं, एक केवल स्विच नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि दूसरा स्विच और ट्रिगर का प्रतिनिधित्व करता है। तीन ग्राफ ़ टोहोल्ड स्विच सेंसर 27 बी (ए), 33 बी (बी), और 47 बी (सी) का उपयोग करके प्राप्त डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं। त्रुटि पट्टियाँ तीन प्रतिकृतियों से माध्य (SEM) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: शीर्ष प्रदर्शन करने वाले सेंसर की पहचान 570 एनएम पर अवशोषण में गुना परिवर्तन की गणना करके की जाती है। फोल्ड परिवर्तन (या अधिकतम ऑन / ऑफ अनुपात) की गणना स्विच केवल नियंत्रण और स्विच प्लस ट्रिगर सीएफपीएस परख के बीच 130 मिनट पर अवशोषण (ओडी570) के अनुपात को मापकर की जाती है। त्रुटि पट्टियाँ तीन प्रतिकृतियों से SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: शीर्ष प्रदर्शन करने वाले स्विच की संवेदनशीलता का आकलन। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड जीका आरएनए को एनएएसबीए प्रतिक्रियाओं में विभाजित किया जाता है। 1 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, प्रतिक्रियाओं को 1: 7 के अनुपात में पेपर डिस्क पर सेल-फ्री पीयूआरएसप्रेस प्रतिक्रियाओं में जोड़ा गया था। 130 मिनट के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर गुना परिवर्तन प्लॉट किया जाता है। इस आंकड़े को24 से पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: पोर्टेबल प्लेट रीडर कैप्चर किए गए छवि डेटा से भरे पृष्ठ को कैप्चर करता है। यह आंकड़ा डेटा संग्रह रन के दौरान पोर्टेबल प्लेट रीडर द्वारा कैप्चर की गई अंतिम छवि की एक नमूना तस्वीर दिखाता है। मूल दिनांक/समय स्टैम्प छवि के शीर्ष पर दिखाई देता है। पीला रंग नियंत्रण या नकारात्मक प्रतिक्रियाओं को इंगित करता है, और बैंगनी रंग एक सकारात्मक प्रतिक्रिया को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: डेटा विश्लेषण मोड। बाईं ओर, उपयोगकर्ता उन डेटा सेटों का चयन करते हैं जिन्हें वे प्लॉट करना चाहते हैं; ग्राफ़ तब प्रत्येक नमूना या नियंत्रण सेट के लिए अद्वितीय रंगों के साथ दाईं ओर प्रदर्शित होते हैं। डैश्ड लाल रेखा सकारात्मक और नकारात्मक नमूने निर्धारित करने के लिए एक सीमा के रूप में कार्य करती है। सीमा से अधिक तीन प्रतियों में परीक्षण किए गए नमूने सकारात्मक माने जाते हैं, जबकि सीमा से नीचे के नमूने नकारात्मक माने जाते हैं। त्रुटि पट्टियाँ तीन प्रतिकृतियों से मानक विचलन (एसडी) का प्रतिनिधित्व करती हैं। Ctrl 1 से Ctrl 5 नियंत्रण इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्र 8. प्लम, एक पोर्टेबल प्लेट रीडर। यह पोर्टेबल प्लेट रीडर एक लैब-इन-ए-बॉक्स के रूप में कार्य करता है और कलरमेट्रिक प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट और मॉनिटर करने के लिए तापमान-नियंत्रित प्लेट रीडर के रूप में कार्य करता है। यह पोर्टेबल डिवाइस साइट पर पेपर-आधारित जीका सेंसर के मात्रात्मक और उच्च-थ्रूपुट माप प्रदान कर सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्र 9: जीका वायरस का पता लगाने के लिए तीन प्रतियों में परीक्षण किए गए दो रोगी नमूनों के प्रवर्धन का आरटी-क्यूपीसीआर प्लॉट। नमूने को सकारात्मक माना जाता है जब चक्र सीमा (सीटी) मान ≤38 होता है। डॉटेड लाल रेखा सकारात्मक और नकारात्मक नमूने निर्धारित करने के लिए एक सीमा के रूप में कार्य करती है। लाल निशान एक सकारात्मक नमूने को इंगित करता है, और नीला निशान एक नकारात्मक नमूने को इंगित करता है। RN (डेल्टा Rn) मान परीक्षण किए गए सभी नमूनों के लिए RT-QPCR उपकरण द्वारा पता लगाए गए प्रतिदीप्ति संकेत के सामान्यीकृत परिमाण का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक प्रोटोकॉल फ़ाइल. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक आंकड़े। कृपया इन आंकड़ों को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें। 

Discussion

यहां वर्णित संयुक्त पेपर-आधारित प्रणाली चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक आणविक निदान ला सकती है, प्रदर्शन के साथ जो कार्यात्मक रूप से आरटी-क्यूपीसीआर के बराबर है, आवश्यकता के बिंदु6 तक। महत्वपूर्ण रूप से, दूरस्थ सेटिंग्स के लिए, साइट पर निदान की उपलब्धता परिणामों के समय को दिनों से घंटों तक कम कर सकती है। इस दृष्टिकोण की प्रोग्रामेबिलिटी पर प्रकाश डालते हुए, वर्णित पाइपलाइन का उपयोग लगभग किसी भी रोगज़नक़ लक्ष्य का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। हमने आणविक उपकरणों को एक उद्देश्य-निर्मित पोर्टेबल प्लेट रीडर के साथ जोड़ा है, जो बैटरी ऑपरेशन (8-9 घंटे) के साथ कॉम्पैक्ट और संगत है और वितरित अनुप्रयोगों को सक्षम करने के लिए ऑनबोर्ड डेटा विश्लेषण प्रदान करता है। अन्य काम में, हमने आरटी-क्यूपीसीआर के समानांतर 268 रोगी नमूनों के साथ संयुक्त हार्डवेयर और जीका वायरस डायग्नोस्टिक प्लेटफॉर्म को मान्य किया है, और 98.5% 24 की नैदानिक सटीकता पाई है। एक साथ लिया गया, हमारा लक्ष्य शोधकर्ताओं को इस मंच के प्रौद्योगिकी हस्तांतरण को सक्षम करना है ताकि इसे समुदाय द्वारा अपूर्ण नैदानिक आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए पुनर्निर्मित और बेहतर बनाया जा सके।

इनसिलिको टोहोल्ड स्विच डिजाइन प्रक्रिया को एक पाइपलाइन में एकीकृत और स्वचालित किया गया है जिसे तीन चरणों में विभाजित किया जा सकता है। पहला चरण टोहोल्ड स्विच डिज़ाइनों का एक पूल उत्पन्न करता है जो एक न्यूक्लियोटाइड वेतन वृद्धि में लक्ष्य अनुक्रम में संकरण करता है। दूसरा चरण द्वितीयक संरचना और टोहोल्ड स्विच उपलब्धता की जांच करता है और इन-फ्रेम प्रीमैच्योर स्टॉप कोडन के साथ सेंसर को समाप्त करता है। एक स्कोरिंग फ़ंक्शन जो कई कारकों (जैसे, टोहोल्ड स्विच का दोष स्तर, टोहोल्ड स्विच उपलब्धता और लक्ष्य साइट पहुंच) पर विचार करता है, फिर समग्र स्कोर के आधार पर शीर्ष टोहोल्ड स्विच डिज़ाइन का चयन करने के लिए लागू किया जाता है। अंतिम चरण में, शीर्ष टोहोल्ड स्विच डिजाइन और उनके संबंधित लक्ष्य ट्रिगर्स के लिए अनुक्रमों की एक सूची उत्पन्न की जाती है। एनसीबीआई/प्राइमर-ब्लास्ट25 का उपयोग करके मानव ट्रांसक्रिपटम और निकटता से संबंधित वायरल जीनोम के खिलाफ विशिष्टता के लिए शीर्ष सेंसर अनुक्रमों की जांच की जानी चाहिए। जीका वायरल जीनोम में अनुक्रम संरक्षण के लिए सेंसर लक्ष्य साइटों को स्क्रीन करना भी सबसे अच्छा अभ्यास है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सेंसर व्यापक और मजबूत पहचान प्रदान करेंगे। टोहोल्ड स्विच डिज़ाइन सॉफ़्टवेयर के कई संस्करण विकसित किए गए हैं और डिज़ाइन एल्गोरिदम उपयोगकर्ताओं को दो संस्करण उत्पन्न करने की अनुमति देता है, या तो श्रृंखला ए6 या श्रृंखला बी टोहोल्ड स्विच6। इस लेख में, श्रृंखला बी टोहोल्ड स्विच डिजाइन पर ध्यान केंद्रित किया गया है।

वाणिज्यिक डीएनए संश्लेषण के बाद, टोहोल्ड स्विच को तेजी से इकट्ठा किया जा सकता है, और फिर सिंथेटिक लक्ष्य ट्रिगर अनुक्रम के खिलाफ प्रारंभिक स्क्रीन करके परीक्षण किया जा सकता है जो लक्ष्य जीनोम के छोटे क्षेत्रों (200-300 एनटी) से मेल खाता है। टोहोल्ड स्विच-आधारित सेंसर के प्रदर्शन की स्क्रीनिंग के लिए, आरएनए के रूप में लक्ष्य अनुक्रम जोड़ना आदर्श है। इस लेख में, इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड ट्रिगर आरएनए को जोड़ने के लिए आवश्यक चरणों को रेखांकित किया गया है। हालांकि, यदि उपलब्ध हो, तो पूर्ण लंबाई वाले जीनोम टेम्प्लेट जैसे कि मात्रात्मक वायरल आरएनए अर्क या वाणिज्यिक सिंथेटिक आरएनए जीनोम या मानकों का उपयोग किया जा सकता है। प्रारंभिक टोहोल्ड स्विच स्क्रीनिंग के लिए पूर्ण लंबाई वाले आरएनए जीनोम का उपयोग करना फायदेमंद है क्योंकि यह सूचित कर सकता है कि अतिरिक्त कारक, जैसे कि आरएनए माध्यमिक संरचना, सेंसर प्रदर्शन को प्रभावित करेगी या नहीं। उम्मीदवार स्विच के ऑन / ऑफ अनुपात को अनुकूलित करने के लिए, टोहोल्ड स्विच डीएनए को सेल-मुक्त प्रतिक्रिया में टाइट किया जा सकता है। यह कदम डाउनस्ट्रीम लक्षण वर्णन चरणों से उच्च प्रदर्शन वाले टोहोल्ड स्विच (फोल्ड प्रवर्धन, या उच्च ऑन / ऑफ अनुपात) की पहचान करने और लीक टोहोल्ड स्विच (लक्ष्य आरएनए की अनुपस्थिति में उच्च संकेत) को छोड़ने के लिए भी काम कर सकता है।

शीर्ष प्रदर्शन करने वाले टोहोल्ड स्विच उम्मीदवारों का पता लगाने की सीमा में सुधार करने के लिए, एनएएसबीए का उपयोग लक्षित जीका वायरल आरएनए की नैदानिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता को एक स्तर तक बढ़ाने के लिए किया जाता है जिसे टोहोल्ड स्विच6 द्वारा पता लगाया जा सकता है। नैदानिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता पर पता लगाने में सक्षम करने के लिए सर्वश्रेष्ठ एनएएसबीए प्राइमर और टोहोल्ड स्विच संयोजनों को निर्धारित करने के लिए फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर सेट के विभिन्न संयोजनों की जांच की जाती है। एक बार एक आदर्श प्राइमर सेट और टोहोल्ड स्विच संयोजन की पहचान हो जाने के बाद, परख को नैदानिक सत्यापन के लिए आगे बढ़ाया जाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि टोहोल्ड स्विच और एनएएसबीए स्क्रीनिंग चरण श्रम और संसाधन-गहन हो सकते हैं और इसलिए परीक्षण विकास अच्छी तरह से संसाधन वाले अनुसंधान साइटों के लिए सबसे उपयुक्त है। यद्यपि हमने प्रक्रिया स्वचालन लागू नहीं किया है, यह संभावना है कि यह पुनरावृत्ति डिजाइन, निर्माण और परीक्षण चक्र32 में तेजी ला सकता है। सौभाग्य से, सेंसर डिजाइन और परीक्षण से तैनाती तक का टर्नअराउंड समय उल्लेखनीय रूप से कम (एक सप्ताह से कम) हो सकता है, जिससे इस रणनीति को समय-महत्वपूर्ण स्थितियों के लिए आदर्श बनाया जा सकता है, जैसे कि महामारी का प्रकोप6.

चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक संवेदनशीलता के साथ एक बायोसेंसर विकसित होने के बाद भी, तकनीकी चुनौतियां हैं जिन्हें संबोधित करने की आवश्यकता है। चूंकि इस प्रोटोकॉल में मैन्युअल ऑपरेशन शामिल है और यह एक बहु-चरण प्रक्रिया है, इसलिए नमूनों के बीच क्रॉस संदूषण का खतरा है। हम सावधानीपूर्वक प्रयोगशाला अभ्यास के माध्यम से इस जोखिम को कम करने की पूरी कोशिश करते हैं। 268 रोगी नमूनों के हालिया नैदानिक परीक्षण में, हमें किसी भी संदूषण के मुद्दों का सामना नहीं करना पड़ा; तथापि, यह एक महत्वपूर्ण विचारहै। इसे ध्यान में रखते हुए, प्रोटोकॉल एक प्रयोगशाला परख बना हुआ है और उचित आणविक जीव विज्ञान तकनीकों की कमान के साथ एक कुशल उपयोगकर्ता की आवश्यकता होती है। तैनाती के लिए एक अतिरिक्त विचार रोगी के नमूनों से आरएनए अलगाव है। यहां हम कॉलम-आधारित न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण किट का उपयोग करके आरएनए अलगाव का वर्णन करते हैं। हालांकि, अन्य काम में, हमने कम बोझ वाले रोगी नमूना प्रसंस्करण 6 के लिए एक प्रभावी और सरल उबलते लाइसिस विधि (2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस) का प्रदर्शनकिया है। यह रणनीति आरएनए निष्कर्षण से जुड़ी लागत को लगभग समाप्त कर देती है और कॉलम-आधारित न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण किट के उपयोग से बचती है, जो कोविड-19 महामारी जैसे संकटों के दौरान कम-संसाधन सेटिंग्स या आपूर्ति श्रृंखला के मुद्दों में लॉजिस्टिक चुनौती पैदा कर सकतीहै।

जैसा कि हमने कोविड-19 महामारी के दौरान देखा है, आरटी-क्यूपीसीआर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण स्वयं एक अड़चन के रूप में काम कर सकते हैं और परीक्षण के लिए रोगी की पहुंच को सीमित कर सकते हैं। यह कारक, जो काफी हद तक वित्तीय भी है, एक केंद्रीकृत परीक्षण मोड की ओर जाता है जो नैदानिक पहुंच को सीमित कर सकता है। उदाहरण के लिए, 2015/2016 के जीका प्रकोप के दौरान, ब्राजील में केवल पांच राष्ट्रीय संदर्भ प्रयोगशालाएं उपलब्ध थीं, जिसके कारण रोगी परीक्षण में देरी हुई। पैमाने की अर्थव्यवस्थाओं के संभावित लाभ पर विचार किए बिना, पोर्टेबल प्लेट रीडर के लिए माल की वर्तमान लागत ~ $ 500 अमरीकी डालर है, जो श्रम और वाणिज्यिक मार्जिन के लिए पांच गुना बढ़ने पर भी एक किफायती साधन प्रदान करती है। यह आरटी-क्यूपीसीआर उपकरणों की तुलना में अच्छी तरह से तुलना करता है जिनकी लागत $ 15,000- $ 90,000 अमरीकी डालर34 से होती है। इसके अलावा, लैटिन अमेरिका में सेल-मुक्त परख के लिए प्रति परीक्षण अनुमानित लागत लगभग $ 5.48 अमरीकी डालर है, जबकि ब्राजील में आरटी-क्यूपीसीआर के प्रति परीक्षण की लागत जीका प्रकोप के समय ~ $ 10-11अमरीकी डालर थी। उपकरण की लागत से परे, पोर्टेबल प्लेट रीडर में एक छोटा पदचिह्न (20 सेमी3), स्वचालित विश्लेषण, इंटरनेट के माध्यम से क्लाउड पर डेटा अपलोड होता है, और बैटरी पावर पर चलाया जा सकता है। ये विशेषताएं नाटकीय रूप से संभावित सेटिंग्स का विस्तार करती हैं जहां परीक्षण तैनात किया जा सकता है और सहवर्ती रूप से रोगी आबादी का विस्तार करता है जिसे सेवा दी जा सकती है।

आज तक सबसे आम वाणिज्यिक ई कोलाई सीएफपीएस प्लेटफॉर्म एस 30 और प्योर सिस्टम37 हैं; हालांकि, निम्न और मध्यम आय वाले देशों में निदान तक पहुंच में सुधार करने में एक महत्वपूर्ण विचार इन अभिकर्मकों की सीमित घरेलू उपलब्धता है। इस चुनौती को हल करने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम स्थानीय सीएफपीएस उत्पादन का विकास है। फेडेरिकी लैब ने हाल ही में लाइसेट-आधारित सेल-फ्री सिस्टम में टोहोल्ड स्विच-आधारित सेंसर को लागू करने के लिए एक गैर-वाणिज्यिक मंच विकसित करने की दिशा में महत्वपूर्ण प्रगति की है, जो जीका वायरस आरएनए14 के साथ 2.7 एफएम एलओडी तक पहुंच गया है। न केवल यह उपलब्धि अभिकर्मकों को उपयोग के देश में बनाने की अनुमति देती है, आयात शुल्क और देरी से बचती है, बल्कि श्रम लागत भी स्थानीय दरों को बढ़ाती है और इस प्रकार समग्र लागत को काफी कम किया जा सकता है। फेडेरिकी समूह द्वारा उल्लिखित काम में, चिली में सीएफपीएस अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया (5 μL) के उत्पादन की लागत 6.9 सेंट (USD) 35,38 थी, जो लाइसेट-आधारितप्रणालियों को लागू करने के लिए दोहरी प्रोत्साहन (बेहतर रसद और लागत) प्रदान करती थी।

वितरित नैदानिक नेटवर्क में आरटी-क्यूपीसीआर-तुलनीय परीक्षण का प्लेसमेंट वर्तमान प्रथाओं पर महत्वपूर्ण लाभ ला सकता है जो केंद्रीकृत आरटी-क्यूपीसीआर सुविधाओं में नमूनों के परिवहन पर निर्भर हैं। पेरी-अर्बन सेटिंग्स में, जहां जीका के मामले केंद्रित थे, एक रोगी और नैदानिक सुविधा के बीच शारीरिक दूरी निदान को धीमा कर देती है और जोखिम को बढ़ाती है कि परिणाम नैदानिक रूप से प्रासंगिक समय पर रोगी तक नहीं पहुंचेंगे। यह हमारी आशा है कि यहां प्रस्तुत कार्य मानव स्वास्थ्य, कृषि और पर्यावरण निगरानी के लिए विकेंद्रीकृत जैव प्रौद्योगिकी और पोर्टेबल हार्डवेयर बनाने के लिए ज्ञान के हस्तांतरण के माध्यम से अनुसंधान समुदाय को सक्षम करने में योगदान दे सकता है।

Disclosures

के.पी. और ए.ए.जी. पेपर-आधारित टोहोल्ड सेंसर से संबंधित प्रौद्योगिकियों के सह-आविष्कारक हैं। वाई.जी., एस.सी., और के.पी. एलएसके टेक्नोलॉजीज, इंक के सह-संस्थापक हैं और प्लम से संबंधित प्रौद्योगिकियों के सह-आविष्कारक हैं। एम.के., के.पी. और ए.ए.जी. एन कार्टा डायग्नोस्टिक्स लिमिटेड के सह-संस्थापक हैं। अन्य लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है। पेटेंट: प्लम डिवाइस: वाईजी, एससी, और केपी पेटेंट आवेदन टोरंटो विश्वविद्यालय द्वारा दायर किया गया था और एलएसके टेक्नोलॉजीज इंक को सौंपा गया था। टोहोल्ड स्विच पेटेंट: एएजी, पीवाई, और जेजेसी "रिबोरेग्यूलेटर रचनाएं और उपयोग के तरीके", पेटेंट। WO2014074648A3 6 नवंबर, 2012 को दायर किया गया; पेपर-आधारित नैदानिक पेटेंट: के.पी. और जे.जे.सी. "पेपर-आधारित सिंथेटिक जीन नेटवर्क" अमेरिकी पेटेंट लंबित है। यूएस 15/963,831 6 दिसंबर, 2013 को दायर किया गया; जीका पेटेंट 1: केपी, एएजी, एमकेटी, डीबी, जीएल, टीएफ, और जेजेसी, "पोर्टेबल, लो-कॉस्ट वायरस डिटेक्शन एंड स्ट्रेन आइडेंटिफिकेशन प्लेटफॉर्म," यूएस प्रोविजनल पेटेंट आवेदन संख्या 62/403,778 4 अक्टूबर, 2016 को दायर; जीका पेटेंट 2: केपी, ए.ए.जी., एम.के.टी., डी.बी., जी.एल., टी.एफ., और जे.जे.सी., "पोर्टेबल, लो-कॉस्ट वायरस डिटेक्शन एंड स्ट्रेन आइडेंटिफिकेशन प्लेटफॉर्म," अमेरिकी अनंतिम पेटेंट आवेदन संख्या 62/341,221 25 मई, 2016 को दायर किया गया।

Acknowledgments

लेखक ग्रीन, पारडी और पेना प्रयोगशालाओं के सभी सदस्यों के साथ-साथ इस पांडुलिपि में प्रकट किए गए काम से संबंधित पिछली पांडुलिपियों के सभी सह-लेखकों को धन्यवाद देते हैं। एस.जे.आर.डी.एस. को फाउंडेशन फॉर साइंस एंड टेक्नोलॉजी ऑफ परनामबुको (फेसपे), ब्राजील द्वारा प्रायोजित पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था, संदर्भ संख्या आईबीपीजी-1321-2.12/18, और वर्तमान में टोरंटो विश्वविद्यालय, कनाडा द्वारा प्रायोजित पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप द्वारा समर्थित है। पीबी को फार्मेसी संकाय, टोरंटो विश्वविद्यालय से विलियम नैप बकले पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया है। एम.के. को टोरंटो विश्वविद्यालय के आंतरिक फैलोशिप नंबर पीआरएमएफ 2019-002 में प्रेसिजन मेडिसिन इनिशिएटिव (पीआरआईएमई) द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को कनाडा रिसर्च चेयर्स प्रोग्राम (फाइल 950-231075 और 950-233107), टोरंटो विश्वविद्यालय के प्रमुख अनुसंधान परियोजना प्रबंधन कोष, सीआईएचआर फाउंडेशन अनुदान कार्यक्रम (201610एफडीएन-375469) और एलपी, एएजी और केपी से केपी को सीआईएचआर / आईडीआरसी टीम ग्रांट के माध्यम से धन द्वारा समर्थित किया गया था। 149783), साथ ही कनाडा के अंतर्राष्ट्रीय विकास अनुसंधान केंद्र (अनुदान 109434-001) से कनाडाई 2019 नॉवल कोरोनावायरस (सीओवीआईडी -19) रैपिड रिसर्च फंडिंग अपॉर्च्युनिटी के माध्यम से केपी को धन द्वारा। इस काम को एरिजोना बायोमेडिकल रिसर्च कमीशन न्यू इन्वेस्टिगेटर अवार्ड (एडीएचएस 16-162400), गेट्स फाउंडेशन (ओपीपी 1160667), एनआईएच निदेशक का नया इनोवेटर अवार्ड (1डीपी2जीएम126892), एनआईएच आर 21 पुरस्कार (1आर21एआई136571-01ए1) से ए.ए.जी. चित्रा 1 केपी को अकादमिक लाइसेंस के तहत Biorender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384 well plate covers - aluminum Sarstedt 95.1995 Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader
384 well plate covers - transparent Sarstedt 95.1994 Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader
384 well plates VWR CA11006-180 2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification
Agarose BioShop Canada AGA001.500 Gel electrophoresis
BSA BioShop Canada ALB001.500 Blocking agent for the Whatman filter paper
Cell free reactions New England Biolabs E6800L PURExpress
CPRG Roche 10884308001 Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside
Disposable Sterile Biopsy Punches Integra Miltex 23233-31 Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate
DNAse I Thermo Scientific K2981 Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction
DNAse I Kit Thermo Scientific 74104 DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA
dNTPs New England Biolabs N0446S Used for PCRs
electrophoresis system Bio-Rad 1704487 Used to run the agarose gels
Gel imaging station Bio-Rad 1708265 ChemiDoc XRS+ Imaging System
IVT kit New England Biolabs E2040S Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening
Nanodrop One Thermo Scientific ND-ONE-W Used for determining nucleic acid concentrations
NASBA kit Life Sciences Advanced Technologies NWK-1 Isothermal amplification reaction components
Nuclease free H20 invitrogen 10977015 Added to reaction mixes
PAGE electrophoresis system Biorad 1658001FC Used to cast and run polyacrylamide gels
pCOLADuet-LacZ DNA Addgene 75006 https://www.addgene.org/75006/
Phusion polymerase/reactioin buffer New England Biolabs M0530L Used for PCRs
Plate reader BioTek BioTek NEO2 Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2
Primers Integrated DNA Technologies Custom oligo synthesis
Q5 polymerase/reaction buffer New England Biolabs M0491L Used for PCRs
Qiagen PCR Puriifcation Kit QIAGEN 27106 QIAprep Spin Miniprep Kit
RNA loading dye New England Biolabs B0363S 2X RNA loading dye
RNA Purification Kit QIAGEN EN0521 QIAamp Viral RNA extraction kit
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S Used to prevent contamination of RNases A, B, and C
RT-qPCR kit QIAGEN 208352 QuantiNova Probe RT-PCR Kit
SYBR Gold Invitrogen S11494 S11494 PAGE gel stain for nucleic acids
TAE Buffer BioShop Canada TAE222.4 Gel electrophoresis buffer
Thermal Cycler Applied Biosystems 4484073 Used for temperature cycling and incubating reactions
Whatman 42 filter paper GE Healthcare 1442-042 Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 184
पेपर-आधारित टोहोल्ड स्विच डायग्नोस्टिक्स के विकास और रोगी सत्यापन के लिए डिजाइन टू कार्यान्वयन अध्ययन
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Jaenes, K., Ribeiro da Silva, S. J., … More

Jaenes, K., Ribeiro da Silva, S. J., Vigar, J. R. J., Wu, K., Norouzi, M., Bayat, P., Karlikow, M., Cicek, S., Guo, Y., Green, A. A., Pena, L., Pardee, K. Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics. J. Vis. Exp. (184), e63223, doi:10.3791/63223 (2022).

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