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Biology

Production de masse de champignons entomopathogènes, Metarhizium robertsii et Metarhizium pinghaense, pour une application commerciale contre les insectes nuisibles

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63246
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Conservation Ecology and Entomology, Faculty of AgriSciences, Private Bag X1

Summary

Les champignons entomopathogènes ont gagné en importance en tant qu’agents de lutte biologique contre les insectes nuisibles agricoles. Dans cette étude, la production en masse d’un nombre suffisant de propagules infectieuses résilientes d’isolats sud-africains de Metarhizium robertsii et de M. pinghaense pour une application commerciale contre les insectes nuisibles a été menée avec succès en utilisant des produits céréaliers agricoles.

Abstract

Les champignons entomopathogènes du complexe d’espèces Metarhizium anisopliae ont gagné en importance en tant qu’agents de lutte biologique contre les insectes nuisibles agricoles. L’augmentation de la résistance des ravageurs aux insecticides chimiques, les préoccupations croissantes concernant les effets négatifs des insecticides sur la santé humaine et la pollution de l’environnement par les pesticides ont conduit à une campagne mondiale pour trouver de nouvelles stratégies durables pour la protection des cultures et la lutte antiparasitaire. Auparavant, des tentatives de culture de masse d’espèces de champignons entomopathogènes (EPF) telles que Beauveria bassiana ont été menées. Cependant, seules des tentatives limitées ont été menées pour la culture de masse Metarhizium robertsii et M. pinghaense pour une utilisation contre les insectes nuisibles. Cette étude visait à produire en masse un nombre suffisant de propagules infectieuses résilientes d’isolats sud-africains de M. robertsii et de M. pinghaense pour une application commerciale. Trois produits céréaliers agricoles, l’avoine en flocons, l’orge en flocons et le riz, ont été utilisés comme substrats de fermentation solide epf. Deux méthodes d’inoculation, les suspensions conidiales et la culture fongique liquide de blastospores ont été utilisées pour inoculer les substrats solides. L’inoculation à l’aide de suspensions conidiales s’est avérée relativement moins efficace, car des niveaux accrus de contamination ont été observés sur les substrats solides par rapport à l’utilisation de la méthode d’inoculation blastospore. L’avoine en flocons n’a pas été un substrat de croissance approprié pour M. robertsii et M. pinghaense, car aucune conidie sèche n’a été récoltée à partir du substrat. Il a été constaté que l’orge en flocons favorisait la production de conidies M. robertsii par rapport à celle de M. pinghaense, et une moyenne de 1,83 g ± 1,47 g de conidies sèches de M. robertsii et zéro gramme de conidies M. pinghaense ont été récoltés sur le substrat. Il a été constaté que les grains de riz favorisaient la production de masse conidiale d’isolats de M. pinghaense et de M. robertsii , avec une moyenne de 8,2 g ± 4,38 g et 6 g ± 2 g récoltés sur le substrat, respectivement.

Introduction

Les champignons entomopathogènes (FPE) ont gagné en importance en tant qu’agents de protection des cultures dans la lutte biologique contre les insectes nuisibles agricoles importants 1,2. Les entomopathogènes, qui se produisent naturellement dans le sol, provoquent des épizooties dans les populations de diverses espèces de ravageurs3. Les espèces de FPE sont spécifiques à l’hôte et présentent relativement peu de risques en termes d’attaque d’espèces non ciblées, et elles ne sont pas toxiques pour l’environnement4. Les FPE ont un mécanisme unique pour envahir leur hôte, ainsi que pour se propager et persister dans leur environnement immédiat1. Ils attaquent l’hôte principalement par le biais de spores asexuées qui s’attachent et pénètrent dans la cuticule de l’hôte pour envahir et proliférer dans l’hémocène hôte. L’hôte finit par mourir en raison de l’épuisement des nutriments de l’hémolymphe ou à la suite de la toxémie causée par les métabolites toxiques libérés par le champignon. Après la mort, dans des conditions environnementales idéales, le champignon émerge sur la surface externe (mycose manifeste) du cadavre hôte 5,6.

Les préoccupations croissantes concernant les effets négatifs des résidus chimiques sur la santé humaine, la pollution de l’environnement et le développement de la résistance aux ravageurs ont conduit à la campagne mondiale visant à réduire les apports d’insecticides à base de produits chimiques et à trouver des stratégies alternatives, nouvelles et durables pour la protection des cultures et la lutte antiparasitaire 6,7,8 . Cela a permis de mettre au point des insecticides à base de microbes à utiliser dans les programmes de lutte intégrée contre les ravageurs (LAI), qui sont des stratégies plus favorables sur le plan écologique que la lutte chimique conventionnelle 3,8.

Pour mettre au point un agent de lutte microbienne efficace pour un ravageur agricole, un organisme approprié doit d’abord être isolé, caractérisé, identifié et sa pathogénicité pour l’organisme nuisible cible confirmée. Cependant, une méthode simple et rentable pour la production à grande échelle de l’agent microbien est nécessaire pour produire un produit viable destiné à être utilisé dans les programmes de lutte biologique 9,10,11,12,13. La production en masse de quantités substantielles d’entomopathogènes de bonne qualité dépend de la souche microbienne, de l’environnement, du ravageur cible, de la formulation, du marché, de la stratégie d’application et du produit final souhaité 14,15,16. L’EPF peut être produit en série en utilisant la fermentation de substrat liquide pour produire des blastospores ou le processus de fermentation de substrat solide pour produire des conidiesaériennes 6,17,18. Cependant, le processus de production et de formulation en masse des entomopathogènes influence directement la virulence, le coût, la durée de conservation et l’efficacité sur le terrain du produit final. Pour une utilisation réussie dans la lutte intégrée, le processus de production des entomopathogènes doit être facile à exécuter, nécessiter un minimum de travail, produire une concentration à haut rendement de propagules virulentes, viables et persistantes et être peu coûteux 4,13,14,16.

Comprendre les besoins nutritionnels des entomopathogènes est important pour la culture de masse avec toutes les méthodes de culture 4,12. Les composants nutritionnels du milieu de production ont un impact significatif sur les attributs des propagules résultantes, y compris l’efficacité du biocontrôle, le rendement, la tolérance à la dessiccation et la persistance 8,19,20,21. L’optimisation des procédures de production est conçue pour répondre à ces facteurs22. Pour l’EPF, les principales exigences pour une bonne croissance, une sporulation et une production de masse de conidies fongiques sont une humidité adéquate, une température de croissance optimale, un pH, un échange gazeux de CO2 et d’O2 et une nutrition, y compris de bonnes sources de phosphore, de glucides, de carbone et d’azote18.

Jaronski et Jackson18 décrivent la méthode de fermentation du substrat solide comme la méthode d’approximation la plus efficace et la plus proche du processus naturel de production d’EPF par rapport à la méthode de fermentation du substrat liquide car, dans des conditions naturelles, le conidium fongique est porté sur des structures érigées solides, comme la surface des cadavres d’insectes. Les produits agricoles et les sous-produits contenant de l’amidon sont principalement utilisés pour la production de masse de champignons hypocréagènes, car les champignons décomposent facilement l’amidon par la sécrétion d’enzymes hydrolytiques hautement concentrées à partir de leurs extrémités hyphales, pour pénétrer dans la substance solide et pour accéder aux nutriments présents dans la substance 11,17,18,23 . Les produits céréaliers répondent également aux besoins d’une production saine de biomasse car, lorsqu’ils sont hydratés et stérilisés, les substrats peuvent absorber d’autres nutriments de tout milieu liquide 16,18,24.

Auparavant, plusieurs études ont tenté de cultiver en masse des espèces d’EPF comme Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas et une partie du Metarhizium anisopliae (Metschn.) Isolats complexes d’espèces de sorokine sur divers substrats 16,23,24. Ces isolats produits en série et développés commercialement comprennent Green Muscle® (souche IMI 330189), développé à partir de M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (souche Meta 69 ICIPE69), et Real Metarhizium 69 (L9281), développé à partir de M. anisopliae, et Broadband® (souche PPRI 5339) et Eco-Bb®, développé à partir de B. bassiana25,26 . Cependant, des tentatives limitées ont été faites pour la culture de masse Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber et Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Ces deux isolats ont été sélectionnés dans une étude précédente comme les plus efficaces pour la lutte contre la cochenille, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Par conséquent, la présente étude visait à formuler et à produire en masse un nombre suffisant de propagules infectieuses résilientes des isolats locaux de M. robertsii et M. pinghaense pour une application commerciale contre les insectes nuisibles. La méthode de fermentation du substrat solide a été utilisée pour produire en masse les conidies fongiques pour les deux isolats d’EPF. Deux méthodes d’inoculation EPF, utilisant des suspensions conidiales et la culture fongique liquide de blastospores, ont été utilisées pour inoculer les substrats solides.

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Protocol

1. Source des souches fongiques

  1. Utiliser des souches fongiques isolées sud-africaines de M. pinghaense 5 HEID (numéro d’acquisition GenBank : MT367414/MT895630) et M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), collectées dans des vergers de pommiers de la province du Cap-Occidental, en Afrique du Sud.
  2. Cultiver des cultures de chaque isolat d’EPF sur 60 g de milieu de gélose au dextrose Sabouraud, complété par 1 g d’extrait de levure (SDAY) et 10 μL de streptomycine.
    REMARQUE: Incuber des cultures EPF à une température contrôlée de ± 25 ° C dans l’obscurité.

2. Metarhizium pinghaense  et M. robertsii inoculation en suspension conidiale

  1. Préparation des substrats solides
    1. Utiliser deux produits agricoles, à savoir l’avoine en flocons et l’orge en flocons, comme milieux de croissance pour les deux isolats d’EPF et les sacs d’autoclave (305 mm × 660 mm) comme sacs de fermentation.
    2. Utilisez un petit tuyau de déchets de polychlorure de vinyle (1000 mm × 50 mm) pour créer un goulot pour le sac de fermentation à l’extrémité ouverte du sac autoclave et utilisez du ruban adhésif pour fixer le tuyau au sac.
    3. Fermez le tuyau avec un bouchon de coton stérile pour permettre un échange de gaz suffisant pendant la fermentation.
    4. Peser les grains secs (200 g) de l’avoine en flocons et de l’orge en flocons et les placer dans les sacs de fermentation, et à chaque sac, ajouter 100 ml d’eau distillée et bien mélanger le contenu des sacs.
    5. Laissez reposer les grains humides pendant 15 à 30 minutes pour absorber l’humidité avant l’autoclavage et la stérilisation. Préparez six sacs pour chaque type de grain et, pour éviter toute contamination, placez les sacs dans d’autres sacs autoclaves et autoclavez les substrats à 121 °C pendant 55 min.
  2. Préparation de l’inoculum de suspension conidiale
    1. Récoltez des conidies fongiques âgées de 2 à 3 semaines à partir de cultures fongiques de M. pinghaense et de M. robertsii en les grattant à l’aide d’une lame chirurgicale stérile.
    2. Suspendre les conidies fongiques collectées dans 20 mL d’eau distillée stérile, complétée par 0,05% Tween 20, et mélanger les suspensions conidiales en vortex pendant 2 min.
    3. Préparer 20 mL de suspensions conidiales, avec une concentration de 1 × 107 conidies/mL, et inoculer les substrats solides d’avoine en flocons et d’orge en flocons, respectivement.
      REMARQUE: Utilisez un hémocytomètre pour déterminer les concentrations conidiales.
  3. Inoculation des substrats solides
    1. Ouvrez chaque sac en retirant les bouchons de col en coton et ajoutez la suspension cidiale préparée de 20 mL au substrat autoclavé refroidi.
    2. Refermez les sacs à l’aide des bouchons de cou et massez le contenu du sac pour permettre à l’inoculum fongique de se mélanger uniformément au substrat de grain.
    3. Incuber les sacs de fermentation à une température contrôlée de ± 25 °C et assurer un échange gazeux suffisant entre la culture et l’environnement.
      REMARQUE: Cette procédure doit être effectuée sous une armoire à flux laminaire.
  4. Phase de fermentation
    1. Massez manuellement les substrats de grain dans les sacs de fermentation 2 jours après l’inoculation et l’incubation, lorsque la croissance mycélienne visible se produit et que le substrat a commencé à être agglutiné par le champignon en croissance.
      REMARQUE: Ceci est fait pour mélanger les granules inoculés afin de permettre la ramification mycélienne au cours des premiers stades de la croissance végétative des champignons.
    2. Utilisez un rouleau à pâtisserie de cuisine pour manipuler le lit du substrat afin d’éviter l’hétérogénéité physique des lits de substrat de grain et l’épaisseur du lit de la masse du substrat.
      REMARQUE: Le processus favorise le métabolisme fongique, ce qui optimise la production de spores fongiques et maximise la surface, favorisant le rendement conique18.
    3. Laissez le processus de fermentation se poursuivre jusqu’à 4-5 semaines et vérifiez les sacs de fermentation tous les 2 jours pour la présence de toute prolifération végétative blanche qui peut se développer pendant le processus de fermentation, ce qui peut grandement affecter le rendement des conidies fongiques.
      REMARQUE: Terminez immédiatement la fermentation dans les sacs de fermentation contenant toute prolifération végétative blanche et séchez les cultures fongiques18.

3. Inoculation de blastospore

  1. Production et inoculation de blastospores
    1. Préparer un milieu de culture liquide contenant 1 L d’eau distillée, 30 g de glucose, 20 g d’extrait de levure, 4 g de phosphate de potassium diabasique (K2HPO4), 15 mL de liqueur de maïs et 10 μg/mL de l’antibiotique streptomycine, pour le M. pinghaense et le M. robertsii.
    2. Tout d’abord, chauffez l’eau distillée, éteignez-la avant d’atteindre le point d’ébullition et ajoutez chacun des ingrédients, à l’exception de la streptomycine, à l’eau chaude dans la casserole. Porter le milieu à ébullition douce pendant 3-4 min, et remuer constamment le milieu pour permettre le bon mélange des ingrédients et empêcher la sédimentation de certains des ingrédients au fond de la casserole.
    3. Versez un total de 100 mL du milieu dans neuf flacons différents de 250 mL et placez un bouchon de coton sur chaque flacon et recouvrez le coton avec du papier d’aluminium comme bouchon (Figure 1A).
    4. Autoclaver le milieu dans les flacons pendant 55 min à 121 °C. Après l’autoclavage, laisser refroidir le milieu dans les flacons et ajouter 10 mg/mL de streptomycine au milieu dans chaque flacon (figure 1B).
    5. Recueillir deux à trois boucles bactériennes de conidies fongiques dans des plaques de culture fongiques vieilles de 2 à 3 semaines pour les isolats d’EPF, M. pinghaense et M. robertsii, et transférer dans chaque milieu liquide de 100 mL dans les flacons de 250 ml, dans des conditions stériles, et sceller les flacons.
    6. Incuber les flacons de culture liquide à ± 25 °C, sur un agitateur orbital à 140 tr/min pendant 3 jours, et cesser l’incubation une fois que les cultures montrent des signes de turbidité élevée avec croissance fongique des blastospores (Figure 1C).
    7. Pour détecter toute contamination bactérienne possible des cultures, prélever un échantillon de 100 μL dans chaque fiole de culture liquide après 24 h pendant l’incubation et plaquer sur trois plaques SDA par isolat. Incuber les plaques pendant 48 h, à une température contrôlée de ± 25 °C.
  2. Préparation du substrat solide
    1. Utilisez du riz blanc étuvé à grains longs comme substrat solide pour les blastospores de M. pinghaense et de M. robertsii (adapté de Jaronski et Jackson18).
    2. Préparer les sachets de fermentation comme indiqué ci-dessus, aux étapes 2.1.1-2.1.3, et pour chaque sac, ajouter 1 kg de riz et 300 ml d’eau distillée stérile.
    3. Mélanger doucement le contenu des sacs de fermentation et placer dans des sacs d’autoclave extérieurs en position verticale, et autoclaver à 121 °C pendant 55 min. Après l’autoclavage, laissez refroidir les substrats pendant ± 45 minutes dans des conditions stériles.
  3. Inoculation et fermentation
    1. Retirer la fermeture de chacune des fioles de culture liquide de M. pinghaense et de M. robertsii sous un écoulement laminaire et enflammer le bord de chaque fiole pendant 10 s.
    2. Versez les cultures liquides de 100 ml dans les sacs de fermentation en retirant les bouchons de coton de leur cou (Figure 2). Replacez les bouchons de coton et couvrez le haut du cou du sac avec du papier chirurgical fixé avec un élastique.
      REMARQUE: Déterminer la concentration de blastospores pour chaque flacon à l’aide d’un hémocytomètre et utiliser des concentrations de blastospores de 1 × 107 - 5 × 108 blastospores / mL pour inoculer les substrats28.
    3. Tordre la partie supérieure du sac et mélanger le contenu du sac en secouant et en manipulant légèrement le substrat par massage, et incuber les sacs à ± 25 °C, en aplatissant le substrat dans les sacs pour éviter la formation de lits épais18.
    4. Casser le substrat dans les sacs de fermentation en massant le contenu des sacs, 2-3 jours après l’inoculation et l’incubation, lorsque la croissance mycélienne visible et la liaison du substrat par le champignon s’étaient produites (adapté de la technique de Jaronski et Jackson18).
      REMARQUE: Laissez la fermentation se poursuivre pendant 4 semaines.

Figure 1
Figure 1: Milieu de culture liquide dans des flacons de 250 mL. (A) Avant autoclavage. (B) Après autoclavage et inoculation avec des spores d’EPF. (C) Milieu trouble avec blastospores fongiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Milieu de culture liquide blastospore préparé. (A) Metarhizium robertsii et (B) Metarhizium pinghaense avant l’inoculation du riz comme substrat solide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Séchage des cultures fongiques

  1. Sécher les cultures fongiques pendant 10 à 12 jours après la fermentation, avant leur utilisation dans des essais, en transférant les cultures sporulées dans des sacs en papier brun de 26 à 30 kg (30 x 43 x 15250 cm3).
  2. Pour améliorer la résistance à la traction des sacs en papier, coupez horizontalement un tiers de la partie supérieure de chaque sac et tapissez le fond du sac (Figure 3A, B).

Figure 3
Figure 3: Préparation des sacs en papier, procédure de séchage des cultures et emballage. (A,B) Préparation des sacs en papier brun. La procédure de séchage des cultures d’espèces de Metarhizium cultivées sur du riz étuvé (C, E) et de l’orge en flocons (D, F). (G) Sacs en papier fermés avec des agrafes pour créer une structure de tente triangulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Émietter doucement le substrat dans chaque sac de fermentation, couper le coin de chaque sac et transférer toute la culture dans les sacs en papier à travers l’espace laissé par le coin de coupure (Figure 3C-F). Pour éviter l’échappement excessif de spores fongiques dans l’air, effectuez ce processus lentement.
    REMARQUE: Effectuez ce processus dans des conditions stériles, en utilisant un flux laminaire, pour éviter la contamination.
  2. Étiquetez chaque sac en papier et pliez-le sur l’extrémité supérieure de chaque sac deux fois et fermez-les avec des agrafes pour créer une structure de tente triangulaire, et placez les sacs sur des supports de séchage en fil pour permettre un séchage correct, uniforme, à une température contrôlée de ± 25 ° C et une faible humidité de 30 à 40%.
  3. Tournez les sacs tous les jours pour permettre un séchage uniforme des cultures et pour éviter toute repousse végétative qui pourrait avoir lieu, ce qui réduirait le rendement en spores fongiques récoltables.
  4. Peser chaque sac de séchage tous les 2 jours pendant le processus de séchage et poursuivre le processus de séchage pour chaque sac jusqu’à ce que peu ou pas de changement soit observé dans la masse des sacs entre les jours successifs.

5. Récolte de conidies fongiques

  1. Récolter mécaniquement les conidies fongiques des cultures à l’aide de trois tamis imbriqués, un tamis d’essai (ETS) maille n° 35 (avec une ouverture de 500 μm), imbriqué sur un tamis d’essai (avec une ouverture de 212 μm), imbriqué sur un maillage ETS n° 100 (avec une ouverture de 150 μm), monté sur un bac de collecte.
  2. Chargez lentement l’échantillon de culture sèche sur le tamis à mailles ETS n° 35 et placez un couvercle sur le tamis pour éviter la libération de conidies fongiques dans l’air.
  3. Ajouter 10 à 12 billes de verre aux tamis pour faciliter le passage des conidies fongiques à travers les tamis à mailles et éviter la rétention des conidies dans le tamis, ce qui peut réduire la récupération des spores.
  4. Scotchez et scellez les joints du tamis à l’aide de ruban électrique pour empêcher la fuite de poussière condescendante.
  5. Placez les tamis sur un agitateur vibrant, muni d’un tampon collant, pour fixer le bac de collecte et les tamis, pendant 20 à 25 minutes, à un mouvement de 560 à 640 vibrations par minute (Figure 4).
    NOTE: Technique adaptée de Jaronski et Jackson18.

Figure 4
Figure 4 : Récolte de spores fongiques provenant de cultures séchées de Metarhizium robertsii sur du riz et de l’orge en flocons. (A) 10 à 12 billes de verre ajoutées aux tamis pour faciliter le passage des conidies fongiques à travers les tamis maillés. Les conidies de M. robertsii récoltées dans les cultures sur (B) le riz et (C) s’écaillaient à peine. (D) Tamis sur un agitateur vibratoire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Retirez les tamis d’essai du bac de collecte, collectez les conidies et conservez les conidies collectées dans des sacs à fermeture à glissière étanches à l’air et imperméables à l’eau pour un stockage à long terme (3 à 6 mois).

6. Quantification des conidies fongiques produites

  1. Mesurer et enregistrer la masse de chaque substrat de grain avant la récolte des conidies fongiques de chaque substrat.
  2. Mesurer le poids total des conidies collectées en soustrayant la masse des spores collectées de la masse du substrat solide.
    REMARQUE: Le rendement total des conidies implique non seulement les conidies récoltées, mais aussi les conidies fongiques laissées sur le substrat solide.
  3. Peser le substrat et retirer 10 g du substrat pesé. Suspendre les 10 g du substrat dans 0,05% Tween 20 et diluer dans 10 mL d’eau distillée stérile.
  4. Mélangez la suspension en vortex pendant 2 min et utilisez un hémocytomètre pour faire le comptage des spores afin de déterminer le nombre de conidies lavées du substrat.
  5. Effectuer d’autres dilutions en transférant 1000 μL de la suspension conidiale lavée de 10 mL à 9 mL d’eau distillée stérile pour constituer 10 mL de suspensions de dilution.
  6. Mélange vortex les suspensions conidiales pendant 2 min et détermine les concentrations conidiales.
    REMARQUE: Suivez la procédure et la formule décrites par Inglis, Enkerli et Goettel30 pour déterminer la concentration conidiale des suspensions.
  7. Recueillir et suspendre un total de 0,1 g de la poudre cidiale recueillie de chaque culture dans 10 mL d’eau distillée stérile complétée par 0,05 % de Tween 20, et mélanger la suspension conique pendant 2 min, et déterminer la concentration cidiale à l’aide d’un hémocytomètre.
  8. Effectuer d’autres dilutions en transférant 1000 μL de la suspension conidiale de 10 mL à 9 mL d’eau distillée stérile pour constituer les dilutions de suspension de 10 mL.
  9. Vortex-mélanger les suspensions conidiales pendant 2 min, calculer les concentrations conidiales et déterminer le nombre de conidies par gramme.
  10. Multipliez le nombre de conidies par gramme de poudre récoltée par la masse initiale de la poudre conidiale récoltée. Multipliez le nombre de conidies lavées du substrat par le poids total du substrat usé, c’est-à-dire le substrat à partir duquel les conidies ont été récoltées.
  11. Additionnez les deux valeurs données et divisez par le poids sec initial du substrat pour calculer le nombre de conidies par kg ou g du substrat18.
    NOTE: Les calculs ont été effectués principalement pour le substrat de riz. L’essai de germination ou de viabilité conidiale a été effectué pour les isolats de M. pinghaense et de M. robertsii afin de déterminer la viabilité des conidies produites.

7. Analyse des données

  1. Utiliser un logiciel informatique approprié pour effectuer l’analyse statistique des résultats obtenus.
    REMARQUE : L’analyse statistique des données a été effectuée à l’aide de statistica version 13.5.0.17.

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Representative Results

Une diminution de la masse de teneur des cultures sur le riz pour le M. pinghaense et le M. robertsii a été observée au fil du temps pendant la phase de séchage des cultures fongiques, sans ou peu de changement observé dans la masse une fois les cultures sèches (figure 5). La poudre de conidies fongiques sèches récoltées du M. pinghaense et du M. robertsii est illustrée à la figure 6.

Figure 5
Figure 5 : Variation de la masse de la teneur en sacs des cultures Metarhizium robertsii et M. pinghaense sur riz (intervalle de confiance à 95 %) sur 10 jours (ANOVA; F5,35 = 2,21; p = 0,08). Différentes lettres au-dessus des barres indiquent la différence significative (p < 0,05) obtenue dans la masse du contenu du sac au fil des jours. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Conidies récoltées. (A) Conidies récoltées dans le bac de collecte. (B) Metarhizium robertsii. (C) M. pinghaense. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Aucune différence significative n’a été observée dans la poudre conidiale moyenne récoltée à partir de chaque type de grain pour M. pinghaense et M. robertsii. Les conidies sèches récoltées pour les deux avaient une viabilité conidiale moyenne de >90 % pour M. pinghaense et M. robertsii. Sur le substrat de riz, M. pinghaense a produit en moyenne 8,2 g ± 4,38 g de poudre conidiale, ce qui a légèrement dépassé la quantité obtenue pour M. robertsii (6 g ± 2 g). Une moyenne de 1,83 g ± 1,47 g de conidies sèches de M. robertsii ont été récoltées sur le substrat d’orge en flocons, tandis que zéro M. pinghaense a été récolté sur le substrat. Aucune conidie fongique sèche n’a été récoltée sur le substrat d’avoine en flocons pour M. pinghaense ou M. robertsii (figure 7).

Figure 7
Figure 7 : Quantité moyenne de poudre de conidies. Quantité moyenne de poudre de conidies de Metarhizium pinghaense et de M. robertsii, mesurée en grammes (intervalle de confiance à 95 %) récoltés à partir des trois substrats solides : riz étuvé, orge en flocons et avoine en flocons (ANOVA : F2,27 = 2,82 ; p = 0,08). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Une différence significative dans les conidies moyennes estimées par gramme, récoltées à partir des grains de riz, a été observée entre M. pinghaense (3,51 x 107/g ± 0,43 x 107/g) et M. robertsii (4,31 x 107/g ± 0,38 x 107/g). M. robertsii avait un nombre moyen de conidies par gramme légèrement plus élevé que M. pinghaense (figure 8).

Figure 8
Figure 8 : Conidies moyennes par gramme. Les conidies moyennes estimées par gramme pour Metarhizium pinghaense et M. robertsii (intervalle de confiance à 95 %) provenant des cultures de riz (ANOVA : F 1,7 = 8,47 ; p = 0,02). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Aucune différence significative dans le nombre estimé de conidies présentes sur le substrat de riz usé n’a été observée entre M. pinghaense (5,02 x 107/mL ± 1,47 x 107/mL) et M. robertsii (3,70 x 107/mL ± 0,91 x 107/mL) (figure 9). Cependant, M. pinghaense avait un nombre légèrement plus élevé de conidies présentes sur le substrat de riz que M. robertsii.

Figure 9
Figure 9 : Conidies fongiques moyennes. Les conidies fongiques moyennes estimées de Metarhizium pinghaense et M robertsii (intervalle de confiance à 95 %) provenant des cultures (F1,7 = 2,45; p = 0,16) présentes sur les substrats de riziculture usés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Aucune différence significative dans le rendement global estimé des conidies n’a été observée entre le M. pinghaense (5,09 x 107/g ± 1,35 x 107/g) et le M. robertsii (3,55 x 107/g ± 0,85 x 107/g) obtenus à partir des cultures de substrat de riz. Cependant, M. pinghaense a produit un rendement conidial légèrement plus élevé que M. robertsii, qui a produit un rendement conidial inférieur (figure 10).

Figure 10
Figure 10: Rendement total des conidies. Le rendement total estimé des conidies de Metarhizium pinghaense et de M. robertsii (intervalle de confiance à 95 %) provenant des cultures sur riz (F1,7 = 3,91; p = 0,09). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’intégration réussie d’agents microbiens pour la lutte biologique contre d’importants insectes nuisibles agricoles dans un agroécosystème dépend à la fois du succès et de la facilité de production de masse des entomopathogènes comme première étape dans des conditions de laboratoire. La production en série d’EPF est importante pour l’application à grande échelle et la disponibilité des produits EPF pour les programmes de lutte intégrée utilisant la lutte biologique 9,10,11,12,13. Le succès de la production de masse de différents isolats de FPE est influencé par les composants nutritionnels du substrat ou du milieu de production, qui ont un impact significatif sur les attributs des conidies résultantes, y compris leur efficacité, leur tolérance à la dessiccation, leur persistance sur le terrain et leur rendement conidial 8,19,20,21 . Par conséquent, il est important de développer les connaissances sur les besoins nutritionnels des entomopathogènes produits en série pendant le processus de culture et de fermentation29.

Dans la présente étude, la production de masse de M. robertsii et de M. pinghaense a été réalisée en utilisant trois produits agricoles différents comme substrats de fermentation: le riz étuvé, l’orge en flocons et l’avoine en flocons. On a observé que les trois substrats de grains différents influençaient de manière significative le rendement conique des isolats fongiques. Le riz étuvé était très favorable à la production de masse des deux isolats, tandis que les grains d’orge en flocons favorisaient uniquement la production de M. robertsii . Les observations ont été faites sur la base du rendement en poudre de conidies fongiques sèches après fermentation. Peu ou pas, les conidies ont été récoltées à partir de l’avoine en flocons après fermentation. On a constaté que l’avoine en flocons retenait des niveaux plus élevés d’humidité dans les sacs de fermentation pendant le processus de fermentation, ce qui aurait pu entraîner la mauvaise performance observée du grain en tant que substrat pour la production de M. pinghaense et de M. robertsii. Le substrat d’avoine en flocons était sujet à une prolifération mycélienne végétative blanche des isolats fongiques dans certains cas, ce qui a grandement influencé le rendement conidial, car la sporulation ne s’est pas produite dans les sacs de fermentation contenant la prolifération. On a également observé que les sacs de fermentation avec le substrat d’avoine en flocons présentaient des niveaux élevés de contamination bactérienne par rapport aux sacs de fermentation contenant des substrats d’orge en flocons.

Des niveaux élevés de champignons saprophytes ou de contamination par les levures ont été observés concernant la production de masse de M. pinghaense en utilisant de l’orge en flocons comme substrat. La contamination fongique saprophytique a été observée à un stade ultérieur du processus de fermentation par la croissance et la conidiogenèse d’un champignon autre que celui utilisé pour inoculer le substrat. Il était difficile de diagnostiquer la contamination du substrat à un stade initial de la fermentation, avant la sporulation conidiale. On pense que la contamination bactérienne et par les levures pendant le processus de fermentation se manifeste par des taches humides dans le substrat, et les grains d’avoine et d’orge en flocons ont tendance à absorber et à retenir l’humidité plus longtemps que les grains de riz. C’était une limitation à l’utilisation de ces deux substrats comme substrats de fermentation pour la production de masse des deux isolats de Metarhizium .

Les observations faites au cours de la présente étude ont montré que le type de méthode d’inoculation utilisée pour inoculer chaque substrat de grain affectait la production conique. La méthode d’inoculation en suspension conique s’est avérée relativement moins efficace, car l’avoine en flocons inoculée et l’orge en flocons ont montré un niveau de contamination accru par rapport à l’époque où la méthode d’inoculation de blastospore en culture liquide était utilisée sur les grains de riz. Contrairement à la méthode d’inoculation de blastospore en culture liquide, la méthode de suspension conique ne permet pas de détecter d’éventuels contaminants dans les suspensions avant l’inoculation des substrats, ce qui entraîne les niveaux élevés de contamination observés dans les sacs de fermentation. Jaronski et Jackson18 ont décrit plusieurs facteurs qui pourraient conduire à la contamination possible des substrats utilisés, tels que l’absence de stérilisation complète du substrat, l’inoculation non stérile et une mauvaise manipulation du substrat de fermentation dans les sacs. La contamination observée dans les sacs de fermentation contenant de l’orge en flocons et de l’avoine en flocons pourrait également avoir résulté d’un manque de stérilisation complète du substrat, ce qui aurait pu se produire pendant le processus d’autoclavage. Jaronski et Jackson18 ont également décrit l’utilisation de suspensions conidiales comme inoculants comme étant désavantageuse, car elle entraîne une augmentation des risques de contamination pendant la récolte de la conidiale à partir d’un milieu d’agar.

Sur le terrain, lors de l’infection d’hôtes appropriés, le champignon accumule d’abord de la biomasse dans l’hémocèle des insectes par prolifération, avant son émergence et sa sporulation sur la surface solide externe des insectes30. Un tel processus a été imité lors de l’utilisation de la méthode de fermentation liquide-blastospore. En conséquence, le bouillon représentait l’hémocèle de l’insecte, l’inoculation du bouillon avec des conidies fongiques représentait le contact initial et l’infection de l’insecte, et la formation de blastospores dans le bouillon représentait la prolifération du processus de blastospore qui se produit à l’intérieur de l’hémocoel de l’insecte infecté. L’inoculation finale des grains de riz et la sporulation du champignon sur les grains au fil du temps représentaient ce qui se passe sur la cuticule de l’insecte une fois que le champignon commence à émerger de l’intérieur du cadavre de l’insecte. Cela peut éventuellement expliquer pourquoi la méthode de fermentation par blastospore liquide a mieux fonctionné que la méthode d’inoculation en suspension conidiale.

Jaronski et Jackson18 ont décrit l’avoine en flocons et les grains d’orge en flocons comme les grains agricoles préférés pour la culture de masse des espèces de Metarhizium , par rapport aux grains de riz, car les deux types de grains ont maintenu leur teneur en humidité pendant le processus de fermentation. Cependant, la présente étude contredit les observations et les conclusions des chercheurs susmentionnés, car l’avoine en flocons et l’orge en flocons ne se sont pas avérées être de bons substrats de fermentation solide pour M. pinghaense ou M. robertsii. Le riz s’est avéré être un bon substrat de grain pour les deux isolats, car il ne s’est pas décomposé en petites particules pouvant se mélanger au produit final, comme cela a été suggéré dans des études antérieures.

La présente étude a montré que les isolats de l’espèce Metarhizium peuvent être cultivés avec succès et produits en masse à l’aide de grains de riz et que les différents grains ont tendance à influencer différemment la sporulation cidiale et le rendement. Cela pourrait être dû au fait que différentes céréales diffèrent en termes de composition nutritionnelle, par exemple, les rapports carbone:azote et la concentration en carbone. La concentration en carbone et le rapport carbone/azote d’un milieu de croissance sont connus pour affecter le rendement des conidies, ainsi que sa qualité en termes de viabilité et de virulence22. Il a également été démontré que les techniques d’inoculation utilisées pour inoculer les substrats influencent le degré de succès atteint dans la production en masse d’isolats de FPE sur des substrats de céréales agricoles spécifiques. Par conséquent, la technique de fermentation des blastospores liquides décrite dans la présente étude est recommandée comme étant la meilleure méthode d’inoculation pour les substrats de céréales agricoles pour la production en série d’isolats de M. pinghaense et de M. robertsii . L’utilisation d’une telle méthode permet la détection possible de la contamination avant l’utilisation des inoculants, ce qui peut entraver la production en masse de l’isolat d’EPF souhaité par rapport à l’utilisation de la technique d’inoculation de suspension conidiale. Il est également recommandé d’utiliser les grains de riz comme substrats solides pour la production de masse de conidies de M. pinghaense et de M. robertsii, plutôt que l’orge en flocons et l’avoine en flocons. La technique décrite est importante pour la production de masse future et l’application commerciale des conidies dans des conditions de terrain contre d’importants insectes nuisibles dans les agroécosystèmes.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Hort Pome, Hort Stone et le programme Technologie et ressources humaines pour l’industrie (THRIP: TP14062571871) pour le financement du projet.

ORCID:
Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578

Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312

Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Tween 20 Lasec Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water
20 mL McCartney bottles Lasec Used to make conidial suspensions
Aluminium foil Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask
Autoclave Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process
Autoclave bags Lasec Fermentation bags or solid substrate containers
Autoclave tape Lasec To secure PVC pipes on the fermentation bags
Brown Kraft paper bags Used to dry conidia cultures on agricultural grains
Bunsen burnner Labnet (Labnet International, Inc.) Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)
Clear edge test sieve Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Corn steep liquor SIGMA 66071-94-1 Ingredient of the blastospore liquid medium
Cotton Wool Lasec Used as plug of the neck for fermentation bags
Duran laboratory bottles Neolab Used to autoclave SDA medium and distilled water
Electrical tape Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust
ENDECOTTS test sieve Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask Lasec Carrier of the blastospore liquid medium
Ethanol (99%) Lasec Used to sterilize surgical blades and inoculating loops
Flaked barley Health Connection Wholefoods Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Flaked oats Tiger brands Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Glucose Merck Ingredient of the blastospore liquid medium
Growth Chamber/ incubators For growing fungal conidia culture
Haemocytometer Used to determine conidial concentrations
Inoculating loops Lasec For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth
Kitchen rolling pin Used to manipulate the solid grain substrate bed
Laminar flow Cabinet ESCO Laminar Flow Cabinet Provide as sterile environment during substrate inoculation
Metarhizium pinghaense conidia Stellenbosch University 5HEID Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense
Metarhizium robertsii conidia Stellenbosch University 6EIKEN Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii
Microscope ZEIZZ (Scope. A1) Used to determine conidial concentrations and conidial viability
Orbital shaker IncoShake- LABOTEC Used for the blastospore production process
Parboiled rice Spekko Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Penicillin-Streptomycin SIGMA Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination
Petri-dishes Lasec Containers for the SDA medium
Pipettes and pipette tips Labnet (BioPette PLUS) Used to measure liquids ingredients
Polyvinylchloride Marley waste pipe Used to create a neck for the fermentation bag
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) SIGMA-ALDRICH Ingredient of the blastospore liquid medium
Rubber band Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks
Sabaroud dextrose agar (SDA) NEOGEN Culture Media Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii
Sterile distilled water To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions
Sticky pad Used to secure the seives on the vibratory shaker
Surgical blade Lasec Used to scrape off spores from fungal cultures
Surgical paper Lasec Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag
Vibratory shaker Used to shake conidia off the agricultural grain substrates
Vortex mixer Labnet (Labnet International, Inc.) Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles
Yeast extract Biolab Added to the SDA medium to improve spore germination and growth
Zipper-lock bags GLAD Used to to store harvested fungal conidia

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Biologie numéro 181 blastospore protection des cultures formulation insecticides culture de masse Metarhizium robertsii Metarhizium pinghaense
Production de masse de champignons entomopathogènes, <em>Metarhizium robertsii</em> et <em>Metarhizium pinghaense</em>, pour une application commerciale contre les insectes nuisibles
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