Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Lyskontrollerte gjæringer for mikrobiell kjemisk og proteinproduksjon

Published: March 22, 2022 doi: 10.3791/63269
Automatic Translation
*1, *1, 1,2,3,4
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2The Andlinger Center for Energy and the Environment, Princeton University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4High Meadows Environmental Institute, Princeton University
* These authors contributed equally

Summary

Optogenetisk kontroll av mikrobiell metabolisme gir fleksibel dynamisk kontroll over gjæringsprosesser. Protokollen her viser hvordan du setter opp blå lysregulerte gjæringer for kjemisk og proteinproduksjon på forskjellige volumetriske skalaer.

Abstract

Mikrobielle cellefabrikker tilbyr et bærekraftig alternativ for produksjon av kjemikalier og rekombinante proteiner fra fornybare råstoffer. Å overbelaste en mikroorganisme med genetiske modifikasjoner kan imidlertid redusere vertens kondisjon og produktivitet. Dette problemet kan løses ved å bruke dynamisk kontroll: induserbart uttrykk for enzymer og veier, vanligvis ved hjelp av kjemiske eller næringsbaserte tilsetningsstoffer, for å balansere cellulær vekst og produksjon. Optogenetikk tilbyr en ikke-invasiv, svært justerbar og reversibel metode for dynamisk regulering av genuttrykk. Her beskriver vi hvordan du setter opp lyskontrollerte gjæringer av konstruerte Escherichia coli og Saccharomyces cerevisiae for produksjon av kjemikalier eller rekombinante proteiner. Vi diskuterer hvordan man bruker lys på utvalgte tidspunkter og doser for å koble fra mikrobiell vekst og produksjon for forbedret gjæringskontroll og produktivitet, samt de viktigste optimaliseringshensynene for best resultat. I tillegg beskriver vi hvordan man implementerer lyskontroller for laboratorieskala bioreaktorforsøk. Disse protokollene letter innføringen av optogenetiske kontroller i konstruerte mikroorganismer for forbedret gjæringsytelse.

Introduction

Optogenetikk, kontrollen av biologiske prosesser med lysresponsive proteiner, tilbyr en ny strategi for dynamisk styring av mikrobielle gjæringer for kjemisk og proteinproduksjon1,2. Byrden av konstruerte metabolske veier og toksisiteten til noen mellomprodukter og produkter svekker ofte celleveksten3. Slike påkjenninger kan føre til dårlig biomasseakkumulering og redusert produktivitet3. Denne utfordringen kan løses ved å dele gjæringer i en vekst- og produksjonsfase, som vier metabolske ressurser til henholdsvis biomasseakkumulering eller produktsyntese4. Vi viste nylig at overgangen fra vekst til produksjon i denne tofase gjæringen kan induseres med endringer i belysningsforholdene5,6,7. Den høye tunabiliteten, reversibiliteten og ortogonaliteten til lysinnganger8 gir unike fordeler for lyskontrollerte gjæringer som er vanskelige eller umulige å gjenskape med kjemiske indusere som brukes i dynamisk kontroll av konvensjonelle tofasede gjæringer4,9,10,11.

Det blålys responsive EL222-proteinet avledet fra Erythrobacter litoralis har blitt brukt til å utvikle flere optogenetiske kretser for metabolsk engineering i Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13. EL222 inneholder et LOV-domene (light-oxygen-voltage sensor) som gjennomgår et konformasjonsskift ved aktivering av blått lys (465 nm), som gjør det mulig å binde seg til sin kojakk-DNA-sekvens (C120)13. Fusing EL222 til det virale VP16-aktiveringsdomenet (VP16-EL222) resulterer i en responsiv transkripsjonsfaktor med blått lys som kan aktivere genuttrykk i S. cerevisiae7 og andre organismer14 fra den syntetiske promotoren PC120. Flere kretser basert på EL222 er utviklet og brukt til kjemisk produksjon i S. cerevisiae, for eksempel det grunnleggende lysaktiverte OptoEXP-systemet7, der genet av interesse uttrykkes direkte fra PC120 (figur 1A). Imidlertid motiverte bekymringer for lysgjennomtrengning ved de høye celletetthetene som vanligvis oppstår i produksjonsfasen av gjæring oss til å utvikle inverterte kretser som er indusert i mørket, for eksempel OptoINVRT- og OptoQ-INVRT-kretsene (figur 1B) 5,7,13. Disse systemene utnytter galaktose (GAL) eller quinic acid (Q) reguloner fra henholdsvis S. cerevisiae og N. crassa, kontrollerer deres tilsvarende undertrykkere (GAL80 og QS) med VP16-EL222, for å undertrykke genuttrykk i lyset og sterkt indusere det i mørket. Ved å kombinere OptoEXP- og OptoINVRT-kretser resulterer det i toveis kontroll av genuttrykk, noe som muliggjør tofasede gjæringer der vekstfasen induseres med blått lys, og produksjonsfasen med mørke (figur 2A)5,7.

Å bruke lys i stedet for mørke for å indusere genuttrykk under produksjonsfasen vil i stor grad utvide evnene til optogenetiske kontroller, men vil også kreve å overvinne lysgjennomtrengningsbegrensningene til de høye celletetthetene som vanligvis oppstår i denne gjæringsfasen. For dette formål har vi utviklet kretser, kjent som OptoAMP og OptoQ-AMP, som forsterker transkripsjonsresponsen på blå lysstimulering. Disse kretsene bruker vilt- eller overfølsomme mutanter av VP16-EL222 for å kontrollere produksjonen av transkripsjonsaktivatorene Gal4p eller QF2 i henholdsvis GAL- eller Q-regulonene, og oppnår forbedret følsomhet og sterkere genuttrykk med lys12,13 (figur 1C). OptoAMP-kretser kan oppnå fullstendig og homogen lysinduksjon i 5 L bioreaktorer med optisk tetthet (målt ved 600 nm; OD600) verdier på minst 40 med bare ~ 0,35% belysning (5% lysdose på bare ~ 7% av bulkoverflaten). Dette viser en høyere grad av følsomhet sammenlignet med OptoEXP, som krever nær 100% belysning12. Evnen til effektivt å indusere genuttrykk med lys ved høye celletettheter åpner nye muligheter for dynamisk kontroll av gjæringer. Dette inkluderer driftsgjæringer i mer enn to tidsfaser, for eksempel trefasede gjæringer, der vekst, induksjon og produksjonsfaser etableres med unike lysplaner for å optimalisere kjemisk produksjon (figur 2B)12.

Figure 1
Figur 1: Optogenetiske kretser for dynamisk kontroll av S. cerevisiae. OptoEXP-, OptoINVRT- og OptoAMP-kretsene er basert på det lysfølsomme VP16-EL222-systemet. (A) I OptoEXP-kretsen forårsaker eksponering for blått lys en konformasjonsendring og dimerisering av VP16-EL222, som eksponerer et DNA-bindende domene og tillater transkripsjon fra PC120. Figuren er endret fra Zhao et al.7. (B) OptoINVRT-kretser utnytter GAL(vist) eller Q-reguloner for å indusere uttrykk i mørket. I GAL-baserte kretser uttrykkes VP16-EL222 og GAL4 konstituativt, mens PC120-stasjonsuttrykket til GAL80-repressoren (i Q-baserte kretser erstattes GAL4 og GAL80 av henholdsvis QF2 og QS, og en syntetisk QUAS-inneholdende promotor brukes i stedet for en GAL-promotor). I lys forhindrer Gal80p aktivering av genet av interesse fra PGAL1. I mørket uttrykkes ikke GAL80 og forringes raskt ved å fusjonere det til et konstituerende degrondomene (lite brunt domene), noe som muliggjør aktivering av PGAL1 av Gal4p. Figuren er endret fra Zhao et al.5. (C) OptoAMP-kretser bruker også VP16-EL222 til å kontrollere GAL- (vist) eller Q-reguloner. I disse kretsene er GAL80-repressoren (eller QS) konstituert uttrykt og smeltet sammen til en fotosensitiv degron (lite blått domene) som sikrer tett undertrykkelse i mørket. PC120 og en overfølsom VP16-EL222 mutant kontrolluttrykk av GAL4 (eller QF2) med lys, som sterkt aktiverer PGAL1 (eller en QUAS-inneholdende promotor) i lyset. GAL-avledede kretser kan bruke konstruerte former for PGAL1, for eksempel PGAL1-M eller PGAL1-S, som har økt aktivitet, samt wild-type promotorer kontrollert av GAL-regulonet (PGAL1, PGAL10, PGAL2, PGAL7). Figuren er endret fra Zhao et al.12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: To- og trefasede gjæringer over tid. (A) Tofase gjæringer operert med inverterte kretser består av en lysdrevet vekstfase og en mørk produksjonsfase. I vekstfasen akkumuleres biomasse etter hvert som produksjonsveien forblir undertrykt. Når du når ønsket OD600, blir cellene flyttet til mørket for å justere metabolsk før de blir resuspendert i friske medier for produksjonsfasen. (B) I en trefaset prosess defineres vekst-, inkubasjons- og produksjonsfasene av unike lysplaner, som kan bestå av en mørk vekstperiode, pulsert inkubasjon og fullt opplyst produksjonsfase. Figur opprettet med Biorender. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Optogenetiske kretser er også utviklet for dynamisk kontroll av kjemisk og proteinproduksjon i E. coli. OptoLAC-kretser styrer den bakterielle LacI-repressoren ved hjelp av den lysresponsive pDawn-kretsen, som er basert på YF1/FixJ tokomponentsystem6 (figur 3). I likhet med OptoINVRT5 er OptoLAC-kretser designet for å undertrykke genuttrykk i lyset og indusere det i mørket. Uttrykksnivåer ved hjelp av OptoLAC-kretser kan matche eller overskride de som oppnås med standard isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induksjon, og dermed opprettholde styrken av kjemisk induksjon samtidig som den tilbyr forbedret tunabilitet og reversibilitet6. Derfor muliggjør OptoLAC-kretser effektiv optogenetisk kontroll for metabolsk engineering i E. coli.

Figure 3
Figur 3: OptoLAC-kretser for dynamisk kontroll av E. coli. OptoLAC-kretsene tilpasser pDawn-systemet og lac operon for å oppnå aktivering i mørket og undertrykkelse i lyset. I mørket, YF1 fosforylater FixJ, som deretter aktiverer PFixK2 promotoren for å uttrykke cI-undertrykkeren . CI-undertrykkeren forhindrer uttrykk for laktI-undertrykkeren fra PR-promotoren , som tillater transkripsjon av genet av interesse fra en laktoholdig promotor. På den annen side reduserer blått lys YF1 netto kinase aktivitet, reversere FixJ fosforylering og dermed cI uttrykk, som derepresser uttrykk for lacI og forhindrer uttrykk fra lacO-inneholdende promotor. Figuren er endret fra Lalwani et al.6. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Vi beskriver her de grunnleggende protokollene for lyskontrollerte gjæringer av S. cerevisiae og E. coli for kjemisk eller proteinproduksjon. For både gjær og bakterier fokuserer vi først på gjæringer med en lysdrevet vekstfase og en mørkeindusert produksjonsfase aktivert av OptoINVRT- og OptoLAC-kretser. Deretter beskriver vi en protokoll for en trefaset (vekst, induksjon, produksjon) lyskontrollert gjæring aktivert av OptoAMP-kretser. Videre beskriver vi hvordan man skalerer opp optogenetisk kontrollerte gjæringer fra mikroplater til laboratorieskala bioreaktorer. Med denne protokollen tar vi sikte på å gi en komplett og lett reproduserbar guide for å utføre lyskontrollerte gjæringer for kjemisk eller proteinproduksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Lyskontrollert kjemisk produksjon ved hjelp av S. cerevisiae OptoINVRT7 krets

  1. Belastning konstruksjon
    1. Få en belastning med his3 auxotrophy, da denne markøren er nødvendig for de fleste eksisterende OptoINVRT plasmider5. Hvis du søker optogenetisk regulering av et gen som er innfødt til S. cerevisiae, konstruere en stamme der enhver endogen kopi av genet slettes.
    2. Lineariser plasmidet som inneholder OptoINVRT7-kretsen, for eksempel EZ-L4395, og integrer den i his3-locus av den auxotrofiske stammen ved hjelp av standard litium-acetattransformasjonsmetoder15. Hvis du bruker EZ-L439-plasmidet, som inneholder komponentene for å undertrykke PGAL1 i lyset og aktivere det i mørket, lineariserer du på PmeI-begrensningsstedet.
    3. Etter transformasjonen, sentrifuger cellene på 150 x g i 1 min og forsiktig resuspend i 200 μL fersk histidin-dropout syntetisk komplett medium (SC-His) medium.
    4. Plate hele cellevolumet på SC-Hans agar plater og inkuber ved 30 °C i 2-3 dager til kolonier vises.
    5. Forbered kompetente celler fra denne stammen ved hjelp av standard litiumacetattransformasjonsprotokoller, og transformer dem med en plasmid som inneholder genene som skal kontrolleres optogenetisk nedstrøms for enten PGAL1-M eller PGAL1-S-promotoren5.
      MERK: Bruk av en plasmid som integreres på δ-nettsteder (YARCdelta5) og velger med Zeocin gir mulighet for stabil multikopiintegrasjon7,16,17,18.
    6. Etter transformasjon, sentrifuger kulturen på 150 x g i 1 min og forsiktig resuspend i 200 μL fersk SC-dropout medium.
      MERK: PGAL1-M-promotoren er en syntetisk versjon av PGAL1-promotoren med Mig1p-undertrykkelsesstedene slettet, mens PGAL1-S er en konstruert versjon av PGAL1-M, som har ekstra Gal4p-aktivatorbindingssteder. Den vanlige PGAL1-promotoren kan brukes til å kontrollere uttrykket; Uttrykksstyrken vil imidlertid være lavere enn fra disse konstruerte promotørene.
    7. Plate hele cellevolumet på en gjær ekstrakt pepton dextrose (YPD) agar plate hvis integrering i δ-steder, eller en SC-dropout plate hvis transformering med en plasmid som inneholder en markeringsmarkør. Inkuber ved 30 °C i 16 timer under konstant blått lys for å holde det optogenetisk kontrollerte genet undertrykt.
      MERK: For noen stammer kan kolonier vokse raskere når de inkuberes i blålyspulser (f.eks. 1 s på/79 s av, 5 s på/75 s av, 10 s på/70 s av, etc.) i stedet for i konstant belysning, som må bestemmes eksperimentelt for hver stamme, om nødvendig.
    8. Bruk en hvilken som helst 465 nm lyskilde og plasser et LED-panel ~ 40 cm over platen slik at lysintensiteten er ~ 80-110 μmol / m2 / s. Mål intensiteten ved hjelp av en kvantemåler (se Materialtabell).
    9. Hvis du integrerer i δ steder, oppretter du en kopi av platen på YPD-plater som inneholder en rekke Zeocin-konsentrasjoner mellom 400 μg/ml og 1200 μg/ml for å velge en rekke integrasjonskopinumre5,7,12,16,17,18. Inkuber replikaplatene ved 30 °C under konstant eller pulsert blått lys i 2-3 dager til koloniene vises.
  2. Foreløpig screening for de beste koloniene
    1. Velg åtte kolonier fra hver plate og bruk dem til å inokulere 1 ml SC-Hans medium supplert med 2% glukose i individuelle brønner av en 24-brønns plate. Vokse i 24-brønns plater under cellene over natten (16-20 h) ved 30 °C med 200 o/min (19 mm orbital diameter) risting under konstant blått lysbelysning.
    2. Neste morgen fortynner du hver kultur i 1 ml av en frisk SC-Hans medium med 2% glukose til OD600-verdier fra 0,01-0,3 og vokser i 24-brønnsplater under konstant eller pulserende lys ved 30 °C med 200 rpm risting til de når celletetthet mellom 2 og 9 OD600 verdier (figur 4A). Hvor lang tid som trengs for denne vekstfasen vil avhenge av belastningen.
    3. Inkuber platene i mørket i 4 timer ved 30 °C med 200 o/min risting ved å slå av lyspanelet og pakke platene inn i aluminiumsfolie.
      MERK: Dette trinnet gjør at cellene metabolsk kan gå over til produksjonsfasen før resuspension i produksjonsmediene.
    4. For å starte produksjonsfasen, sentrifuger kulturene i 24-brønnsplaten ved 234 x g i 5 min og resuspendceller i 1 ml fersk SC-frafallsmedium med 2% glukose. Forsegle platene for å forhindre fordampning av ønsket produkt ved hjelp av sterilt mikroplateforseglingstape.
    5. Gjær de forseglede platene i mørket i 48 timer ved 30 °C med risting ved 200 o/min. Sørg for at platene er pakket inn i aluminiumsfolie for å forhindre eksponering for lys.
      MERK: Innpakning av platene i folie begrenser ikke oksygen- eller gasstilgjengeligheten i gjæringer; Det sterile tetningsbåndet begrenser imidlertid gassoverføringen. Små hull kan stikkes i båndet for å introdusere oksygen, om nødvendig.
  3. Høsting og analyse
    1. For å høste gjæringene, sentrifuger platene i 5 min ved 234 x g og overfør 800 μL av supernatanten til 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    2. Avhengig av kjemikaliet av interesse, analyser ved hjelp av høyytelses væskekromatografi (HPLC), gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS), eller en annen analytisk metode ved hjelp av prøveprepareringsteknikken som passer best for instrumentet som brukes.

2. Lyskontrollert proteinproduksjon ved hjelp av E. coli OptoLAC-systemet

  1. Belastning konstruksjon
    1. Kotransformer elektrokompetent BL21 DE3 ΔlacI ΔlacI-DE3 med en plasmid som inneholder OptoLAC1B- eller OptoLAC2B-kretsen6 og en plasmid som uttrykker det rekombinante proteinet av interesse fra PT7-promotoren19.
    2. Etter transformering, gjenopprette cellene i 1 time i 1 ml super optimal buljong med katabolitt undertrykkelse (SOC; 2% trypton, 0,5% gjær ekstrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukose) ved 37 °C med rotasjon eller risting.
      MERK: Plasmidet som inneholder proteinet av interesse må være kompatibelt med OptoLAC-plasmidet (dvs. forskjellig motstandsmarkør og opprinnelse av replikasjon) og må ikke inneholde en kopi av lakti.
    3. Sentrifuger cellene ved 4845 x g i 3 min og konsentrer pelletsen i 200 μL lysogenybuljong (LB) medier. Plate hele konsentrerte celler på en LB agar plate med passende antibiotika og vokse ved 37 °C over natten under konstant blått lys for å holde proteinuttrykk undertrykt.
  2. Første screening for å bekrefte uttrykk
    1. Ta tre enkeltkolonier og bruk dem til å inokulere 1 ml LB-medier med passende antibiotika i individuelle brønner av en 24-brønns plate. Vokse over natten (16-20 h) ved 37 °C med 200 o/min risting under konstant blått lysbelysning (figur 4A).
    2. Neste dag bruker du 1,5 μL kultur for å måle OD600 i et spektrofotometer med mikrovolummåling. Fortynn kulturer til 1 ml fersk LB i 24-brønnsplater til OD600-verdier fra 0,01-0,1.
    3. Vokse kulturene ved 37 °C med 200 o/min risting under blått lys i 2-3 timer. Fra den andre timen, ta OD600 målinger hvert 15 min for å sikre at kulturene ikke overgrodde OD600-området på 0,1-1,5.
    4. Når kulturene er på ønsket OD600, slår du av lyspanelet og pakker platen i aluminiumsfolie for å starte produksjonsfasen. Oppbevar platen i mørket i 8 timer (37 °C), 20 h (30 °C) eller 48 h (18 °C), med risting på 200 o/min.
    5. Mål og registrer den endelige OD600-verdien for hver kultur.
  3. Høsting og analyse
    1. Overfør 800 μL av hver kultur til et 1,5 ml mikrosenterrør og sentrifuge i 5 min ved 17 000 x g.
    2. Resuspend cellepellet i 200 μL resuspension buffer (Tris 50 mM, pH 8.0, NaCl 300 mM).
      MERK: Konsentrasjonen av NaCl kan justeres basert på det rekombinante proteinet som analyseres.
    3. Tilsett 50 μL 6x natrium dodecylsulfat (SDS) prøvebuffer (Tris 375 mM, pH 6,8, SDS 9%, glyserol 50%, bromofenol blå 0,03%, DTT 9%). Inkuber ved 100 °C i 10 minutter med risting ved 700 o/min i en thermomixer.
    4. Last ~ 3-20 μL av kulturen i en 12% SDS-PAGE gel. Bruk den endelige OD600-målingen som en veiledning, last omtrent samme mengde protein for hver prøve (tilsvarende 10 μL av prøven som tilsvarer en endelig OD600-verdi på 1). Bruk en strømforsyning til å kjøre elektroforese ved 100 V til gelen er helt løst.
    5. Flekk gelen med Coomassie strålende blå G-250-løsning ved oppvarming i 30-40 s i en mikrobølgeovn, og inkuber deretter på en plattformrotator i minst 15 minutter.
    6. Skyll med deionisert vann to ganger og destain på en plattformrotator i minst 30 min (eller over natten), og tilsett to rengjøringsservietter bundet i en knute for å absorbere flekken. Kok gelen i tilstrekkelig mengde vann i mikrobølgeovnen i 15 min for å øke hastigheten på destainingsprosessen.

3. Trefase gjæring ved hjelp av S. cerevisiae OptoAMP-systemet

  1. Belastning konstruksjon
    1. Få en belastning med en his3 auxotrofisk markør, da denne markøren er nødvendig for å bruke eksisterende OptoAMP plasmider5. Hvis du søker optogenetisk regulering av et gen som er innfødt til S. cerevisiae, konstruere en stamme der den endogene kopien av dette genet slettes.
    2. Lineariser en plasmid som inneholder OptoAMP4-kretsen, for eksempel EZ-L58012, og integrer den i his3 locus av den auxotrofiske stammen ved hjelp av standard litium-acetattransformasjonsmetoder15. Hvis du bruker EZ-L580, lineariserer du plasmidet på pmeI-begrensningsstedet.
    3. Etter transformasjonen sentrifugerer du cellene på 150 x g i 1 min og forsiktig resuspend i 200 μL fersk SC-His medium.
    4. Plate hele cellevolumet på selektive medier (SC-His-agar) og inkuber ved 30 °C i 2-3 dager til kolonier vises.
    5. Forbered kompetente celler fra denne stammen og transformer dem med en plasmid som inneholder genet (e) som skal kontrolleres optogenetisk nedstrøms for PGAL1-S-promotoren12.
      MERK: Bruk av en plasmid som integreres på δ-nettsteder og valg med Zeocin gir mulighet for stabil multikopiintegrasjon og utvalg.
    6. Etter transformering, sentrifuger kulturen på 150 x g i 1 min og forsiktig resuspend i 200 μL fersk SC-dropout medium.
      MERK: PGAL1-S-promotoren er en syntetisk versjon av PGAL1-promotoren der Mig1p-undertrykkelsesstedene slettes og ekstra Gal4p-aktivatorbindingssteder legges til. Den vanlige PGAL1-promotoren kan brukes; Uttrykksstyrken vil imidlertid være lavere enn denne konstruerte promotoren.
    7. Plate hele cellevolumet på en YPD eller SC-dropout agar plate og inkuber ved 30 °C i 16 timer i mørket (innpakket i aluminiumsfolie). Inkubering i mørket holder det optogenetisk kontrollerte genet undertrykt, noe som gjør at cellene kan lede sine metabolske ressurser mot cellevekst i stedet for kjemisk produksjon.
    8. Hvis du integrerer i δ steder, kan du kopiere platen på YPD-plater som inneholder en rekke Zeocin-konsentrasjoner, for å velge for en rekke integrasjonskopinumre. Inkuber platene ved 30 °C i mørket (innpakket i aluminiumsfolie) i 2-3 dager til kolonier vises.
  2. Foreløpig screening for de beste koloniene
    1. Velg åtte kolonier fra hver plate og bruk dem til å inokulere 1 ml SC-Hans medium med 2% glukose i individuelle brønner av en 24-brønns plate. Vokse cellene over natten (16-20 h) i mørket ved 30 °C med 200 o/min risting.
    2. Neste morgen fortynner du hver kultur i 1 ml fersk SC-Hans medium med 2% glukose til 0,1 OD600 og vokser i mørke ved 30 °C med 200 o/min risting til de når en OD600 av 3. Pakk platene i aluminiumsfolie for å forhindre eksponering for lys. Hvor lang tid som trengs for denne vekstfasen vil avhenge av belastningen.
    3. For å starte induksjonsfasen, inkuber platene under pulserende lys (for eksempel 5 s på / 95 s av) i 12 timer ved 30 ° C med 200 rpm risting. Bruk en hvilken som helst lyskilde på 465 nm og plasser et LED-panel over platen slik at lysintensiteten er ~80-110 μmol/m2/s for optimale resultater (figur 4A).
      MERK: Den optimale lyspulsvarigheten for denne inkubasjonen vil variere avhengig av kjemikaliet som produseres. Det anbefales å screene en rekke lysplaner fra 0,1% (f.eks. 1 s på 999 s av) til 100% (fullt lys).
    4. For å starte produksjonsfasen, sentrifugere kulturene på 234 x g i 5 min og resuspend i fersk SC-Hans medium med 2% glukose. Forsegle platene for å forhindre fordampning av ønsket produkt ved hjelp av sterilt mikroplateforseglingstape.
    5. Fermenter de forseglede platene i lys i 48 timer ved 30 °C med risting ved 200 o/min. Optimaliser lysplanen i dette trinnet, da noen kjemikalier drar nytte av en pulserende produksjonsfase i stedet for fullt lys.
  3. Høsting og analyse
    1. Høst gjæringene ved å sentrifugere platene i 5 min ved 234 x g og overføre 800 μL av supernatanten til 1,5 ml mikrosenterrør.
    2. Avhengig av kjemikaliet av interesse, analyser ved hjelp av HPLC, GC-MS eller en annen analytisk metode ved hjelp av prøveprepareringsteknikken som passer best for instrumentet som brukes.

4. Kjemisk (mevalonat) produksjon fra E. coli i en lyskontrollert bioreaktor

  1. Første inokulasjons- og bioreaktoroppsett
    1. Inokuler en koloni av en E. coli-stamme konstruert med lyskontrollert kjemisk produksjon i 5 ml M9 minimale salter (3,37 mM Na2HPO4, 2,2 mM KH2PO4, 0,855 mM NaCl, 0,935 mM NH4Cl) supplert med 0,2 % m/v casamino-syrer, 5 % m/v glukose og blanding av spormetall20 (0,0084 g/L EDTA, 0,0025 g/L CoCl2, 0,015 g/L MnCl2, 0,0015 g/L CuCl2, 0,003 g/L H3BO3, 0,0025 g/L Na2MoO4, 0,008 g/L ZnCl2, 0,06 g/L Fe (III) sitrat, 0,0045 g/l tiamin, 1,3 g/L MgSO4) i et 50 ml konisk rør.
    2. Vokse kulturen over natten ved 30 °C med 200 o/min risting under blått lys belysning.
    3. Sett opp bioreaktorbeholderens hodeplate, og sørg for at følgende porter er installert: sett inn for termisk sonde; oppløst oksygen (DO)-sonde; gassspurger - koble til luftkilden gjennom et 0,2 μm filter; løpehjul; gasskondensator - koble til et 0,2 μm filter; kjølelinje (x2); feedlinjer (x2) - en for medietillegg, en for pH-kontroll; prøvetakingslinje - sørg for at den når bunnen av fartøyet; tom port; pH-sonde - kalibrer sonden med standarder for pH = 4 og pH = 7 før installasjon, enten autoklaver med resten av karet eller steriliser med 95% etanol og sett inn aseptisk før oppsett.
    4. Fyll beholderen med 1 L filtrert vann, og fest hodeplaten og stram til, og pass på at O-ringen sitter godt og tetninger.
    5. Dekk eventuelle åpninger inn i reaktoren med aluminiumsfolie.
    6. Forbered tre rørstrimler: en for å fjerne vannet, en for å sette inn fôret og en for pH-kontroll. Dekk endene med aluminiumsfolie og pakk alle slangene i aluminiumsfolie.
      MERK: NH4OH, som brukes til pH-justering, flyter ikke jevnt i silikonrør, noe som kan føre til unøyaktige strømningshastigheter og overbassifisering av kulturen. For å unngå dette problemet, bruk biokompatibel pumperør (BPT) til NH4OH-fôret.
    7. Autoklaver bioreaktoren og slangen ved hjelp av en 30 min væskesyklus.
    8. Fjern materialene fra autoklaven. Når du er avkjølt nok til å håndtere, kobler du løpehjulet, pH- og DO-sondene, luftkilden, kondensatorinntaket og -uttaket og kjøleinntaket og -uttaket til kontrollstasjonen.
    9. Sett inn den termiske sonden og dekk fartøyet med en varmejakke. Fest jakken mot toppen av fartøyet for å unngå å blokkere kulturen mot lyseksponering.
    10. Koble et av de sterile rørene til prøvetakingslinjen og fest det gjennom prøvetakingspumpen. Plasser den andre enden slik at den strømmer inn i en tom beholder som kan holde minst 1 L. Tøm vannet inne i fartøyet.
    11. Koble et annet sterilt rør til en av matelinjene og fest gjennom en av matepumpene. Koble den andre enden av røret til en flaske M9-medier. Mat mediet inn i reaktoren.
    12. Koble et annet sterilt rør til en av matelinjene og fest gjennom en av matepumpene. Koble den andre enden av røret til flasken som inneholder 28%-30% NH4OH.
      FORSIKTIG: NH4OH er etsende. Arbeid i en avtrekkshette mens du overfører til en fôrflaske og sørg for at fôrflasken er plassert i sekundær inneslutning.
    13. Plasser tre lyspaneler i en trekantet formasjon ~20 cm fra reaktoren, og kontroller at lysintensitetene på overflaten av fartøyet når ~80-110 μmol/m2/s fra hver side (figur 4B).
    14. Neste dag slår du på bioreaktorsystemet og kjøleren. Sett reaktortemperaturinnstillingspunktet til 37 °C, pH-innstilt til 7,0 og agitasjonen til 200 o/min. Varmejakken skal slås på.
    15. Kalibrer DO-sonden ved først å vente til temperatur- og DO-målingene blir konstante (dette vil være 100% settpunktet). Koble deretter sonden fra systemet (dette vil være 0% setpoint). Gjenta til DO-målingen stabiliserer seg på 100 % når sonden er tilkoblet, og sett deretter DO-settet til 20 %.
  2. Lyskontrollert kjemisk produksjon
    1. Inokuler bioreaktoren til en innledende OD600 på 0,001-0,1. Slå på lyspanelene for å starte veksten.
    2. Etter 3 timer begynner du å ta prøver fra prøvetakingslinjen for å ta OD600-målinger for å unngå å overgrodde den optimale celletettheten til induksjon (ρs). Når de optimale ρs er nådd (den optimale verdien for mevalonatproduksjon er 0,17), slå av lyspanelene, dekk reaktoren i aluminiumsfolie og pakk oppsettet i svart klut for å starte den mørke produksjonsfasen.
    3. Tilsett 50 μL antifoam, 8 timer etter at du har byttet til mørket. Skru av den tomme porten og pipette antifoam direkte inn i reaktoren.
    4. Bruk prøvetakingsporten til å ta prøver med jevne mellomrom for HPLC- eller GC-analyse.
  3. Demontering og analyse
    1. Når eksperimentet er avsluttet, slår du av systemet. Skru forsiktig av DO- og pH-sondene og vask dem med såpe og vann. Skru av hodeplaten og vask den med såpe og vann med en børste.
    2. Overfør kulturen til en tom beholder og legg blekemiddel til en endelig konsentrasjon på 10% v / v. Plasser i en avtrekkshette og kast den etter 30 min.
    3. Vask reaktorbeholderen med såpe og vann med en børste.
    4. Forbered prøvene for analyse basert på produktet av interesse. For mevalonatproduksjon blander du 560 μL kultur med 140 μL 0,5 M HCl og virvel i høy hastighet i 1 min. Dette konverterer mevalonat til (±)-mevalonolakton.
      FORSIKTIG: HCl er en helsefare. Håndter med riktig verneutstyr og sørg for at prøverørene er ordentlig avkortet før virveling.
    5. Sentrifuge ved 17.000 x g i 45 min ved 4 °C. Overfør 250 μL av supernatanten til et HPLC-hetteglass.
    6. For mevalonat, analyser prøver ved hjelp av en organisk syrer ionbyttekolonne. Kvantifisere produksjonen ved hjelp av en brytningsindeksdetektor (RID), som sammenligner toppområder med en standard på (±)-mevalonolakton.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Optogenetisk regulering av mikrobiell metabolisme har blitt vellykket implementert for å produsere en rekke produkter, inkludert biodrivstoff, bulkkjemikalier, proteiner og naturlige produkter5,6,7,12,13. De fleste av disse prosessene er designet for at cellevekst skal skje i lyset (når lav celletetthet gir minimale utfordringer med lett penetrasjon), og for at produksjonen skal induseres av mørket når cellene er vokst. Ulike kjemikalier som er produsert av gjær ved hjelp av denne tilnærmingen, inkludert melkesyre, en verdifull polymerforløper og tilsetningsstoff, samt isobutanol, en neste generasjons biodrivstoff. For begge kjemikaliene stammer en vanlig utfordring fra den sterke drivkraften til S. cerevisiae for å metabolisere glukose mot etanolproduksjon i stedet for produktet av interesse og manglende evne til å slette etanolgjæringsveien uten å forårsake en alvorlig vekstfeil7. En kombinasjon av lysaktiverte OptoEXP- og lystrykkede OptoINVRT-kretser har blitt brukt til selektiv aktivering med lys genet for pyruvat dekarboksylase (PDC1) som kreves for etanolgjæring, og indusere banen for ønsket produkt i mørket5 (figur 5A, B). Ved hjelp av denne strategien med en optimalisert celletetthet av induksjon (ρs), kan høye titere av begge ønskede kjemikalier oppnås (figur 5C,D), og fremhever verdien av toveis kontroll som tilbys av optogenetikk.

Mens de fleste gjærbaserte optogenetiske prosesser har sentrert seg om en lysdrevet vekstfase og mørkeindusert produksjonsfase, har den nylige utviklingen av ekstra sensitive og sterke OptoAMP-kretser åpnet muligheter for lysdrevne gjæringer også12. Disse lysdrevne gjæringene ligner på de tidligere beskrevne prosessene; Lysplanene reverseres imidlertid slik at produksjonen skjer i lyset. Videre tillater disse kretsene implementering av trefaseprosesser, noe som gir mer fleksibilitet og kontroll til produksjonen sammenlignet med standard tofaset tilnærming. Gitt følsomheten og styrken til disse kretsene, er disse trefaseprosessene vanligvis optimalisert ved å screene forskjellige lysplaner i hver fase. Optimale lyspulser avhenger av belastningen og produktet av interesse. Slike kretser har blitt brukt på produksjon av naringenin, et naturlig produkt med terapeutiske anvendelser, i tillegg til melkesyre og isobutanol12 (figur 6). Den økte produksjonen av alle tre kjemikaliene viser verdien av optogenetisk regulering på tvers av en rekke banekompleksiteter, samt det nye potensialet som tilbys av trefase gjæringer.

Utover disse demonstrasjonene i gjær, har optogenetikk også blitt brukt for å forbedre produksjonen av proteiner og kjemikalier i bakteriell arbeidshest E. coli. Fermenteringer med denne verten har fulgt et lysdrevet vekst- og mørkeindusert produksjonsrammeverk ved hjelp av OptoLAC-pakken med kretser6. Når den brukes til å produsere et gult fluorescerende protein (YFP) eller transkripsjonsfaktor FdeR, er lyskontrollert produksjon sammenlignbar eller overlegen nivåene oppnådd med standard IPTG-induksjon, men med enklere tunabilitet for mellomliggende produksjonsnivåer (figur 7A). I tillegg har OptoLAC-kretser blitt brukt til å produsere mevalonat, en viktig terpenoidforløper, både på mikroplate- og bioreaktornivå (figur 7B, C). Disse utvalgte resultatene gir en generell oversikt over styrken, allsidigheten og tunabiliteten av optogenetisk regulering for mikrobiell kjemisk og proteinproduksjon.

Figure 4
Figur 4: Eksperimentelt oppsett for belysning av plater og bioreaktorer. (A) 24-brønnsplater kan belyses under risting ved å plassere et blått LED-lyspanel ca. 40 cm over shakeren. Lysintensiteten bør måles med en kvantemåler for å sikre at den er mellom ~80-110 μmol/m2/s. (B) For å belyse en bioreaktor, plasser tre lyspaneler i en trekantet formasjon rundt bioreaktoren. Som med 24-brønnsplatene, bør lysintensiteten måles og justeres for å nå ~ 80-110 μmol / m2 / s fra alle sider. Figur opprettet med Biorender. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Lett undertrykt produksjon av kjemikalier fra S. cerevisiae. For å forbedre produksjonen av melkesyre (A) eller isobutanol (B), har en kombinasjon av lys- og mørk-induserbare kretser blitt brukt til selektiv aktivering av spesifikke veier. I begge scenariene blir den essensielle etanolproduksjonsveien indusert i lyset ved å kontrollere PDC1-uttrykket med OptoEXP, mens produksjonsveiene aktiveres i mørket ved hjelp av en OptoINVRT-krets. (C) Produksjon av melkesyre ble testet ved en rekke ρs-verdier med to kretser fra OptoINVRT-suiten. OptoINVRT7-versjonen fungerte best, med en optimal ρs-verdi på 7.0. (D) OptoINVRT7-versjonen maksimerte også isobutanolproduksjonen sammenlignet med den andre kretsen, med en optimal ρs på 8,75. **p < 0,01, ***p < 0,001. Statistikk avledes ved hjelp av en tosidig t-test. Data vises som gjennomsnittsverdier, og feilfelt representerer standardavvikene for fire replikeringer. Figuren er endret fra Zhao et al.5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Lysaktivert produksjon av kjemikalier i trefase gjæringer av S. cerevisiae. Fermenteringer ved hjelp av OptoAMP-kretsene kan operere med tre dynamiske faser: vekst (i), induksjon (ii) og produksjon (iii), hver definert av forskjellige lysavgiftssykluser. (A) Biosyntese av melkesyre induseres i blått lys ved optogenetisk kontroll av LDH-uttrykk . (B) Melkesyreproduksjon kan optimaliseres ved hjelp av en pulserende (1 s på/79 s av) lysplan i vekstfasen og full belysning i induksjons- og produksjonsfasene. (C) Produksjon av isobutanol induseres ved optogenetisk kontrollerende ILV2-uttrykk . (D) Isobutanol-produksjonen optimaliseres ved hjelp av en pulserende vekstfase (1 s på/79 s av), fullt opplyst induksjonsfase og pulsert (2 s på/118 s av) produksjonsfase. (E) Kontroll av den mer komplekse biosyntetiske banen for naringenin, indusert av optogenetisk kontrollerende uttrykk for TAL - og PAL-genene . (F) Naringenin biosyntese er best optimalisert ved hjelp av en pulserende vekst (1 s på/79 s av), fullt opplyst induksjon og mørk produksjonsfase. *p < 0,05, **p < 0,01, n.s. = ingen betydning. Statistikk avledes ved hjelp av en tosidig t-test. Data vises som gjennomsnittsverdier, og feilfelt representerer standardavvikene for fire uavhengige replikeringer. Figuren er endret fra Zhao et al.12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Optogenetisk produksjon av rekombinante proteiner og kjemikalier i E. coli. OptoLAC-systemet har blitt brukt til å produsere både proteiner og kjemikalier ved titere som kan sammenlignes med, eller høyere enn de som nås ved hjelp av kjemisk induksjon med IPTG. (A) Optogenetisk uttrykk for FdeR er både sterkt og justerbart ved hjelp av en rekke lette driftssykluser, som løst og kvantifisert med vestlig flekk. (B) En stamme konstruert for mevalonatproduksjon overskrider titere oppnådd ved hjelp av IPTG-induksjon ved 24-brønnsskalaen til optimal ρs-verdi . (C) Optogenetisk produksjon av mevalonat i en 2 L bioreaktor demonstrerer skalerbarheten av produksjonen utover mikroplater. *p < 0,05. **p < 0,01, ***p < 0,001. Statistikk avledes ved hjelp av en tosidig t-test. Alle data vises som gjennomsnittsverdier og feilfelt representerer standardavvikene for biologisk uavhengige prøver. Data for (A) og (C) representerer tre replikeringer, mens for (B) antall replikeringer fra venstre mot høyre= 4, 4, 6, 3, 4, 4, 4, 4. Figuren er endret fra Lalwani et al.6. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dynamisk kontroll har lenge vært brukt for å forbedre utbyttet for metabolsk engineering og rekombinant proteinproduksjon4. Endringer i enzymatisk uttrykk implementeres vanligvis ved hjelp av kjemiske indusere som IPTG21, galaktose22 og tetracyklin23, men har også blitt formidlet ved hjelp av prosessforhold som temperatur og pH. Optogenetisk kontroll av genuttrykk eliminerer behovet for endringer i gjæringsparametere eller mediesammensetning, noe som gjør det til et lett anvendelig alternativ til tradisjonelle induksjonsstrategier. Den enkle som lys kan slås på eller av tilbyr også nye evner som rask og reversibel tuning av gendosering. Videre, mens disse protokollene fokuserer på blå lysresponsive systemer, tilbyr eksistensen av optogenetiske verktøy som inverterer eksisterende lysresponser24 eller reagerer på andre bølgelengder av lys25,26,27,28,29 spennende potensial for ortogonalt å kontrollere flere veier for et enestående kontrollnivå. Slike fordeler gjør lys til en allsidig ny løsning for fleksibel kontroll over mikrobielle gjæringer.

Utover screening for de beste koloniene, som diskutert i protokollene, bør andre parametere som celletettheten der kulturer byttes fra vekst til produksjon (ρs), lengder på produksjons- og inkubasjonsperiodene og lette driftssykluser også optimaliseres. De beste verdiene til disse parametrene er produkt- og belastningsavhengige og bør derfor optimaliseres på nytt for enhver ny applikasjon. For eksempel kan veier som involverer giftige sluttprodukter dra nytte av høyere ρs-verdier, noe som gir tilstrekkelig opphopning av celler før produksjonen induseres6,7, mens en svakere, men mindre lekk krets kan favorisere lavere verdier av ρs for å maksimere total uttrykkstid. På samme måte kan noen veier og rekombinante proteiner dra nytte av mellomliggende uttrykksnivåer, som kan oppnås med unike lysoppgaver. Videre, når det gjelder gjæringer som bruker OptoAMP-kretser, kan antall temporale faser optimaliseres. Mens den demonstrerte protokollen beskriver en trefaset prosess, kan gjæringer ved hjelp av disse kretsene styres med et større antall faser definert av unike lystjenesteplaner og varigheter. Dermed bør en rekke av disse parametrene testes for å optimalisere ytelsen.

Unngå kilder til lysforurensning gir en viktig vurdering under eksperimentelt oppsett. For prosesser som krever en forsinkelse av lysstimulering til senere stadier (f.eks. mørke til lyse gjæringer), kan det være lurt å arbeide i et mørkt rom for å unngå for tidlig aktivering av optogenetiske systemer. I disse tilfellene kan en inert lyskilde brukes for synlighet under det eksperimentelle oppsettet (for eksempel en fjernrød lyskilde på ~ 700 nm når du arbeider med blå lysaktiverte systemer). En fordel med prosesser som starter med lysindusert vekst (lys til mørk) er at innledende eksperimentelle manipulasjoner kan utføres under omgivelseslys med god synlighet.

Den enkle som et stort antall lysavgiftsplaner kan brukes på gjæringer, gir muligheten til å utvikle høyere gjennomstrømningsmetoder for å balansere biosyntetiske veier og belyse de optimale forholdene som maksimerer gjæringsproduktiviteten. I stedet for å balansere metabolske veier ved å teste et stort antall kombinatorisk sammensatte konstruksjoner som har hvert enzym uttrykt av promotorer med forskjellige styrker, kan veier balanseres ved å variere genuttrykksnivåer ved hjelp av forskjellige lysavgiftssykluser fra et mye mindre antall konstruksjoner. Dette hindrer behovet for mer tungvinte eksperimentelle oppsett, for eksempel resuspension i forskjellige induksjonsmedier eller serielle fortynninger for kjemiske indusere. Optogenetiske eksperimenter kan potensielt til og med automatiseres for å øke gjennomstrømningen ved å bruke i silicokontrollere for å levere spesielt tidsberegnet eller lokaliserte lyspulser til forskjellige prøvebassenger30. Imidlertid må eksperimenter med høy gjennomstrømning under forskjellige lysforhold være tilstrekkelig separert for å unngå krysskontaminering av lys, noe som kan utgjøre romlige begrensninger. I tillegg forhindrer kravet til lysstimulering bruk av de fleste platelesere og mikrobioreaktorer for kontinuerlige målinger. Selv om det ennå ikke er allment tilgjengelig kommersielt, har flere apparater og algoritmer nylig blitt utviklet for høy gjennomstrømning og kontinuerlige optogenetiske eksperimenter, noe som bidrar til å løse disse romlige begrensningene31,32,33,34. Til tross for disse begrensningene tilbyr optogenetikk et stort potensial for å øke eksperimentell gjennomstrømning samtidig som det gir forbedret kontrollerbarhet.

Protokollene og videoen som presenteres her vil forhåpentligvis senke barrierene for andre forskere til å vedta optogenetiske kontroller av cellulær metabolisme og mikrobielle gjæringer. Optogenetikk er en muliggjørende teknologi for grunnleggende forskning og bioteknologiske anvendelser som kan dra nytte av finjustert kontroll av genuttrykk, som genetikk, molekylær- og cellebiologi, metabolisme, systembiologi og cybergenetikk35,36,37,38. I tillegg er optogenetisk regulering av genuttrykk demonstrert i andre mikroorganismer som Bacillus subtilis og Pseudomonas aeruginosa, noe som tyder på at fordelene med lyskontroll kan utvides til studiet og anvendelsen av forskjellige arter39,40,41. Disse mulighetene fremhever det fremtidige potensialet for optogenetikk for metabolsk engineering, proteinproduksjon og andre bioteknologiske applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har søkt om flere patenter for optogenetiske kretser og metoder beskrevet i denne artikkelen.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av U.S. Department of Energy, Office of Science, Office of Biological and Environmental Research Award Number DE-SC0019363, NSF CAREER Award CBET-1751840, The Pew Charitable Trusts og Camille Dreyfus Teacher-Scholar Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Light-controlled chemical production using S. cerevisiae
24-well culture plate USA Scientific CC7672-7524
Agar powder Thermo Fisher Scientific 303991049
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Blue LED panel HQRP 884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 Plasmid N/A N/A See Reference 1
Glucose Thermo Fisher Scientific 501879892 (G8270-5KG)
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Petri dish Celltreat 229656
PmeI New England Biolabs R0560L
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
Replica-plating device Thomas Scientific F37848-0000
Replica-plating pads Sunrise Science Products 3005-012
SC-His powder Sunrise Science Products 1303-030
SC Complete powder Sunrise Science Products 1459-100
Sterile sealing film Excel Scientific STR-SEAL-PLT
YPD agar plates VWR 100217-054
Zeocin Thermo Fisher Scientific R25005
Light-controlled protein production using E. coli
6X SDS Sample Buffer Cepham Life Sciences 10502
12% Acrylamide protein gels Thermo Fisher Scientific NP0341BOX
24-well culture plate USA Scientific CC7672-7524
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Blue LED panel HQRP 884667106091218
Coomassie Brilliant Blue G-250 Thermo Fisher Scientific 20279
Electrophoresis cell Bio-Rad 1658004
Electrophoresis power supply Bio-Rad 1645050
LB broth (Miller) Fisher Scientific BP97235
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
NaCl Thomas Scientific SX0425-1
OptoLAC plasmids N/A N/A See Reference 2
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Petri dish Celltreat 229656
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
SOC medium Thermo Fisher Scientific 15544034
Thermomixer Eppendorf 5382000015
Tris base Fisher Scientific BP1521
Three-phase fermentation using S. cerevisiae
Same materials as "Light-controlled chemical production using S. cerevisiae" protocol plus the following:
EZ-L580 OptoAMP4 Plasmid N/A N/A See Reference 10
Chemical production in a light-controlled bioreactor
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
Antifoam Sigma-Aldrich A8311
Bioreactor with control station Eppendorf B120110001
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Bleach VWR Scientific 89501-620 (CS)
Blue LED panel HQRP 884667106091218
BPT tubing Fisher Scientific 14-170-15
Glucose Thermo Fisher Scientific 501879892 (G8270-5KG)
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific 7647-01-0
M9 Minimal Salts Thermo Fisher Scientific A1374401
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
NH4OH Solution Sigma-Aldrich I0503-1VL
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
SC Complete powder Sunrise Science Products 1459-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Figueroa, D., Rojas, V., Romero, A., Larrondo, L. F., Salinas, F. The rise and shine of yeast optogenetics. Yeast. 38 (2), 131-146 (2021).
  2. Pouzet, S., et al. The promise of optogenetics for bioproduction: Dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).
  3. Venayak, N., Anesiadis, N., Cluett, W. R., Mahadevan, R. Engineering metabolism through dynamic control. Current Opinion in Biotechnology. 34, 142-152 (2015).
  4. Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Avalos, J. L. Current and future modalities of dynamic control in metabolic engineering. Current Opinion in Biotechnology. 52, 56-65 (2018).
  5. Zhao, E. M., et al. Design and characterization of rapid optogenetic circuits for dynamic control in yeast metabolic engineering. ACS Synthetic Biology. 9 (12), 3254-3266 (2020).
  6. Lalwani, M. A., et al. Optogenetic control of the lac operon for bacterial chemical and protein production. Nature Chemical Biology. 17 (1), 71-79 (2021).
  7. Zhao, E. M., et al. Optogenetic regulation of engineered cellular metabolism for microbial chemical production. Nature. 555 (7698), 683-687 (2018).
  8. Baumschlager, A., Khammash, M. Synthetic biological approaches for optogenetics and tools for transcriptional light-control in bacteria. Advanced Biology. 5 (5), 2000256 (2021).
  9. Dvorak, P., et al. Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3) carrying a synthetic metabolic pathway. Microbial Cell Factories. 14, 201 (2015).
  10. Hartline, C. J., Schmitz, A. C., Han, Y., Zhang, F. Dynamic control in metabolic engineering: Theories, tools, and applications. Metabolic Engineering. 63, 126-140 (2021).
  11. Ni, C., Dinh, C. V., Prather, K. L. J. Dynamic control of metabolism. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 12, 519-560 (2021).
  12. Zhao, E. M., et al. Optogenetic amplification circuits for light-induced metabolic control. ACS Synthetic Biology. 10 (5), 1143-1154 (2021).
  13. Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Wegner, S. A., Avalos, J. L. The Neurospora crassa Inducible Q System Enables Simultaneous Optogenetic Amplification and Inversion in Saccharomyces cerevisiae for Bidirectional Control of Gene Expression. ACS Synthetic Biology. 10 (8), 2060-2075 (2021).
  14. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  15. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  16. Marx, H., Mecklenbräuker, A., Gasser, B., Sauer, M., Mattanovich, D. Directed gene copy number amplification in Pichia pastoris by vector integration into the ribosomal DNA locus. FEMS Yeast Research. 9 (8), 1260-1270 (2009).
  17. Nordén, K., et al. Increasing gene dosage greatly enhances recombinant expression of aquaporins in Pichia pastoris. BMC Biotechnology. 11, 47 (2011).
  18. Zhao, E. M., et al. Light-based control of metabolic flux through assembly of synthetic organelles. Nature Chemical Biology. 15 (6), 589-597 (2019).
  19. Dowee, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
  20. Zhou, K., Edgar, S., Stephanopoulos, G. Engineering microbes to synthesize plant isoprenoids. Methods in Enzymology. 575, 225-245 (2016).
  21. Arfman, N., Worrell, V., Ingram, L. O. Use of the tac promoter and lacI(q) for the controlled expression of Zymomonas mobilis fermentative genes in Escherichia coli and Zymomonas mobilis. Journal of Bacteriology. 174 (22), 7370-7378 (1992).
  22. Steen, E. J., et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol. Microbial Cell Factories. 7 (1), 1-8 (2008).
  23. Tan, S. Z., Manchester, S., Prather, K. L. J. Controlling central carbon metabolism for improved pathway yields in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 5 (2), 116-124 (2015).
  24. Jayaraman, P., et al. Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6994 (2016).
  25. Fernandez-Rodriguez, J., Moser, F., Song, M., Voigt, C. A. Engineering RGB color vision into Escherichia coli. Nature Chemical Biology. 13 (7), 706-708 (2017).
  26. Ding, Q., et al. Light-powered Escherichia coli cell division for chemical production. Nature Communications. 11 (1), 1-14 (2020).
  27. Senoo, S., Tandar, S. T., Kitamura, S., Toya, Y., Shimizu, H. Light-inducible flux control of triosephosphate isomerase on glycolysis in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 116 (12), 3292-3300 (2019).
  28. Ramakrishnan, P., Tabor, J. J. Repurposing synechocystis PCC6803 UirS-UirR as a UV-violet/green photoreversible transcriptional regulatory tool in E. Coli. ACS Synthetic Biology. 5 (7), 733-740 (2016).
  29. Tabor, J. J., Levskaya, A., Voigt, C. A. Multichromatic control of gene expression in escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 405 (2), 315-324 (2011).
  30. Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and implementation of an automated illuminating, culturing, and sampling system for microbial optogenetic applications. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (120), e54894 (2017).
  31. Grødem, E. O. S., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
  32. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, (2016).
  33. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  34. Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLoS Biology. 18 (7), (2020).
  35. Carrasco-López, C., García-Echauri, S. A., Kichuk, T., Avalos, J. L. Optogenetics and biosensors set the stage for metabolic cybergenetics. Current Opinion in Biotechnology. 65, 296-309 (2020).
  36. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7 (1), 1-11 (2016).
  37. Melendez, J., et al. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology: Quantitative Biosciences From Nano to Macro. 6 (3), 366-372 (2014).
  38. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  39. Castillo-Hair, S. M., Baerman, E. A., Fujita, M., Igoshin, O. A., Tabor, J. J. Optogenetic control of Bacillus subtilis gene expression. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  40. Xia, A., et al. Optogenetic modification of pseudomonas aeruginosa enables controllable twitching motility and host infection. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 531-541 (2021).
  41. Pu, L., Yang, S., Xia, A., Jin, F. Optogenetics manipulation enables prevention of biofilm formation of engineered pseudomonas aeruginosa on surfaces. ACS Synthetic Biology. 7 (1), 200-208 (2018).

Tags

Bioingeniør utgave 181
Lyskontrollerte gjæringer for mikrobiell kjemisk og proteinproduksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hoffman, S. M., Lalwani, M. A.,… More

Hoffman, S. M., Lalwani, M. A., Avalos, J. L. Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production. J. Vis. Exp. (181), e63269, doi:10.3791/63269 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter