Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Kontrollerede halvautomatiske laserinducerede skader til undersøgelse af rygmarvsregenerering hos zebrafisklarver

Published: November 22, 2021 doi: 10.3791/63259
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh Medical School: Biomedical Sciences, 2Center for Regenerative Therapies at the TU Dresden

ERRATUM NOTICE

Summary

Den nuværende protokol beskriver en metode til at fremkalde vævsspecifikke og meget reproducerbare skader hos zebrafisklarver ved hjælp af et laserlæsionssystem kombineret med en automatiseret mikrofluidisk platform til larverhåndtering.

Abstract

Zebrafisklarver har et fuldt funktionelt centralnervesystem (CNS) med en høj regenerativ kapacitet kun få dage efter befrugtning. Dette gør denne dyremodel meget nyttig til at studere rygmarvsskade og regenerering. Standardprotokollen til inducering af sådanne læsioner er at transektere den dorsale del af bagagerummet manuelt. Denne teknik kræver imidlertid omfattende træning og beskadiger yderligere væv. En protokol blev udviklet til laserinducerede læsioner for at omgå disse begrænsninger, hvilket giver mulighed for høj reproducerbarhed og fuldstændighed af rygmarvstranssektion over mange dyr og mellem forskellige sessioner, selv for en uuddannet operatør. Desuden er vævsskader hovedsageligt begrænset til selve rygmarven, hvilket reducerer forvirrende virkninger af at skade forskellige væv, f.eks. Hud, muskler og CNS. Desuden er hemi-læsioner i rygmarven mulige. Forbedret bevarelse af vævsintegritet efter laserskade letter yderligere dissektioner, der er nødvendige for yderligere analyser, såsom elektrofysiologi. Derfor giver denne metode præcis kontrol over skadesomfanget, der er uopnåeligt manuelt. Dette giver mulighed for nye eksperimentelle paradigmer i denne kraftfulde model i fremtiden.

Introduction

I modsætning til pattedyr kan zebrafisk (Danio rerio) reparere deres centralnervesystem (CNS) efter skade1. Brugen af zebrafisklarver som model for rygmarvsregenerering er relativt nylig. Det har vist sig værdifuldt at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for reparation2. Dette skyldes den lette manipulation, den korte eksperimentelle cyklus (nye larver hver uge), vævets optiske gennemsigtighed og larvernes lille størrelse, ideel til in vivo fluorescensmikroskopi.

I tilfælde af rygmarvsregenerering er to yderligere fordele ved at bruge larver genopretningshastigheden, et par dage sammenlignet med et par uger for voksne og letheden ved at fremkalde skader ved hjælp af manuelle teknikker. Dette er blevet anvendt med succes i mange undersøgelser3,4,5, herunder nylige undersøgelser6,7. Samlet set fører dette til øget meningsfuld dataproduktion, høj tilpasningsevne af eksperimentelle protokoller og reducerede eksperimentelle omkostninger. Brugen af larver yngre end 5 dage efter befrugtning reducerer også brugen af dyr efter 3R-principperne i dyreforsøg8.

Efter en rygmarvsskade hos zebrafisklarver forekommer mange biologiske processer, herunder inflammatorisk respons, celleproliferation, neurogenese, migration af overlevende eller nygenererede celler, reformation af funktionelle axoner og en global ombygning af neurale processer kredsløb og rygsøjlevæv6,7,9,10 . For at blive orkestreret med succes involverer disse processer en fint reguleret interaktion mellem en række celletyper, ekstracellulære matrixkomponenter og biokemiske signaler11,12. Unraveling detaljerne i denne betydelige omorganisering af et komplekst væv som rygmarven kræver brug og udvikling af præcise og kontrollerede eksperimentelle tilgange.

Det primære eksperimentelle paradigme, der bruges til at studere rygmarvsregenerering i zebrafisk, er at bruge kirurgiske midler til at fremkalde vævsskade ved resektion, knivstik eller kryoskade3,13. Disse tilgange har den ulempe, at de kræver specifik uddannelse i mikrokirurgiske færdigheder, hvilket er tidskrævende for enhver ny operatør og kan forhindre deres anvendelse i kortsigtede projekter. Desuden fremkalder de normalt skade på det omgivende væv, hvilket kan påvirke regenerering.

En anden tilgang er at fremkalde celleskader kemisk14 eller ved genetiske manipulationer15. Sidstnævnte giver mulighed for meget målrettede skader. En sådan teknik kræver imidlertid et langt forberedende arbejde for at generere nye transgene fisk, før der udføres et forsøg, fornyet hver gang en unik celletype målrettes.

Der er således behov for en metode, der muliggør målrettede, men alsidige læsioner, der er egnede til en række undersøgelser inden for regenerering. En løsning er at bruge en laser til at fremkalde lokaliseret skade i vævet af interesse16,17,18,19,20. Faktisk præsenterer brugen af laserinduceret vævsskade en robust tilgang til generering af rygmarvslæsioner med mange fordele. Mikroskoperne udstyret med sådanne lasermanipulationsmoduler gør det muligt at specificere et tilpasset formet område, hvor celleablation vil forekomme, med den ekstra fordel ved tidsmæssig kontrol. Læsionens størrelse og placering kan således tilpasses til at løse eventuelle spørgsmål.

Det manglende træk ved de fleste laserlæsionssystemer er muligheden for at fremkalde skader på en meget reproducerbar måde for en række larver. Her beskrives en original protokol ved hjælp af en UV-laser til at fremkalde halvautomatiske præcise og kontrollerede læsioner i zebrafisklarver baseret på en mikrofluidisk platform designet til automatiseret larvehåndtering21. Desuden indsættes larver i det system, der præsenteres her, i en glaskapillær, som tillader fri rotation af dyret omkring dets rostrocaudale akse. Brugeren kan vælge, hvilken side af larven der skal præsenteres for laseren, samtidig med at fluorescensbilleddannelse præcist kan målrette laserstrålen og vurdere skaden efter læsionen.

Den protokol, der er beskrevet her, anvendes sammen med et halvautomatisk billeddannelsessystem for zebrafisklarver kombineret med en spindeskive udstyret med en UV-laser (i det følgende betegnet som VAST-systemet). Imidlertid er protokollens hovedpunkter og de fleste af teknikkens påstande gyldige for ethvert system udstyret med en laser, der er i stand til celleablation, herunder to-foton laserscanningsmikroskoper, spindediskmikroskoper forsynet med en UV-laser (FRAP-modul) eller videomikroskoper med et lasermodul til fotomanipulation. En af de største forskelle mellem VAST-systemet og konventionel prøvehåndtering vil være, at for sidstnævnte vil det være nødvendigt at montere larver i agarose med lavt smeltepunkt på glasdæksler/petriskåle med glasbund i stedet for at lægge dem i en plade med 96 brønde.

Fordelene ved denne metode åbner muligheder for innovativ forskning i de cellulære og molekylære mekanismer under regenereringsprocessen. Desuden giver den høje datakvalitet mulighed for kvantitative undersøgelser i en tværfaglig sammenhæng.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført med godkendelse fra det britiske indenrigsministerium og i henhold til dets regler under projektlicens PP8160052. Projektet blev godkendt af University of Edinburgh Institutional Animal Care and Use Committee. Til eksperimentelle analyser blev zebrafisklarver op til 5 dage gamle af begge køn anvendt af følgende tilgængelige transgene linjer: Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg(Xla.Tubb:DsRed), Tg(betaactin:utrophin-mCherry), Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) og Tg(mnx1:gfp) (se supplerende fil 1 vedrørende generering af de transgene zebrafiskelinjer). En skematisk oversigt over protokollen ved hjælp af den automatiserede platform til håndtering af zebrafisklarver er vist i figur 1. Al brugerdefineret software, scripts og detaljerede eksperimentelle protokoller, der anvendes i dette arbejde, er tilgængelige på https://github.com/jasonjearly/micropointpy/.

1. Prøveforberedelse

  1. Ved 5 timer efter befrugtning sorteres embryonerne for det korrekte udviklingsstadium21. Kassér døde æg og dårligt udviklede og overudviklede embryoner.
  2. Ved 3 dage efter befrugtning (dpf) anæstesiere larver ved at tilsætte 2 ml 0,4% aminobenzoesyre-ethylmethylester til 50 ml fiskeanlægsvand i en 90 mm petriskål. Brug dyr opdrættet med phenylthiourinstof (PTU) (se materialetabel) for at forhindre hudpigmentering, hvis det er et problem, hvilket ikke er tilfældet for rygmarvsskader på 3 dpf larver beskrevet i denne protokol.
    BEMÆRK: Denne relativt høje bedøvelseskoncentration bruges til at forhindre larvernes bevægelser efter laserpåvirkningen.
  3. Screene embryonerne for fluorescerende reporterudtryk (supplerende fil 1).
    BEMÆRK: En fluorescerende reporter til rygmarven (eller anden struktur af interesse) er ofte nødvendig for at vurdere effektiviteten af skaden. Brugen af tg(Xla.Tubb:DsRed) hjælper med at identificere rygmarven.
  4. Overfør de udvalgte larver til en plade med 96 brønde til brug i VAST-systemet (se materialetabel) med 300 μL fiskeanlægsvand pr. brønd. Brug mediet, der indeholder bedøvelsesstofet fra 90 mm petriskålen direkte. Sørg for kun at have en larve pr. Brønd. Forbered en ekstra tom 96-brønds plade for at samle de læsionerede larver.
    BEMÆRK: Hvis du bruger et andet laserlæsionssystem, skal larverne monteres i 1% LMP-agarosegel (Low-Melting Point) i et passende observationskammer.

2. Mikroskop forberedelse

  1. Tænd for alle systemkomponenterne (VAST, mikroskop, laser, PC), inklusive laseren til ablation.
  2. Når hardwaren er fuldt initialiseret, skal du starte mikroskopsoftwaren, ImageJ / Fiji, et python integreret udviklingsmiljø (IDE) og den automatiserede zebrafiskbilleddannelsessoftware (VAST-system), hvis du bruger denne platform (se Tabel over materialer).
  3. Konfigurer VAST-softwaren ved at følge nedenstående trin.
    1. Når VAST-softwaren starter, skal du vælge Plade i det første vindue og klikke på knappen Udført (figur 2A). Et andet lille vindue dukker op og spørger, om kapillæren er tom og ren. Kontroller ved at se på billedet af kapillæren, om der er luftbobler indeni. Hvis ikke, skal du klikke på Ja. Hvis der er bobler, skal du klikke på Nej og følge trin 2.3.2-2.3.3 (figur 2B).
    2. I vinduet Large Particle (LP) Sampler skal du klikke på Prime for at fjerne luftbobler (figur 2C).
    3. Gå til hovedsoftwarevinduet (med kapillærbilledet) og højreklik på billedet. Vælg Optag tomt kapillærbillede i pop op-menuen (figur 2B).
    4. I vinduet LP Sampler skal du gå til menuen Filer og vælge indstillingen Åbn script . Vælg en fil, der indeholder det script, der svarer til det eksperiment, der skal udføres.
    5. I hovedvinduet VAST-software skal du gå til Filer og vælge Åbn eksperiment. Vælg den eksperimentfil, der svarer til det planlagte eksperiment.
      BEMÆRK: Sørg for, at felterne Automatisk aflæsning og Masseudgang til affald IKKE er markeret.
  4. Konfigurer mikroskopsoftwaren til billeddannelse.
    1. Start mikroskopbilleddannelsessoftwaren (se Tabel over materialer) for at initialisere hardwaren. Dette kan tage et par minutter, afhængigt af systemet.
    2. Gå til anskaffelsesindstillingerne, og opsæt mikroskopet til billeddannelse af fluoroforen udtrykt i larverne. Brug et 10x NA 0,5 vanddyppende mål for at sikre, at brændvidden er langstrakt nok langs den optiske akse til at læsion hele dybden af rygmarven eller det målrettede væv.
  5. Konfigurer ImageJ/Fiji til laserlæsioner.
    1. Gå til menuen Filer , vælg Ny / Script for at åbne scriptvinduet.
    2. I vinduet Ny skal du gå til menuen Filer og vælge Åbn for at indlæse laserlæsionsscriptet (Manual_MP_Operation.ijm).
  6. Konfigurer Python-IDE'et.
    1. Start Python IDE.
    2. Gå til filet menuen og vælg Åbn fil for at indlæse scriptet til at administrere laseren (Watch_for_ROIs_py3.py).
    3. Gå til menuen Kør , og vælg Kør uden fejlfinding for at køre scriptet. Kontroller, at der vises en sekvens af meddelelser i PANELET TERMINAL sammen med noget støj, mens laserdæmperen initialiseres (figur 2D).

3. Udførelse af laserlæsioner på VAST-systemet

  1. Centrer kapillæren i forhold til mikroskopmålet ved at flytte scenen ved at klikke på pileknapperne i vast-softwarens hovedvindue (figur 2B).
  2. Fokuser på toppen af kapillæren ved at se gennem okularerne og bruge mikroskopets transmitterede lys.
    FORSIGTIG: Kapillæren er meget skrøbelig og kan gå i stykker, hvis den berøres af målet. Flyt mikroskopknappen langsomt, når du fokuserer ind og ud.
  3. Placer pladerne med 96 brønde på pladeholderen på LP Sampler i VAST-systemet. Placer pladen indeholdende larver på venstre holder og pladen til opsamling til højre. Sørg for, at pladerne er korrekt orienteret: A1-brønden skal være i det forreste venstre hjørne af holderen.
  4. I VAST-softwaren skal du i LP Sampler-vinduet klikke på knappen Plate Template og vælge alle de brønde, der indeholder larver. Klik på OK-knappen for at validere og lukke vinduet (figur 2C).
  5. I LP Sampler-vinduet skal du klikke på knappen Kør plade for at begynde at indlæse en larve.
    BEMÆRK: Efter nogen tid skal larven være synlig i kapillæren på position (foruddefineret i eksperimentdefinitionsfilen), hvilket gør det muligt at skade rygmarven. VAST-bakkelyset slukkes efter et par rotationer for at indstille larven med den laterale side vendt mod mikroskopmålet.
  6. Gå til mikroskopsoftwaren, og klik på knappen Live for at afbilde larven.
  7. Drej mikroskopets fokusknap, indtil rygmarvens centrale kanal er synlig.
    BEMÆRK: Det kan være lettere at fokusere ved hjælp af transmitteret lys først og derefter forfine med fluorescens.
  8. Tag et øjebliksbillede i fluorescens, og gem billedet i en dedikeret mappe.
  9. Åbn billedet i ImageJ, og juster kontrasten, hvis det er nødvendigt (ved hjælp af menuen Image/Adjust/Brightness/contrast... i ImageJ).
  10. Klik på linjeværktøjet Region of Interest (ROI), og tegn en kort linje (20 μm) centreret på rygmarven (figur 3A).
  11. Skift mikroskopet til den 100% reflekterende spejlposition.
  12. Indlæs ImageJ-scriptet, og klik på knappen Kør . Brug følgende parametre: Gentagelse - 2; Prøve - 1; Bredde - 40 mikron; Dæmpning - 89 (Fuld lasereffekt) (figur 3C).
  13. Når laserskudssekvensen er færdig, skal du skifte til fluorescensbilleddannelse på billedbehandlingssoftwaren og justere fokus, hvis det er nødvendigt.
    BEMÆRK: Et skift i fokus observeres ofte på grund af haleforskydning under lasereksponering.
  14. Tag et nyt øjebliksbillede, og gem det.
  15. Åbn dette nye billede i ImageJ og tegn en ny linje, der skal være større end selve rygmarven (~ 80 μm), startende under den ventrale side af rygmarven i den øverste del af notokordet og gå mod den dorsale side for at ende i mellemrummet mellem rygmarven og huden (figur 3B).
  16. Skift mikroskopet til den 100% reflekterende spejlposition.
  17. Gå til ImageJ-scriptvinduet, og klik på knappen Kør . Brug følgende parametre: Gentagelse - 2; Prøve - 1; Bredde - 40 mikron; Dæmpning - 89 (Fuld lasereffekt).
  18. Når den (længere) laserskudssekvens er afsluttet, skal du kontrollere transektionskvaliteten ved at afbilde fluorescens og fokusering. Sørg for, at ingen celle eller axoner forbliver intakte på læsionsstedet, som skal fremstå som et mørkt eller som et svagt og homogent fluorescerende område (figur 3D, bundpanel).
  19. Saml de læsionerede larver i den tomme 96-brønds plade (med de samme brøndkoordinater som den oprindelige brønd) ved at gå til hovedvinduet VAST-software og klikke på knappen Collect .
  20. Tænd for VAST-systemlampen igen ved at klikke på afkrydsningsfeltet Bakkelys nederst til venstre i vinduet.
  21. Gentag trin 3.3-3.17 for hver ny larve, der skal skades.

4. Håndtering efter læsion og yderligere eksperimenter

  1. Tag larver ud af pladen med 96 brønde så hurtigt som muligt og overfør dem til en ren petriskål med frisk fiskeanlægsvand, så larverne kan komme sig efter læsionen. Sæt petriskålen i en inkubator ved 28 °C.
    BEMÆRK: Skaden fortsætter ofte med at forplante sig i den første time efter læsionen. Læsionens faktiske omfang bør derfor vurderes ved fluorescensbilleddannelse efter en forsinkelse på ca. 1 time.

5. Fejlfinding

  1. Hvis der er luftbobler i rørene og kapillæren i VAST-systemet, skal du klikke på Prime-knappen i LP Sampler-vinduet for at fjerne dem.
  2. Overvej de mislykkede læsioner (som vurderet ud fra den resterende fluorescens på læsionsstedet, bortset fra den forventede resterende og homogene baggrund), hvilket kan skyldes flere grunde, der er nævnt nedenfor.
    1. Lav lasereffekt: Når dette sker, kan du prøve med en højere værdi.
      BEMÆRK: VAST-systemet er udstyret med en farvelaser. Dette indebærer, at koncentrationen af farvestofopløsningen, der anvendes til laserlysgenerering, kan ændre sig med tiden, hvilket fører til et fald i lasereffekten. Udskiftning med en ny løsning løser normalt problemet22.
    2. Dårlig kalibrering: Når dette sker, skal lasersystemets kalibrering og effekt kontrolleres i henhold til trin 5.2.2.1-5.2.2.4. Hvis laseren ikke kalibreres korrekt, vil den ikke blive dirigeret til det ønskede sted, hvilket fører til mislykkede læsioner eller uønsket skade i tilstødende væv.
      1. Placer et spejlglider oven på kapillærkammeret. Fokuser på den belagte side (den skal vende mod målet). Brug en tidligere standard i lysbilledet til lettere at fokusere.
      2. Anvend et mønster af laserablation ved hjælp af et kalibreringsscript.
      3. Vurder kvaliteten af mønsteret. Pletterne eller linjerne skal virke skarpe og ikke slørede.
      4. Brug en rampe med stigende effekt til at vurdere, om lasereffekten har ændret sig i forhold til de foregående sessioner.
    3. Larvebevægelse under læsioner: Larver reagerer forskelligt på anæstesi; således kan laserlæsionen udløse bevægelser af halen under processen og dermed forhindre en vellykket transektion. Når dette sker, skal du tage en ekstra iteration af laserlæsionstrinnene for at fuldføre det, mens du stadig undgår skade på det omgivende væv.
    4. Dårligt fokus: Når dette sker, skal du fokusere på midten af den centrale kanal for at få de bedste resultater.
    5. ROI-tegning, position og størrelse: PLACERINGEN og størrelsen af ROI er afgørende for vellykkede transektioner. ROI skal være større end rygmarven og centreret på midten af rygmarven. For at løse dette skal du begynde at trække ROI fra den ventrale side af rygmarven og gå op mod den dorsale side for at opnå en vellykket transektion. Dette skyldes sandsynligvis halebevægelser udløst af sekvensen af laserskud under ablationsproceduren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validering af rygmarvstranssektion
Strukturelle og funktionelle undersøgelser blev udført for at vurdere, om protokollen tillader en fuldstændig rygmarvstranssektion.

For det første blev der udført immunfarvning ved hjælp af et antistof mod acetyleret tubulin (se tabel over materialer og supplerende fil 1) for at verificere, at tabet i fluorescens på læsionsstedet skyldtes neuronal vævsskade og ikke fluorescensfotobleaching fra laserbelysningen. En fuldstændig forstyrrelse af axonerne mellem læsionens kaudale og rostrale sider blev observeret, hvilket bekræftede den fuldstændige transektion af rygmarven (figur 4B). En vellykket rygmarvstranssektion bør ikke efterlade nogen resterende neuronal projektion på tværs af læsionsstedet (se figur 4C for et eksempel på en mislykket læsion). Ved hjælp af denne teknik blev succesraten for rygmarvslaserlæsioner anslået til at være 75% (fire ufuldstændige transektioner hos 16 dyr).

Tabet af funktionalitet efter laserlæsion blev undersøgt ved hjælp af calciumbilleddannelse. På intakt fisk genererer den spontane koordinerede neuronale netværksaktivitet fluorescenstoppe langs hele rygmarven. En vellykket transektion ville afbryde udbredelsen af denne aktivitet mellem begge sider af læsionen. For at kontrollere kvaliteten af rygmarvstranssektionen blev laserlæsioner udført på tg (Xla.Tubb: GCaMP6s) larver ved 3 dpf. Efter indsamling i en ny multi-brønd plade blev larver mildt bedøvende. De blev monteret på et glasdæksler i lavsmeltepunktsalgarose for at udføre fluorescens time-lapse-optagelser på et konfokalmikroskop fra 3 timer efter skaden. Et tab af aktivitet på den kaudale side af læsionsstedet blev observeret. Faktisk viser kvantificeringen af fluorescens, at pigge på grund af fiskens spontane aktivitet kun var til stede på den rostrale side efter skade, men forekom på en koordineret måde i de tilsvarende rostrale og kaudale positioner i intakte fisk (figur 4D,E). Det lave restsignal på den kaudale side efter skade skyldtes sandsynligvis aktiviteten af sensoriske neuroner (sandsynligvis Rohon-Beard sensoriske neuroner på den kaudale side af rygmarven23) som reaktion på halebevægelsen induceret af muskelkontraktion på rostralsiden.

Regenereringsprocesser induceret af laserlæsioner
Efter 24 timer efter skaden (hpi) begyndte såret at lukke, hvilket førte til en delvis restaurering af rygmarvens oprindelige struktur efter 48 timer (figur 5D). Ved hjælp af calciumbilleddannelse blev en delvis funktionel genforbindelse bekræftet (figur 5E,F) efter 48 hpi. Beregningen af forholdet (kaldet Connectivity Restoration Index af forfatterne) mellem amplituden af piggene i det kaudale område og det rostrale område (figur 5G) viste en stigning mellem 3, 24 og 48 hpi, som forventet under rygmarvsregenerering.

Laserlæsioner udløser et immunrespons
Makrofag (mpeg1: GFP + celler) rekruttering blev observeret efter laserlæsioner ved anvendelse af tg (Xla.Tubb: DsRed; mpeg1: GFP) larver laserlæsioner (figur 5H,I). Dette er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser foretaget af forfatterne ved hjælp af manuelle læsioner, der viser makrofagernes væsentlige rolle for vellykket regenerering af rygmarven i zebrafisklarver6,24. Denne observation indikerer, at immunreaktioner kan studeres efter laserskade og bekræfter, at vævsskade opstod.

Laserlæsioner og manuelle læsioner udløser øget neurogenese i rygmarven
Tidligere undersøgelser har brugt manuelle læsioner til at studere neurogenesen, der opstår efter en rygmarvsskade6,15. Laserlæsioner kan være et værdifuldt redskab til at studere dette fænomen. Et tidligere offentliggjort eksperiment viste øget neurogenese efter en manuel rygmarvsskade sammenlignet med ikke-lesionerede kontroller15. Her blev tg(mnx1:gfp) fisk brugt som motorneuroner og blev fluorescerende mærket. Anti-GFP-antistoffarvning blev brugt til at forbedre synligheden af GFP i larverne. Dette blev kombineret med EdU-farvning25 (se Supplerende fil 1), som mærker nygenererede neuroner. EdU blev tilføjet umiddelbart efter en skade på 3 dpf, hvilket betyder, at alle celler mærket med EdU blev genereret efter skade. Derfor repræsenterer celler, der viser colocaliseret farvning, nye motorneuroner, der er født efter rygmarvsskade. Antallet af colokaliserede celler på hver side af skadestedet eller i et område svarende til placeringen og størrelsen af skadestedet i ikke-påvirkede kontroller (fanget i to 50 μm vinduer) blev talt, og forskellen i det gennemsnitlige antal colokaliserede celler blev analyseret ved hjælp af en envejs ANOVA26.

Denne protokol blev brugt på manuelt og laserlæsionerede larver til at sammenligne virkningerne af hver læsionsmetode på neurogenese (figur 6). Der blev ikke observeret nogen forskel i antallet af mærkede celler mellem manuelle og laserlæsioner. Ikke-ionerede fisk viste færre dobbeltmærkede celler end læsionerede fisk under begge læsionsbetingelser (figur 6D). Dette er i overensstemmelse med tidligere resultater, der viser øget neurogenese hos manuelt læsionerede fisk sammenlignet med ikke-lesionerede fisk15.

Disse resultater understøtter calciumbilleddannelse og acetyleret tubulinfarvningsresultaterne, da laserskaden fremkalder et regenereringsrespons, der kan sammenlignes med en manuel læsion. Dette indikerer, at laserlæsionen ikke blot bleger fluorescensen i cellerne, men resulterer i en skade, der udløser de samme cellulære reaktioner, som en manuel læsion gør.

Laserlæsioner resulterer i mindre hud- og muskelskader end manuelle læsioner
Manuelle læsioner resulterer ofte i store mængder muskel- og hudskader. I modsætning hertil kan laserlæsioner målrettes mere specifikt mod rygmarven, hvilket reducerer skaden på andre væv. For at illustrere dette blev Tg (beta-actin: utrophin-mCh) larver brugt til at udføre manuelle og laserlæsioner. Denne linje mærker fluorescerende et F-actinbindende protein, der muliggør visualisering af rygmarvsceller og muskelfibre. Larverne blev derefter levende monteret og afbildet (figur 7A,B). Figur 7A viser skaden på rygmarven. Manglen på utrophin på skadestedet i både laser- og manuelle læsionsbetingelser tyder på, at begge læsionsmetoder har beskadiget cellerne i rygmarven. Figur 7B viser muskelskaden. Der er en klar chevronlignende struktur til myotomerne i den ikke-ledige tilstand, og bundter af actinfibre er synlige. Der er en synlig forstyrrelse af myotomformen i den manuelle læsionstilstand, og færre actinfibre er til stede. Dette viser betydelig muskelskade. I laserlæsionstilstanden opretholdes myotomets chevronstruktur imidlertid. Der er en vis skade på muskelfibre, men dette er indeholdt i et eller to myotomer sammenlignet med inden for fire i den manuelle læsionstilstand. Derudover er der mindre hudskader i laserlæsionstilstanden sammenlignet med den manuelle læsionstilstand, som vist på billeder taget på et stereomikroskop i figur 7C.

Alt i alt viser disse resultater, at reproducerbare, halvautomatiske laserlæsioner har potentialet til at være et kraftfuldt værktøj til at studere neural regenerering i zebrafisk.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over den halvautomatiske laserskadearbejdsgang. Tre dage efter befrugtning (dpf) lægges larver i en plade med 96 brønde og placeres på den automatiserede larverhåndteringsplatform. Derefter lægges hver larve i en kapillær placeret under en 10x NA 0,5 linse på et opretstående mikroskop til billeddannelse og laserlæsion. Efter læsioner losses larver til en ny 96-brønds plade til indsamling og yderligere eksperimenter. Øverst transmitterede og fluorescensbilleder af tg(Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf larver før og efter laserlæsion (skalabjælke = 50 μm). Larver er orienteret rostral venstre og dorsal op (for alle figurer). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Software opstart af det halvautomatiske zebrafisk larver billedbehandlingssystem og laserstyringssystem. (A) VAST software ved opstart. (B) Hovedvinduet i VAST-softwaren viser den tomme kapillær. (C) LP Sampler-vindue med en tom pladeskabelon. (D) Visningen af python IDE med Watch_for_ROIs_py3.py script kørende. Det orange rektangel peger på terminalfanen med meddelelser, der vises under initialiseringen af laserdæmperen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Eksempel på laserlæsionssekvens på tg(Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf larver. (A) Det første trin i laserlæsion ved hjælp af en linje på 20 μm efter valg af linje-ROI-værktøjet fra ImageJ-værktøjslinjen. B) Andet trin med en linje på 80 μm til fuldstændig transektion af rygmarven. (C) Visning af det script, der bruges til at styre laseren fra ImageJ. (D) Sekvensen af billeder under laserlæsioner. Øverst: før læsion; Midten: umiddelbart efter det første trin; Nederst: umiddelbart efter det andet trin (skalabjælke = 50 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Acetyleret tubulinimmunstaining (A-C) og calciumbilleddannelse (D,E) indikerer, at laserlæsion fuldstændig forstyrrer kontinuiteten i rygmarvsvævet. (A) Intakt rygmarv. (B) Fuldstændig transektion af rygsøjlen, der viser en fuldstændig forstyrrelse af rygmarvsvævet langs både de dorsale-ventrale og mediale-laterale akser. C) Ufuldstændig transektion. (skalabjælke = 50 μm). (D) Transekteret rygmarv på en tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) 3 dpf larve. Rektanglerne viser de ROI'er, der bruges til at kvantificere fluorescensintensiteten i læsionens rostrale (blå) og kaudale (orange) sider. (E) Graf over fluorescensintensiteten ændres over tid i rostrale og kaudale analyse ROI'er. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Laserskade fremkalder et immunrespons og fører til vellykket anatomisk og funktionel genopretning. (A-D) Den maksimale intensitetsprojektionsfluorescensbilleder af en tg (Xla.Tubb: DsRed) 3dpf larve før (A) og på forskellige tidspunkter efter laserlæsionen: efter 3 timer (B), efter 24 timer (C) og efter 48 timer (D). (E-G) Anvendelsen af calciumbilleddannelse til at vurdere funktionsgendannelsen. (E) Læsioned tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) larve med analyse ROI'er. (F) Graf over fluorescensintensiteten ændres over tid i rostrale og kaudale analyse ROI'er. (G) Kvantificering af forholdet mellem kaudale og rostrale spikeamplituder (Connectivity Restoration Index) ved 3, 24, 48 timer efter læsion (N = 3). (H-I) Karakterisering af immunresponset efter læsion. (H) Fluorescensbilleder af ikke-lesioneret (venstre) og læsionet (højre) tg (Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) 3 dfp larve, der viser akkumuleringen af makrofager (mpeg1+ celle, grøn) ved 6 hpi. I) Kvantificering af antallet af makrofager ved 6 timer efter læsion hos skadede og intakte larver (N = 3) (skalastænger = 50 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Læsionsinduceret generering af motorneuroner er sammenlignelig mellem laser og manuel læsion. (A-C) Billeder fra ApoTome-mikroskopet af tg(mnx1:gfp) 5 dpf larver med EdU-farvning, i laserlæsion (A), manuel læsion (B) og ikke-llesionerede (C) betingelser. Pilespidser angiver celler, der er dobbeltmærket for begge markører. Skalabjælke = 100 μm. (A'-C') Højere forstørrelse af dobbeltmærkede celler betegnet med hvide bokse. (D) Kvantificering af celletal for antallet af colokaliserede celler i hver larve. 50 μm vinduer blev placeret på hver side af skadestedet, og colokaliserede celler blev talt i alle Z-stack billeder. Envejs ANOVA blev udført med Tukeys posthoc test27. Ingen signifikant forskel mellem laser og manuelle læsioner (p = 0,909). Signifikant færre mnx1:gfp+/EdU+-celler i ikke-ionerede kontroller sammenlignet med laserlæsion (2,4 fold ændring, p = 0,011) og manuel læsion (2,3 gange ændring, p = 0,018). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Laserlæsion inducerer mindre muskel- og hudskader end den manuelle læsion. (A-B) Enkelt Z-stack billeder af tg(beta-actin:utrophin-mCherry) 3 dpf larver i de ulesionerede, manuelle læsions- og laserlæsionsbetingelser, taget på det konfokale mikroskop ved 20x forstørrelse. Hvide pile angiver skadestedet. Skalastang = 50 μm. (A) betegner Z-stakke, hvor rygmarven og notokorden er synlige. SC mærker rygmarven, og NC mærker notokorden. (B) betegner Z-stakke, hvor muskelfibrene er synlige. (C) Billeder blev taget på stereomikroskopet af 3 dpf larver i de ulesionerede, manuelle læsions- og laserlæsionsbetingelser. Larver blev fastgjort til en platform ved hjælp af wolframtrådstifter (synlig i laserlæsionsbillede). Den sorte boks angiver læsionsstedet. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil 1: De eksperimentelle detaljer i protokollen. Genereringen af de transgene zebrafiskelinjer, manuelle rygmarvsskader, acetyleret tubulinimmunhistokemi, Hb9 / EdU-farvning, billeddannelse og billedbehandling og analyse beskrives. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er et presserende behov for en dybere forståelse af de processer, der er på spil under regenerering i zebrafisk. Denne dyremodel giver mange fordele for biomedicinsk forskning, især for rygmarvsskader1. De fleste af undersøgelserne involverer manuelle læsioner, der kræver en veluddannet operatør og inducerer multivævsskade. En laserlæsionsprotokol præsenteres her, hvilket muliggør kontrol over læsionsegenskaberne og reduceret skade på det omgivende væv. Desuden er denne teknik let nok til med succes at blive brugt af relativt uuddannede eksperimenter.

Kritiske trin i protokollen er kalibreringen af laseren og definitionen af ROI'er. I praksis er kalibreringen meget stabil (selv i flere måneder), og når den rigtige størrelse og position af ROI er blevet bestemt, er brugen af denne teknik ligetil. Selvom protokollen beskrev, hvordan man udfører læsionerne på specifikt udstyr, er de fleste af fordelene ved laserlæsioner tilgængelige for forskellige systemer, såsom et spindediskmikroskop.

De vigtigste begrænsninger i denne protokol er behovet for at bruge en fluorescensreporter af rygmarven og den tid, der kræves for at udføre læsionerne (~ 5 minutter / fisk). Sidstnævnte kompenseres af høj reproducerbarhed, der kræver færre dyr. Manuelle læsioner er dog stadig levedygtige til applikationer såsom lægemiddeltestning, hvor der er behov for mange læsionerede dyr. Som vist her er omfanget af læsionsinduceret neurogenese sammenligneligt mellem laser og manuelle læsioner.

Laserskader har imidlertid enorme potentielle anvendelser, nogle af dem relateret til de unikke fordele, der tilbydes. For eksempel tillader en roterende kapillær at udføre læsioner i en lang række positioner på en kontrolleret måde. For eksempel kan det bruges til at inducere enkelt neuron axotomi i Mauthner-celler (data ikke vist), som det også er blevet påvist i Bhatt et al.15's arbejde. Dette ville ikke være muligt ved hjælp af manuelle læsioner.

Resultaterne viser også, at skaden hovedsageligt er indeholdt i rygmarven med minimal skade på omgivende væv. Dette kan betyde, at cellulære reaktioner set efter en laserlæsion er mere tilbøjelige til at blive tilskrevet rygmarven specifikt snarere end signalering fra andre beskadigede væv. Det kan også betyde, at laserlæsionerede larver er mere i stand til at modstå yderligere forberedelser til forsøg. For eksempel indebærer dissektion til elektrofysiologi fjernelse af bagagerumshuden ved hjælp af tang28,29,30, hvilket ville resultere i højt mekanisk tryk placeret på det allerede sarte skadested og risikere, at eventuelle aksonale forbindelser brydes igen. Integriteten af hud og muskelvæv, der ses i laserlæsionerede larver, kan beskytte læsionsstedet mod yderligere skade og resultere i en mere nøjagtig repræsentation af det opnåede regenereringsniveau.

Desuden begrænser den forbedrede lokalisering af skader efter laserskade udvidelsen af koblingen mellem forskellige regenereringsprocesser, hvilket kan maskere mere subtile processer, når der anvendes manuelle læsioner. Tilgangen til eksperimentel skade i larvezebrafisken, der er beskrevet her, kan åbne for en række nye undersøgelser inden for rammerne af kvantitativ biologi, biologisk fysik og beregningsbiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af BBSRC (BB/S0001778/1). CR er finansieret af Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme. Vi takker David Greenald (CRH, University of Edinburgh) og Katy Reid (CDBS, University of Edinburgh) for den venlige gave af transgen fisk (se supplerende fil). Vi takker Daniel Soong (CRH, University of Edinburgh) for den venlige adgang til 3i spinning-disk confocal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Software
Microscope software Zen Blue 2.0 Carl Zeiss
ImageJ/FIJI Open-Source
Visual Studio Code Microsoft
Microscope and accessories
ApoTome microscope Carl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens Carl Zeiss
dual AxioCam 506 m CCD cameras Carl Zeiss
Laser scanning confocal microscope LSM880 Carl Zeiss
Spinning-disk module CSU-X1 Yokogawa
Upright microscopeAxio Examiner D1 Carl Zeiss
UV laser Micropoint
VAST BioImager Union Biometrica
Labware
90 mm Petri dish Thermo-Fisher 101R20
96-well plate Corning 3841
Chemicals
Click-It EdU Imaging Kit Invitrogen C10637
aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) Sigma-Aldrich A5040
phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
Antibodies
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 Jackson 703-545-155
Donkey anti-mouse Cy3 Jackson 715-165-150
Mouse anti-GFP Abcam AB13970
Mouse anti-tubulin acetylated antibody Sigma T6793
Transgenic zebrafish lines
Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) N/A Established by David Greenhald, University of Edinburgh
Tg(mnx1:gfp) N/A First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed) N/A First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) N/A Established by Katy Reid, University of Edinburgh
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) N/A Established by David Greenhald, University of Edinburgh

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
  2. Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
  3. Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
  4. Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
  5. Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
  6. Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
  7. Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
  8. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. , Available from: https://nc3rs.org.uk (2021).
  9. Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
  10. Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
  11. Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
  12. Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
  13. Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
  14. Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
  15. Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
  16. Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
  17. Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
  18. Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
  19. Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
  20. Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
  21. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  22. AndOr Micropoint Manual. , Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021).
  23. Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260 (2017).
  24. Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
  25. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  26. Howell, D. Statistical methods for psychology. , Duxbury. 324-325 (2002).
  27. Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
  28. Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
  29. Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  30. Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).

Tags

Medicin udgave 177

Erratum

Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 04/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.

The title was updated from:

Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

to:

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Kontrollerede halvautomatiske laserinducerede skader til undersøgelse af rygmarvsregenerering hos zebrafisklarver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

El-Daher, F., Early, J. J.,… More

El-Daher, F., Early, J. J., Richmond, C. E., Jamieson, R., Becker, T., Becker, C. G. Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (177), e63259, doi:10.3791/63259 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter