Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

פציעות חצי אוטומטיות מבוקרות הנגרמות בלייזר לחקר התחדשות חוט השדרה בזחלי דגי זברה

Published: November 22, 2021 doi: 10.3791/63259
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh Medical School: Biomedical Sciences, 2Center for Regenerative Therapies at the TU Dresden

ERRATUM NOTICE

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לגרימת פציעות ספציפיות לרקמות ולשחזור גבוה בזחלי דגי זברה באמצעות מערכת נגע בלייזר בשילוב עם פלטפורמה מיקרופלואידית אוטומטית לטיפול בזחלים.

Abstract

לזחלי דגי הזברה יש מערכת עצבים מרכזית מתפקדת לחלוטין (CNS) עם יכולת התחדשות גבוהה רק כמה ימים לאחר ההפריה. זה עושה את המודל החייתי הזה מאוד שימושי לחקר פגיעה בחוט השדרה והתחדשות. הפרוטוקול הסטנדרטי לגרימת נגעים כאלה הוא לחצות את החלק הגבי של תא המטען באופן ידני. עם זאת, טכניקה זו דורשת הכשרה נרחבת ופוגעת ברקמות נוספות. פותח פרוטוקול עבור נגעים הנגרמים בלייזר כדי לעקוף מגבלות אלה, המאפשר רבייה גבוהה ושלמות של העברת חוט השדרה על בעלי חיים רבים ובין מפגשים שונים, אפילו עבור מפעיל לא מאומן. יתר על כן, נזק לרקמות מוגבל בעיקר לחוט השדרה עצמו, מה שמפחית השפעות מבלבלות מפגיעה ברקמות שונות, למשל עור, שרירים ומערכת העצבים המרכזית. יתר על כן, נגעים חמי של חוט השדרה אפשריים. שימור משופר של שלמות הרקמות לאחר פגיעה בלייזר מקל על ניתוחים נוספים הדרושים לניתוחים נוספים, כגון אלקטרופיזיולוגיה. לפיכך, שיטה זו מציעה שליטה מדויקת על היקף הפגיעה שאינו ניתן להשגה באופן ידני. זה מאפשר פרדיגמות ניסיוניות חדשות במודל רב עוצמה זה בעתיד.

Introduction

בניגוד ליונקים, דגי זברה (דניו ריו) יכולים לתקן את מערכת העצבים המרכזית שלהם (CNS) לאחר פציעה1. השימוש בזחלי דגי זברה כמודל להתחדשות חוט השדרה הוא חדש יחסית. זה הוכיח ערך לחקור את המנגנונים התאיים והמולקולריים שבבסיס תיקון2. הסיבה לכך היא קלות המניפולציה, מחזור הניסויים הקצר (זחלים חדשים מדי שבוע), השקיפות האופטית של הרקמות, וגודלו הקטן של הזחלים, המותאם באופן אידיאלי למיקרוסקופיה פלואורסצנטית של vivo .

במקרה של התחדשות חוט השדרה, שני יתרונות נוספים של שימוש בזחלים הם מהירות ההתאוששות, כמה ימים לעומת כמה שבועות למבוגרים, ואת הקלות של גרימת פציעות באמצעות טכניקות ידניות. זה שימש בהצלחה במחקרים רבים3,4,5, כולל חקירות האחרונות6,7. בסך הכל, זה מוביל לייצור נתונים משמעותיים מוגברים, הסתגלות גבוהה של פרוטוקולים ניסיוניים, וירידה בעלויות הניסוי. השימוש בזחלים מתחת ל-5 ימים לאחר ההפריה גם מפחית את השימוש בבעלי חיים בעקבות עקרונות ה-3R במחקר בבעלי חיים8.

לאחר פגיעה בחוט השדרה בזחלי דגי הזברה, מתרחשים תהליכים ביולוגיים רבים, כולל תגובה דלקתית, התפשטות תאים, נוירוגנזה, הגירה של תאים ששרדו או חדשים שנוצרו, רפורמציה של אקסונים פונקציונליים, ושיפוץ גלובלי של מעגלי תהליכים עצביים ורקמות עמוד שדרה6,7,9,10 . כדי להיות מתוזמר בהצלחה, תהליכים אלה כרוכים אינטראקציה מווסתת היטב בין מגוון של סוגי תאים, רכיבי מטריצה חוץ תאית, אותות ביוכימיים1,12. חשיפת הפרטים של ארגון מחדש משמעותי זה של רקמה מורכבת כגון חוט השדרה דורשת שימוש ופיתוח של גישות ניסיוניות מדויקות ומבוקרות.

הפרדיגמה הניסיונית העיקרית המשמשת לחקר התחדשות חוט השדרה בדגי זברה היא להשתמש באמצעים כירורגיים כדי לגרום נזק לרקמות על ידי כריתה, דקירה או קריוג'ורי3,13. לגישות אלה יש את החיסרון של דרישת הכשרה ספציפית במיומנויות מיקרוכירורגיות, אשר גוזל זמן רב עבור כל מפעיל חדש ועשוי למנוע את השימוש בהם בפרויקטים לטווח קצר. יתר על כן, הם בדרך כלל לגרום נזק לרקמות שמסביב, אשר עשוי להשפיע על התחדשות.

גישה נוספת היא לגרום נזק לתאים כימית14 או על ידי מניפולציות גנטיות15. זה האחרון מאפשר נזק ממוקד מאוד. עם זאת, טכניקה כזו דורשת עבודת הכנה ארוכה כדי ליצור דגים מהונדסים חדשים לפני ביצוע כל ניסוי, מחודש בכל פעם סוג תא ייחודי הוא ממוקד.

יש, אם כן, את הצורך בשיטה המאפשרת נגעים ממוקדים אך תכליתיים המתאימים למגוון מחקרים בהתחדשות. הפתרון הוא להשתמש בלייזר כדי לגרום נזק מקומי ברקמת העניין16,17,18,19,20. ואכן, השימוש בנזק לרקמות הנגרמות בלייזר מציג גישה חזקה ליצירת נגעים בחוט השדרה עם יתרונות רבים. המיקרוסקופים המצוידים במודולים כאלה של מניפולציה בלייזר מאפשרים לציין אזור מעוצב מותאם אישית שבו תתרחש אבלציה של תאים, עם היתרון הנוסף של שליטה זמנית. כך ניתן להתאים את גודלו ומיקום הנגע כדי לענות על כל שאלה.

התכונה החסרה של רוב מערכות נגע הלייזר היא האפשרות לגרום לפציעות באופן רב לשחזור עבור סדרה של זחלים. כאן מתואר פרוטוקול מקורי באמצעות לייזר UV כדי לגרום לנגעים מדויקים ומבוקרים חצי אוטומטיים בזחלי דגי זברה המבוססים על פלטפורמה מיקרופלואידית המיועדת לטיפול אוטומטי בזחלים21. יתר על כן, במערכת המוצגת כאן, זחלים מוכנסים נימי זכוכית, המאפשר סיבוב חופשי של החיה סביב ציר rostrocaudal שלה. המשתמש יכול לבחור איזה צד של הזחל להציג ללייזר תוך מתן הדמיה פלואורסצנטית כדי למקד במדויק את קרן הלייזר ולהעריך את הנזק לאחר הנגע.

הפרוטוקול המתואר כאן משמש עם מערכת הדמיה אוטומטית למחצה של זחלי דגי זברה בשילוב עם דיסק מסתובב המצויד בלייזר UV (המיועד להלן כמערכת VAST). עם זאת, הנקודות העיקריות של הפרוטוקול ורוב הטענות של הטכניקה תקפות לכל מערכת המצוידת בלייזר המסוגל לאבלציה של תאים, כולל מיקרוסקופים לסריקת לייזר שני פוטונים, מיקרוסקופים של דיסק מסתובב המסופקים עם לייזר UV (מודול FRAP), או מיקרוסקופי וידאו עם מודול לייזר לייזר למניפולציה בתמונה. אחד ההבדלים העיקריים בין מערכת VAST לבין טיפול מדגם קונבנציונאלי יהיה כי עבור האחרון, הרכבה זחלים בנקודת התכה נמוכה התעוררו על כיסויי זכוכית / צלחות פטרי תחתית זכוכית במקום לטעון אותם בצלחת 96-well- well יהיה צורך.

היתרונות המוצעים בשיטה זו פותחים הזדמנויות למחקר חדשני על המנגנונים התאיים והמולקולריים במהלך תהליך ההתחדשות. יתר על כן, איכות הנתונים הגבוהה מאפשרת חקירות כמותיות בהקשר רב תחומי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו באישור משרד הפנים הבריטי ועל פי תקנותיו, תחת רישיון הפרויקט PP8160052. הפרויקט אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת אדינבורו. לניתוחים ניסיוניים, זחלי דגי זברה עד גיל 5 ימים משני המינים שימשו לקווים הטרנסגניים הזמינים הבאים: Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg(Xla.Tubb:DsRed), Tg(betaactin:utrophin-mCherry), Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) ו- Tg(mnx1:gfp) (ראה קובץ משלים 1 לגבי הדור של קווי דגי הזברה הטרנסגניים). תרשים של הפרוטוקול באמצעות פלטפורמת הטיפול האוטומטית בזחלי דגי זברה מוצג באיור 1. כל התוכנות המותאמות אישית, קבצי ה- Script והפרוטוקולים הניסיוניים המפורטים המשמשים בעבודה זו זמינים https://github.com/jasonjearly/micropointpy/.

1. הכנה לדוגמה

  1. בשעה 5 שעות לאחר ההפריה, מיין את העוברים לשלב ההתפתחותי הנכון21. להשליך ביצים מתות ועוברים מפותחים מפותחים ומתפתחים יתר על המידה.
  2. ב 3 ימים לאחר ההפריה (dpf), מרדים זחלים על ידי הוספת 2 מ"ל של 0.4% aminobenzoic-חומצה-אתיל מתיל-אסתר ל 50 מ"ל של מי מתקן דגים בצלחת פטרי 90 מ"מ. השתמש בבעלי חיים שגדלו עם phenylthiourea (PTU) (ראה טבלה של חומר) כדי למנוע פיגמנטציה בעור אם זה בעיה, וזה לא המקרה של פציעות חוט השדרה על 3 זחלי dpf המתוארים בפרוטוקול זה.
    הערה: ריכוז הרדמה גבוה יחסית זה משמש למניעת תנועות של הזחלים בעקבות השפעת הלייזר.
  3. סנן את העוברים עבור ביטוי עיתונאי פלואורסצנטי (קובץ משלים 1).
    הערה: כתב פלואורסצנטי לחוט השדרה (או מבנה עניין אחר) נדרש לעתים קרובות כדי להעריך את יעילות הפציעה. השימוש ב- tg (Xla.Tubb:DsRed) מסייע בזיהוי חוט השדרה.
  4. מעבירים את הזחלים הנבחרים לצלחת של 96 בארות לשימוש במערכת VAST (ראו טבלת חומרים) עם 300 μL של מי מתקן דגים לבאר. השתמשו במדיום המכיל את חומר ההרדמה מצלחת הפטרי בקוטר 90 מ"מ ישירות. ודא שיש רק זחל אחד לכל באר. הכן צלחת ריקה נוספת של 96 בארות כדי לאסוף את הזחלים הנגעים.
    הערה: אם אתם משתמשים במערכת אחרת של נגע בלייזר, הר את הזחלים בג'ל אגרוז של נקודת התכה נמוכה (LMP) 1% בתא תצפית מתאים.

2. הכנת מיקרוסקופ

  1. הפעל את כל רכיבי המערכת (VAST, מיקרוסקופ, לייזר, מחשב), כולל לייזר לאבלציה.
  2. לאחר שהחומרה מאותחלת במלואה, הפעל את תוכנת המיקרוסקופ, ImageJ/Fiji, סביבת פיתוח משולבת פיתון (IDE) ואת תוכנת הדמיית דגי הזברה האוטומטית (מערכת VAST) אם אתה משתמש בפלטפורמה זו (ראה טבלת חומרים).
  3. הגדר את תוכנת VAST בעקבות השלבים הבאים.
    1. כשתוכנת VAST מופעלת, בחרו 'לוח' בחלון הראשון ולחצו על הכפתור 'סיום ' (איור 2A). חלון קטן נוסף יצוץ וישאל אם הנימים ריקים ונקיים. ודא על ידי התבוננות בתמונה של הנימים אם יש בועות אוויר בפנים. אם לא, לחץ על כן. אם יש בועות כלשהן, לחץ על לא ובצע את שלב 2.3.2-2.3.3 (איור 2B).
    2. בחלון סמפלר החלקיקים הגדולים (LP), לחץ על Prime כדי להסיר בועות אוויר (איור 2C).
    3. עבור אל חלון התוכנה הראשי (עם התמונה הנימית) ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התמונה. בחרו ' הקלט תמונה נימית ריקה ' בתפריט הנפתח (איור 2B).
    4. בחלון LP Sampler , עבור לתפריט קובץ ובחר באפשרות פתח סקריפט . בחר קובץ המכיל את קובץ ה- Script המתאים לניסוי שיש לבצע.
    5. בחלון התוכנה הראשי VAST, עבור אל קובץ ובחר פתח ניסוי. בחר את קובץ הניסוי המתאים לניסוי המתוכנן.
      הערה: ודא שהתיבות ביטול טעינה אוטומטי ופלט בצובר לבזבוז אינן מסומנות.
  4. הגדר את תוכנת המיקרוסקופ להדמיה.
    1. הפעל את תוכנת הדמיית המיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים) כדי לאתחל את החומרה. פעולה זו עשויה להימשך מספר דקות, בהתאם למערכת.
    2. עבור אל הגדרות הרכישה והגדר את המיקרוסקופ להדמיית הפלואורופור המתבטא בזחלים. השתמש במטרה 10x NA 0.5 טבילה במים כדי להבטיח את נפח המוקד מוארך מספיק לאורך הציר האופטי כדי לפגוע בכל עומק חוט השדרה או הרקמה הממוקדת.
  5. הגדר ImageJ / פיג'י עבור נגעים בלייזר.
    1. עבור לתפריט קובץ , בחר חדש/Script כדי לפתוח את חלון קובץ ה- Script.
    2. בחלון חדש , עבור לתפריט קובץ ובחר פתח כדי לטעון את סקריפט נגע הלייזר (Manual_MP_Operation.ijm).
  6. תקים את פייתון IDE.
    1. הפעל את פייתון IDE.
    2. עבור לתפריט קובץ ובחר פתח קובץ כדי לטעון את קובץ ה- Script לניהול הלייזר (Watch_for_ROIs_py3.py).
    3. עבור לתפריט הפעלה ובחר הפעל ללא איתור באגים כדי להפעיל את קובץ ה- Script. ודאו שרצף הודעות בחלונית TERMINAL יופיע יחד עם רעש מסוים בזמן שהמנחת הלייזר מאותחל (איור 2D).

3. ביצוע נגעי לייזר במערכת VAST

  1. מרכז את הנימים ביחס למטרת המיקרוסקופ על ידי הזזת הבמה על ידי לחיצה על כפתורי החצים בחלון הראשי של תוכנת VAST (איור 2B).
  2. התמקד בחלק העליון של הנימים על ידי התבוננות דרך העפעפיים ושימוש באור המועבר של המיקרוסקופ.
    אזהרה: הנימים שבריריים מאוד ועלולים להישבר אם המטרה נוגעת בהם. הזז את ידית המיקרוסקופ באיטיות בעת התמקדות פנימה והחוצה.
  3. מניחים את הצלחות 96-well על מחזיק הצלחת של סמפלר LP של מערכת VAST. מניחים את הצלחת המכילה זחלים על המחזיק השמאלי ואת הצלחת לאיסוף בצד ימין. ודא שהצלחות מכוונות כראוי: באר A1 חייבת להיות בפינה הקדמית-שמאלית של המחזיק.
  4. בתוכנת VAST, בחלון סמפלר LP, לחץ על לחצן תבנית צלחת ובחר את כל הבארות המכילות זחלים. לחצו על כפתור אישור כדי לאמת ולסגור את החלון (איור 2C).
  5. בחלון LP Sampler, לחץ על לחצן לוח הפעלה כדי להתחיל לטעון זחל.
    הערה: לאחר זמן מה, הזחל צריך להיות גלוי בנימי במיקום (מוגדר מראש בקובץ הגדרת הניסוי), המאפשר לפגוע בחוט השדרה. אור מגש VAST יכבה לאחר מספר סיבובים כדי להגדיר את הזחל עם הצד לרוחב מול מטרת המיקרוסקופ.
  6. עבור אל תוכנת המיקרוסקופ ולחץ על לחצן Live כדי לדמיין את הזחל.
  7. סובב את ידית המיקוד של המיקרוסקופ עד שהתעלה המרכזית של חוט השדרה נראית לעין.
    הערה: זה יכול להיות קל יותר להתמקד באמצעות אור מועבר תחילה, ולאחר מכן לחדד עם פלואורסצנטיות.
  8. צלם תמונה בפלואורסצנטיות ושמור את התמונה בתיקיה ייעודית.
  9. פתחו את התמונה ב-ImageJ והתאמו את הניגודיות במידת הצורך (באמצעות התפריט תמונה/כוונון/בהירות/ניגודיות... ב-ImageJ).
  10. לחץ על כלי הקו של אזור העניין (ROI) וצייר קו קצר (20 מיקרומטר) שבמרכזו חוט השדרה (איור 3A).
  11. העבר את המיקרוסקופ למיקום המראה המשקף 100%.
  12. טען את קובץ ה- Script של ImageJ ולחץ על לחצן הפעלה . השתמש בפרמטרים הבאים: חזרה - 2; מדגם - 1; רוחב - 40 מיקרון; הנחתה - 89 (עוצמת לייזר מלאה) (איור 3C).
  13. לאחר סיום רצף צילומי הלייזר, עבור להדמיית פלואורסצנטיות בתוכנת ההדמיה והתאם את המוקד במידת הצורך.
    הערה: שינוי במיקוד נצפה לעתים קרובות עקב תזוזת זנב במהלך חשיפה ללייזר.
  14. קח תמונה חדשה ושמור אותה.
  15. פתחו את התמונה החדשה ב-ImageJ וציירו קו חדש שאמור להיות גדול יותר מחוט השדרה עצמו (כ-80 מיקרומטר), החל מתחת לצד הגחוני של חוט השדרה בחלקו העליון של הנוטוקורד והולך לכיוון הצד הגבי עד הסוף ברווח שבין חוט השדרה לעור (איור 3B).
  16. העבר את המיקרוסקופ למיקום המראה המשקף 100%.
  17. עבור אל חלון סקריפט ImageJ ולחץ על לחצן הפעל . השתמש בפרמטרים הבאים: חזרה - 2; מדגם - 1; רוחב - 40 מיקרון; הנחתה - 89 (כוח לייזר מלא).
  18. לאחר סיום רצף צילומי הלייזר (הארוך יותר), ודא את איכות ההעברה על-ידי הדמיית פלואורסצנטיות ומיקוד. ודאו שאף תא או אקסונים לא יישארו שלמים באתר הנגע, שאמור להיראות כאפל או כאזור פלואורסצנטי קלוש והומוגני (איור תלת-ממד, החלונית התחתונה).
  19. לאסוף את הזחלים נגע לתוך צלחת ריקה 96-well (עם אותם מתאמים היטב כמו זה של הבאר המקורית) על ידי הולך לחלון התוכנה הראשי VAST ולחיצה על כפתור איסוף .
  20. הפעל שוב את נורית המערכת VAST על-ידי לחיצה על תיבת הסימון Tray Light בפינה הימנית התחתונה של החלון.
  21. חזור על שלב 3.3-3.17 עבור כל זחל חדש להיפגע.

4. טיפול לאחר נגע וניסויים נוספים

  1. הוציאו את הזחלים מצלחת 96 הבאר בהקדם האפשרי והעבירו אותם לצלחת פטרי נקייה עם מי מתקן דגים טריים לזחלים כדי להתאושש לאחר הנגע. שים את צלחת פטרי באינקובטור ב 28 °C (50 °F).
    הערה: הנזק לעתים קרובות ממשיך להתפשט בשעה הראשונה לאחר הנגע. לפיכך, יש להעריך את היקף הנגע בפועל על ידי הדמיית פלואורסצנטיות לאחר עיכוב של כ 1 שעות.

5. פתרון בעיות

  1. אם בועות אוויר נמצאות בצינורות ובנימים של מערכת VAST, לחץ על כפתור Prime בחלון LP Sampler כדי להסיר אותם.
  2. שקול את הנגעים הלא מוצלחים (כפי שהוערך מן הפלואורסצנטיות הנותרת באתר הנגע, מלבד הרקע השיורי וההומוגני הצפוי), אשר יכול להיות בשל מספר סיבות שהוזכרו להלן.
    1. עוצמת לייזר נמוכה: כאשר זה קורה, נסה עם ערך גבוה יותר.
      הערה: מערכת VAST מצוידת בלייזר צבע. משמעות הדבר היא כי הריכוז של פתרון הצבע המשמש לייצור אור לייזר יכול להשתנות עם הזמן, מה שמוביל לירידה בכוח הלייזר. החלפה בפתרון חדש בדרך כלל פותרת את הבעיה22.
    2. כיול לקוי: כאשר זה קורה, לאמת את הכיול והעוצמה של מערכת הלייזר לפי שלב 5.2.2.1-5.2.2.4. אם לא מכויל כראוי, הלייזר לא יופנה למיקום הרצוי, ובכך יוביל נגעים לא מוצלחים או נזק בלתי רצוי ברקמות סמוכות.
      1. הנח שקופית מראה על גבי תא הנימים. דגש על הצד המצופה (זה צריך להתמודד עם המטרה). השתמש בברירת מחדל קודמת בשקופית כדי להתמקד ביתר קלות.
      2. החל תבנית של אבלציה לייזר באמצעות סקריפט כיול.
      3. להעריך את איכות התבנית. הכתמים או הקווים צריכים להיראות חדים ולא מטושטשים.
      4. השתמש ברמפה עם כוח הולך וגדל כדי להעריך אם כוח הלייזר השתנה בהשוואה למפגשים הקודמים.
    3. תנועת זחלים במהלך נגעים: זחלים מגיבים באופן שונה להרדמה; לכן, נגע הלייזר עשוי לעורר תנועות של הזנב במהלך התהליך, ובכך למנוע טרנסקציה מוצלחת. כאשר זה קורה, לקחת איטרציה נוספת של צעדי נגע לייזר כדי להשלים אותו תוך הימנעות נזק לרקמות שמסביב.
    4. מיקוד רע: כאשר זה קורה, להתמקד באמצע התעלה המרכזית כדי לקבל את התוצאות הטובות ביותר.
    5. ציור החזר השקעה, מיקום וגודל: המיקום והגודל של ההחזר על ההשקעה הם קריטיים עבור מעברים מוצלחים. החזר ההשקעה צריך להיות גדול יותר מחוט השדרה ומרוכז במרכז חוט השדרה. כדי לפתור זאת, התחל לצייר את ההחזר על ההשקעה מהצד הגחוני של חוט השדרה ולעלות לכיוון הצד הגבי כדי להשיג העברה מוצלחת. זה כנראה בגלל תנועות זנב מופעלות על ידי רצף של יריות לייזר במהלך הליך אבלציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אימות של העברת חוט השדרה
חקירות מבניות ותפקודיות בוצעו כדי להעריך אם הפרוטוקול מאפשר העברה מלאה של חוט השדרה.

ראשית, כדי לוודא כי אובדן פלואורסצנטיות באתר הנגע נבע מנזק לרקמות עצביות ולא מהלבנת פלואורסצנטיות מתאורת הלייזר, בוצע אימונוסטנציה באמצעות נוגדן נגד טובולין אצטילציה (ראה טבלת חומרים ותיק משלים 1). נצפתה הפרעה מוחלטת של האקסונים בין הצדדים הקואודליים והרוסטרליים של הנגע, המאשרת את המעבר המלא של חוט השדרה (איור 4B). מעבר מוצלח לחוט השדרה לא אמור להשאיר שום הקרנה עצבית שנותרה על פני אתר הנגע (ראו איור 4C לדוגמה של נגע לא מוצלח). באמצעות טכניקה זו, שיעור ההצלחה של נגעי לייזר בחוט השדרה הוערך להיות 75% (ארבעה transections לא שלם ב 16 בעלי חיים).

אובדן הפונקציונליות לאחר נגע בלייזר נחקר באמצעות הדמיית סידן. על דגים שלמים, פעילות הרשת העצבית הספונטנית המתואמת מייצרת פסגות פלואורסצנטיות לאורך חוט השדרה כולו. החלפה מוצלחת תפריע להתפשטות של פעילות זו בין שני צידי הנגע. כדי לשלוט באיכות של העברת חוט השדרה, נגעי לייזר בוצעו על tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) זחלים ב 3 dpf. לאחר איסוף בצלחת רב-בארות חדשה, הזחלים היו מורדמים קלות. הם הוצבו על כיסוי זכוכית בנקודה נמוכה-התכה agarose לבצע הקלטות זמן לשגות פלואורסצנטיות על מיקרוסקופ קונפוקלי מ 3 שעות לאחר הפציעה. אובדן פעילות בצד caudal של אתר הנגע נצפתה. ואכן, כימות הפלואורסצנטיות מראה כי קוצים עקב פעילותו הספונטנית של הדגים היו נוכחים רק בצד הרוטסטרלי לאחר פציעה, אך התרחשו באופן מתואם בתנוחות הרוטציה והקודליות המקבילות בדגים שלמים (איור 4D,E). האות השיורי הנמוך בצד הקבורה לאחר הפציעה נבע ככל הנראה מפעילותם של נוירונים חושיים (ככל הנראה נוירונים חושיים Rohon-Beard בצד הקודאלי של חוט השדרה23) בתגובה לתנועת הזנב הנגרמת על ידי התכווצות שרירים בצד rostral.

תהליכי התחדשות הנגרמים על ידי נגעים בלייזר
לאחר 24 שעות לאחר הפציעה (HPI), הפצע החל להיסגר, מה שהוביל לשיקום חלקי של המבנה הראשוני של חוט השדרה לאחר 48 שעות (איור 5D). באמצעות הדמיית סידן, אושר חיבור תפקודי חלקי (איור 5E,F) לאחר 48 כ"ס. חישוב היחס (הנקרא מדד שחזור קישוריות על ידי המחברים) בין משרעת הקוצים באזור caudal לבין אזור rostral (איור 5G), הראה עלייה בין 3, 24, ו 48 כ"ס, כצפוי במהלך התחדשות חוט השדרה.

נגעי לייזר מעוררים תגובה חיסונית
גיוס מקרופאג' (mpeg1:GFP + תאים) נצפה לאחר נגעים בלייזר באמצעות tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) נגעי לייזר זחלים (איור 5H,I). זה עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים על ידי המחברים באמצעות נגעים ידניים מדגימים את התפקיד החיוני של מקרופאגים להתחדשות מוצלחת של חוט השדרה בזחלי דגי זברה6,24. תצפית זו מצביעה על כך שניתן לחקור תגובות חיסוניות לאחר פגיעה בלייזר ומאשרת כי נגרם נזק לרקמות.

נגעים בלייזר ונגעים ידניים גורמים לנוירוגנזה מוגברת בחוט השדרה
מחקרים קודמים השתמשו נגעים ידניים כדי לחקור את neurogenesis המתרחשת בעקבות פגיעה בחוט השדרה6,15. נגעי לייזר יכולים להיות כלי בעל ערך לחקר התופעה. ניסוי שפורסם בעבר הראה נוירוגנזה מוגברת בעקבות פגיעה ידנית בחוט השדרה בהשוואה לבקרות ללא נגע15. כאן tg(mnx1:gfp) דגים שימשו נוירונים מוטוריים וסומנו פלואורסצנטיות. כתמי נוגדנים נגד GFP שימשו לשיפור הנראות של GFP בזחלים. זה היה בשילוב עם כתמים EdU25 (ראה קובץ משלים 1), אשר תוויות נוירונים שנוצרו לאחרונה. EdU נוספה מיד לאחר פציעה ב 3 dpf, כלומר כל התאים המסומנים עם EdU נוצרו לאחר פציעה. לכן, תאים המציגים כתמים colocalized מייצגים נוירונים מוטוריים חדשים שנולדים לאחר פגיעה בחוט השדרה. מספר התאים colocalized משני צדי אתר הפציעה, או באזור המתאים למיקום ולגודל של אתר הפציעה בפקדים unlesioned (שנתפסו בשני חלונות 50 מיקרומטר) נספרו, ואת ההבדל במספרים הממוצעים של תאים colocalized נותח באמצעות ANOVA26 חד כיווני.

פרוטוקול זה שימש על זחלים נגועים בלייזר באופן ידני ולייזר כדי להשוות את ההשפעות של כל שיטת נגע על נוירוגנזה (איור 6). לא נצפתה הבדל במספר התאים המסומנים בין נגעים ידניים ללייזר. דגים ללא נגע הציגו פחות תאים בעלי תווית כפולה מאשר דגים נגועים בשני תנאי הנגע (איור 6D). זה עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים המראים neurogenesis מוגברת בדגים נגע באופן ידני לעומת דגים ללא נגע15.

תוצאות אלה תומכות בהדמיית סידן ובתוצאות כתמי טובולין אצטילציה, שכן פגיעת הלייזר מעוררת תגובת התחדשות הדומה לנגע ידני. זה מצביע על כך שנגע הלייזר אינו רק מלבין את הפלואורסצנטיות בתאים אלא גורם לפציעה שמפעילה את אותן תגובות תאיות כמו נגע ידני.

נגעים בלייזר גורמים פחות נזק לעור ולשרירים מאשר נגעים ידניים
נגעים ידניים לעתים קרובות לגרום כמויות גדולות של נזק לשרירים ולעור. לעומת זאת, נגעי לייזר יכולים להיות ממוקדים באופן ספציפי יותר לחוט השדרה, ובכך להפחית את הנזק לרקמות אחרות. כדי להמחיש זאת, זחלי Tg(beta-actin:utrophin-mCh) שימשו לביצוע נגעים ידניים ולייזר. קו זה מתייג באופן פלואורסצנטי חלבון מחייב F-actin, המאפשר הדמיה של תאי חוט השדרה וסיבי שריר. לאחר מכן הזחלים הורכבו וצולמו (איור 7A, B). איור 7A מראה את הנזק לחוט השדרה. המחסור באוטרופין באתר הפציעה הן בתנאי לייזר והן בתנאי נגע ידניים מצביע על כך ששתי שיטות הנגע פגעו בתאים בחוט השדרה. איור 7B מראה את הנזק לשרירים. יש מבנה ברור דמוי שברון למיוטומים במצב ללא נגע, וחבילות של סיבי אקטין גלויים. יש הפרעה גלויה לצורת המיוטום במצב הנגע הידני, ופחות סיבי אקטין נמצאים. זה מדגים נזק משמעותי לשרירים. עם זאת, במצב נגע לייזר, מבנה שברון של myotome נשמר. יש נזק מסוים סיבי שריר, אבל זה כלול בתוך מיוטומים אחד או שניים לעומת בתוך ארבעה במצב הנגע הידני. בנוסף, יש נזק קל לעור במצב הנגע בלייזר בהשוואה למצב הנגע הידני, כפי שמוצג בתמונות שצולמו במיקרוסקופ סטריאו באיור 7C.

בסך הכל, תוצאות אלה ממחישות כי נגעי לייזר חצי אוטומטיים הניתנים לשחזור יש פוטנציאל להיות כלי רב עוצמה לחקר התחדשות עצבית בדגי זברה.

Figure 1
איור 1: סכמטי של זרימת העבודה החצי-אוטומטית של פגיעה בלייזר. שלושה ימים לאחר ההפריה (dpf), זחלים נטענים לתוך צלחת 96 בארות ומונחים על פלטפורמת הטיפול האוטומטית בזחלים. לאחר מכן, כל זחל נטען לתוך נימי להציב תחת 10x NA 0.5 עדשה על מיקרוסקופ זקוף להדמיה ונגע לייזר. לאחר נגעים, זחלים נפרקים לצלחת חדשה של 96 בארות לאיסוף וניסויים נוספים. בחלק העליון, תמונות משודרות ופלואורסצנטיות של tg(Xla.Tubb:DsRed) 3 זחלים dpf לפני ואחרי נגע בלייזר (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). הזחלים מכוונים שמאלה וגב למעלה (לכל הדמויות). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: סטארט-אפ תוכנה למערכת ההדמיה האוטומטית למחצה של זחלי דגי זברה ומערכת בקרת לייזר. (A) תוכנה VAST בסטארט-אפ. (ב) החלון הראשי של תוכנת VAST מציג את הנימים הריקים. (C) חלון סמפלר LP עם תבנית צלחת ריקה. (ד) התצוגה של python IDE כאשר קובץ ה- Script Watch_for_ROIs_py3.py פועל. המלבן הכתום מציין את לשונית המסוף עם הודעות המוצגות במהלך האתחול של מנחת הלייזר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: דוגמה לרצף נגע בלייזר ב- tg(Xla.Tubb:DsRed) 3 זחלי dpf. (A) השלב הראשון של נגע בלייזר באמצעות קו של 20 מיקרומטר לאחר בחירת כלי החזר ההשקעה של הקו מסרגל הכלים ImageJ. (B) שלב שני עם קו 80 מיקרומטר להעברה מלאה של חוט השדרה. (ג) הצגת התסריט המשמש לשליטה בלייזר מ- ImageJ. (ד) רצף התמונות במהלך נגעי לייזר. למעלה: לפני הנגע; אמצע: מיד לאחר הצעד הראשון; למטה: מיד לאחר השלב השני (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: חיסון טובולין אצטילטי (A-C) והדמיה סידן (D,E) מצביעים על כך שנגע בלייזר משבש לחלוטין את ההמשכיות של רקמת עמוד השדרה. (A) חוט השדרה שלם. (B) העברה מלאה של עמוד השדרה מראה הפרעה מוחלטת של רקמת חוט השדרה לאורך הצירים הגב-גחוניים והמדיאליים-לרוחב. (ג) העברה לא שלמה. (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). (D) חוט שדרה חוצה על tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) 3 dpf זחל. המלבנים מראים את החזרי ההשקעה המשמשים לכימות עוצמת הפלואורסצנטיות בצדדים הרוסטרליים (הכחולים) והקאודלים (כתומים) של הנגע. (ה) גרף של עוצמת הפלואורסצנטיות משתנה עם הזמן ב- ROSTRAL ו- roaudal analysis ROIs. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: פגיעה בלייזר מעוררת תגובה חיסונית ומובילה להתאוששות אנטומית ותפקודית מוצלחת. (A-D) תמונות פלואורסצנטיות של הקרנה בעוצמה מרבית של tg(Xla.Tubb:DsRed) זחל 3dpf לפני (A) ובזמנים שונים לאחר נגע הלייזר: לאחר 3 שעות (B), לאחר 24 שעות (C) ואחרי 48 שעות (D). (E-G) השימוש בהדמיית סידן כדי להעריך את שחזור הפונקציה. (E) זחל tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) עם החזרי הוצאות ניתוח. (F) גרף של עוצמת הפלואורסצנטיות משתנה עם הזמן ב- ROSTRAL ו- ROAUDAL ANALYSI ROIs. (ז) כימות היחס בין משרעת ספייק caudal ו rostral (אינדקס שיקום קישוריות) ב 3, 24, 48 שעות לאחר נגע (N = 3). (H-I) אפיון התגובה החיסונית לאחר הנגע. (H) תמונות פלואורסצנטיות של זחלים (משמאל) ונגעים (מימין) tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) 3 זחלים dfp המציגים הצטברות של מקרופאגים (mpeg1 + תא, ירוק) ב 6 כ"ס. (I) כימות של מספר המקרופאגים ב 6 שעות לאחר נגע בזחלים פצועים ושלמים (N = 3) (סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: הדור המושרה בנגעים של נוירונים מוטוריים דומה בין לייזר לנגע ידני. (A-C) תמונות מהמיקרוסקופ ApoTome של tg(mnx1:gfp) 5 זחלי dpf עם כתמי EdU, בנגע לייזר (A), נגע ידני (B) ותנאי unlesioned (C). ראשי חץ מציינים תאים בעלי תווית כפולה עבור שני הסמנים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (A'-C') הגדלה גבוהה יותר של תאים בעלי תוויות כפולות המסומנים על-ידי תיבות לבנות. (D) כימות ספירת תאים עבור מספר התאים הקולוקאליים בכל זחל. חלונות 50 מיקרומטר הונחו משני צדי אתר הפציעה, ותאים colocalized נספרו בכל תמונות Z-stack. ANOVA חד כיווני בוצע עם הבדיקה posthoc של טוקי27. אין הבדל משמעותי בין נגעים בלייזר וידניים (p = 0.909). באופן משמעותי פחות mnx1:gfp + / EdU + תאים בפקדים ללא נגעים לעומת נגע בלייזר (שינוי פי 2.4, p = 0.011) ונגע ידני (שינוי קיפול 2.3, p = 0.018). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: נגע בלייזר גורם פחות נזק לשרירים ולעור מאשר הנגע הידני. (א-ב) תמונות Z-מחסנית אחת של tg(בטא-אקטין:utrophin-mCherry) 3 זחלי dpf בתנאי נגע בלתי מנוצחים, נגע ידני ונגע לייזר, נלקח על מיקרוסקופ קונפוקלי בהגדלה 20x. חצים לבנים מציינים את אתר הפציעה. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (A) מציין ערימות Z שבהן חוט השדרה ו notochord גלויים. SC מתייג את חוט השדרה, ו- NC מתייג את הנוטוקורד. (B) מציין ערימות Z שבהן סיבי השריר נראים לעין. (ג) תמונות צולמו במיקרוסקופ הסטריאו של 3 זחלי dpf בתנאי הנגעים, הנגע הידני והנגע בלייזר. זחלים הוצמדו לפלטפורמה באמצעות סיכות חוט טונגסטן (הנראות בתמונת נגע בלייזר). הקופסה השחורה מציינת את אתר הנגע. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: הפרטים הניסיוניים של הפרוטוקול. הדור של קווי דגי זברה מהונדסים, פגיעות ידניות בחוט השדרה, אימונוהיסטוכימיה אצטיל-טובולין, כתמים Hb9 / EdU, הדמיה, ועיבוד וניתוח תמונה מתוארים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

יש צורך דחוף בהבנה עמוקה יותר של התהליכים במשחק במהלך התחדשות בדגי זברה. מודל זה של בעלי חיים מציע יתרונות רבים למחקר ביו-רפואי, במיוחד עבור פגיעות בחוט השדרה1. רוב המחקרים כוללים נגעים ידניים הדורשים מפעיל מאומן היטב ולגרום נזק רב רקמות. פרוטוקול נגע לייזר מוצג כאן, המאפשר שליטה על מאפייני הנגע ונזק מופחת לרקמות שמסביב. יתר על כן, טכניקה זו היא קלה מספיק כדי לשמש בהצלחה על ידי ניסויים לא מאומנים יחסית.

שלבים קריטיים בפרוטוקול הם כיול הלייזר וההגדרה של החזר על ההשקעה. בפועל, הכיול יציב מאוד (אפילו במשך חודשים), וברגע שנקבעו הגודל והמיקום הנכונים של ההחזר על ההשקעה, השימוש בטכניקה זו הוא פשוט. למרות הפרוטוקול תיאר כיצד לבצע את הנגעים על ציוד ספציפי, רוב היתרונות של נגעי לייזר זמינים עבור מערכות שונות, כגון מיקרוסקופ ספינינג-דיסק.

המגבלות העיקריות של פרוטוקול זה הן הצורך להשתמש בכתב פלואורסצנטי של חוט השדרה ואת הזמן הנדרש כדי לבצע את הנגעים (~ 5 דקות / דגים). זה האחרון מפוצה על ידי רבייה גבוהה הדורשת פחות בעלי חיים. עם זאת, נגעים ידניים עדיין קיימא עבור יישומים כגון בדיקות סמים, שבו בעלי חיים נגע רבים נדרשים. כפי שמוצג כאן, מידת הנגע המושרה neurogenesis דומה בין לייזר נגעים ידניים.

עם זאת, פגיעה בלייזר יש יישומים פוטנציאליים עצומים, חלקם קשורים היתרונות הייחודיים המוצעים. לדוגמה, נימי מסתובב מאפשר ביצוע נגעים במגוון רחב של עמדות בצורה מבוקרת. לדוגמה, זה יכול לשמש כדי לגרום axotomy נוירון יחיד בתאי Mauthner (נתונים לא מוצגים), כפי שהודגם גם בעבודתו של Bhatt et al.15. זה לא יהיה אפשרי באמצעות נגעים ידניים.

התוצאות גם ממחישות כי הנזק כלול בעיקר בחוט השדרה, עם נזק מינימלי לרקמות שמסביב. משמעות הדבר היא כי תגובות תאיות לראות בעקבות נגע לייזר נוטים יותר להיות מיוחסים לחוט השדרה במיוחד ולא איתות מרקמות פגומות אחרות. זה גם יכול להיות כי זחלים נגע לייזר מסוגלים יותר לעמוד בהכנות נוספות לניסויים. לדוגמה, ניתוח אלקטרופיזיולוגיה כרוך בהסרת עור תא המטען באמצעות מלקחיים28,29,30, אשר יגרום ללחץ מכני גבוה להציב על אתר הפציעה העדין כבר ולהסתכן כל קשרים אקסוניים להישבר שוב. שלמות העור ורקמת השריר הנראים בזחלים עם נגע בלייזר יכולה להגן על אתר הנגע מפני נזק נוסף ולהביא לייצוג מדויק יותר של רמת ההתחדשות שהושגה.

יתר על כן, לוקליזציה משופרת של נזק לאחר פגיעה בלייזר מגבילה את ההרחבה של צימוד בין תהליכי התחדשות שונים, אשר עשוי להסוות תהליכים עדינים יותר בעת שימוש נגעים ידניים. הגישה לפגיעה ניסיונית בדגי הזברה הזחליים המתוארים כאן עשויה לפתוח במגוון חקירות חדשות בהקשר של ביולוגיה כמותית, פיזיקה ביולוגית וביולוגיה חישובית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי BBSRC (BB/S0001778/1). CR ממומן על ידי הנסיכה המלכותית TENOVUS סקוטלנד מחקר רפואי תוכנית מלגות. אנו מודים לדיוויד גרינלד (CRH, אוניברסיטת אדינבורו) וקייטי ריד (CDBS, אוניברסיטת אדינבורו) על המתנה הנדיבה של דגים מהונדסים (ראה קובץ משלים). אנו מודים לדניאל סונג (CRH, אוניברסיטת אדינבורו) על הגישה האדיבה לקונפוקל 3i ספינינג-דיסק.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Software
Microscope software Zen Blue 2.0 Carl Zeiss
ImageJ/FIJI Open-Source
Visual Studio Code Microsoft
Microscope and accessories
ApoTome microscope Carl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens Carl Zeiss
dual AxioCam 506 m CCD cameras Carl Zeiss
Laser scanning confocal microscope LSM880 Carl Zeiss
Spinning-disk module CSU-X1 Yokogawa
Upright microscopeAxio Examiner D1 Carl Zeiss
UV laser Micropoint
VAST BioImager Union Biometrica
Labware
90 mm Petri dish Thermo-Fisher 101R20
96-well plate Corning 3841
Chemicals
Click-It EdU Imaging Kit Invitrogen C10637
aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) Sigma-Aldrich A5040
phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
Antibodies
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 Jackson 703-545-155
Donkey anti-mouse Cy3 Jackson 715-165-150
Mouse anti-GFP Abcam AB13970
Mouse anti-tubulin acetylated antibody Sigma T6793
Transgenic zebrafish lines
Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) N/A Established by David Greenhald, University of Edinburgh
Tg(mnx1:gfp) N/A First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed) N/A First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) N/A Established by Katy Reid, University of Edinburgh
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) N/A Established by David Greenhald, University of Edinburgh

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
  2. Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
  3. Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
  4. Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
  5. Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
  6. Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
  7. Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
  8. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. , Available from: https://nc3rs.org.uk (2021).
  9. Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
  10. Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
  11. Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
  12. Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
  13. Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
  14. Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
  15. Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
  16. Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
  17. Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
  18. Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
  19. Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
  20. Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
  21. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  22. AndOr Micropoint Manual. , Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021).
  23. Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260 (2017).
  24. Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
  25. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  26. Howell, D. Statistical methods for psychology. , Duxbury. 324-325 (2002).
  27. Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
  28. Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
  29. Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  30. Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).

Tags

רפואה גיליון 177

Erratum

Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 04/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.

The title was updated from:

Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

to:

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

פציעות חצי אוטומטיות מבוקרות הנגרמות בלייזר לחקר התחדשות חוט השדרה בזחלי דגי זברה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

El-Daher, F., Early, J. J.,… More

El-Daher, F., Early, J. J., Richmond, C. E., Jamieson, R., Becker, T., Becker, C. G. Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (177), e63259, doi:10.3791/63259 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter