Summary
Aquí, entregamos imitaciones exógenas de miARN sintetizadas artificialmente al riñón a través de la inyección de venas de cola de un vector no viral y nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal. Esto condujo a una sobreexpresión significativa de miARN objetivo en el riñón, lo que resultó en una progresión inhibida de la enfermedad renal en varios modelos de ratón.
Abstract
Los microARN (miARN), pequeños ARN no codificantes (21-25 bases) que no se traducen en proteínas, inhiben muchos ARN mensajeros diana (ARNm) al desestabilizar e inhibir su traducción en diversas enfermedades renales. Por lo tanto, la alternancia de la expresión de miARN por imitadores de miARN sintetizados artificialmente exógenos es una opción de tratamiento potencialmente útil para inhibir el desarrollo de muchas enfermedades renales. Sin embargo, debido a que la ARNasa sérica degrada inmediatamente los miARN exógenos administrados sistemáticamente imita in vivo, la entrega de miARN al riñón sigue siendo un desafío. Por lo tanto, son necesarios vectores que puedan proteger a los imitadores de miARN exógenos de la degradación por la ARNasa y entregarlos significativamente al riñón. Muchos estudios han utilizado vectores virales para administrar imitadores o inhibidores exógenos de miARN al riñón. Sin embargo, los vectores virales pueden causar una respuesta de interferón y/o inestabilidad genética. Por lo tanto, el desarrollo de vectores virales también es un obstáculo para el uso clínico de imitadores o inhibidores exógenos de miARN. Para superar estas preocupaciones con respecto a los vectores virales, desarrollamos un método de vector no viral para administrar imitadores de miARN al riñón utilizando la inyección en la vena de la cola de nanopartículas de polietilenimina (PEI-NP), lo que condujo a una sobreexpresión significativa de miARN objetivo en varios modelos de ratón de enfermedad renal.
Introduction
Los miRNAs, pequeños ARN no codificantes (21-25 bases) que no se traducen en proteínas, inhiben muchos ARN mensajeros diana (ARNm) desestabilizándolos e inhibiendo su traducción en diversas enfermedades renales 1,2. Por lo tanto, la terapia génica que emplea imitadores o inhibidores exógenos de miARN sintetizados artificialmente es una nueva opción potencial para inhibir el desarrollo de muchas enfermedades renales 3,4,5.
A pesar de la promesa de imitadores o inhibidores de miARN para la terapia génica, la administración a órganos diana sigue siendo un gran obstáculo para que los experimentos in vivo desarrollen su potencial clínico. Debido a que los imitadores o inhibidores de miARN sintetizados artificialmente están sujetos a degradación inmediata por la RNasa sérica, su vida media se acorta con la administración sistémica in vivo6. Además, la eficiencia de los imitadores o inhibidores de miARN para atravesar la membrana plasmática y el citoplasma transfecto es generalmente mucho menor sin vectores apropiados 7,8. Estas líneas de evidencia sugieren que se requiere el desarrollo del sistema de administración de miRNA imitadores o inhibidores para el riñón, para permitir su uso en entornos clínicos y convertirlos en una nueva opción de tratamiento para pacientes con diversas enfermedades renales.
Los vectores virales se han utilizado como portadores para administrar imitadores o inhibidores exógenos de miARN al riñón 9,10. A pesar de haber sido desarrollados para la bioseguridad y la eficacia de la transfección, los vectores virales aún pueden causar una respuesta de interferón y/o inestabilidad genética11,12. Para superar estas preocupaciones, desarrollamos un sistema de administración de miRNA imita el riñón utilizando nanopartículas de polietilenimina (PEI-NPs), un vector no viral, en varios modelos de ratón de enfermedad renal13,14,15.
Los PEI-NP son NP lineales basados en polímeros que pueden entregar oligonucleótidos de manera efectiva, incluidos los imitadores de miARN, al riñón, y se consideran preferibles para preparar vectores no virales debido a su seguridad y biocompatibilidad a largo plazo13,16,17.
Este estudio demuestra los efectos de la administración sistemática de miARN exógeno con PEI-NP a través de la inyección de venas de cola en ratones modelo de fibrosis renal producidos por obstrucción unilateral del uréter (UUO). Además, demostramos los efectos de la administración sistemática de miRNA exógeno con PEI-NPs a través de la inyección de venas de la cola en ratones modelo de enfermedad renal diabética (ratones db / db: C57BLKS / J Iar -+Lepr db / +Leprdb) y ratones modelo de lesión renal aguda producidos por lesión renal por isquemia-reperfusión (IRI).
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Protocol
Todos los protocolos experimentales con animales fueron aprobados por el comité de ética animal de la Universidad Médica de Jichi y se realizaron de acuerdo con las pautas de uso y cuidado de animales experimentales de la Guía para animales de laboratorio de la Universidad Médica de Jichi. Aquí, demostramos la entrega de miRNA imita al riñón, lo que resulta en su sobreexpresión utilizando ratones UUO. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Jichi [Aprobación Nos. 19-12 para fibrosis renal, 17-024 para infección renal aguda (LRA) y 19-11 para nefropatía diabética].
1. Preparación del complejo PEI-NPs-miRNA-imitador
NOTA: Aquí, la preparación de PEI-NPs-miRNA-imita13,14,15 y PEI-NPs-control-miRNA (como control negativo) se describen para un ratón.
- Prepare los siguientes elementos:
- Preparar 10 μL de PEI-NPs lineales.
- Preparar 50 μL de miRNAs sintetizados artificialmente disueltos en agua libre de nucleasas a una concentración de 100 μM (5 nmol miRNA disueltos en 50 μL de agua libre de nucleasa).
- Preparar 50 μL de miRNAs control sintetizados artificialmente (no objetivo) disueltos en agua libre de nucleasas a una concentración de 100 μM (5 nmol miRNA disueltos en 50 μL de agua libre de nucleasas).
- Preparar soluciones de glucosa al 5% y 10%. Asegurar la disponibilidad de tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y un mezclador de vórtice.
- Disolver 10 μL de PEI-NPs en 90 μL de solución de glucosa al 5% en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Luego, vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo.
- Mezclar 50 μL de miRNAs sintetizados artificialmente (5 nmol) disueltos en agua libre de nucleasas (concentración de 100 μM) con 50 μM de solución de glucosa al 10% en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Luego, vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo. Este proceso produce miARN disuelto en solución de glucosa al 5%.
- Mezclar 100 μL de PEI-NPs en solución de glucosa al 5% y 100 μL de miRNA imitador (5 nmol) en solución de glucosa al 5%. Luego, vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo.
- Incubar la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente (RT) para preparar un complejo estable de PEI-NPs-miRNA-imitador. Esta solución contiene PEI-NPs y miRNA imitador (5 nmol) en una proporción de nitrógenos (N) en el polímero a fosfato (P) en ácidos nucleicos (relación N/P) = 6 (Figura 1).
NOTA: El complejo PEI-NPs-control-miRNA se puede preparar utilizando el mismo proceso descrito en los pasos 1.1-1.5 para todos los modelos de ratones con enfermedad renal descritos en este manuscrito (UUO, nefropatía diabética y LRA). Un volumen de inyección de PEI-NP-miRNAs-mimic es el mismo que 5 nmol de miRNAs-imitan conjugado con PEI-NPs en relación N/P = 6. La duración y frecuencia de inyección de cada imitación de PEI-NP-miRNAs depende del modelo de enfermedad en el que se aplica.
2. Confirmación de la entrega significativa de miRNA imitador al riñón en ratones UUO por PEI-NP a través de la inyección de venas de la cola utilizando microscopía fluorescente
NOTA: Aquí, se elabora el método de administración de miRNA purificado artificialmente imitador al riñón, lo que indica el establecimiento de métodos terapéuticos para diversas enfermedades renales. En resumen, a los ratones UUO se les administró miARN marcado con ácido carboxílico cianina3 (Cy3) agregado a 100 μL de PEI-NP a través de la vena de la cola. El suministro a los riñones se confirmó con microscopía de fluorescencia. Se describe el imitador de miARN marcado con ácido carboxílico (Cy3) PEI-NPs-cianina3 (oligonucleótidos) para un ratón. Este método puede administrar significativamente miRNA imitador al riñón en varios modelos de ratón, como ratones UUO, ratones con enfermedad renal diabética y ratones AKI producidos por IRI. Aquí, utilizamos un modelo de ratón UUO para la demostración de video. El método de inducción de UUO fue descrito previamente en otra parte13. Siga estos protocolos dentro de los seis días posteriores a la cirugía UUO.
- Prepare los siguientes elementos:
- Preparar 2 μL de PEI-NPs y 100 μL de oligonucleótidos de doble cadena marcados con Cy3 [imitador de miARN marcado con Cy3 (1 nmol; 10 μM)].
- Preparar soluciones de glucosa al 5% y 10%. Asegurar la disponibilidad de tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y un mezclador de vórtice.
- Use un tubo de centrífuga de plástico de 50 ml con un pequeño orificio en la tapa para aislar las venas de la cola de los ratones UUO.
- Para la microscopía de fluorescencia, prepare un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT), un criostato, nitrógeno líquido, solución salina tamponada con fosfato (PBS), jeringas de 1.0 ml con una aguja de 27 G y vidrio recubierto de silano.
NOTA: Se puede preparar lectina Lotus tetragonolobus marcada con fluoresceína (un marcador de túbulo proximal) y 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la tinción opcional de túbulos proximales y núcleos celulares.
- Disolver 2 μL de PEI-NPs en 98 μL de solución de glucosa al 10% en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Luego, vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo.
- Añadir 100 μL de miARN marcado con Cy3 imitador a 100 μL de PEI-NPs en solución de glucosa al 10% (preparada en el paso 2.2). Luego, vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo.
- Incubar la mezcla durante 15 min en RT para preparar un complejo estable de imitador de miARN marcado con PEI-NPs-Cy3.
- Coloque el ratón UUO de cabeza en un tubo de centrífuga de 50 ml sin anestesia, y luego coloque la cola a través del orificio preparado en la tapa.
- Llene una jeringa de 1,0 ml con una aguja de 27 G con 200 μL del complejo imitador de PEI-NPs-Cy3-miRNA.
- Inyecte PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic (200 μL) a través de la vena de la cola del ratón utilizando la jeringa de 1,0 ml con aguja de 27 G.
NOTA: Limpie la vena de la cola con algodón saturado en etanol (70% -80%) para dilatar la vena de la cola y desinfectar el área de inyección. - Una hora después de 200 μL de inyección del complejo imitador de PEI-NPs-Cy3-miRNA, anestesiar al ratón con isoflurano (4% -5%) utilizando un dispositivo anestésico apropiado para animales pequeños. Confirme la profundidad de la anestesia con una ausencia de reflejo de pellizco del dedo del pie. Mantener la anestesia con isoflurano (3%) durante toda la cirugía.
- Luego, haga una incisión en la piel, los músculos y las costillas con tijeras quirúrgicas y fórceps para exponer el corazón. Después de hacer una incisión en la aurícula derecha, inyecte PBS en el ventrículo izquierdo para extraer sangre por todo el cuerpo hasta que el color del riñón cambie a amarillo pálido (lo que indica que todo el cuerpo del ratón está perfundido con PBS).
NOTA: La perfusión cardíaca se realiza para eliminar eficientemente la sangre en todo el cuerpo. - Deje de tomar isoflurano y retire los riñones de los ratones y lávelos con PBS. Después de eso, retire las cápsulas renales de los riñones y lave los riñones dos veces con PBS.
- Incrustar las muestras de tejido renal en OCT compuesto y congelar en nitrógeno líquido.
- Utilice un criostato para preparar secciones (5 μm de espesor). Monte las secciones en portaobjetos de vidrio recubiertos de silano y fíjelos con paraformaldehído al 4%.
NOTA: Los tejidos renales pueden teñirse opcionalmente con lectina Lotus tetragonolobus marcada con fluoresceína (2 mg/ml) a RT durante 2 h para los túbulos proximales, seguido de DAPI (30 nM en PBS) a RT durante 15 min para los núcleos celulares. - Lave suavemente las diapositivas dos veces con PBS.
- Visualice la tinción de fluorescencia mediante microscopía de fluorescencia con un aumento de 100x y 400x y el software de imágenes adecuado.
3. Confirmación de alteraciones del miARN diana después de la administración de miARN imitador al riñón por PEI-NP mediante inyección en la vena de la cola
- Realizar una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) para confirmar las alteraciones del miARN objetivo.
NOTA: Consulte el artículo publicado anteriormente para obtener detalles de qRT-PCR18,19,20. El sistema qRT-PCR utilizado para generar los resultados representativos que se proporcionan a continuación fue cambiado por el fabricante. La qRT-PCR debe realizarse de acuerdo con el protocolo más reciente del fabricante.
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Representative Results
Los miRNAs diana para fibrosis renal, nefropatía diabética y LRA descritos a continuación se seleccionaron en función de la investigación de microarrays, qRT-PCR y / o base de datos para aplicaciones de terapia génica. Para más detalles, consulte las publicaciones anteriores13,14,15.
Entrega y efectos del miRNA-146a-5p-imitador usando PEI-NPs en ratones con fibrosis renal13
El análisis de microscopía fluorescente mostró que la inyección de PEI-NP en la vena de la cola podría entregar la imitación de miARN al espacio tubulointersticial. En ratones con fibrosis renal producidos por UUO, esto incluyó células tubulares renales, que no tienen una forma regular en el riñón (flecha de la Figura 2A) y el glomérulo (Figura 2A). El análisis qRT-PCR mostró que la inyección de PEI-NPs-miRNA-146a-5p-imitador indujo una sobreexpresión significativa de miRNA-146a-5p en el riñón (Figura 2B). Además, la inyección inhibió la progresión de la fibrosis renal en los ratones modelo producidos por UUO, según lo estimado con la tinción de rojo Sirius (rojo indica áreas fibróticas) in vivo. La inyección de PEI-NPs-miRNA-146a-5p-imitador se realizó 1 día antes, 1 día después y 3 días después del tratamiento con UUO (estimado 6 días después del tratamiento con UUO) (Figura 2C). La inyección de miRNA control de PEI-NPs no mostró efectos preventivos sobre la fibrosis renal (Figura 2B, C). La administración de PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic y PEI-NPs-miRNA-control-miRNAs no causó una respuesta IFN, como el aumento de la expresión de 5-oligoadenilato sintasa y la transducción de señales y activador de la transcripción 1 en ratones (Figura 2D).
Entrega y efectos del miRNA-181b-5p-imitador utilizando PEI-NPs en ratones modelo con enfermedad renal diabética14
Para evaluar el potencial terapéutico de miRNA-181b-5p para la enfermedad renal diabética, inyectamos miRNA-181b-5p-PIE-NPs o control de miRNA-PIE-NPs en ratones db / db de 10 semanas de edad semanalmente durante 10 semanas. El análisis de microscopía fluorescente mostró que la inyección de PEI-NP en la vena de la cola podría administrar miARN imitador al glomérulo y al espacio tubulointersticial en riñones de ratones modelo de riñón diabético (db / db) in vivo (Figura 3A). Además, el análisis qRT-PCR mostró que la inyección de PEI-NPs-miRNA-181b-5p-imitador indujo una sobreexpresión significativa de miRNA-181b-5p en el riñón (Figura 3B). El análisis histológico con tinción periódica de ácido-Schiff mostró que la inyección de PEI-NPs-miRNA-181b-5p-imitador una vez por semana a partir de las 10-20 semanas de edad inhibió la progresión de la enfermedad renal diabética en ratones db/db in vivo (Figura 3C). Por el contrario, la inyección de miARN control de PEI-NPs no produjo efectos preventivos sobre la fibrosis renal (Figura 3B, C).
Entrega y efectos de PEI-NPs-miRNA-5100-mimic en ratones modelo de lesión renal aguda producidos por IRI15
El análisis de microscopía fluorescente mostró que la inyección de la vena de la cola de PEI-NPs podría administrar miRNA imitador al glomérulo y al espacio tubulointersticial de riñones de ratones modelo AKI in vivo (Figura 4A). El análisis qRT-PCR mostró que la inyección de PEI-NPs-miRNA-5100-5p-imitador indujo una sobreexpresión significativa de miRNA-5100 en riñones de ratones AKI producidos por IRI (Figura 3B). El análisis histológico con tinción de hematoxilina-eosina mostró que una sola inyección de PEI-NPs-miRNA-5100 redujo la apoptosis de células tubulares (flecha negra), lo que impidió el desarrollo de LRA en el modelo de ratones LRA producido por IRI. PEI-NPs-miRNA-5100-mimic se inyectó a través de la vena de la cola 2 días antes del procedimiento IRI (Figura 4B). La inyección de PEI-NPs -miRNA de control- no mostró efectos preventivos sobre la fibrosis renal (Figura 4B,C).
Figura 1: Estructura del complejo imitador de PEI-NP-MIRNA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Entrega y efectos de PEI-NPs-miRNA-146a-5p-imitación en ratones con fibrosis renal . (A) Análisis de microscopía fluorescente. Barra de escala = 200 μm. (B) Análisis qRT-PCR de los niveles de expresión de miRNA-146a-5p en cada grupo (n = 6 por grupo). (C) Análisis histológico con tinción de rojo Sirius (rojo indica el área fibrótica, barra de escala = 100 μm). La inyección de PEI-NPs-miRNA-146a-5p-imita 1 día antes, 1 día después y 3 días después del tratamiento con UUO inhibió el desarrollo de fibrosis renal en ratones in vivo. (D) análisis qRT-PCR de riñón para investigar los posibles efectos de la respuesta de IFN a PEI-NPs-miRNA-146a-5p en ratones UUO (n = 6 por grupo). Abreviaturas: DAPI, 4,6-diamidino-2-fenilindol; FITC: isotiocianato de fluoresceína; qRT-PCR: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real; NS, no significativo; PEI-NPs: nanopartículas de polietilenimina; miARN, microARN; UUO: obstrucción unilateral del uréter; OAS1: 5′-oligoadenilato sintasa; STAT1, transducción de señales y activador de la transcripción 1. Los valores representan la media ± error estándar (barras de error). *P < 0,05. Morishita et al. (International Journal of Nanomedicine 2015 10 3475-3488. Publicado originalmente y utilizado con permiso de Dove Medical Press Ltd). 13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Entrega y efectos de PEI-NPs-miRNA-181b-5p-imitación en ratones modelo de enfermedad renal diabética14. (A) Análisis de microscopía fluorescente. Barra de escala = 200 μm. (B) análisis qRT-PCR para evaluar los efectos de sobreexpresión de miRNA-181b-5p después de la inyección de PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic (n = 3 por grupo). (C) Se observaron cambios fenotípicos por microscopía óptica. La inyección de PEI-NPs-miRNA-181b-5p-imitador una vez por semana a partir de las 12-20 semanas de edad inhibió la progresión de la enfermedad renal diabética en ratones db/db in vivo. Barra de escala = 50 μm. Se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) para las pruebas de análisis de comparación múltiple entre los grupos. Si detectamos significación estadística por el ANOVA, realizamos la prueba de Turquía para comparar las medias de dos grupos como un análisis post hoc. Abreviaturas: PEI-NPs, nanopartículas de polietilenimina; qRT-PCR: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real; miARN, microARN. *P < 0,05. Esta cifra ha sido modificada de Ishii et al. 14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Entrega y efectos de PEI-NPs-miRNA-5100-mimic en ratones modelo de lesión renal aguda producidos por IRI . (A) Análisis de microscopía fluorescente. Barra de escala = 100 μm. (B) análisis qRT-PCR para evaluar los efectos de sobreexpresión de miRNA-5100 después de la inyección de PEI-NPs-miRNA-5100-mimic. (C) Análisis histológico del riñón teñido con hematoxilina-eosina. Barra de escala = 100 μm. Los PEI-NP inyectados a través de la vena de la cola 2 días antes del procedimiento IRI previenen la progresión de la LRA inducida por la IRI. Abreviaturas: PEI-NPs, nanopartículas de polietilenimina; qRT-PCR: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real; miARN, microARN; IRA: lesión renal aguda; IRI: lesión por isquemia-reperfusión. **P < 0,01,*P < 0,05. Esta figura ha sido modificada de Aomatsu et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Usando el protocolo presentado en este manuscrito, los PEI-NP pueden administrar imitadores de miARN al riñón para inducir la sobreexpresión de miARN objetivo, lo que resulta en efectos del tratamiento en modelos de ratón in vivo de varias enfermedades renales, incluida la fibrosis renal, la enfermedad renal diabética y la LRA.
El método para preparar el complejo de PEI-NPs y miRNA imitan es muy simple. La superficie cargada positivamente de los PEI-NPs atrapa la imitación de miRNA cuando solo se mezclan 13,14,15,16,17 (Figura 1). Además, como vector no viral lineal basado en polietilenamina, los PEI-NP evitan problemas asociados con el uso de vectores virales, como la respuesta al IFN y la oncogénesis inducida por inestabilidad genética11,15,16.
La inyección de PEI-NPs-imitador a través de la vena de la cola puede requerir entrenamiento ya que las venas de la cola de ratones con enfermedad renal a veces son difíciles de perforar debido a la deshidratación, especialmente en ratones AKI y obesos db / db. Además, la inyección repetida de PEI-NPs-miRNA-imitador puede ser necesaria para varios modelos de ratones. Los intervalos de inyección deben determinarse por la experiencia previa de cómo se produce la sobreexpresión por imitación de PEI-NPs-miRNA-en el contexto de cada modelo de ratón con enfermedad renal.
Los vectores virales se utilizan con frecuencia para la transfección de miARN imitador en los riñones y pueden conducir a una transfección significativa de miARN 9,10. Sin embargo, los vectores virales tienen problemas potenciales como causar una respuesta de interferón y/o inestabilidad genética11,12. Por lo tanto, se han desarrollado varios métodos alternativos de administración utilizando vectores no virales, como Gelatin-NPs 21,22, electroporación23, inyección hidrodinámica 24,25 y transfección mediante ultrasonido 26. En este manuscrito, presentamos las PEI-NP como un vector no viral para el riñón. Algunos vectores no virales son altamente invasivos (electroporación e inyección hidrodinámica) y, por lo tanto, pueden ser difíciles de aplicar para uso clínico. Sin embargo, una comparación de PEI-NPs con otros vectores no virales, tales como nanopartículas basadas en lípidos y Gelatin-NPs, debe ser evaluada en estudios adicionales.
Este protocolo tiene las siguientes limitaciones. En primer lugar, aunque los MIRNAs de PEI-NPs son adecuados para modelos de ratón (al menos como primera etapa), se requieren grandes cantidades de PEI-NPs-miRNAs para modelos animales grandes (como ratas, conejos, monos y perros) utilizados para la investigación preclínica. Además, debe tenerse en cuenta que los PEI-NP no administraron miARN imitador específicamente al riñón porque los PEI-NP, al igual que los vectores virales, no son un sistema de administración dirigido. Por lo tanto, puede ser necesario investigar el fenotipo de otros órganos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue parcialmente apoyado por JSPS KAKENHI (Subvención No. 21K08233). Agradecemos a Edanz (https://jp.edanz.com/ac) por editar los borradores de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
| Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |
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