Visualisering av cytoskelettberoende handel med lipidhaltiga organeller i Drosophila-embryon

Summary

I det tidiga Drosophila-embryot är många organeller rörliga. I princip kan de avbildas live via specifika fluorescerande sonder, men äggskalet förhindrar direkt applicering på embryot. Detta protokoll beskriver hur man introducerar sådana sonder via mikroinjektion och sedan analyserar bulkorganellrörelse via partikelbildsverocimetri.

Abstract

Tidiga Drosophila-embryon är stora celler som innehåller ett stort antal konventionella och embryospecifika organeller. Under de första tre timmarna av embryogenesen genomgår dessa organeller dramatiska rörelser som drivs av aktinbaserad cytoplasmatisk strömning och motordriven handel längs mikrotubuli. Utvecklingen av en mängd små, organellspecifika fluorescerande sonder (FP) gör det möjligt att visualisera ett brett spektrum av olika lipidinnehållande strukturer i vilken genotyp som helst, vilket möjliggör levande avbildning utan att kräva en genetiskt kodad fluorofor. Detta protokoll visar hur man injicerar vitala färgämnen och molekylära sonder i Drosophila-embryon för att övervaka handeln med specifika organeller genom levande avbildning. Detta tillvägagångssätt demonstreras genom märkning av lipiddroppar (LD) och efter deras bulkrörelse med partikelbildsverocimetri (PIV). Detta protokoll ger en strategi som är mottaglig för studier av andra organeller, inklusive lysosomer, mitokondrier, äggula vesiklar och ER, och för att spåra rörelsen hos enskilda LD längs mikrotubuli. Att använda kommersiellt tillgängliga färgämnen ger fördelarna med separation i de violetta / blå och långröda regionerna i spektrumet. Genom multiplex sammärkning av organeller och/eller cytoskelettelement via mikroinjektion är alla genetiska resurser i Drosophila tillgängliga för smugglingsstudier utan att behöva introducera fluorescerande märkta proteiner. Till skillnad från genetiskt kodade fluoroforer, som lätt har låga kvantutbyten och blekmedel, möjliggör många av de tillgängliga färgämnena snabb och samtidig fångst av flera kanaler med höga fotonutbyten.

Introduction

Vitala färgämnen och molekylära sonder är kraftfulla verktyg för att avbilda specifika cellulära strukturer och organeller levande. I Drosophila-embryot visar många olika organeller cytoskelettdriven lokalisering 1,2,3,4, men appliceringen av dessa små molekyler är utmanande eftersom äggskalet är ogenomträngligt för många av dem. Detta protokoll beskriver en metod för att använda fluorescerande sonder (FP) i levande embryon via mikroinjektion för att upptäcka storskalig handel med organeller. Förfarandet omfattar beredning av injektionslösningen, ägguppsamling och beredning av embryon, mikroinjektion, avbildning och bildanalys.

Dramatiska rumsliga omarrangemang av organeller är vanliga i många djuroocyter, ägg och embryon, delvis på grund av den stora storleken på dessa celler. I Drosophila-embryot rör sig till exempel lipiddroppar (ED) och äggula vesiklar mot embryocentret strax före cellularisering⁵. Denna rörelse beror på mikrotubuli och lämnar en ~ 40 μm region runt periferin av embryot utarmat av de två organellerna. Under tidigare klyvningsstadier transporteras många organeller av cytoplasmatiska flöden som drivs av aktin-myosinbaserade sammandragningar vid embryoytan⁶. Även om embryon från många arter uppvisar liknande omarrangemang, är Drosophila-embryot särskilt lämpat för att följa dessa processer genom avbildning eftersom det utvecklas externt vid standard laboratoriets "rumstemperatur", är relativt transparent, tillräckligt liten för att passa på de flesta mikroskopinställningar och kan manipuleras med hjälp av kraftfulla genetiska verktyg.

För vissa organeller finns fluorescerande märkta proteiner tillgängliga som specifikt märker dessa strukturer. Till exempel är LSD-2 (även känd som dPLIN2) ett protein som i embryon specifikt riktar sig mot 1^{100-talet 7}. Flyglinjer finns tillgängliga som bär antingen inducerbara transgener som kodar för en fusion mellan grönt fluorescerande protein (GFP) och LSD-2⁸ eller en genfälla där gult fluorescerande protein (YFP) sätts in i den kodande regionen i den endogena LSD-2-genen ^9,10. Detta tillvägagångssätt har emellertid begränsningar, inklusive att dessa fusionsproteiner har låga kvantutbyten och tenderar att bleka lätt. Dessutom kan märkning av flera olika strukturer samtidigt vara utmanande: för många organeller är endast en typ av fluorescerande tagg (ofta GFP eller mCherry) för närvarande tillgänglig, så avbildning av två organeller samtidigt kan kräva nya transgener eller insättningar; Även om kompatibla taggar är tillgängliga kan det krävas tidskrävande kors för att introducera dem i en enda stam. Det gör det också mindre bekvämt att använda de många kraftfulla genetiska resurserna, t.ex. om två organellmarkörer, en Gal4-drivrutin och en inducerbar RNAi-konstruktion alla måste vara närvarande i samma mamma.

I princip kan dessa begränsningar övervinnas med användning av FP, inklusive vitala färgämnen (t.ex. LysoTracker för att markera lysosomer), molekylära sonder (t.ex. SiR-tubulin för att märka mikrotubuli) och fluorescerande märkta biologiska molekyler (t.ex. C12 BODIPY för att undersöka fettsyrametabolism¹¹). Från användning i odlade celler är de vanligtvis väl validerade som kraftfulla verktyg för att undersöka cellbiologi. FP: er är mångsidiga, har överlägsna fotoegenskaper och är kompatibla med fluorescerande proteiner. Flera färgämnen kan blandas och appliceras samtidigt, ofta med fördelarna med separation i de violetta / blå och långröda områdena i spektrumet och små Stokes-skift, vilket förhindrar att kanalen blöder igenom. Små Stokes-skift möjliggör samtidig inspelning av flera bildkanaler, vilket möjliggör spårning av flera organeller samtidigt. Slutligen kan de också tillämpas på märkning av organeller i embryon från andra Drosophila-arter eller till och med andra insekter där inga fluorescerande märkta proteiner kan finnas tillgängliga.

De flesta av dessa FP kan emellertid inte korsa den utarbetade äggskalan hos Drosophila-embryot . Den består av fem lager: tre yttre korionskikt (korion) som förhindrar mekanisk skada plus ett vaxartat skikt som omger vitellinmembranet som skapar en kemisk barriär¹². För enkelhetens skull kommer kombinationen av det vaxartade skiktet och vitellinmembranet att kallas "vitellinmembranet" nedan. För att kringgå äggskalet anpassar detta protokoll en etablerad embryomikroinjektionsmetod för att införa FP i Drosophila-embryot . Protokollet beskriver hur man övervakar det cytoplasmatiska flödet av LD i klyvningsstadiet embryon. Det innefattar beredning av injektionsnålar och ägguppsamlingsburar, processen för ägguppsamling och mekaniskt avlägsnande av korionen. Den går igenom hur man mikroinjekerar och avbildar embryona och hur man analyserar bulkflödet av LD med hjälp av partikelbildsverocimetri (PIV, anpassad från⁶). Den ger råd om felsökning för att säkerställa embryoöverlevnad och skapa det bästa systemet för avbildning. Också diskuterat är hur protokollet kan modifieras för att samtidigt avbilda LD och mikrotubuli eller för att tillämpa det på studier av andra organeller, inklusive lysosomer, mitokondrier, äggula vesiklar och endoplasmatisk retikulum (ER).

Protocol

1. Förbered nödvändiga material

OBS: Dessa preparat görs bäst dagar eller veckor i förväg.

1. Förbered injektionsnålar.
   OBS: Nålar kan förvaras på obestämd tid i en täckt behållare. Nålar måste vara tillräckligt fina för att leverera ~ 700 fL samtidigt som de är tillräckligt starka för att genomborra vitellinmembranet.
   1. Placera en kapillär i kapillärhållaren på nålavdragaren. Säkra kapillären med vingnötterna. Rikta in kapillärens mitt mot värmeelementet så att två symmetriska nålar genereras.
   2. Välj lämpliga inställningar på nålavdragaren enligt tillverkarens instruktioner.
   3. Utför kvalitetskontroll med hjälp av ett dissekeringsomfång.
      OBS: Nålspetsar ska vara så fina som möjligt. Spruckna, taggiga eller storborrade nålspetsar kasseras.
   4. Förbered partier med 10 nålar (5 kapillärer värda) åt gången.
   5. Placera en deformerbar kitt, som har rullats upp i en cylinder, i mitten av botten av en behållare med lock. Tryck försiktigt in nålarna i kittet så att det håller dem horisontellt med nålspetsarna säkert upphängda i luften för att förhindra skador. Täck med locket och förvara tills det används.
2. Förbered ägguppsamlingsplattor. Förvara vid 4 °C.
   OBS: Ägguppsamlingsplattor är små agarplattor kompletterade med fruktjuice för att uppmuntra äggläggning. Hur man förbereder dem beskrivs i många protokoll, inklusive¹³.
3. Förbered heptanlim.
   OBS: Detta lim extraheras från dubbelsidig tejp och används för att säkert fästa embryon på en täckglas. Det hindrar embryot från att flyta ur fokus under injektion och avbildning. Limet kan beredas dagar eller veckor i förväg.
   1. Bolla upp dubbelsidig tejp till en storlek större än en golfboll och placera den längst ner i en ~ 50 ml glasbehållare med ett tätt tätningslock. Packa tejpen tätt så att det finns tillräckligt med lim.
   2. Fyll glasbehållaren med heptan i en dragskåpa för att täcka hela tejpen. Håll behållaren tätt stängd när den inte används.
      VARNING: Heptan är brandfarligt som vätska och ånga. Det kan orsaka irritation i ögon, hud och luftvägar. Andningsångor kan orsaka dåsighet, yrsel och lungskador. Håll heptan borta från antändningskällor och förvara den i ett välventilerat område som är avsett för brandfarliga ämnen och borta från oförenliga ämnen.
   3. Låt heptanlimmet sitta över natten eller längre. För bästa resultat, placera behållaren på en shaker eller en annan omrörare över natten för att hjälpa till med att lösa upp limet.
      OBS: Tejpen själv kommer att förbli, men limet kommer att lösas i heptanen. I steg 5.1.2 appliceras limet på en täckglas; heptan avdunstar och lämnar limet bakom sig.
   4. Testa heptanlimberedningen genom att placera en droppe av den på en glasskiva och se till att en klibbig rest kvarstår när heptanen har avdunstat. Om limrester inte syns efteråt, lägg till mer tejp i glasbehållaren och upprepa föregående steg.
      OBS: När limet är förberedt kan det användas i månader eller till och med år.
4. Bered en 1 mg/ml (3,8 mM) BODIPY493/503 stamlösning genom utspädning av kommersiellt erhållen beredning i ren vattenfri DMSO. Håll den täckt för att skydda den från ljus och vatten. Förvaras på obestämd tid vid -20 °C eller på kort sikt vid 4 °C.

2. Förbered ägguppsamlingsburar

OBS: Gör detta minst en dag (helst 2 eller 3 dagar) före den planerade injektionen.

1. Förbered jästpasta.
   OBS: Jästpasta kompletterar protein och andra viktiga näringsämnen som inte finns i äppeljuiceplattorna. Det främjar äggproduktion och äggläggning.
   1. Tillsätt 2-10 g torr bagerjäst och sedan 1 ml kranvatten till en liten bägare. Blanda med en spatel.
   2. Fortsätt tillsätta kranvatten i steg om 1 ml tills önskad, tandkrämliknande konsistens uppnås.
   3. Täck blandningen och förvara den vid 4 °C.
2. Ställ in flugburar för ägguppsamling.
   OBS: Manliga och kvinnliga flugor av önskad genotyp krävs: 10-50 honor mindre än 2 veckor gamla och ett liknande antal män. Ett antal olika alternativ för flugburar finns tillgängliga, inklusive hemlagade alternativ ^14,13. Det är viktigt att storleken på äppeljuiceplattorna matchas med storleken på flugburarna.
   1. Lägg ett litet smet av jästpasta på en äppeljuiceplatta. Håll den täckt och låt den komma i rumstemperatur eftersom flugor inte lägger ägg på tallriken om det är för kallt.
   2. Överför flugor till en embryouppsamlingsbur, försegla med den jästa äppeljuiceplattan och säkra plattan till embryouppsamlingsburet.
   3. Låt nyligen överförda flugor acklimatisera sig till buret i 1-2 dagar, byt ut plattan med en ny dagligen. Om all jäst har ätits nästa dag, öka mängden jästpasta för framtida samlingar.
      OBS: Detta är ett viktigt steg för att öka äggutbytet eftersom välmatade honor lägger fler ägg.

3. På injektionsdagen, förbered injektionslösningen och ladda den i nålen

1. Använd stamlösningen av BODIPY 493/503 (3,8 mM i DMSO) som injektionslösning.
2. Ladda en enda nål med 1 μL av injektionslösningen med hjälp av nålladdningsspetsar.
   OBS: Sträva efter att få vätskan hela vägen till spetsen utan att fånga luftbubblor. Var redo att snabbt byta ut den laddade nålen vid oavsiktligt brott.
   1. Fäst en laddningsspets på en mikropipett och dra 1 μL av injektionslösningen i spetsen. Använd handskar och håll nålen i ena handen med spetsen riktad bort för att minimera risken för brott.
   2. Sätt försiktigt in laddningsspetsen i nålen och tryck den nära nålspetsen. Fördela vätskan nära nålspetsen. När du har tagit bort pipetten, håll nålen vertikalt med spetsen nedåt tills vätskan rinner till spetsen.
3. Förvara de laddade nålarna i en separat behållare med kitt enligt ovan (se steg 1.1.5).
   OBS: Nålar ska förberedas i förväg (upp till flera timmar) av injektionen men ska inte användas efter mer än en dag.
4. Håll nålarna borta från omgivande ljus för att förhindra blekning av färgämnena. Täck förvaringsbehållaren med aluminiumfolie utan att skada nålspetsarna. Se till att allt ljus är dolt.

4. Samla embryon för injektion

OBS: Tidpunkten för insamling beror på vilket stadium av embryon injektionen behöver utföras vid. Med tidsschemat nedan kommer embryon vid tidpunkten för förberedelse för injektion att vara 0-90 min gamla, vilket motsvarar klyvningssteg¹⁵.

1. På injektionsdagen, förbered äppeljuiceplattor med jäst, som i steg 2.2.1. Om N omgångar av injektioner planeras, förbered N + 2 plattor. Förvara dessa plattor vid rumstemperatur.
   OBS: Förutom N-plattorna för att samla embryon för injektion behövs en platta som en föruppsamlingsplatta och en annan för att mata flugorna i buret när samlingarna är färdiga.
2. Byt ut plattan på buret med en färsk jästplatta (föruppsamlingsplatta) och lämna den på buret i 1-2 timmar.
3. Byt ut plattan på buret med en ny tallrik (uppsamlingsplatta). Kassera församlingsplattan, eftersom den kommer att innehålla embryon äldre än önskat. Låt sedan flugorna lägga ägg i 1,5 timmar.
   OBS: Eftersom välmatade flugor vanligtvis lägger sina ägg strax efter att äggen har befruktats, säkerställer en 1,5 timmars insamlingstid att i slutet av samlingen är de flesta embryon på plattan 0-90 minuter gamla, dvs är i klyvningsstadier. Kvinnliga flugor som inte har matats färsk jäst sedan föregående dag tenderar att behålla befruktade ägg under en obestämd tid innan de läggs. Därför kan förinsamlingsplattan ha embryon som befruktades före insamlingens början och därmed är äldre än 60 minuter, ibland mycket äldre.
4. Byt ut plattan på buret med en ny jästplatta. Täck uppsamlingsplattan så att stridsflugor inte lägger ägg på dem.

5. Förbered embryon för mikroinjektion

1. Montera de material som behövs.
   1. Fäst en bit dubbelsidig tejp på en glasskiva. Undvik att röra tejpen med fingrarna eftersom det minskar dess klibbighet.
      OBS: Den här bilden kommer att användas för att ta bort korionen och inte för bildbehandling.
   2. Använd en överföringspipett eller en mikropipett (p200 eller p1000), placera en liten droppe (200 μL eller mindre) heptanlim ungefär i mitten av en rektangulär täckglas (60 x 25 mm). Låt heptanen avdunsta (det tar mindre än en minut).
      OBS: Denna täckglas kommer att användas för att montera embryon för injektion och avbildning. Måtten väljs för att passa in i en justerbar metallhållare på konfokalmikroskopet.
   3. Montera en uttorkningskammare, en förseglad kammare (t.ex. en Tupperware-smörgåslåda) som innehåller uttorkningspärlor. Använd endast uttorknings pärlor som inte har hydratiserats.
      OBS: För att säkerställa att embryona tar upp injektionslösningen måste embryot vara något uttorkat för att minska det inre trycket. Detta görs genom att placera täckglaset med de dechorionerade, luftexponerade embryona i uttorkningskammaren.
2. Ta bort korionen mekaniskt.
   1. Täck den lämpligt åldrade embryoplattan med ett tunt lager Halocarbon Oil 27 för att göra äggskalet transparent.
      OBS: Embryon blir genomskinliga inom tiotals sekunder¹⁵. Om detta steg inte sker effektivt kan äppeljuiceplattorna vara för våta och måste torkas av före användning.
   2. Se plattan under ett dissektionsomfång med transillumination (dvs ljuset som går genom plattan in i okularen) för att bekräfta embryonernas stadium.
   3. Välj embryon i klyvningsstadier.
      OBS: Klyvningsstadiets embryon är helt ogenomskinliga; de efterföljande blastodermstadierna kan kännas igen av ett band av transparent cytoplasma runt det ogenomskinliga centrumet¹⁵. En bra introduktion om hur man känner igen olika embryonala stadier finns på webbplatsen (som ges i referens¹⁶) som underhålls av Society of Developmental Biology.
   4. Använd fin pincett, ta ett embryo av önskat stadium genom dess dorsala bilagor och överför det till den förberedda glasskivan täckt med en bit dubbelsidig tejp. Placera embryot på tejpen. Minimera överföringen av olja.
   5. Rulla embryot så försiktigt som möjligt över tejpens yta genom att försiktigt knuffa embryot med sidan av pincettens spets. Stick inte embryot direkt med de skarpa pincettspetsarna.
      OBS: Om den applicerade kraften är för låg kommer embryot inte att rulla. Om den är för hög kommer den att brista. Att hitta lämplig mellanliggande kraft kräver erfarenhet och därför bör detta steg övas i förväg.
   6. Fortsätt rulla embryot tills korionen tillfälligt fäster vid tejpen och spricker.
   7. När korionen spricker, fortsätt rulla för att separera embryot (fortfarande inuti vitellinmembranet) från korionen eftersom korionen förblir fast vid tejpen.
   8. Bekräfta att korionen är helt borttagen genom att observera förlusten av dorsala bilagor från embryot.
   9. Rulla tillbaka embryot på korionen, som är mindre vidhäftande än tejpen. Gnid försiktigt embryot med pincetten tills det fäster på pincetten för överföring.
   10. Överför embryot till täckglaset med heptanlimmet och sätt det i kontakt med limet, vilket vanligtvis lossnar det från pincetten.
   11. Justera embryonets orientering på täckglaset.
       1. Bädda in embryonets laterala yta i limet.
          OBS: Ytan på embryot inbäddat i limet är den som kommer att avbildas. Att bädda in sidoytan är det enklaste, men detta kan justeras beroende på personliga preferenser eller den biologiska frågan som ska besvaras.
       2. Orientera embryonets långa axel vinkelrätt mot täckglasets långa axel.
       3. Om embryot inte ligger i önskad riktning, rengör pincetten för att ta bort eventuell olja som skulle lossa embryot från limet. Försök sedan försiktigt att rulla embryot på plats.
   12. Förbered det önskade antalet embryon för injektion på det sätt som beskrivits ovan.
       OBS: När tiden går efter avlägsnandet av korionen kommer den omgivande luften att börja avtorka embryona och därmed kommer effekten av steg 5.3 att vara ojämn för embryon på täckglaset, som dechorionerades vid olika tidpunkter. Vanligtvis är 1-3 embryon de mest hanterbara.
3. Uttorka embryon.
   1. Placera täckglaset med embryon i den beredda uttorkningskammaren och försegla den.
   2. Låt embryona uttorka i 5-12 min.
      OBS: Tidpunkten för detta steg är beroende av omgivningstemperaturen och luftfuktigheten och måste därför bestämmas empiriskt.
   3. Ta bort täckglaset från kammaren och placera en droppe Halocarbon Oil 700 på den, som helt täcker embryon, för att förhindra ytterligare uttorkning.
   4. Inspektera embryona på ett dissekerande omfång för att bedöma korrekt uttorkning.
   5. Om embryon bara är något skrynkliga, men inte tömda, fortsätt till mikroinjektion (steg 6).
   6. Om embryona inte är tillräckligt eller alltför uttorkade, återgå till steg 5.2 och förbered ett nytt parti embryon eftersom Halocarbon Oil 700 inte kan avlägsnas. Om embryona var alltför uttorkade, förkorta uttorkningstiden för nästa sats embryon med 3 minuter. om de var undertorkade, öka uttorkningstiden med 3 minuter.

6. Mikroinjektera embryon

OBS: Se till att mikroinjektionsinställningen innehåller ett inverterat mikroskop, en mikromanipulator för att hålla och placera injektionsnålen och en kommersiell mikroinjektor för att leverera kontrollerade volymer.

1. Slå på mikroinjektorn och mata in de önskade inställningarna.
   OBS: För detta protokoll rekommenderas att du använder linjär rörelseutgång och snabbinställning, men många andra kommer att fungera. Operatören bör bestämma personliga preferenser.
2. Ladda nålen i mikromanipulatorn. För att förhindra att nålen skadas när du laddar täckglaset som innehåller embryon, flytta den ur vägen till ett säkert läge.
3. Placera täckglaset på scenen, med embryon ovanpå, mot nålen. Flytta sedan försiktigt nålen tillbaka till plats för injektion, med spetsen fortfarande långt ovanför scenen.
4. Sätt 4x-målet i ljusbanan. Använd fokusknappen på mikroskopet och sätt embryon i fokus.
   OBS: Detta kommer att vara fokalplanet som används för injektion och kommer att justeras endast minimalt framöver.
5. Använd scenkontrollerna och flytta embryon horisontellt in i mitten av synfältet.
   1. Pan bort från embryon, håll dem vid kanten av synfältet, som förberedelse för att sänka nålen. Håll dig i samma fokalplan för att säkerställa att nålen sänks till rätt position.
6. Sänk nålspetsen i rätt fokalplan och se till att den syns i synfältet tillsammans med embryona.
   1. Använd mikromanipulatorkontrollerna och titta ovanifrån (ännu inte genom okularen), släpp långsamt nålspetsen i oljan och sikta på det område där målet pekar på. Eftersom oljan är ganska viskös, gå långsamt för att undvika att skada nålen.
   2. När nålen är synlig genom okularen, fortsätt använda mikromanipulatorkontrollerna tills nålspetsen är i fokus och i mitten av synfältet.
   3. Genom att flytta scenen, ta embryon tillbaka till mitten av synfältet. Använd scenkontrollen, mikromanipulatorkontrollerna och fokusratten för att finjustera embryots och nålspetsens position i förhållande till varandra medan båda är i fokus. Sikta på att utföra injektioner så nära täckglaset som möjligt.
7. Utför nålkvalitetskontroll.
   1. För att säkerställa att nålen är funktionell, dispensera en del av injektionslösningen i Halocarbon Oil 700 som omger embryot, synligt som en bubbla i oljan.
   2. Om ingenting strömmar ut ur nålen, öka gradvis trycket vid injektorn. Om detta inte fungerar, få en ny nål.
8. Injicera embryot.
   OBS: Acceptabla injektionsvolymer varierar från ~ 0,06-1 pL. Den nedre gränsen sätts av vad som kan visualiseras komma in i embryot. Den övre gränsen fastställs av det trauma som injektionen utövar på embryot.
   1. Injicera längs embryonets sidokanter eftersom detta är det minst invasiva.
   2. Använd scenkontrollerna och flytta embryot mot nålspetsen tills den senare försiktigt punkterar embryot och går in i det.
   3. Starta samtidigt flödet av injektionslösning och titta på utseendet på en övergående klar fläck på nålspetsens plats, vilket indikerar en framgångsrik överföring av vätska till embryot.
   4. Övervaka embryot. Om embryot motstår nålen och brister (cytoplasma sprutar ut) vid inträde, återgå till steg 5 och öka uttorkningstiden. Om embryot är plant mot täckglaset och uppträder diskett under injektionen, återgå till steg 5 och förkorta uttorkningstiden.
   5. Om inget färgämne kom in i embryot, bekräfta att färgämnet fortfarande kan flöda fritt från nålen som i steg 6.7. Om färgämnet inte flyter, byt ut nålen. Om färgämnet flyter, injicera ett nytt embryo och börja släppa färgämnet strax innan nålen punkterar embryot.
      OBS: Upprepade injektioner av samma embryo rekommenderas inte eftersom det brister på föregående sår/injektionsställe.
9. Upprepa tills alla embryon injiceras.

7. Bildembryon

OBS: Detta protokoll använder ett laserskanningskonfokalmikroskop.

1. Placera täckglaset i metallhållaren på konfokalmikroskopet så att embryona avbildas direkt underifrån genom täckglaset; ovanför täckglaset finns det bara olja och ingen annan barriär.
2. Som ett kvalitetskontrollsteg, bild först med epifluorescensfunktionen på konfokalmikroskopet, med ett 40x mål. Se till att fluoroforen är synlig i embryot innan du fortsätter.
3. Om det önskade avbildningsplanet skiljer sig från injektionsstället, ge tillräckligt med tid för färgämnet att diffundera till målområdet.
   OBS: För BOPIPY 493/503 varierar denna tid vanligtvis från 30-60 min. Eftersom diffusionstiden beror mycket på färgämnet kan andra färgämnen kräva optimering av injektionsstället och väntetiden.
4. Använd olika mål för avbildning i olika skalor. Använd ett 40x mål för att avbilda hela embryot och ett 63x mål för att avbilda underavsnitt för mindre skalor.
5. För live-avbildning under de syncytiella stadierna före cellularisering, använd följande villkor till att börja med: bildstorlek på 512 x 512 pixlar, linjegenomsnitt på 3, bildhastighet på 0,1 bilder per sekund (dvs. 1 bildruta förvärvad var 10: e sekund). Justera förhållandena enligt kapaciteten hos det använda mikroskopet.
   OBS: Dessa villkor gör det möjligt att skaffa ~ 500+ bilder från BOPIPY 493/503 och fånga det mesta av rörelsen.

8. Analysera LD-flödet genom att först använda FIJI för att förbereda en tidsserie med bilder och sedan python för PIV-analys

1. Optimera bildförvärv.
   1. Utför injektioner av önskat färgämne i lämpligt skede. Upprepa detta steg tills den dagliga variationen är försumbar.
   2. Optimera inställningarna för bildförvärv, inklusive förstoring, zoom, upplösning och bildhastighet.
      OBS: Det finns en avvägning mellan högkvalitativa bilder (upplösning + linjemedelvärde) och förvärvshastighet (bildhastighet).
2. Förbered data i FIJI.
   1. Skaffa en högkvalitativ tidsserie som ska analyseras.
   2. Öppna en bildruta i tidsserien för att generera en mask med FIJI. Duplicera bilden. Konvertera bildens typ till en 8-bitars.
   3. Definiera gränsen för embryot med hjälp av Polygon eller Freehand Selection Tool. Använd Rensa utanför för att ställa in pixelvärden utanför markeringen till 0. Rensa och invertera sedan inom markeringen för att ställa in värdet på pixlarna i markeringen till det maximala värdet (255).
   4. Avmarkera och använd sedan kommandot Histogram för att säkerställa att endast pixelvärden på 0 och 255 finns.
   5. Spara den nya bildmasken för den specifika tidsserien.
   6. Öppna tidsserien av intresse. Välj vilka tio ramar som bäst fångar tiden av intresse, till exempel kärncykel 9 vid början av den kortikala sammandragningen. Duplicera de tio ramarna av intresse och bilda en delstack.
   7. Använd funktionen Stack to Images för att generera 10 bilder att analysera med PIV.
   8. Spara de enskilda filerna på ett sätt som bevarar deras ordning (SeriesX_1, SeriesX_2, SeriesX_3 ...).
3. Använd den förberedda masken och enskilda ramar för PIV-analys, med hjälp av det angivna python-exempelskriptet (kompletterande data) eller ett anpassat skript som genereras av användaren.
   Det angivna skriptet är baserat på python-tillämpningen av OpenPIV¹⁷. Den matar ut avstånd i pixlar som kan konverteras med pixelbredd och bildhastighet för att generera hastigheter eller hastigheter.
4. Generera repliker genom att slutföra föregående steg för ytterligare embryon och kompilera utdatavärdena.

Representative Results

Efter injektion kommer färgämnet endast att lokaliseras på den plats där nålspetsen sattes in. Färgämnet diffunderar sedan bort från injektionsstället beroende på dess diffusiva egenskaper. Figur 1 visar injektion av BODIPY 493/503, strax efter injektion (panel A) och 24 min senare (panel B). Efter 24 minuter har färgämnet tagit sig till ungefär mittpunkten på embryots långa axel.

Analys av organellmotilitet kan uppnås genom färgämnesinjektioner och time-lapse-avbildning. I figur 2 injicerades ett embryo samtidigt med BODIPY 493/503 (figur 2A) och LysoTracker Red (figur 2B) och avbildades med laser excitation vid 488 respektive 596 nm. Detta embryo avbildades sedan (en ram var 30: e s i 30 min, 5 min analyserades). Tidsserien kördes sedan genom PIV-analys, vars utdata visas via strömlinjeformningar i figur 2A,B. Observera att strömlinjeformningarna inte representerar banan för enskilda partiklar, men det cytoplasmatiska flödet härleds från att analysera alla partiklar i den regionen av cytoplasman. Genom märkning av två oberoende cellulära strukturer (LD och sura organeller) finner PIV-analysen liknande flöden, med båda etiketterna konvergerande på embryots centrala region där cytoplasman strömmar in i embryots inre⁶.

För närvarande tillgängliga FP tillåter märkning av många andra organeller och cellulära strukturer. Figur 3 visar märkningen av ER via ER tracker Green. ER tracker ger en fin upplösning av kärnhöljet, vilket möjliggör visualisering av större cellcykelsteg. ER tracker Green avbildas med 488 nm excitation.

Märkning av mitokondrierna är knepigt, eftersom de flesta testade färgämnen verkar vara fångade i den första mitokondrien de kommer in i. Å andra sidan upptäcktes inga tecken på färgämnestoxicitet, vilket gjorde det möjligt att följa märkta mitokondrier genom cellularisering och den ectodermala kärncykeln 15. Figur 4 visar en ectodermal cell flera timmar efter injektion med Mitoview 633 (excitationsvåglängd 633 nm).

BODIPY, Lysotracker och LipidSpot är robusta och kan användas för att förvärva ~ 500+ bilder vid 512 x 512, linjegenomsnitt 3, bildhastigheter från 1 / s till 0,1 / s. ER tracker Green, SiR-tubulin och de mitokondriella färgämnena som nämns är mindre robusta och ger ~ 50-200 bilder under samma förhållanden.

Från och med blastodermstadier rör sig LDs dubbelriktat längs mikrotubuli, som drivs av motsatta polaritetsmotorer kinesin-1 och cytoplasmatisk dynein⁵. Denna rörelse kan visualiseras genom att sammärka 1-10 och mikrotubuli genom att injicera både BODIPY 493/503 och SiR-Tubulin (Figur 5). Eftersom LD ofta vänder sin rörelseriktning (när de växlar mellan kinesin-1 och cytoplasmatisk dynein), fångar högre bildhastigheter under förvärvet bättre kritiska detaljer om LD-motilitet.

Levande avbildning av autofluorescerande äggula vesiklar är möjlig utan någon form av färgämne injektion (Figur 6). Autofluorescensen är emellertid svag och excitationslasern är fototoxisk. Således har levande avbildning av autofluorescerande äggula ett dåligt signal-brusförhållande i förhållande till färgämnesinjektion.

Figur 1: Diffusion av BODIPY 493/503 genom embryot. Färgämnet injicerades längs sidokanten mot den främre änden (uppe till höger) och diffunderar från detta injektionsställe till embryot och märker ED. (A) Färgämnet har diffunderats genom delar av embryot intill injektionsstället. (B) Ungefär 24 min/2 kärncykler senare har färgämnet spridit sig förbi embryots mittpunkt. Skalstång: 100 μm. En ram på 1024 x 1024 (linjegenomsnitt 4) förvärvades var 30: e s. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Partikelbildsvelocimetri (PIV) för LD och sura organeller. Ett embryo injicerades med både BODIPY 493/503 och LysoTracker Red. (A) BODIPY kanal. (B) LysoTracker röd kanal. (A',B') Strömlinjeformade diagram genererade av PIV-analys av de två kanalerna som genereras från 10 sekventiella ramar, inklusive de som visas i A och B. A' motsvarar flödet av LD-er, och B' motsvarar flödet av sura organeller. Observera att både A ' och B' visar en sammanflöde till vänster om mitten där embryonalt innehåll strömmar ut ur synplanet, in i mitten av embryot. Observera också att BODIPY har spridit mer än LysoTracker eftersom olika färgämnen har olika diffusiva egenskaper. Skalstång: 100 μm. En ram på 1024 x 1024 (linjegenomsnitt 4) förvärvades var 30: e s. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: ER tracker etiketter syncytial nuclear divisions. Ett syncytial blastoderm embryo mikroinjicerades med ER tracker och en del av dess yta avbildades över tiden. (A) Spindelmontering under en kärnteknisk uppdelning. (B) Avskärning av kärnhöljet under samma uppdelning. (C) Efterföljande interfas. (D) Början av nästa division indikeras av centrosomutseende (förekomst av cirkulära ER-fria regioner, markerade med pilspetsar). Notera den gradvisa färgblekningen. Excitationsvåglängd: 488 nm. Skalstång: 5 μm. A: initial ram, B: 3 min förfluten tid, C: 10 min förfluten tid, D: 13 min förfluten. En ram på 1024 x 1024 (linjegenomsnitt 4) förvärvades var 30: e s. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Mitoview 633 märkning av mitokondrier. Ett embryo injicerades med Mitoview 633 under det synkytiella blastodermstadiet och avbildades 4 timmar senare, efter cellularisering. Bilden visar en neuroektodermal cell av ett embryo i bakteriebandsförlängning. Skalstång: 5 μm. En ram på 1024 x 1024 (linjegenomsnitt 4) förvärvades var 30: e s. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: Sammärkning av 1-tal och mikrotubuli. Ett cellulariserande embryo injicerades med en blandning av BODIPY 493/503 (gul A,B,C) och SiR Tubulin (magenta A',B',C'). A'', B'', C'' visar de sammanslagna kanalerna. Panelerna A, A', och A'' visar den ursprungliga ramen, panelerna B, B' och B'' visar ramen efter 5 s och panelerna C, C' och C'' visar ramen efter 10 s. Skalstång: 5 μm. En ram på 512 x 512 (linjegenomsnitt 3) förvärvades var 2,5: e s. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: Avbildning av äggula vesiklar autofluorescens under syncytial klyvningsstadier. (A) I början av förvärvet. (B) Efter 8 min. (C) Efter 16 min. Excitation våglängd: 405 nm. Låg excitationsintensitet användes för att hålla embryot vid liv. Skalstång: 100 μm. En ram på 1024 x 1024 (linjegenomsnitt 4) förvärvades var 30: e s. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande uppgifter. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Drosophila-embryot är en kraftfull och bekväm modell för att studera grundläggande frågor inom cell- och organismbiologi. Dess relativa enkelhet, kraftfulla genetik och lilla storlek gör det till ett utmärkt system för avbildning av både cellulära processer och utveckling. Här är ett standardmikroinjektionsprotokoll anpassat för att möjliggöra FP-användning i embryon. Detta tillvägagångssätt möjliggör fluorescerande avbildning av specifika cellulära strukturer utan behov av genetiskt kodade fluoroforer, vilket öppnar många genetiska bakgrunder för avbildning. Genom att kombinera flera färgämnen plus strategiskt utvalda fluorescerande märkta proteiner kan man öppna flerkanalig liveavbildning som spänner över hela spektrumet av synligt ljus.

Kritiska steg i protokollet:
Detta protokoll använder BODIPY 493/503 för att märka 1-1-00. Detta tillvägagångssätt kan enkelt anpassas för att markera andra cellulära strukturer. För efterföljande bildanalys är en av de viktigaste faktorerna signal-brusförhållandet, dvs färgämnets ljusstyrka jämfört med bakgrundssignalen. Lysosomer har framgångsrikt avbildats (LysoTracker Red, 1 mM), liksom mitokondrier (Mitoview 633, 200 μM), ER (ER tracker Green, 10 μM) och mikrotubuli (SiR tubulin, 200 nM i DMSO), som visas i figur 2, figur 3, figur 4, figur 5. Dessutom är äggula vesiklar autofluorescent och avger blått ljus vid UV-excitation (bild med 405 nm som excitationsvåglängd (figur 6)). För andra färgämnen, sikta på att färgämneskoncentrationen ska vara 100-1000x av vad som skulle behövas för färgning av odlade celler levande; detta liknar koncentrationen av en stamlösning som skulle spädas ut i cellodlingsmedier. Eftersom detta protokoll kräver en injektion av 100 fL och Drosophila-embryot är ungefär 9 nL i volym¹⁸, kommer dessa färgämneskoncentrationer i genomsnitt att uppgår till en intern embryonal koncentration på under 1/100 av vad som finns i cellodlingsmediet. Tillfälligt kommer den lokala koncentrationen att vara högre vid injektionsstället, vilket är mest relevant för FP som inte diffunderar väl (dvs mitokondriella färgämnen och SiR-tubulin). För dessa FP, börja med de rekommenderade höga koncentrationerna; Om oväntad död observeras, späd successivt två gånger tills en acceptabel kompromiss mellan överlevnad och signalstyrka uppnås.

Vid samtidig injektion av flera färgämnen bör båda färgämnena antingen vara i samma lösningsmedel, eller så bör både lösningsmedlen och färgämnena vara kompatibla med blandningen (alkoholkoncentrationer som överstiger ~ 10% rekommenderas inte).

Nålarnas kvalitet är avgörande för att denna procedur ska lyckas, eftersom spetsen måste vara så fin som möjligt. Annars kan skador från injektionssåret äventyra den efterföljande utvecklingen av embryot. Eftersom kommersiella nålavdragare skiljer sig åt är det viktigt att följa tillverkarens förslag och prova flera dragparametrar tills önskad form uppnås. Det är viktigt att utföra kvalitetskontrollsteg 1.1.3 eftersom arbetet med en sprucken, taggig eller stor borrnålspets kommer att göra den framgångsrika injektionen svårare eller till och med omöjlig.

Embryot måste torkas delvis så att ytterligare volymer vätska kan tillsättas under injektionen. Om embryot är undertorkat kommer nålen inte att komma in lätt, och cytoplasman sprutar ut när nålen tränger in eller när lösningen injiceras. Om embryot är övertorkat kommer det att se tömt ut och kommer inte att utvecklas ordentligt. Den exakta torktiden beror på lokala förhållanden, t.ex. luftfuktighet, och kan ändras från dag till dag. Det måste bestämmas empiriskt för varje session.

Embryots förmåga att överleva efter mikroinjektion beror kritiskt på nålens kvalitet, korrekt uttorkning och begränsning av injektionsvolymen till mindre än 1 pL (helst 100 fL). Så länge dessa parametrar är optimerade är ingen signifikant toxicitet uppenbar när de beskrivna färgämnena injiceras i rekommenderade koncentrationer. Om embryon överlever uttorknings- och injektionsstegen utvecklas de vanligtvis framgångsrikt väl till bakteriebandsförlängning, ett undantag är mikrotubuli- och ER-sonderna som orsakade cellulariseringsdefekter vid höga nivåer (100 fL injektion av stamkoncentrationen av varje). Testning fann inga uppenbara utvecklingsfel när DMSO, vatten och blandningar av de två injicerades vid de rekommenderade volymerna, med en embryoöverlevnad genom bakteriebandsförlängning på ~ 75% eller mer. Injektionsvolymer mer än över 1 pL orsakade defekter och embryon injicerade med ~ 4 pL volymer utvecklade under mindre än 1 timme. Därför måste injektionsvolymerna hållas låga, vilket innebär att färgämneskoncentrationerna måste vara höga.

I allmänhet rekommenderas injektioner längs embryots sidokant eftersom de resulterar i minst skada. Injektionsstället kan dock behöva justeras beroende på de diffusiva egenskaperna hos de FPs som används. BODIPY 493/503 och LysoTracker diffunderar snabbare över hela embryot än Lipid Spot 610 (ett annat färgämne för att markera 1-01), medan SiR-Tubulin och Mitoview 633 aldrig diffunderar helt över embryot (avbildning så sent som 7 timmar efter injektion). Således kan injektion i eller nära platsen av intresse vara nödvändig. Vid injektion i de främre eller bakre regionerna rekommenderas en särskilt fin nål.

Bildförvärv bygger på konfokalmikroskopi till optisk sektion och löser små organeller och alla cytoskelettkomponenter. Tekniker som kräver analys av många bilder (t.ex. STORM eller PALM) fungerar inte eftersom det embryonala innehållet är i rörelse och fluoroforerna inte är optimerade för fotoväxling. Epifluorescensmikroskopi saknar lateral och axiell upplösning för att ta fram de flesta organeller och mindre cellulära strukturer. Av dessa skäl rekommenderas det starkt att använda ett konfokalmikroskop eller använda ljusplåtsteknik.

Reproducerbarheten av bildanalysen är i hög grad beroende av konsekventa bilddata. För största chans att lyckas krävs optimering av injektionstekniken och bildförvärv. Att etablera och öva en teknik där färgämnen av intresse, injektionsställe, embryots ålder, injektionsvolym och förvärvsinställning är konsekventa kommer att generera de mest robusta data för bildanalys.

Ändringar och felsökning av metoden
Detta protokoll demonstrerar en metod för att analysera bulkflödet av LD i klyvningsstadiumembryon med hjälp av partikelbildsverocimetri. Samma tillvägagångssätt kan användas för andra organeller, andra utvecklingsstadier och andra analysmetoder. Figur 2 visar till exempel analys av LD och sura organeller som flyter i de syncytiella stadierna av embryogenes, visualiserad genom att saminjicera BODIPY 493/503 och LysoTracker Red. Ytterligare framgångsrik avbildning av LD-rörelse i embryon upp till 7 timmar efter befruktning har uppnåtts; dessa embryon behåller injektionssåret men kan utvecklas i flera timmar.

Data som samlats in med hjälp av detta protokoll har använts för partikelbildselocimetri, men många andra analystekniker finns tillgängliga. Till exempel kan partikelspårningsprogram som de som finns i ImageJ, Imaris eller manuell spårning användas för att erhålla hastigheter och riktningar för rörliga strukturer. Observera att de flesta sådana spårningsprogram är byggda för att fungera med data från plana cellodlingssystem och inte alltid anpassar sig bra till 3D-strukturer som Drosophila-embryot . Vidare, för generering av partikelspårningsdata av bästa kvalitet, skulle flera Z-plan behöva avbildas; detta bör vara möjligt om förvärvstiderna för bildstacken är under ~ 2 s. Detta riktmärke bör kunna nås på snurrande skivkonfokal, gitterljusark och senaste laserskanningskonfokalsystem. Genomförbarheten av partikelspårning för rikliga organeller som LD, mitokondrier och lysosomer är dock låg eftersom mängden positiv signal i ett synfält är för hög för de nuvarande spårningsmetoderna. Spårning av mindre rikliga strukturer som kärnor eller äggula vesiklar kan vara möjligt. PIV för flödesanalys fungerar bra för LD och sura organeller i klyvningsstadier eftersom båda organellerna rör sig fritt. Organeller som kärnor, ER och mitokondrier är bundna till andra cellulära strukturer och rör sig därför inte fritt och är inte lämpade för mjukvaruanalys som förutsätter fri rörelse. Utredaren bör välja de tekniker som är bäst lämpade för organellen av intresse.

Under de syncytiella och cellulära blastodermstadierna rör sig LD (liksom några andra organeller) längs radiellt orienterade mikrotubuli⁵. Det är därför möjligt att hitta tvärsnittsvyer (som i figur 5) där enstaka mikrotubuli är i fokus för långa avstånd, vilket möjliggör partikelspårning i 2D. Eftersom dessa optiska plan är djupt inne i embryot minskar den totala signalstyrkan och signal-brusförhållandet reduceras.

För spårningsanalys kan avbildning så snabbt som möjligt avslöja viktiga detaljer om rörelsen och därmed av det rörliga maskineriet. Till exempel är lipiddropprörelse en blandning av två rörliga tillstånd, långsam kort rörelse (~ 200 nm / s; genomsnittligt reseavstånd ~ 100 nm) och snabb-lång rörelse (~ 450 nm / s; genomsnittligt reseavstånd ~ 1000 nm) ¹⁹; Således, om bilder tas varje sekund eller ännu mindre ofta, blir det långsamma korta tillståndet odetekterbart. Emellertid inducerar frekvent avbildning också fluoroforblekning och fototoxicitet. Bildförhållandena måste därför justeras beroende på den exakta frågan som ska behandlas.

Begränsningar av metoden
Beroende på önskat färgämne kan metoden begränsas av kompatibiliteten mellan färgämnets löslighet och injektionslösningens toxicitet. Alkoholer som isopropanol och etanol är svåra att hantera i en nål på grund av deras lägre viskositet och verkar skada cellulära komponenter och döda embryot.

Metoden är inte heller väl lämpad för att visualisera de tidigaste stegen i embryogenesen eftersom det tar 30+ minuter att förbereda embryona för injektion. Vid rumstemperatur är embryonets initiala cellcykler bara ~ 10 minuter långa vardera; så även om man skulle välja ett nybefruktat ägg i steg 5.2.3, skulle de första cellcyklerna redan vara färdiga när embryot är klart för avbildning.

Belysning med ljus i UV/blått område är betydligt mer fototoxisk än för längre våglängder. Under sådana förhållanden (t.ex. att följa autofluorescerande äggula vesiklar; Figur 6), man måste begränsa avbildningstiden (vilket leder till kortare tidsserier) eller använda lägre lasereffekt (vilket resulterar i ett minskat signal-brusförhållande).

Efter cellularisering tenderar färgämnen som injiceras på en specifik plats att diffundera dåligt, eftersom de måste korsa många cellmembran. Detta begränsar observationsområdet i senare utvecklingsstadier.

Metodens betydelse med avseende på befintliga/alternativa metoder
Rörelsen av LD och andra lipidinnehållande organeller i tidiga embryon kan visualiseras med genetiskt kodade fluoroforer, etikettfria tekniker och genom införande av FP. Det senare kan uppnås genom permeabilisering av vitellinmembranet¹² eller mikroinjektionsmetoden som diskuteras här.

Genetiskt kodade fluoroforer är mångsidiga markörer vars nivåer vanligtvis är mycket reproducerbara från embryo till embryo. De har dock lägre kvantutbyten och blekmedel lättare än FP: er. Vanligtvis är de bara tillgängliga i en eller två taggade versioner (t.ex. GFP eller mCherry), vilket begränsar valet av vilka strukturer som kan avbildas samtidigt. FP, å andra sidan, finns ofta i en stor variation; till exempel finns olika lipiddroppsspecifika färgämnen tillgängliga med emissionsspektra från Autodot i UV / blått spektrum till Lipidtox och LipidSpot 610 i det avlägsna röda spektrumet. FP kan också appliceras direkt på alla stammar av intresse och kräver därför inte töjningskonstruktion för att till exempel införa den önskade organellmarkören i en mutant stam av intresse. Denna fördel är särskilt uttalad när flera strukturer ska märkas samtidigt; istället för tidskrävande kors som sträcker sig över flera generationer kan detta uppnås på en enda dag genom att blanda relevanta färgämnen och introducera dem samtidigt. Slutligen, om cellulära processer ska undersökas med farmakologisk hämning, kan läkemedel och färgämnen införas tillsammans.

Etikettfria metoder är mycket kraftfulla metoder för att upptäcka specifika cellulära strukturer. Till exempel kan 1-0-tal detekteras specifikt i tidiga embryon genom tredje harmoniska generationens mikroskopi²⁰ eller genom femtosekund Stimulerad Ramanförlustmikroskopi²¹. Liksom FP kan dessa metoder tillämpas i vilken genetisk bakgrund som helst, och eftersom de inte orsakar blekning möjliggör de potentiellt snabbare bildförvärv. De är emellertid vanligtvis begränsade till specifika organeller och stöder därför inte i sig multiplexavbildning; de kräver också specialiserade mikroskop.

Det finns två allmänna strategier för att införa små molekyler i embryon. En är mikroinjektionsmetoden som används här; den andra är kemisk (terpen) behandling för att permeabilisera vitellinmembranet. Det senare tillvägagångssättet¹² är mindre involverat än mikroinjektion, men också mer variabelt från embryo till embryo. Dessutom, efter permeabilisering, äventyras skyddet från vitellinmembranet och embryot är tillgängligt för det yttre mediet, vilket gör det mer utmanande att hålla det vid liv. Mikroinjektion är mycket mindre sannolikt att spåra embryonal utveckling än permeabilisering. Permeabilisering rekommenderas dock om många embryon behöver övervakas samtidigt, t.ex. för läkemedelsscreening. För att följa rörelsen av cellulära strukturer och erhålla reproducerbara bildserier som är lämpliga för bildanalys är mikroinjektion den valda metoden.

Metodens betydelse och potentiella tillämpningar inom specifika forskningsområden
Drosophila-embryot är ett viktigt modellsystem för att studera många cellbiologiska och utvecklingsprocesser ^1,5,6. Märkning av organeller med fluorescerande proteiner har gjort stora bidrag till förståelsen av hur det tidiga embryot utvecklas, hur olika organeller trafikerar och hur sådan handel moduleras utvecklingsmässigt och genetiskt. Men deras benägenhet att bleka och utmaningarna med att generera stammar där flera organeller är märkta med olika färger begränsar tillämpningen av detta tillvägagångssätt. Användningen av FP som introduceras av mikroinjektion löser många av dessa utmaningar och kan till och med kombineras med fluorescerande märkta proteiner. Denna teknik möjliggör avbildning av flera organeller, cellstrukturer och cytoskelettkomponenter i vilken genetisk bakgrund som helst. Som ett resultat kan flera genotyper jämföras via levande avbildning, vilket gör det möjligt att bestämma effekten av mutationer på handeln med flera organeller.

Detta protokoll visar FP-injektionsmetoden för embryon av Drosophila melanogaster, men i princip gäller detta tillvägagångssätt för alla insektsägg för vilka mikroinjektionstekniker har fastställts, inklusive andra arter av Drosophila, syrsor²² och bladlöss²³.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AUTODO	abcepta	SM1000a	Stains lipid droplets in violet/blue
BODIPY 493/503	ThermoFisher	D3922	Stains lipid droplets in green
Desiccant Beads –Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite	W.A. Hammond Drierite Company	21001
Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base	Zeiss	4350030000000000
Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape	Scotch (3M)	-	Sold by many vendors
ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)	ThermoFisher	E34251	Stains the ER/nuclear envelope
Femptotip II	Eppendorf	H129354N	Ready to use
Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in	World Precision Instruments	TW100F-4	Must be pulled
Glass coverslip	-	-	Buy the appropriate refractive index for your objective lens
Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned	FisherBrand	12-550-343
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML
Heptane greener alternative anhydrous, 99%	Sigma-Aldrich	246654-1L	Heptane is considered toxic by the USA's OSHA
Confocal microscope	Leica	Sp5	Many different types of confocal microscopes will work.
LipidSpot 610	Biotium	#70069	Stains lipid droplets in far red
LysoTracker Red	ThermoFisher	L7528	Stains lysosomes in red
MitoView 633	Biotium	#70055	Stains mitochondria
Needle loading pipette tips - 20uL microloader tips	Eppendorf	# 5242956.003
P-1000, Next Generation Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1x1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip.
SiR-Tubulin	Cytosketon Inc	CY-SC014	Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red
TransferMan	Eppendorf	5178 NK
ViaFluor 405	Biotium	#70064	Stains microtubules in violet/blue