Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल कैनबिनोइड अनुसंधान में तम्बाकू हॉर्नवर्म मैंडुका सेक्स्टा का उपयोग करने के लिए अनुदेशात्मक जानकारी प्रदान करता है। यहां वर्णित विधि में कैनबिडिओल (सीबीडी) उपचार के जवाब में कीट मॉडल के शारीरिक और व्यवहारिक परिवर्तनों की निगरानी करने के लिए सभी आवश्यक आपूर्ति और प्रोटोकॉल शामिल हैं।
Abstract
चिकित्सा में कैनबिनोइड्स पर बढ़े हुए ध्यान के साथ, कई स्तनधारी मॉडल जीवों का उपयोग उनके अज्ञात दवा कार्यों को स्पष्ट करने के लिए किया गया है। हालांकि, स्तनधारी अनुसंधान में कई कठिनाइयां बनी हुई हैं, जो कैनबिनोइड अनुसंधान के लिए गैर-स्तनधारी मॉडल जीवों के विकास की आवश्यकता होती है। लेखकों ने तम्बाकू हॉर्नवर्म मांडुका सेक्स्टा को एक उपन्यास कीट मॉडल प्रणाली के रूप में सुझाव दिया है। यह प्रोटोकॉल कैनबिडिओल (सीबीडी) की अलग-अलग मात्रा के साथ कृत्रिम आहार तैयार करने, एक खेती के वातावरण की स्थापना करने और सीबीडी उपचार के जवाब में उनके शारीरिक और व्यवहारिक परिवर्तनों की निगरानी करने के बारे में जानकारी प्रदान करता है। संक्षेप में, हॉर्नवर्म अंडे प्राप्त करने पर, अंडे को बेतरतीब ढंग से नियंत्रण में वितरित करने से पहले हैच करने के लिए 12: 12 प्रकाश-अंधेरे चक्र पर 25 डिग्री सेल्सियस पर 1-3 दिनों की अनुमति दी गई थी (गेहूं रोगाणु-आधारित कृत्रिम आहार); एडी), वाहन (एडी + 0.1% मध्यम श्रृंखला ट्राइग्लिसराइड तेल; एमसीटी तेल) और उपचार समूह (एडी + 0.1% एमसीटी + 1 एमएम या सीबीडी के 2 एमएम)। एक बार मीडिया तैयार होने के बाद, पहले इंस्टार लार्वा को व्यक्तिगत रूप से लकड़ी के skewer छड़ी के साथ 50 मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब में रखा गया था, और फिर टेस्ट ट्यूब को एक चीज़क्लॉथ के साथ कवर किया गया था। सीबीडी प्रशासन के लिए शारीरिक और व्यवहारिक प्रतिक्रियाओं के लिए 2-दिन के अंतराल में माप लिया गया था। यह सरल खेती प्रक्रिया शोधकर्ताओं को किसी दिए गए प्रयोग में बड़े नमूनों का परीक्षण करने की अनुमति देती है। इसके अतिरिक्त, अपेक्षाकृत कम जीवन चक्र शोधकर्ताओं को एक समरूप आबादी की कई पीढ़ियों में कैनबिनोइड उपचार के प्रभाव का अध्ययन करने में सक्षम बनाते हैं, जिससे डेटा को उच्च स्तनधारी मॉडल जीवों में एक प्रयोगात्मक डिजाइन का समर्थन करने की अनुमति मिलती है।
Introduction
पिछले वर्षों में, सार्वजनिक ध्यान उनकी चिकित्सीय क्षमता के कारण कैनबिनोइड्स पर केंद्रित है, जिसमें मिर्गी 1, पार्किंसंस रोग 2, मल्टीपल स्केलेरोसिस 3, और कैनाबिडिओल (सीबीडी) के साथ कैंसर के विभिन्न रूपों के उपचार शामिल हैं। चूंकि कैनबिस को 2018 के कृषि सुधार अधिनियम में एक कृषि वस्तु के रूप में वैध किया गया है, इसलिए सार्वजनिक कानून 115-334 (2018 फार्म बिल), कैनबिस और खाद्य, कॉस्मेटिक और दवा उद्योगों में कैनबिनोइड डेरिवेटिव में तेजी से वृद्धि हुई है। इसके अतिरिक्त, एकल कैनबिनोइड्स और कैनबिनोइड मिश्रणों के नैदानिक-ग्रेड आइसोलेट्स का मानव विषयों 7, सेल लाइन5,8, और विविध पशु मॉडल सिस्टम 9,10 में सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया है।
एक नैदानिक परीक्षण एक विशिष्ट बीमारी पर कैनबिनोइड्स की प्रभावकारिता और प्रतिकूल प्रभावों को मान्य करने के लिए आदर्श होगा। हालांकि, नैदानिक परीक्षणों में कई चुनौतियां हैं, जिनमें नैतिक / आईआरबी अनुमोदन, भर्ती और विषयों के प्रतिधारण शामिल हैं। इन बाधाओं को दूर करने के लिए, विभिन्न मानव सेल लाइनों का उपयोग किया गया था क्योंकि मानव-व्युत्पन्न सेल लाइनें लागत प्रभावी, संभालने में आसान हैं, नैतिक मुद्दों को बाईपास कर सकती हैं, और लगातार और पुन: प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान कर सकती हैं क्योंकि सेल लाइनें 'कोशिकाओं की शुद्ध आबादी हैं जिनमें अन्य कोशिकाओं और रसायनों का कोई क्रॉस-संदूषण नहीं है'।
Alves et al. (2021)13 ने अपरा ट्रोफोब्लास्ट्स में एक खुराक-निर्भर तरीके से सीबीडी का परीक्षण किया, जो प्लेसेंटा की विशेष कोशिकाएं हैं जो भ्रूण आरोपण और निर्णायक मातृ गर्भाशय के साथ बातचीत में एक आवश्यक भूमिका निभाती हैं। उनके परिणामों से पता चला कि सीबीडी ने सेल व्यवहार्यता हानि, सेल चक्र प्रगति व्यवधान और एपोप्टोसिस प्रेरण का कारण बना। ये अवलोकन गर्भवती महिलाओं द्वारा कैनबिस के उपयोग के संभावित नकारात्मक प्रभावों को प्रदर्शित करते हैं13। इसी तरह, सेल लाइनों की एक श्रृंखला का उपयोग मानव रोगों में सीबीडी के औषधीय प्रभावों की जांच करने के लिए भी किया गया था, विशेष रूप से, कैंसर के विभिन्न रूपों में। इन विट्रो अध्ययनों ने सफलतापूर्वक अग्नाशय 15, breast8, और कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं 16 में एंटी-कैंसर प्रभावों का प्रदर्शन किया। हालांकि, व्यापक रूप से उपलब्ध होने और संभालने में आसान होने के दौरान, विशिष्ट सेल लाइनें जैसे कि हेला, एचईके 293 आनुवंशिक और फेनोटाइपिक परिवर्तनों के लिए प्रवण हैं क्योंकि उनकी विकास की स्थिति में परिवर्तन या हैंडलिंग 17।
कैनबिस अनुसंधान में, विभिन्न पशु मॉडल सिस्टम, जैसे माउस 18, गिनी-पिग 19 और खरगोश 19 जैसे छोटे जानवरों से लेकर बड़े जानवरों जैसे कैनाइन 20, पिगलेट 21, बंदर 22, हॉर्स 23 तक, अज्ञात चिकित्सीय प्रभावों का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया है। चूहों को उनके शारीरिक, शारीरिक और मनुष्यों के लिए आनुवंशिक समानता के कारण कैनबिनोइड अनुसंधान के लिए सबसे पसंदीदा पशु मॉडल प्रणाली रही है24। सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि चूहों के तंत्रिका तंत्र में सीबी 1/2 रिसेप्टर्स होते हैं, जो मनुष्यों में मौजूद होते हैं। उनके पास मानव विषयों की तुलना में एक छोटा जीवन चक्र भी है, जिसमें आसान रखरखाव और प्रचुर मात्रा में आनुवंशिक संसाधन हैं, इस प्रकार पूरे जीवन चक्र में कैनबिनोइड्स के प्रभावों की निगरानी करना बहुत आसान हो जाता है। स्तनधारी प्रणाली का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और सफलतापूर्वक प्रदर्शित किया गया है कि सीबीडी जब्ती विकारों 1, पोस्ट-ट्रॉमेटिक स्ट्रेस डिसऑर्डर 9, मौखिक अल्सर 25 और मनोभ्रंश जैसे लक्षणों से राहत देता है। माउस मॉडल ने एक समुदाय के भीतर व्यक्तियों के सामाजिक संपर्क अध्ययन को भी सक्षम किया है जो बड़े जानवरों और मनुष्यों में बेहद मुश्किल है26।
पशु मॉडल प्रणाली के सभी फायदों के बावजूद, यह अभी भी महंगा है और दवा प्रशासन और डेटा संग्रह के दौरान गहन देखभाल की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, प्रयोगात्मक डिजाइन और कठोरता में सीमाओं के कारण अपरिवर्तनीयता और मानव स्थितियों के खराब पुनरावृत्ति के कारण अनुसंधान में चूहों का उपयोग करने की जांच की जाती है27।
कैनबिनोइड्स के चिकित्सा / प्रीक्लिनिकल अध्ययन की बढ़ती मांग के साथ, एक गैर-स्तनधारी मॉडल प्रणाली की आवश्यकता होती है। अकशेरुकी मॉडल पारंपरिक रूप से कशेरुक मॉडल पर विशिष्ट लाभ प्रदान करते थे। महत्वपूर्ण लाभों में कई नमूनों को पालने की आसानी और कम लागत शामिल है और शोधकर्ताओं को आनुवंशिक रूप से सजातीय आबादी की कई पीढ़ियों की निगरानी करने में सक्षम बनाना शामिल है। हाल के एक अध्ययन ने फल मक्खी, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर को एक प्रभावी कीट मॉडल प्रणाली साबित कर दिया, जो खिला व्यवहार को संशोधित करने में कैनबिनोइड्स के औषधीय कार्यों की जांच करने के लिए एक प्रभावी कीट मॉडल प्रणाली है। कीट मॉडल प्रणालियों में, लेखकों ने तम्बाकू हॉर्नवर्म, मैंडुका सेक्स्टा पर ध्यान केंद्रित किया, जिसे कैरोलिना स्फिंक्स कीट या हॉक कीट के रूप में भी जाना जाता है, कैनबिनोइड अनुसंधान के लिए एक उपन्यास कीट मॉडल प्रणाली के रूप में।
मांडुका सेक्स्टा स्फिंगिडे के परिवार से संबंधित है। कीट दक्षिणी संयुक्त राज्य अमेरिका में सबसे आम पौधों कीट है, जहां वे सोलेनेशियस पौधों पर फ़ीड करते हैं। कीट मॉडल का कीट शरीर विज्ञान, जैव रसायन, न्यूरोबायोलॉजी और दवा इंटरैक्शन अध्ययनों में अनुसंधान में एक लंबा इतिहास है। मैंडुका सेक्स्टा के शोध पोर्टफोलियो में एक मसौदा जीनोम अनुक्रम शामिल है, जो आवश्यक सेलुलर प्रक्रियाओं की आणविक स्तर की समझ के लिए अनुमति देता है30। इस मॉडल प्रणाली का एक और महत्वपूर्ण लाभ इसका बड़ा आकार है, जो लार्वा विकास के 18-25 दिनों में लंबाई में 100 मिमी से अधिक और वजन में 10 ग्राम तक पहुंचता है। बड़ा आकार शोधकर्ताओं को सीबीडी उपचार के जवाब में वास्तविक समय में रूपात्मक और व्यवहारिक परिवर्तनों की आसानी से निगरानी करने में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, आकार के कारण, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं की जांच पेट के तंत्रिका तंत्र के साथ की गई थी, जिसमें उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के बिना लार्वा से विच्छेदित गैन्ग्लिया भी शामिल था। अद्वितीय विशेषता शोधकर्ताओं को प्रशासित कैनबिनोइड (ओं) के लिए तीव्र और दीर्घकालिक प्रतिक्रियाओं की आसानी से जांच करने की अनुमति देती है।
इस तरह की बहुमुखी प्रतिभा के बावजूद, एम sexta केवल हाल ही में कैनबिस और कैनबिनोइड अध्ययन के लिए एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में अपनी उपयुक्तता के लिए पता लगाया गया है। 2019 में, लेखकों ने पहली बार कीट मॉडल प्रणाली का उपयोग इस परिकल्पना को संबोधित करने के लिए किया कि कैनबिस ने खुद को कीट जड़ी-बूटियों से बचाने के लिए कैनबिडिओल का उत्पादन करने के लिए विकसित किया है30,31। परिणाम से स्पष्ट रूप से पता चला है कि पौधों ने सीबीडी को एक खिला निवारक के रूप में शोषण किया और कीट कीट एम. सेक्स्टा कैटरपिलर के विकास को रोक दिया, साथ ही साथ मृत्यु दर में वृद्धि हुई। अध्ययन ने नशे में इथेनॉल लार्वा के लिए सीबीडी के बचाव के प्रभावों का भी प्रदर्शन किया, सीबीडी के वाहक के रूप में इथेनॉल के संभावित वाहन प्रभाव की पहचान की। जैसा कि दिखाया गया है, कीट मॉडल प्रणाली ने अन्य पशु प्रणालियों की तुलना में कम श्रम और लागत के साथ 3-4 सप्ताह के भीतर कैनबिनोइड्स के चिकित्सीय प्रभावों की प्रभावी ढंग से जांच की। यद्यपि कीट मॉडल में कैनबिनोइड रिसेप्टर्स (यानी, कोई CB1/2 रिसेप्टर्स) की कमी है, मॉडल सिस्टम कैनबिनोइड रिसेप्टर-स्वतंत्र तरीके से कैनबिनोइड्स की औषधीय भूमिकाओं को समझने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है।
इस अध्ययन के लेखकों ने पहले कैनबिनोइड रिसर्च 31 के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में तम्बाकू हॉर्नवर्म के साथ काम किया है। एम sexta का उपयोग करने के लाभों और जोखिमों पर सावधानीपूर्वक विचार करने के बाद, हमने प्रीक्लिनिकल परीक्षणों के लिए उचित देखभाल और आहार की तैयारी को शामिल करने वाली एक विधि प्रदान की है जो भविष्य के प्रीक्लिनिकल प्रयोगशाला उपयोग के अवसरों की अनुमति देती है।
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Protocol
1. Hornworm तैयारी और cannabidiol उपचार
- 150-200 व्यवहार्य एम प्राप्त करें। sexta अंडे और गेहूं रोगाणु आधारित कृत्रिम आहार ( सामग्री की तालिका देखें).
- एक गेहूं रोगाणु आधारित कृत्रिम आहार (एडी) परत के साथ एक polystyrene पेट्री डिश में hornworm अंडे जगह और एक कीट पालन कक्ष ( सामग्री की तालिका देखें) 40% -60% सापेक्ष आर्द्रता के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा अंडे हस्तांतरण.
- 1-3 दिनों के लिए तम्बाकू हॉर्नवर्म अंडे को कीट पालन कक्ष के अंदर हैच करने की अनुमति दें, जिसे 40% -60% सापेक्ष आर्द्रता के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया है।
- Cannabidiol (CBD) स्टॉक समाधान (200 mM) तैयार करें, जिसमें 1.26 ग्राम >98% शुद्धता CBD आइसोलेट को 20 mL EtOH (200 सबूत) या 100% मध्यम श्रृंखला ट्राइग्लिसराइड्स (MCT) तेल में अलग किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: सीबीडी आइसोलेट प्रकाश-संवेदनशील है, इसलिए अंधेरे में संभालें। - 200 mM CBD स्टॉक समाधान के 5 mL और 10 mL को 1,000 g AD में जोड़ें ताकि क्रमशः CBD के आहार 1 mM और 2 mM की अंतिम सांद्रता लाई जा सके।
नोट: सुनिश्चित करें कि आहार और सीबीडी स्टॉक समाधान अच्छी तरह से मिश्रित हैं जब तक कि पूरी तरह से सजातीय मिश्रण का गठन नहीं किया जाता है। हाथ से कम से कम 45 मिनट के लिए एक प्लास्टिक बैग में CBD के स्टॉक युक्त AD मिश्रण।
सावधानी: कॉफी मिक्सर या किसी भी अन्य धातु चक्की अप्रभावी होने के लिए दिखाई दिया। - तीन मीडिया, नियंत्रण (एडी), वाहन (एडी + ईटीओएच या एमसीटी तेल का 0.1%) के 20 ग्राम को वितरित करें, और सीबीडी युक्त मीडिया (एडी + ईटीओएच या एमसीटी तेल का 0.1% + सीबीडी के 1 एमएम / 2 एमएम) को 50 एमएल ट्यूब के नीचे तक वितरित करें।
- बेतरतीब ढंग से एक 50 एमएल टेस्ट ट्यूब में व्यक्तिगत रूप से 1 इंस्टार लार्वा (~ 2 मिमी लंबा) वितरित करें और एक छिद्रित ढक्कन या चीज़क्लॉथ के साथ कवर करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: ट्यूब को उल्टा रखें और एक कीट पालन कक्ष में कीड़े उगाएं, जो 40% -60% सापेक्ष आर्द्रता के साथ 25 °C बनाए रखा। - उन्हें एक कीट पालन कक्ष के अंदर विकसित करें ( सामग्री की तालिका देखें) 12 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा।
2. एम sexta लार्वा वृद्धि, आहार की खपत, और मृत्यु दर माप
- लार्वा विकास (यानी, आकार और वजन) को एक विश्लेषणात्मक संतुलन और मृत्यु दर के साथ 2-दिवसीय अंतराल पर अलग-अलग कंटेनरों में स्थानांतरित करने के बाद मापें जब तक कि प्यूपेशन को एक कठोर एक्सोक्यूटिकल परत के गहरे भूरे रंग के रूप में मान्यता नहीं दी जाती है।
- लार्वा को अपने संबंधित आहार में पेश करने से पहले लार्वा के प्रत्येक समूह के प्रारंभिक द्रव्यमान (ग्राम में) को रिकॉर्ड करें और लार्वा विकास चरणों के बीच बड़े पैमाने पर लाभ निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक द्रव्यमान से प्रत्येक माप पर लार्वा के द्रव्यमान को घटाएं जब तक कि लार्वा पिल्ला चरण को पूरा नहीं करता है।
- प्रत्येक आहार पर प्यूपेशन तक लार्वा विकास के चरणों के बीच विकास की समय सीमा में अंतर को समझने के लिए इनस्टार विकास चरणों के बीच दिनों की संख्या रिकॉर्ड करें।
नोट: किसी भी मोल्ड संदूषण से बचने के लिए कंटेनर से फेकल मैटर को स्क्रैप करें। प्रयोग उद्देश्यों पर निर्भर भविष्य के परीक्षण के लिए मामले को इकट्ठा करें (उदाहरण के लिए, सीबीडी संचय दर गणना, माइक्रोबियल प्रोफाइलिंग)। एपोलाइसिस या एक्डिसिस की नाजुक अवधि के दौरान कीट को सावधानीपूर्वक संभालना महत्वपूर्ण है। एक कंटेनर से लार्वा से बाहर निकालते समय, धीरे से एक फ्लैट-टिप और चौड़े संदंश के साथ कीट के मुख्य शरीर को पकड़ो और जब कोई कीट बहाने की प्रक्रिया में होता है तो त्वचा की बाहरी परत को हटाने के लिए मजबूर नहीं होता है।
- 1 इंस्टार लार्वा और pupation के बीच कंटेनर के आहार हानि का वजन करके आहार की खपत 31 को मापें। प्रयोग की शुरुआत में आहार के प्रारंभिक ग्राम रिकॉर्ड करें और लार्वा के पूर्ण प्यूपेशन चरण में प्रवेश करने पर आहार की शेष मात्रा से प्रारंभिक मात्रा को घटाएं।
नोट: फेकल पदार्थ को आहार माप से बाहर रखा जाना चाहिए। फेकल मैटर और अन्य मलबे (यानी, त्वचा शेड) को कंटेनर को उल्टा रखकर मीडिया से आसानी से हटाया जा सकता है। - गतिशीलता माप के लिए, अधीन कीट को कम से कम 5 मिनट के लिए कक्ष वातावरण को अनुकूलित करने की अनुमति दें और उन दूरी 31 को ट्रैक करें जो 5 वें इंस्टार कीटों (लंबाई में 80-100 मिमी) के तीन समूहों ने एक स्वचालित, कंप्यूटरीकृत भय कंडीशनिंग कक्ष का उपयोग करके यात्रा की (सामग्री की तालिका देखें)।
- एक गति का पता लगाने वाले सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके 5 मिनट के लिए 60 फ्रेम / सेकंड रिकॉर्ड किए गए वीडियो के माध्यम से गतिशीलता प्रतिक्रिया 31 का विश्लेषण करें जो एक गति सूचकांक उत्पन्न करता है।
3. सांख्यिकीय विश्लेषण
- लार्वा विकास (यानी, आकार और वजन) और टकी के बाद के परीक्षण 32 के साथ एक तरफा एनोवा द्वारा गति सूचकांक में अंतर का विश्लेषण करें।
- उत्तरजीविता वक्र तुलना के लिए लॉग-रैंक (Mantel-Cox) test33 का उपयोग करें।
नोट: सभी सांख्यिकीय विश्लेषण सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किए गए थे ( सामग्री की तालिका देखें)।
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Representative Results
कैनबिनोइड्स विषाक्तता की जांच करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में मांडुका सेक्स्टा
चित्रा 1 तम्बाकू hornworm Manduca sexta का उपयोग कर सीबीडी प्रयोग के प्रमुख घटकों को दर्शाता है. बड़ी संख्या में कीड़े (>20) को व्यक्तिगत रूप से 12 घंटे: 12 घंटे = प्रकाश: अंधेरे चक्र पर 25 डिग्री सेल्सियस पर पाला गया था। कीड़ों के आकार, वजन और मृत्यु दर को उच्च खुराक वाले सीबीडी (2 एमएम) उपचार के बाद अल्पकालिक और दीर्घकालिक प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए 2-दिन के अंतराल पर मापा गया था।
चित्रा 2 कीट के विकास और विकास पर सीबीडी के प्रतिकूल प्रभावों को दर्शाता है। एक कृत्रिम आहार (एडी) पर पाले गए कीड़ों ने सबसे अच्छा विकास प्रदर्शन दिखाया। वाहन नियंत्रण जो सीबीडी आइसोलेट के लिए एक भंग एजेंट के रूप में 0.1% मध्यम-श्रृंखला ट्राइग्लिसराइड (एमसीटी) तेल का उपयोग करता था, ने भी बिना किसी हानिकारक प्रभाव के सामान्य विकास दिखाया। हालांकि, सीबीडी (2 एमएम) की एक उच्च खुराक ने वजन घटाने (चित्रा 2 सी) को प्रेरित किया और नियंत्रण और वाहन समूहों (चित्रा 2 डी) की तुलना में उच्च मृत्यु दर का नेतृत्व किया।
24 वें दिन, एडी पर खिलाए गए लार्वा का औसत आकार 63.9 मिमी (एन = 20-22) था। हालांकि, सीबीडी के 2 एमएम वाले एडी पर पाले गए लार्वा का आकार 50.7 मिमी था, जो एडी पर उगाए गए लार्वा (चित्रा 2 सी में लाल रेखा) 31 की तुलना में ~ 21% छोटा था। 24 वें दिन, एडी पर पाले गए लार्वा का औसत वजन 6.5 ग्राम था, जो कि सीबीडी के 2 एमएम (एन = 12-16, पी < 0.00001) 31 के साथ एडी पर पाले गए लार्वा की तुलना में 2.2 गुना अधिक था। विशेष रूप से, सीबीडी (2 एमएम) की उच्च खुराक ने मृत्यु दर को 40% तक काफी बढ़ा दिया, जबकि नियंत्रण और वाहन समूहों ने केवल 20% मृत्यु दर (चित्रा 2 डी) 31 दिखाई। परिणामों ने संकेत दिया कि आहार में सीबीडी (2 एमएम) की उच्च खुराक कीट विकास के लिए हानिकारक है और मृत्यु दर में वृद्धि के लिए संबंधित है।
कैनबिनोइड्स के अज्ञात चिकित्सीय कार्यों का पता लगाने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में मैंडुका सेक्स्टा
चित्रा 2 से पता चला है कि कीट मॉडल प्रणाली प्रभावी रूप से उनके रूपात्मक और शारीरिक परिवर्तनों की निगरानी करके सीबीडी के किसी भी हानिकारक प्रभाव की निगरानी करती है। प्रारंभिक परिणाम ने संकेत दिया कि >1% इथेनॉल (ईटीओएच) नकारात्मक रूप से उनके विकास, गतिशीलता, आहार की खपत और जीवित रहने की दर से संबंधित है। यह जांचने के लिए कि क्या सीबीडी ईटीओएच-नशे में एम सेक्स्टा लार्वा में कीट की गतिशीलता और खिला व्यवहार में सुधार करता है, कीड़ों द्वारा उपभोग किए गए आहार की कुल मात्रा और 10 मिनट के लिए उन्होंने जो दूरी तय की थी, उसे तीन खिला स्थितियों (एडी, एडी + 1% ईटीओएच, और एडी + 1% ईटीओएच + 1 एमएम सीबीडी) के तहत उगाए गए कीड़ों से मापा गया था। चित्र 3A से पता चलता है कि M. CBD के 1 mM युक्त AD पर पाले गए sexta लार्वा ने EtOH-added diet31 पर पाले गए लोगों की तुलना में कम से कम 3.1 गुना अधिक आहार द्रव्यमान का सेवन किया। हालांकि, सीबीडी-एडेड मीडिया के 2 एमएम पर पाले गए कीड़ों की आहार खपत ईटीओएच-केवल आहार (पी > 0.05) 31 पर पाले गए लार्वा की तुलना में काफी अलग नहीं थी।
लार्वा गतिशीलता को यह जांचने के लिए भी ट्रैक किया गया था कि क्या सीबीडी ने ईटीओएच के साथ नशे में होने पर उनकी गतिशीलता को प्रभावित किया था। मोबाइल इंडेक्स को फ्रीज के प्रतिशत (%) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। चित्र 3B, M के मोबाइल सूचकांक की तुलना करता है। सेक्स्टा लार्वा विभिन्न परिस्थितियों में पाला जाता है। परिणामों से पता चलता है कि 1% ईटीओएच-उपचारित लार्वा ने गतिशीलता को प्रभावित नहीं किया (पी > 0.05)। 1 mM CBD प्रशासन ने गतिशीलता को भी प्रभावित नहीं किया (p > 0.05)31। 2% EtOH उपचार एम sexta लार्वा के लिए घातक हो गया; इसलिए, कोई गतिशीलता सूचकांक दर्ज नहीं किया गया था। 2% EtOH युक्त एडी में CBD (2 mM) की उच्च खुराक के अलावा, गतिशीलता कम (80% फ्रीज) 31 बनी रही।
चित्र 1: कैनबिडिओल अध्ययन में तम्बाकू हॉर्नवर्म मैंडुका सेक्स्टा कैटरपिलर का उपयोग करने की संक्षेप प्रक्रिया। (A) हॉर्नवर्म अंडे कृत्रिम आहार की एक परत के साथ एक अलग बड़े कंटेनर में हैच किए जाते हैं। (बी) कंटेनर के किनारों पर चिपकने से किसी भी आहार को रोकने के लिए कंटेनर को भरने के लिए एक सिरिंज का उपयोग किया गया था। (C) चीज़क्लॉथ के साथ 50 मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब में एक दूसरा इंस्टार तम्बाकू हॉर्नवॉर्म। (d) एक तीसरा इंस्टार तम्बाकू हॉर्नवॉर्म। (ई) हॉर्नवर्म लंबाई (मिमी) और वजन (जी) को एक पैमाने पर मापा गया था। (एफ) 5 वें इंस्टार तम्बाकू हॉर्नवर्म जो एक्डिसिस से गुजरता है और प्यूपेशन के लिए तैयार है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: तम्बाकू हॉर्नवर्म की वृद्धि और मृत्यु दर पर कैनबिडिओल (CBD) के प्रभाव Manduca sexta. (A) 5 वें, 3 instar पर तम्बाकू hornworm कैटरपिलर, और प्रारंभिक pupation। M का आकार (B), वजन (C), और मृत्यु दर (D) है। कृत्रिम आहार (एडी) पर खिलाए जाने पर सेक्स्टा, एडी + मध्यम-श्रृंखला ट्राइग्लिसराइड (एमसीटी) का 0.1%, और एडी + एमसीटी का 0.1% + सीबीडी का 2 एमएम। कीट वृद्धि और उत्तरजीविता दर पर सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, टकी के कई तुलना परीक्षण (एन = 20-22, पी < 0.05) और मैंटेल-कॉक्स परीक्षण (एन = 20-22, पी < 0.05) के साथ एक तरफा एनोवा का उपयोग क्रमशः किया गया था। यह आंकड़ा Reference31 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: कीट ों के खिलाने के व्यवहार और गतिशीलता पर कैनबिडिओल (CBD) के प्रभाव। (A) कृत्रिम आहार (AD) पर पाले गए तम्बाकू हॉर्नवर्म कैटरपिलर की आहार खपत, AD + इथेनॉल (EtOH) का 1-2% और AD + ETOH का 1-2% + CBD का 1-2mM (एक तरफा एनोवा, tukey की p < 0.05 पर कई तुलना)। (बी) कीट गतिशीलता। गतिशीलता को फ्रीज % के रूप में दर्शाया गया है। p < 0.01 को इंगित करता है. यह आंकड़ा Reference31 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
फीडिंग अध्ययन से पता चला है कि सीबीडी (2 एमएम) की उच्च खुराक ने कीट के विकास को रोक दिया और मृत्यु दर में वृद्धि हुई। कीट मॉडल ने इथेनॉल के प्रति संवेदनशीलता भी दिखाई; हालांकि, सीबीडी ने इथेनॉल विषाक्तता को प्रभावी ढंग से डिटॉक्सिकेट किया, जिससे उनकी जीवित रहने की दर, आहार की खपत और भोजन खोज व्यवहार को नियंत्रण समूह (चित्रा 3 ए, बी) 31 के समान स्तर तक बढ़ाया गया। वर्णित कीट मॉडल प्रणाली तीन महत्वपूर्ण चरणों से बनी है: (1) यह सुनिश्चित करना कि एम. सेक्स्टा के अंडे आकार और समय में समान रूप से हैंच किए जाते हैं, (2) विकास मीडिया को तैयार करना जो एक लक्षित एकाग्रता के लिए कैनबिनोइड्स के साथ सजातीय रूप से मिश्रित होते हैं, और (3) 40% -60% पर आदर्श आर्द्रता स्तर को बनाए रखते हुए कवक संदूषण से मुक्त होने के लिए विकास मीडिया को बनाए रखना। कीट मॉडल प्रणाली ने हमें मीडिया की तैयारी से लेकर डेटा संग्रह और व्याख्या तक 25 दिनों के भीतर अनुसंधान प्रश्न को संबोधित करने में सक्षम बनाया। सबसे महत्वपूर्ण बात, कीट प्रणाली ने बड़े नमूनों से लगातार परिणाम उत्पन्न किए।
खेती एम sexta लार्वा की सफलता सुनिश्चित करने के लिए, कंटेनर के अंदर 40% -60% पर सापेक्ष आर्द्रता बनाए रखना आवश्यक है। यदि कोई कंटेनर उच्च आर्द्रता को पकड़ने में विफल रहता है, तो कैनबिनोइड्स युक्त एक कृत्रिम आहार को तेजी से विघटित किया जाएगा, जिससे कीड़ों की मृत्यु के कारण प्रारंभिक प्रयोग समाप्ति हो जाएगी। हालांकि, एक बंद प्रणाली में, उच्च आर्द्रता कवक प्रकोप के लिए एक आदर्श स्थिति प्रदान करती है, जिसे मिटाना मुश्किल है। लेखकों ने मीडिया से पानी के नुकसान को कम करते हुए पर्याप्त वायु परिसंचरण की आपूर्ति करने के लिए एक छिद्रित ढक्कन या चीज़क्लॉथ का उपयोग करने का सुझाव दिया है। एक प्राकृतिक वातावरण में, कैटरपिलर एक पत्ती के अक्षीय पक्ष पर फ़ीड करना पसंद करते हैं जहां नमी अधिक होती है, जबकि पत्ती की सतह के क्षेत्र की तुलना में कम ट्राइकोम प्रस्तुत करती है। इस प्रकार, एक कंटेनर को उल्टा रखना एक शरण क्षेत्र प्रदान करते समय या रेंगने वाली लकड़ी की छड़ी प्रदान करते समय असाधारण रूप से सहायक था। यह मीडिया क्षेत्र से फेकल पदार्थ को हटाने में भी मदद करता है और आगे के एसेस के लिए अपशिष्ट एकत्र करना आसान बनाता है।
जैसा कि कैनबिनोइड्स रिसेप्टर्स अकशेरुकी 35 में अनुपस्थित हैं, तम्बाकू हॉर्नवर्म एम सेक्स्टा एंडोकैनाबिनोइड प्रणाली द्वारा मध्यस्थता किए गए चिकित्सीय अध्ययनों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। हालांकि, हमारे पायलट अध्ययन में प्रदर्शित कई लाभों के साथ, कीट को कैनबिनोइड्स के औषधीय कार्यों की जांच करने के लिए एक नई मॉडल प्रणाली माना जाना चाहिए, विशेष रूप से गैर-सीबी रिसेप्टर-मध्यस्थता फार्माकोकाइनेटिक्स से जुड़े अध्ययन। एम sexta के अपेक्षाकृत कम जीवन चक्र शोधकर्ताओं को कई पीढ़ियों से कैनबिनोइड युक्त आहार के प्रभावों को समझने की अनुमति देता है, जिससे उच्च स्तनपायी मॉडल जीवों में एक प्रयोगात्मक डिजाइन की अनुमति मिलती है।
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Disclosures
लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस शोध को कोलोराडो स्टेट यूनिवर्सिटी-प्यूब्लो और विज्ञान और आईसीटी मंत्रालय (2021-डीडी-यूपी-0379) और चुन्चियोन शहर (गांजा आर एंड डी और औद्योगीकरण, 2020-2021) में कैनबिस रिसर्च संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytic balance | Mettler Instrument Corp. | AE100S | |
| Cannabidiol isolate (>99.4%) | Lilu's Garden | ||
| Cheesecloth | VWR INTERNATIONAL | 470150-438 | |
| Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes | VWR | 89093-192 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof | Sigma-Aldrich | EX0276-1 | |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Insect rearing chamber | Darwin Chambers | INR034 | |
| Medium chain triglycerides (MCT) oil | Walmart | ||
| Motion detection software (Actimetrics) | Coulbourn Instruments | ||
| Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) | VWR INTERNATIONAL | 688161 | |
| Tobacco hormworm artificial diet | Carolina Biological Supply Company | Item # 143908 | Ready-To-Use-Hornworm-Diet |
| Tobacco hormworm eggs | Carolina Biological Supply Company | Item # 143880 | Unit of 30-50 |
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