Summary
Entomopatogene svampe har fået betydning som biologiske bekæmpelsesmidler for skadedyr i landbruget. I denne undersøgelse blev masseproduktionen af et tilstrækkeligt antal elastiske infektivende propaguler af sydafrikanske isolater af både Metarhizium robertsii og M. pinghaense til kommerciel anvendelse mod skadedyr med succes udført ved anvendelse af landbrugskornprodukter.
Abstract
Entomopatogene svampe i Metarhizium anisopliae artskomplekset har fået betydning som de biologiske bekæmpelsesmidler for landbrugsinsektskadedyr. Stigningen i skadedyrsresistens over for kemiske insekticider, den voksende bekymring over insekticidernes negative virkninger på menneskers sundhed og miljøforureningen fra pesticider har ført til en global indsats for at finde nye bæredygtige strategier for afgrødebeskyttelse og skadedyrsbekæmpelse. Tidligere er forsøg på at massekulturere sådanne entomopatogene svampe (EPF) arter som Beauveria bassiana blevet udført. Der er dog kun gjort begrænsede forsøg på at massedyre Metarhizium robertsii og M. pinghaense til brug mod skadedyr. Denne undersøgelse havde til formål at masseproducere et tilstrækkeligt antal modstandsdygtige infektiøs propaguler af sydafrikanske isolater af M. robertsii og M. pinghaense til kommerciel anvendelse. Tre landbrugskornprodukter, flager havre, flager byg og ris, blev brugt som EPF faste gæringssubstrater. To podningsmetoder, konidiale suspensioner og den flydende svampekultur af blastosporer blev brugt til at inokulere de faste substrater. Inokulation ved hjælp af konidiale suspensioner blev observeret at være relativt mindre effektiv, da der blev observeret øgede niveauer af kontaminering på de faste substrater i forhold til ved anvendelse af blastospore-podningsmetoden. Flaget havre viste sig ikke at være et egnet vækstsubstrat for både M. robertsii og M. pinghaense, da der ikke blev høstet tørre conidier fra substratet. Flaked byg viste sig at favorisere produktionen af M. robertsii conidia frem for M. pinghaense, og et gennemsnit på 1,83 g ± 1,47 g tør M. robertsii conidia og nul gram M. pinghaense conidia blev høstet fra substratet. Riskorn viste sig at favorisere den konidiale masseproduktion af både M. pinghaense og M. robertsii isolater, med et gennemsnit på 8,2 g ± henholdsvis 4,38 g og 6 g ± 2 g høstet fra substratet.
Introduction
Entomopatogene svampe (EPF) har fået betydning som plantebeskyttelsesmidler i den biologiske bekæmpelse af vigtige landbrugsinsektskadegørere 1,2. Entomopatogenerne, som forekommer naturligt i jorden, forårsager epizootier i populationerne af forskellige skadedyrsarter3. EpF-arterne er værtsspecifikke og udgør relativt få risici med hensyn til at angribe ikke-målarter, og de er ugiftige for miljøet4. EPF har en unik mekanisme til at invadere deres vært samt til at udbrede og fortsætte i deres umiddelbare miljø1. De angriber værten hovedsageligt gennem aseksuelle sporer, der fastgøres til og trænger ind i værtskutiklen for at invadere og sprede sig i værtshæmokølen. Værten dør til sidst på grund af udtømning af hæmolymfenæringsstofferne eller som følge af toksæmi forårsaget af de toksiske metabolitter frigivet af svampen. Efter døden, under ideelle miljøforhold, fremkommer svampen på den ydre overflade (åbenlys mykose) af værtskadaveren 5,6.
Voksende bekymring over de negative virkninger af kemiske rester på menneskers sundhed, miljøforurening og udviklingen af skadedyrsresistens har ført til den globale indsats for at reducere input af kemisk baserede insekticider og finde alternative, nye og bæredygtige strategier for afgrødebeskyttelse og skadedyrsbekæmpelse 6,7,8 . Dette har givet mulighed for at udvikle mikrobielt baserede insekticider til brug i Integrated Pest Management (IPM) programmer, som er mere økologisk gunstige strategier end konventionel kemisk bekæmpelse 3,8.
For at udvikle et vellykket mikrobielt bekæmpelsesmiddel til et landbrugsskadegører skal en egnet organisme først isoleres, karakteriseres, identificeres og dens patogenicitet for målskadegøreren bekræftes. Der kræves imidlertid en nem og omkostningseffektiv metode til storskalaproduktion af det mikrobielle agens for at fremstille et levedygtigt produkt til brug i biologiske bekæmpelsesprogrammer 9,10,11,12,13. Masseproduktion af betydelige mængder entomopatogener af god kvalitet afhænger af den mikrobielle stamme, miljøet, målskadegøreren, formuleringen, markedet, anvendelsesstrategien og det ønskede slutprodukt 14,15,16. EPF kan masseproduceres ved hjælp af flydende substratfermentering til fremstilling af blastosporer eller fermenteringsprocessen for fast substrat til fremstilling af luftkonidier 6,17,18. Masseproduktions- og formuleringsprocessen af entomopatoggener påvirker imidlertid direkte virulensen, omkostningerne, holdbarheden og felteffektiviteten af slutproduktet. For en vellykket anvendelse i IPM skal produktionsprocessen for entomopatogerne være let at køre, kræve minimal arbejdskraft, producere en høj udbyttekoncentration af virulente, levedygtige og vedvarende propaguler og være lav i omkostninger 4,13,14,16.
Forståelse af de ernæringsmæssige behov for entomopatogener er vigtig for massedyrkning med alle dyrkningsmetoder 4,12. De ernæringsmæssige komponenter i produktionsmediet har en betydelig indvirkning på egenskaberne ved de resulterende propaguler, herunder biokontroleffektivitet, udbytte, udtørringstolerance og persistens 8,19,20,21. Optimeringen af produktionsprocedurerne er designet til at imødegå sådanne faktorer22. For EPF er de vigtigste krav til god vækst, sporulation og masseproduktion af svampekonidier tilstrækkelig fugtighed, optimal væksttemperatur, pH, gasudveksling af CO2 ogO2 og ernæring, herunder gode fosfor-, kulhydrat-, kulstof- og nitrogenkilder18.
Jaronski og Jackson18 beskriver fermenteringsmetoden med fast substrat som den mest effektive og tætteste tilnærmelsesmetode til den naturlige proces til EPF-produktion i forhold til fermenteringsmetoden for flydende substrat, fordi svampekonidiumet under naturlige forhold bæres på faste oprejste strukturer, som overfladen af insektkadavere. Landbrugsprodukter og biprodukter, der indeholder stivelse, anvendes for det meste til masseproduktion af hypokrealeanske svampe, da svampene let nedbryder stivelse gennem udskillelse af stærkt koncentrerede hydrolytiske enzymer fra deres bindestregsspidser, for at trænge ind i det faste stof og for at få adgang til de næringsstoffer, der er til stede i stoffet 11,17,18,23 . Kornprodukterne stiller også krav til sund biomasseproduktion, fordi substraterne, når de hydreres og steriliseres, kan optage yderligere næringsstoffer fra ethvert flydende medium 16,18,24.
Tidligere forsøgte flere undersøgelser at massekulturere EPF-arter som Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas og nogle af Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin artskompleks isolerer på forskellige substrater 16,23,24. Sådanne masseproducerede og kommercielt udviklede isolater omfatter Green Muscle® (stamme IMI 330189), udviklet fra M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 stamme ICIPE69) og Real Metarhizium 69 (L9281), udviklet fra M. anisopliae, og bredbånd® (stamme PPRI 5339) og Eco-Bb®, udviklet fra B. bassiana25,26 . Der er dog gjort begrænsede forsøg på massekultur Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber og Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Disse to isolater blev udvalgt i en tidligere undersøgelse som de mest effektive til bekæmpelse af mælkebuggen, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Derfor havde den nuværende undersøgelse til formål at formulere og masseproducere et tilstrækkeligt antal modstandsdygtige infektiøs propaguler af de lokale isolater af M. robertsii og M. pinghaense til kommerciel anvendelse mod skadedyr. Den faste substratfermenteringsmetode blev brugt til at masseproducere svampekonidierne for begge EPF-isolater. To EPF-podningsmetoder ved anvendelse af konidiale suspensioner og den flydende svampekultur af blastosporer blev anvendt til at inokulere de faste substrater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kilde til svampestammer
- Brug sydafrikanske isolerede svampestammer af både M. pinghaense 5 HEID (GenBank tiltrædelsesnummer: MT367414/ MT895630) og M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), indsamlet fra æbleplantager i Western Cape-provinsen, Sydafrika.
- Dyrkningskulturer af hvert EPF-isolat på 60 g Sabouraud dextrose agar medium, suppleret med 1 g gærekstrakt (SDAY) og 10 μL Streptomycin.
BEMÆRK: Inkuber EPF-kulturer ved en kontrolleret temperatur på ± 25 °C i mørke.
2. Metarhizium pinghaense og M. robertsii conidial suspension podning
- Fremstilling af de faste substrater
- Brug to landbrugsprodukter, nemlig flager havre og flager byg, som vækstmedier for de to EPF-isolater og autoklaveposer (305 mm × 660 mm) som gæringsposer.
- Brug et lille polyvinylchloridaffaldsrør (1000 mm × 50 mm) til at skabe en hals til gæringsposen i den åbne ende af autoklaveposen, og brug autoklavetape til at fastgøre røret til posen.
- Luk røret med en steril bomuldsuldprop for at muliggøre tilstrækkelig gasudveksling under gæringen.
- Afvej tørre korn (200 g) af både flager havre og flager byg og læg dem i gæringsposerne, og til hver pose tilsættes 100 ml destilleret vand og blandes indholdet af poserne grundigt.
- Lad de våde korn hvile i 15-30 minutter for at absorbere fugt inden autoklavering og sterilisering. Forbered seks poser til hver korntype, og for at forhindre forurening skal du placere poserne i andre autoklaveposer og autoklaver substraterne ved 121 ° C i 55 minutter.
- Fremstilling af conidial suspension inokulum
- Høst 2-3 uger gamle svampekonidier fra svampekulturer af både M. pinghaense og M. robertsii ved skrabning ved hjælp af et sterilt kirurgisk blad.
- Suspender de opsamlede svampekonidier i 20 ml sterilt destilleret vand, suppleret med 0,05% Tween 20, og hvirvelblanding af de konidiale suspensioner i 2 minutter.
- Der forberedes 20 ml konidialsuspensioner med en koncentration på 1 × 107 conidier/ml, og podes henholdsvis faste substrater for flager havre og flager af byg.
BEMÆRK: Brug et hæmocytometer til at bestemme konidiale koncentrationer.
- Podning af de faste substrater
- Åbn hver pose ved at fjerne bomuldsuldens nakkepropper, og tilsæt den forberedte 20 ml konidiale suspension til det afkølede autoklavede substrat.
- Luk poserne igen ved hjælp af nakkepropperne, og massér posens indhold, så svampeinokulumet kan blandes jævnt med kornsubstratet.
- Gæringsposerne inkuberes ved en kontrolleret temperatur på ± 25 °C og sikrer tilstrækkelig gasformig udveksling mellem kulturen og miljøet.
BEMÆRK: Denne procedure skal udføres under et laminært flowskab.
- Fermenteringsfase
- Massér kornsubstraterne manuelt i fermenteringsposerne 2 dage efter podning og inkubation, når synlig mycelial vækst opstår, og substratet er begyndt at blive klumpet af den voksende svamp.
BEMÆRK: Dette gøres for at blande de podede granulater for at muliggøre mycelforgrening i de første tidlige stadier af svampens vegetative vækst. - Brug en køkkenrullestift til at manipulere substratbedet for at undgå den fysiske heterogenitet af kornsubstratbedene og lagtykkelsen af substratmassen.
BEMÆRK: Processen fremmer svampemetabolisme, som optimerer svampesporeproduktionen og maksimerer overfladearealet, hvilket fremmer conidial udbytte18. - Lad fermenteringsprocessen fortsætte i op til 4-5 uger, og kontroller fermenteringsposerne hver anden dag for tilstedeværelsen af enhver hvid vegetativ overvækst, der kan udvikle sig under fermenteringsprocessen, hvilket i høj grad kan påvirke svampekonidiudbyttet.
BEMÆRK: Afslut straks gæringen i gæringsposerne, der indeholder hvid vegetativ tilgroning, og tør svampekulturerne18.
- Massér kornsubstraterne manuelt i fermenteringsposerne 2 dage efter podning og inkubation, når synlig mycelial vækst opstår, og substratet er begyndt at blive klumpet af den voksende svamp.
3. Blastospore podning
- Blastospore produktion og podning
- Der fremstilles et flydende dyrkningsmedium indeholdende 1 liter destilleret vand, 30 g glucose, 20 g gærekstrakt, 4 g kaliumphosphatdiabasisk (K2HPO4), 15 ml majsstejllud og 10 μg/ml af antibiotikummet Streptomycin til både M. pinghaense og M. robertsii.
- Opvarm først det destillerede vand, sluk inden kogepunktet, og tilsæt hver af ingredienserne, undtagen Streptomycin, til det varme vand i gryden. Bring mediet i kog i 3-4 minutter, og rør konstant mediet for at muliggøre korrekt blanding af ingredienserne og forhindre bundfældning af nogle af ingredienserne i bunden af gryden.
- Hæld i alt 100 ml af mediet i ni forskellige 250 ml kolber og anbring en vatpind på hver kolbe, og dæk bomuldsulden med aluminiumsfolie som prop (figur 1A).
- Autoklaver mediet i kolberne i 55 min. ved 121 °C. Efter autoklaven afkøles mediet i kolberne, og der tilsættes 10 mg/ml Streptomycin til mediet i hver kolbe (figur 1B).
- To til tre bakteriesløjfer af svampekonidier opsamles fra 2-3 uger gamle svampekulturplader for begge EPF-isolaterne, M. pinghaense og M. robertsii, og overføres til hvert flydende medie på 100 ml i kolberne på 250 ml under sterile forhold, og kolberne forsegles.
- Inkubere de flydende dyrkningskolber ved ± 25 °C på en orbitalryster ved 140 o / min i 3 dage, og stop inkubationen, når kulturerne viser tegn på høj turbiditet med svampeblastosporevækst (figur 1C).
- For at påvise eventuel bakteriel kontaminering fra kulturerne udtages en prøve på 100 μL fra hver flydende dyrkningskolbe efter 24 timer under inkubationen og plade på tre SDA-plader pr. isolat. Pladerne inkuberes i 48 timer ved en kontrolleret temperatur på ± 25 °C.
- Fremstilling af det faste substrat
- Brug parboiled langkornet hvid ris som et fast substratmedium til blastosporerne af både M. pinghaense og M. robertsii (tilpasset fra Jaronski og Jackson18).
- Gæringsposerne som beskrevet ovenfor i trin 2.1.1-2.1.3 forberedes, og der tilsættes 1 kg ris og 300 ml sterilt destilleret vand for hver pose.
- Bland forsigtigt indholdet af gæringsposerne og læg dem i ydre autoklaveposer i opretstående stilling, og autoklave ved 121 °C i 55 min. Efter autoklaven skal substraterne køle af i ± 45 minutter under sterile forhold.
- Podning og gæring
- Lukningen af hver af de flydende dyrkningskolber af både M. pinghaense og M. robertsii fjernes under en laminær strømning, og hver kolbe flammes kant i 10 s.
- Hæld de 100 ml flydende kulturer i gæringsposerne ved at fjerne bomuldsuldpropperne fra halsen (figur 2). Sæt bomuldspropperne på igen, og dæk toppen af posens hals med kirurgisk papir, der er fastgjort med et gummibånd.
BEMÆRK: Blastosporekoncentrationen bestemmes for hver kolbe ved hjælp af et hæmocytometer, og der anvendes blastosporekoncentrationer på 1 × 107-5 × 108 blastosporer/ml til at inokulere substraterne28. - Drej den øverste del af posen og bland posens indhold ved at ryste og lette manipulation af underlaget ved massage, og inkuber poserne ved ± 25 °C ved at flade substratet i poserne for at forhindre dannelse af tykke senge18.
- Bryd substratet i fermenteringsposerne ved at massere indholdet af poserne 2-3 dage efter podningen og inkubationen, når synlig mycelial vækst og bindingen af substratet af svampen havde fundet sted (tilpasset fra teknikken i Jaronski og Jackson18).
BEMÆRK: Lad gæringen fortsætte i 4 uger.
Figur 1: Flydende dyrkningsmedium i 250 ml kolber. (A) Før autoklavering. (B) Efter autoklavering og podning med EPF-sporer. (C) Uklart medium med svampeblastosporer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Tilberedt blastospore flydende kulturmedium. (A) Metarhizium robertsii og (B) Metarhizium pinghaense før podning af ris som et fast substrat. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Tørring af svampekulturer
- Svampekulturerne tørres i 10-12 dage efter gæringen, inden de anvendes i forsøg, ved at overføre de sporulerede kulturer til 26-30 kg (30 x 43 x 15250cm3) brune papirposer.
- For at forbedre papirposernes trækstyrke skal du vandret afskære en tredjedel af den øverste del af hver pose og beklæde bunden af posen (figur 3A, B).
Figur 3: Fremstilling af papirposer, tørringsprocedure for kulturer og emballering. (A,B) Fremstilling af brune papirposer. Tørringsproceduren for Metarhizium-artskulturer dyrket på (C,E) parboiled ris og (D,F) flaget byg. (G) Papirposer lukket med hæfteklammer for at skabe en trekantet teltstruktur. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Smuldr forsigtigt substratet i hver gæringspose, skær hjørnet af hver pose af og overfør hele kulturen til papirposerne gennem det rum, der er tilbage af det afskårne hjørne (figur 3C-F). For at undgå overdreven undslippe af svampesporer i luften, udfør denne proces langsomt.
BEMÆRK: Udfør denne proces under sterile forhold ved hjælp af laminær strømning for at undgå forurening. - Mærk hver papirpose, og fold den øverste ende af hver pose to gange, og luk med hæfteklammer for at skabe en trekantet teltstruktur, og læg poserne på trådtørrestativer for at muliggøre korrekt, jævn tørring, ved en kontrolleret temperatur på ± 25 ° C og lav luftfugtighed på 30-40%.
- Vend poserne dagligt for at muliggøre jævn tørring af kulturerne og for at undgå vegetativ genvækst, der måtte finde sted, hvilket ville sænke udbyttet af høstbare svampesporer.
- Hver tørrepose vejes efter hver anden dag under tørringsprocessen, og tørringsprocessen for hver pose fortsættes, indtil der kun observeres få eller ingen ændringer i posernes masse mellem de på hinanden følgende dage.
5. Høst af svampekonidier
- Høst svampekonidier mekanisk fra kulturerne ved hjælp af tre indlejrede sigter, en testsigte (ETS) maske nr. 35 (med 500 μm blænde), indlejret på en testsigte (med 212 μm blænde), indlejret på ETS-maske nr. 100 (med 150 μm blænde), monteret på en opsamlingspande.
- Læg tørkulturprøven langsomt på ETS-maske nr. 35-sigten, og læg et låg på sigten for at forhindre frigivelse af svampekonidier i luften.
- Tilsæt 10-12 glaskugler til sigterne for at hjælpe med at passere svampekonidierne gennem maskeskærmene og undgå tilbageholdelse af conidierne i sigten, hvilket kan resultere i reduceret sporegenvinding.
- Tape og forsegl sigtesamlingerne ved hjælp af elektrisk tape for at forhindre udslip af konidialt støv.
- Anbring sigterne på en vibrationsryster, der er udstyret med en klæbrig pude, for at fastgøre opsamlingspanden og sigterne i 20-25 minutter i en bevægelse på 560-640 vibrationer pr. Minut (figur 4).
BEMÆRK: Teknik tilpasset fra Jaronski og Jackson18.
Figur 4: Høst af svampesporer fra tørrede Metarhizium robertsii kulturer på ris og flager byg. (A) 10-12 glaskugler tilsat sigterne for at hjælpe svampekonidierne med at passere gennem maskeskærmene. M. robertsii conidia høstet fra kulturer på (B) ris og (C) flagede næppe. (D) Sigter på en vibrationsryster. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Fjern testsigterne fra opsamlingspanden, saml conidier og opbevar de opsamlede conidier i lufttætte og vanduigennemtrængelige lynlåslåsposer til langtidsopbevaring (3-6 måneder).
6. Kvantificering af svampekonidier produceret
- Mål og registrer massen af hvert kornsubstrat inden høsten af svampekonidierne fra hvert substrat.
- Mål den samlede vægt af de indsamlede conidier ved at trække massen af de opsamlede sporer fra massen af det faste substrat.
BEMÆRK: Det samlede conidia udbytte involverer ikke kun de høstede conidier, men også svampe conidia tilbage på det faste substrat. - Vej substratet og fjern 10 g fra det vejede substrat. Suspender 10 g af substratet i 0,05% Tween 20 og fortynd i 10 ml sterilt destilleret vand.
- Vortex-bland suspensionen i 2 minutter, og brug et hæmocytometer til at udføre sporetællingen for at bestemme antallet af conidier, der vaskes fra substratet.
- Der foretages yderligere fortyndinger ved at overføre 1000 μL af den 10 ml vaskede conidialsuspension til 9 ml sterilt destilleret vand for at udgøre 10 ml fortyndingssuspensioner.
- Vortex-bland de konidiale suspensioner i 2 minutter, og bestem de konidiale koncentrationer.
BEMÆRK: Følg proceduren og formlen beskrevet af Inglis, Enkerli og Goettel30 for at bestemme suspensionernes konidiale koncentration. - Opsaml og suspender i alt 0,1 g af det opsamlede konidialpulver fra hver kultur i 10 ml sterilt destilleret vand suppleret med 0,05% Tween 20, og hvirvelblanding af den konidiale suspension i 2 minutter, og konidialkoncentrationen bestemmes ved hjælp af et hæmocytometer.
- Der foretages yderligere fortyndinger ved at overføre 1000 μL af 10 ml konidialsuspensionen til 9 ml sterilt destilleret vand for at udgøre 10 ml suspensionsfortyndingerne.
- Vortex-mix de konidiale suspensioner i 2 minutter, beregn de konidiale koncentrationer og bestem antallet af conidier pr. Gram.
- Multiplicer antallet af conidier pr. Gram høstet pulver med den oprindelige masse af det høstede konidiale pulver. Multiplicer antallet af conidier vasket fra substratet med den samlede vægt af det brugte substrat, der er substratet, hvorfra conidierne blev høstet.
- De to givne værdier lægges sammen, og divideres med substratets oprindelige tørvægt for at beregne antallet af conidier pr. kg eller g af substratet18.
BEMÆRK: Beregningerne blev hovedsageligt udført for rissubstratet. Spirings- eller conidial levedygtighedstesten blev udført for både M. pinghaense og M. robertsii-isolaterne for at bestemme levedygtigheden af de producerede conidier.
7. Analyse af data
- Brug et passende computersoftwareprogram til at foretage den statistiske analyse af de opnåede resultater.
BEMÆRK: Statistisk analyse af dataene blev udført ved hjælp af STATISTICA version 13.5.0.17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et fald i indholdsmassen af kulturerne på ris for både M. pinghaense og M. robertsii blev observeret over tid under tørringsfasen af svampekulturerne, hvor der ikke blev observeret nogen eller lidt ændring i massen, når kulturerne var tørre (figur 5). Det høstede tørre svampekonidierpulver fra både M. pinghaense og M. robertsii er vist i figur 6.
Figur 5: Ændringen i poseindholdsmassen af Metarhizium robertsii og M. pinghaense-kulturerne på ris (95% konfidensinterval) over 10 dage (ANOVA; F5,35 = 2,21; p = 0,08). Forskellige bogstaver over stængerne angiver den signifikante forskel (p < 0,05) opnået i poseindholdsmasse i løbet af dagene. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Høstede conidier. (A) Høstede conidier i opsamlingspanden. (B) Metarhizium robertsii. (C) M. pinghaense. Klik her for at se en større version af denne figur.
Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel i det gennemsnitlige konidiale pulver, der blev høstet fra hver korntype for både M. pinghaense og M. robertsii. Høstede tørre conidier for begge havde i gennemsnit >90% conidial levedygtighed for både M. pinghaense og M. robertsii. På rissubstratet producerede M. pinghaense i gennemsnit 8,2 g ± 4,38 g konidialt pulver, hvilket lidt oversteg den mængde, der blev opnået for M. robertsii (6 g ± 2 g). Et gennemsnit på 1,83 g ± 1,47 g tør M. robertsii conidia blev høstet fra det flagede bygsubstrat, mens nul M. pinghaense blev høstet fra substratet. Der blev ikke høstet tørre svampekonidier fra det flagede havresubstrat for hverken M. pinghaense eller M. robertsii (figur 7).
Figur 7: Gennemsnitlig mængde conidia pulver. Den gennemsnitlige mængde conidiapulver af Metarhizium pinghaense og M. robertsii, målt i gram (95% konfidensinterval) høstet fra de tre faste substrater: parboiled ris, flaget byg og flaget havre (ANOVA: F2,27 = 2,82; p = 0,08). Klik her for at se en større version af denne figur.
Der blev observeret en signifikant forskel i de anslåede gennemsnitlige conidier pr. gram, høstet fra riskornene, mellem M. pinghaense (3,51 x 107/g ± 0,43 x 107/g) og M. robertsii (4,31 x 107/g ± 0,38 x 107/g). M. robertsii havde et lidt højere gennemsnitligt conidiatal pr. gram end M. pinghaense (figur 8).
Figur 8: Gennemsnitlige conidier pr. gram. De estimerede gennemsnitlige conidier pr. gram for Metarhizium pinghaense og M. robertsii (95 % konfidensinterval) fra riskulturerne (ANOVA: F 1,7 = 8,47; p = 0,02). Klik her for at se en større version af denne figur.
Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel i det anslåede antal conidier, der var til stede på det brugte rissubstrat, mellem M. pinghaense (5,02 x 107/ml ± 1,47 x 107/ml) og M. robertsii (3,70 x 107/ml ± 0,91 x 107/ml) (figur 9). M. pinghaense havde imidlertid et lidt højere antal conidier til stede på rissubstratet end M. robertsii.
Figur 9: Gennemsnitlige svampekonidier. De estimerede gennemsnitlige svampekonidier af Metarhizium pinghaense og M robertsii (95% konfidensinterval) fra kulturerne (F1,7 = 2,45; p = 0,16), der er til stede på de brugte riskultursubstrater. Klik her for at se en større version af denne figur.
Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel i det estimerede samlede conidia-udbytte mellem M. pinghaense (5,09 x 107/g ± 1,35 x 107/g) og M. robertsii (3,55 x 107/g ± 0,85 x 107/g) opnået fra rissubstratkulturerne. M. pinghaense producerede imidlertid et lidt højere konidialudbytte end M. robertsii, hvilket gav et lavere konidialudbytte (figur 10).
Figur 10: Samlet conidia udbytte. Det estimerede samlede conidia udbytte af Metarhizium pinghaense og M. robertsii (95% konfidensinterval) fra kulturerne på ris (F1,7 = 3,91; p = 0,09). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den vellykkede integration af mikrobielle agenser til biologisk bekæmpelse af vigtige landbrugsinsektskadegørere i et agroøkosystem afhænger af både succes og let masseproduktion af entomopatogenerne som det første skridt under laboratorieforhold. Masseproduktionen af EPF er vigtig for den store anvendelse og tilgængelighed af EPF-produkter til IPM-programmer, der bruger biologisk kontrol 9,10,11,12,13. Succesen med masseproduktion af forskellige EPF-isolater påvirkes af ernæringskomponenterne i produktionssubstratet eller mediet, hvilket i væsentlig grad påvirker egenskaberne ved de resulterende conidier, herunder deres effektivitet, udtørringstolerance, feltpersistens og conidial udbytte 8,19,20,21 . Derfor er det vigtigt at udvikle viden om de ernæringsmæssige behov for masseproducerede entomopatoggener under dyrknings- og fermenteringsprocessen29.
I den aktuelle undersøgelse blev masseproduktionen af både M. robertsii og M. pinghaense udført ved anvendelse af tre forskellige landbrugsprodukter som gæringssubstrater: parboiled ris, flager byg og flager havre. De tre forskellige kornsubstrater blev observeret for at påvirke svampeisolaternes konidiale udbytte betydeligt. Den parboiled ris var yderst gunstig for masseproduktion af begge isolater, mens de flagede bygkorn kun favoriserede produktionen af M. robertsii . Observationerne blev foretaget på baggrund af udbyttet af tørt svampekonidipulver efter gæring. Lidt eller nej, conidier blev høstet fra de flagede havre efter gæring. De flagede havre viste sig at bevare højere fugtighedsniveauer i gæringsposerne under fermenteringsprocessen, hvilket kunne have resulteret i den observerede dårlige ydeevne af kornet som substrat til produktion af M. pinghaense og M. robertsii. Det flagede havresubstrat var i nogle tilfælde tilbøjeligt til en hvid vegetativ mycelial overvækst af svampeisolaterne, hvilket i høj grad påvirkede det konidiale udbytte, da sporulation ikke forekom i gæringsposerne, der indeholdt tilgroningen. Fermenteringsposerne med det flagede havresubstrat blev også observeret at have høje niveauer af bakteriel kontaminering i forhold til fermenteringsposerne indeholdende flager bygsubstrater.
Høje niveauer af saprofytiske svampe eller gærforurening blev observeret vedrørende masseproduktion af M. pinghaense ved anvendelse af flaget byg som substrat. Den saprofytiske svampekontaminering blev observeret på et senere stadium af fermenteringsprocessen gennem vækst og conidiogenese af en anden svamp end den, der blev brugt til at inokulere substratet. Det var vanskeligt at diagnosticere substratkontaminering i en indledende fase af fermenteringen forud for konidial sporulation. Bakteriel og gærforurening under gæringsprocessen menes at manifesteres af våde pletter i substratet, og både flager havre og bygkorn har tendens til at absorbere og bevare fugt i længere tid end riskorn. Dette var en begrænsning til at anvende disse to substrater som fermenteringssubstrater til masseproduktion af de to Metarhizium-isolater .
Observationerne foretaget under den aktuelle undersøgelse viste, at den type podningsmetode, der blev brugt til at inokulere hvert kornsubstrat, påvirkede conidialproduktionen. Den konidiale suspensionspodningsmetode viste sig at være relativt mindre effektiv, da de podede flager havre og flager byg viste et øget forureningsniveau i forhold til, da den væskedyrkede blastosporepodningsmetode blev anvendt på riskorn. I modsætning til den væskekulturerede blastosporepodningsmetode tillader den konidiale suspensionsmetode ikke påvisning af mulige forurenende stoffer i suspensionerne inden podning af substraterne, hvilket resulterer i de høje niveauer af kontaminering, der blev observeret i fermenteringsposerne. Jaronski og Jackson18 beskrev flere faktorer, der kunne føre til mulig forurening af de anvendte substrater, såsom manglen på fuldstændig sterilisering af substratet, ikke-steril podning og forkert håndtering af fermenteringssubstratet i poserne. Den observerede forurening i gæringsposerne indeholdende flaget byg og flager havre kan også have været et resultat af manglende fuldstændig sterilisering af substratet, hvilket kunne have fundet sted under autoklaveringsprocessen. Jaronski og Jackson18 beskrev også brugen af conidiale suspensioner som inokulanter som værende ufordelagtig, da det resulterer i øgede chancer for forurening under den konidiale høst fra et agarmedium.
I marken opbygger svampen under infektion af egnede værter først biomasse i insekternes hæmocoel gennem spredning, inden den opstår og sporulation på insekternes ydre faste overflade30. En sådan proces blev efterlignet ved anvendelse af væske-blastosporefermenteringsmetoden. Følgelig repræsenterede bouillon insektets hæmocoel, podningen af bouillon med svampekonidier repræsenterede insektets indledende kontakt og infektion, og dannelsen af blastosporer i bouillon repræsenterede spredning af blastosporeprocessen, der forekommer inde i det inficerede insekts hæmocoel. Den endelige podning af riskornene og sporulation af svampen på kornene over tid repræsenterede, hvad der sker på insektets neglebånd, når svampen begynder at dukke op inde fra insektets kadaver. Dette kan muligvis forklare, hvorfor den flydende blastosporefermenteringsmetode fungerede bedre end den konidiale suspensionspodningsmetode.
Jaronski og Jackson18 beskrev flager havre og flager bygkorn som de foretrukne landbrugskorn til massekultur af Metarhizium-arter sammenlignet med riskorn, da de to korntyper viste sig at opretholde deres fugtindhold under gæringsprocessen. Den nuværende undersøgelse modsiger imidlertid de førnævnte forskeres observationer og konklusioner, da både de flagede havre og den flagede byg ikke viste sig at være gode faste fermenteringssubstrater for hverken M. pinghaense eller M. robertsii. Risen viste sig at være et godt kornsubstrat for begge isolater, da den ikke nedbrydes til små partikler, der kunne blandes med slutproduktet, som det blev foreslået i tidligere undersøgelser.
Den nuværende undersøgelse har vist, at isolater af Metarhizium-arterne med succes kan dyrkes og masseproduceres ved hjælp af riskorn, og at de forskellige korn har tendens til at påvirke den konidiale sporulation og give forskelligt. Dette kan muligvis skyldes, at forskellige korn adskiller sig med hensyn til en sådan ernæringssammensætning, f.eks. kulstof: nitrogenforhold og kulstofkoncentration. Kulstofkoncentrationen og kulstofforholdet: nitrogenforholdet mellem et vækstmedium er kendt for at påvirke udbyttet af conidier såvel som dets kvalitet med hensyn til levedygtighed og virulens22. De podningsteknikker, der anvendes til at inokulere substraterne, har også vist sig at påvirke graden af succes opnået i masseproduktionen af EPF-isolater på specifikke landbrugskornsubstrater. Derfor anbefales den flydende blastosporefermenteringsteknik, der er beskrevet i den aktuelle undersøgelse, som værende den bedste podningsmetode til landbrugskornsubstrater til masseproduktion af både M. pinghaense - og M. robertsii-isolater . Anvendelse af en sådan metode muliggør mulig påvisning af kontaminering inden anvendelse af inokulanterne, hvilket kan hindre masseproduktionen af det ønskede EPF-isolat i forhold til anvendelsen af den konidiale suspensionspodningsteknik. Det anbefales også, at riskorn anvendes som de faste substrater til masseproduktion af conidier af både M. pinghaense og M. robertsii, snarere end flager byg og flager havre. Den beskrevne teknik er vigtig for fremtidig masseproduktion og kommerciel anvendelse af conidierne under markforhold mod vigtige insektskadedyr i agroøkosystemerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Hort Pome, Hort Stone og Technology and Human Resources for Industry Programme (THRIP: TP14062571871) for at finansiere projektet.
ORCID:
Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween 20 | Lasec | Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water | |
| 20 mL McCartney bottles | Lasec | Used to make conidial suspensions | |
| Aluminium foil | Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask | ||
| Autoclave | Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process | ||
| Autoclave bags | Lasec | Fermentation bags or solid substrate containers | |
| Autoclave tape | Lasec | To secure PVC pipes on the fermentation bags | |
| Brown Kraft paper bags | Used to dry conidia cultures on agricultural grains | ||
| Bunsen burnner | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks) | |
| Clear edge test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Corn steep liquor | SIGMA | 66071-94-1 | Ingredient of the blastospore liquid medium |
| Cotton Wool | Lasec | Used as plug of the neck for fermentation bags | |
| Duran laboratory bottles | Neolab | Used to autoclave SDA medium and distilled water | |
| Electrical tape | Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust | ||
| ENDECOTTS test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask | Lasec | Carrier of the blastospore liquid medium | |
| Ethanol (99%) | Lasec | Used to sterilize surgical blades and inoculating loops | |
| Flaked barley | Health Connection Wholefoods | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Flaked oats | Tiger brands | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Glucose | Merck | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Growth Chamber/ incubators | For growing fungal conidia culture | ||
| Haemocytometer | Used to determine conidial concentrations | ||
| Inoculating loops | Lasec | For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth | |
| Kitchen rolling pin | Used to manipulate the solid grain substrate bed | ||
| Laminar flow Cabinet | ESCO Laminar Flow Cabinet | Provide as sterile environment during substrate inoculation | |
| Metarhizium pinghaense conidia | Stellenbosch University | 5HEID | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense |
| Metarhizium robertsii conidia | Stellenbosch University | 6EIKEN | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii |
| Microscope | ZEIZZ (Scope. A1) | Used to determine conidial concentrations and conidial viability | |
| Orbital shaker | IncoShake- LABOTEC | Used for the blastospore production process | |
| Parboiled rice | Spekko | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination | |
| Petri-dishes | Lasec | Containers for the SDA medium | |
| Pipettes and pipette tips | Labnet (BioPette PLUS) | Used to measure liquids ingredients | |
| Polyvinylchloride Marley waste pipe | Used to create a neck for the fermentation bag | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Rubber band | Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks | ||
| Sabaroud dextrose agar (SDA) | NEOGEN Culture Media | Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii | |
| Sterile distilled water | To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions | ||
| Sticky pad | Used to secure the seives on the vibratory shaker | ||
| Surgical blade | Lasec | Used to scrape off spores from fungal cultures | |
| Surgical paper | Lasec | Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag | |
| Vibratory shaker | Used to shake conidia off the agricultural grain substrates | ||
| Vortex mixer | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles | |
| Yeast extract | Biolab | Added to the SDA medium to improve spore germination and growth | |
| Zipper-lock bags | GLAD | Used to to store harvested fungal conidia |
References
- Shah, P. A., Pell, J. K. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes. African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).
- Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia. Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).
- Banu, J. G., Rajalakshmi, S. Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi. Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).
- Roberts, D. W., Humber, R. A. Entomogenous fungi. Biology of Conidial Fungi. Cole, G. T., Kendrick, W. B. , Academic Press. New York. 201-236 (1981).
- Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. G. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control. Current status. Biocontrol Science and Technology. 4 (1), 3-34 (1994).
- Karanja, L. W., Phiri, N. A., Oduor, G. I. Effect of different solid substrates on mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae entomopathogens. The Proceedings of the12th KARI Biennial Scientific Conference. , Nairobi, Kenya. 8-12 (2010).
- Prasad, C. S., Pal, R. Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste. Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).
- Ehlers, R. U. Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection. Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).
- Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. G., Kim, K. Production of blastospore of entomopathogenic Beauveria bassiana in a submerged batch culture. Mycobiology. 37 (3), 218-224 (2009).
- Bhadauria, B. P., Puri, S., Singh, P. K. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products. The Bioscan. 7 (2), 229-232 (2012).
- Latifian, M., Rad, B., Amani, M. Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid-solid diphasic method for date palm pest control. International Journal of Farming and Allied Sciences. 3 (4), 368-372 (2014).
- Agale, S. V., Gopalakrishnan, S., Ambhure, K. G., Chandravanshi, H., Gupta, R., Wani, S. P. Mass production of entomopathogenic fungi (Metarhizium anisopliae) using different grains as a substrate. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (1), 2227-2232 (2018).
- Jackson, M. A. Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19 (3), 180-187 (1997).
- Deshpande, M. V. Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges. Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).
- Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products. African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).
- Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. M. Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations. Bioprocess Engineering. 23 (1), 25-29 (2000).
- Jaronski, S. T., Jackson, M. A. Mass production of entomopathogenic Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology 2nd edition. Lacey, L. A. , Academic Press. London. 255-284 (2012).
- Vega, F. E., Jackson, M. A., Mercandier, G., Poprawski, T. J. The impact of nutrition on spore yields for various fungal entomopathogens in liquid culture. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 (4), 363-368 (2003).
- El Damir, M. Effect of growing media and water volume on conidial production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Journal of Biological Sciences. 6 (2), 269-274 (2006).
- Pandey, A. K., Kanaujia, K. R. Effect of different grains as solid substrates on sporulation, viability and pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin. Journal of Biological Control. 22 (2), 369-374 (2008).
- Kassa, A., et al. Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Mycological Research. 112 (5), 583-591 (2008).
- Sharma, S., Gupta, R. B. L., Yadavam, C. P. S. Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens. Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).
- Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).
- Price, R. E., Müller, E. J., Brown, H. D., D'Uamba, P., Jone, A. A. The first trial of a Metarhizium anisopliae var. acridum mycoinsecticide for the control of the red locust in a recognised outbreak area. International Journal of Tropical Insect Science. 19 (4), 323-331 (1999).
- Hatting, J. L., Moore, S. D., Malan, A. P. Microbial control of phytophagous invertebrate pests in South Africa. Current status and future prospects. Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae). Biocontrol Science and Technology. , (2021).
- Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , Academic Press, Elsevier. Chapter 7 189-253 (2012).
- Mehta, J., et al. Impact of carbon & nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi). European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).
- Burges, H. D. Formulation of mycoinsecticides. Formulation of Microbial Biopesticides. , Springer. Dordrecht. 131-185 (1998).
