Summary
Оценка качества культур молочнокислых бактерий (LAB) была подтверждена как эффективный способ повышения жизнеспособности и функциональности штаммов LAB для процедур ферментации. Чтобы подкрепить это утверждение, мы разработали протокол, который разъясняет, как LAB-культуры активируются и культивируются для ферментации и биообработки.
Abstract
Молочнокислые бактерии (LAB) являются важными молочными заквасочными культурами, которые в значительной степени используются для производства ферментированных молочных продуктов, таких как йогурт и сыр. LAB преимущественно производят молочную кислоту в качестве основного конечного продукта ферментации, и они синтезируют важные метаболиты, которые придают органолептические характеристики ферментированных пищевых продуктов. LAB - это привередливые бактерии, которые процветают во многих средах, когда удовлетворяются адекватные потребности в питании. Спрос на превосходные молочные заквасочные культуры LAB для ферментации в пищевой и молочной промышленности привел к необходимости обеспечения жизнеспособных и активных культур для всех операций по биообработке. Таким образом, разработка стандартного протокола для обеспечения жизнеспособности и расширенной функциональности лабораторных культур в лабораторных условиях, а также в средах переработки молочных продуктов имеет очень важное значение. При решении проблем, связанных с реанимационными слабыми, напряженными и травмированными клетками культуры LAB, протокол, который ярко описывает основные шаги по восстановлению, усилению регенерации клеток и улучшению метаболической функциональности штаммов LAB, имеет первостепенное значение. Поддержание чистоты, функциональности и жизнеспособности культур для заквасок LAB также имеет решающее значение. Таким образом, соблюдение уникального руководства по протоколу приведет к повышению производительности ферментации для многих штаммов LAB, предназначенных для процессов ферментации и биотехнологии. В результате Лаборатория пищевой микробиологии и биотехнологии в Сельскохозяйственном и техническом государственном университете Северной Каролины разработала стандартный протокол для активации и контроля качества отдельных штаммов LAB, что привело к созданию высокофункциональных и жизнеспособных штаммов культуры LAB, используемых для исследований ферментации. Адаптация и рекомендация такого протокола для использования в молочной и пищевой промышленности поможет обеспечить жизнеспособность и функциональность LAB для многих применений.
Introduction
Молочнокислые бактерии (LAB) представляют собой группу уникально разнообразных бактерий, обладающих промышленным потенциалом. Штаммы, принадлежащие Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus и Streptococcus thermophilus, в основном используются в качестве молочных заквасок для ферментированных молочных пищевых продуктов, таких как йогурт1. Выбранные штаммы LAB также классифицируются как пробиотики, поскольку они приносят пользу для здоровья людей при адекватном введении доз2. Молочнокислые бактерии также являются грамположительными, неспорообразующими, недыхающимися, но аэротолерантными микроорганизмами, которые обычно характеризуются производством молочной кислоты в качестве ключевого продукта ферментации. LAB также синтезирует эссенциальные метаболиты, например, органические кислоты, бактериоцины и другие антимикробные соединения3, которые могут ингибировать широкий спектр патогенов пищевого происхождения4. Молочная кислота, основной конечный продукт углеводного катаболизма и побочный продукт ферментации LAB, является органическим метаболитом, который обладает антимикробными свойствами и потенциально полезен для применения в биоконсервации пищевых продуктов 3,5,6. Кроме того, органические кислоты, производимые LAB, придают вкус, текстуру и аромат пищевых продуктов, тем самым усиливая их общие органолептические свойства 5,6. Различные потребности в питании LAB в сочетании с их вездесущей природой в конечном итоге позволяют бактериям легко процветать в различных средах, таких как молочные продукты, ферментированные продукты, овощи, а также в кишечнике человека7.
Существует растущий спрос на заквасочные культуры из LAB для производства йогурта и многих разнообразных молочных применений 8,9, поэтому следует придерживаться критического внимания и установленных научных методов при выращивании штаммов LAB, а также при активации как лиофилизированных, так и изолированных штаммов, поскольку эта активность жизненно важна для повышения производительности ферментации. Поэтому лаборатория пищевой микробиологии и биотехнологии активно участвует в разработке подходящей технологии, ориентированной на активацию, превосходный рост и ферментацию, характерные для штаммов LAB, выделенных из ферментированных молочных продуктов, а также из промышленных заквасок, используемых для производства йогурта. Кроме того, следует отметить, что промышленно произведенные штаммы культуры LAB подвергаются консервирующим действиям, таким как сублимационная сушка и замороженное хранение, вызывая клеточный стресс и травмы, в результате процесса холодного шока они подвергаются10. При ограничении проблем жизнеспособности и улучшении функциональности штаммов LAB, полученных либо из изолированных пищевых продуктов, либо из сублимированных продуктов, важно правильно активировать эти культуры в качестве формы контроля качества для улучшения их ферментативной характеристики8. В этом исследовании цель состояла в том, чтобы разработать собственный протокол контроля качества для активации и роста штаммов культуры L. delbrueckii subsp. bulgaricus, который в конечном итоге способствовал жизнеспособному росту LAB, а также улучшал эффективность ферментации и метаболическую функциональность штаммов LAB. Этот протокол в конечном итоге может быть адаптирован (с использованием оптимальных питательных сред и соответствующих условий культивирования) для выращивания других штаммов LAB для исследований ферментации, а также для промышленных целей или операций биообработки. Таким образом, этот протокол активации LAB и контроля качества обеспечит получение и потенциальное функционирование высококачественных молочных заквасочных культур для различных применений в мировой молочной и пищевой промышленности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Общие материалы и методы
- Источник Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
- Получить штаммы L. bulgaricus из надежных источников.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании в исследовании контроля качества было использовано в общей сложности пять (5) штаммов L. bulgaricus (таблица 1). Два штамма сублимированного L. bulgaricus для промышленного производства кисломолочных продуктов были предоставлены доктором Альбертом Крастановым, кафедрой биотехнологии Университета пищевых технологий, Пловдив, Болгария. Два штамма, выделенные из коммерческих йогуртовых продуктов, доступных на рынке США, были получены из запаса -80 ° C лаборатории пищевой микробиологии и биотехнологии в Университете штата Северная Каролина A & T, а один лиофилизированный штамм был поставлен поставщиком C. Все штаммы LAB выдерживали при -80 °C до дальнейшего использования. Другой бактериальный штамм (Limosilactobacillus reuteri) был получен из запаса -80 ° C лаборатории пищевой микробиологии и биотехнологии в Государственном университете Северной Каролины A & T.
- Получить штаммы L. bulgaricus из надежных источников.
- Стандарт L. MRS среда ферментационного бульона
- Готовят среду deMan, Rogosa Sharpe (MRS), полностью растворив 55 г MRS и 0,5 г L-цистеина в 1 л деионизированной воды (DW).
- Дозировать 7 мл и 2 мл приготовленного раствора МРС в пробирки соответственно автоклав при 121 °С в течение 15 мин, а затем охладить при комнатной температуре (РТ).
- MRS агар средний
- Готовят МРС агаровую среду, полностью растворив 55 г МРС и 0,5 г L-цистеина в 1 л DW. Добавить порошок агара (15 г), стерилизовать агаровую среду при 121 °C в течение 15 мин, а затем охладить на водяной бане.
- Вылейте все свежеприготовленные среды в стерильные чашки Петри и храните их при 4 °C до дальнейшей необходимости.
- Модифицированный армированный клостридиальный средо-пируват (mRCM-PYR)
- Оптимизировать усиленную клостридиальную среду согласно Oyeniran et al.13 и Nwamaioha и Ibrahim18, для селективности и точного перечисления L. bulgaricus путем растворения 10 г пептона No3, 10 г экстракта говядины, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлорида натрия, 3 г ацетата натрия, 2 г двухосновного фосфата калия, 0,1 г урацила, 0,25 г хлорида кальция, 5 г декстрозы, 5 г фруктозы, 10 г мальтозы, 2 г пирувата натрия, 0,2% Tween 80 и 0,5 г L-цистеина в 1 л DW.
- Отрегулируйте конечный рН (6,0 ± 0,2) раствора, используя 6 N HCl перед добавлением 0,008% анилинового синего и 15 г агара. Автоклав среды при 121 °C в течение 15 мин, остудить на водяной бане и вылить в стерильные чашки Петри. Храните все свежеприготовленные среды в стерильных чашках Петри при температуре 4 °C до тех пор, пока это не понадобится.
- Глицериновый запас LAB культур
- Готовят глицериновые запасы (50% глицерина) путем разбавления 100% глицерина в том же объеме DW и стерилизуют при 100 °C в течение 30 мин с использованием сухого цикла стерилизации. Охладите запасы глицерина до RT и асептически храните их для дальнейшего использования.
- Используют бактериальный рост (единичную колонию L. bulgaricus , полученную с помощью разработанного протокола КК) из ночных культур.
- Пипетка 500 мкл ночных культур в 50% глицерин в 2 мл центрифужной трубки и осторожно смешивают их вместе. Заморозьте и храните глицериновый запас, содержащий культуры LAB, при сверхнизкой температуре -80 °C до тех пор, пока это не понадобится.
ПРИМЕЧАНИЕ: Графическая схема протокола контроля качества и активации LAB культур показана на рисунке 1.
| Нет | Код продукта | Образец | Источник | Бактериальная композиция с маркировкой1 |
| 1 | С9 | Чистый промышленный штамм | Болгария | Lb. bulgaricus |
| 2 | ЛБ6 | Чистый промышленный штамм | Болгария | Lb. bulgaricus, |
| 3 | АТХК 11842 | Чистый промышленный штамм | АТХК | Lb. bulgaricus |
| 4 | ГАЛКА | Йогурт | США | Lb. bulgaricus, другая живая культура |
| 5 | Е22 | Йогурт | США | Lb. bulgaricus, другая живая культура |
| 6 | Реутери | Йогурт | США | Limosilactobacillus reuteri |
| 1фунт = Лактобациллы | ||||
Таблица 1: Пробиотические штаммы. В таблице перечислены пробиотические штаммы, используемые в этом исследовании.
2. Протокол активации и контроля качества LAB культур
- Возьмите подготовленный глицериновый запас штаммов LAB (в 2 мл центрифужных пробирок) из морозильной камеры со сверхнизким содержанием -80 °C и не дайте им оттаять перед использованием.
- Очистите и продезинфицируйте отверстие трубок центрифуги 70% спиртом и осторожно вихрь перед использованием.
- Пипетка около 250 мкл (0,25 мл) запасной культуры LAB из центрифужных пробирок в свежие пробирки MRS объемом 2 мл.
- Осторожно вихрь, парафильмируют пробирки и анаэробно инкубируют их в течение ночи при 42 °C в течение 12-16 ч.
- Возьмите около 500 мкл (0,5 мл) из выращенных на ночь культур из пробирок 2 мл MRS в свежие пробирки 7 мл MRS, вихрь и анаэробно инкубируйте их в течение ночи при 42 °C в течение 12-16 ч.
- Оцените рост микробов путем измерения оптической плотности (OD) или роста культур при 610 нм с помощью УФ-видимого спектрофотометра и запишите приемлемые результаты между 0,7 и 0,9.
- Проведите ночные культуры из 7 мл пробирок MRS на агаровые пластины MRS и MRCM-PYR и инкубируйте их анаэробно в течение 72 ч при 42 °C.
- Соберите изолированные колонии из агаровых пластин, переложите их в свежие пробирки MRS объемом 7 мл, осторожно вихрь и анаэробно инкубируйте их в течение ночи при 42 °C в течение 12-16 ч.
- Храните агаровые пластины, содержащие изолированные штаммы при 4 °C, в холодильнике в течение недели.
- Измерьте и подтвердите OD (от 0,7 до 0,9) из 7 мл пробирок MRS культур LAB, выделенных из полосатых пластин при 610 нм, и используйте их в качестве рабочих культур для всех связанных экспериментов.
- Выполняют десятикратное разведение (последовательное разбавление) выращенных культур LAB из конечных 7 мл пробирок MRS с использованием 9 мл пептонной воды (физиологический буфер) для получения соотношения 1:10.
- Наконец, возьмите около 250 мкл (0,25 мл) из соответствующих последовательных разведений для всех экспериментов по ферментации.
- Активируют бульон, содержащий штаммы (250 мкл) со стадии 2.12 путем переноса их в свежий бульон МРС 7 мл и инкубации их анаэробно при 42 °С в течение 16 ч.
- Продолжайте повторять шаги 2.6-2.12, чтобы обеспечить жизнеспособный и превосходный рост клеток из культур LAB.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все штаммы L. bulgaricus активировали в свежеприготовленном бульоне MRS и затем инкубировали анаэробно при 42 °C в течение 16 ч, чтобы достичь оптической плотности (OD610 нм) роста бактерий между 0,7 и 0,9. Рост бактерий измеряли с помощью УФ-видимого спектрофотометра при 610 нм. Значения рН ночных культур находились в диапазоне от 3,5 до 5,3 в результате производства молочной кислоты, органического конечного продукта ферментации LAB. Соблюдались и соблюдались процедуры безопасности, такие как правильная циркуляция воздушного потока в вытяжке биобезопасности и предотвращение ожогов во время использования горелки Бунзена.
Рисунок 1: Графическая схема протокола активации культур молочнокислых бактерий (LAB). Схема содержит подробную информацию и основные инструменты, необходимые для обработки и активации штаммов культуры LAB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рост клеток оцениваемых штаммов LAB, культивируемых с помощью протокола контроля качества, значительно отличался (P < 0,05), чем у штаммов, культивируемых без этого стандартного протокола. Протокол QC как для L. bulgaricus , так и для L. reuteri использовал многосубкультурный подход (субкультурирование три раза перед растяжкой на агаровых пластинах), тогда как процедура контроля имела субкультурную обработку, выполненную только один раз со всеми другими условиями, сохраненными постоянными. Рост колонии также был выше и хорошо определен на пластинах сред роста, которые культивировались с использованием этого стандартного протокола QC. Это подтвердило эффективность протокола в обеспечении усиленного роста LAB за счет деления клеток в ферментативном бульоне, тем самым способствуя усиленному клеточному метаболизму в штаммах LAB. Рост двух штаммов, культивируемых с разработанным протоколом контроля качества и без него, показан на рисунке 2. Штаммы были нанесены на агаровые пластины после того, как наблюдался и измерялся интенсивный рост (0,7-0,9 при OD610 нм). Пластины анаэробно инкубировали при 42 °C в течение 72 ч, после чего дискретные колонии наблюдались вдоль линий стрекинга. Другое исследование (рисунок 3) подтвердило эффективность протокола контроля качества по росту Lactobacillus reuteri, культивируемого в среде TPY и инкубированного при 37 °C, в результате чего колонии, генерируемые методом протокола QC, подтвердили стабильный устойчивый рост (в среднем 0,9 при OD610 нм) на основе исторических данных. Контрольный метод активации LAB без многократного субкультирования, который не использовал разработанную технику контроля качества, привел к неравномерной картине роста (0,9-0,75 при OD610 нм) L. reuteri.
Рисунок 2: Колониальная морфология роста штаммов L. bulgaricus, культивируемых с разработанным протоколом контроля качества и без него. Штаммы были разделены в трех экземплярах и анаэробно инкубировались при 42 °C в течение 72 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Поведение Л. реутери в течение периода после роста в среде TPY при 37 °C с использованием стандартизированного протокола КК и традиционного метода бактериального культивирования (P < 0,05). Рост L. reuteri периодически отслеживался в течение месяца и был приведен в соответствие с историческими данными предыдущих лет на основе активации культуры со стандартным протоколом контроля качества. В строках ошибок указывается стандартное отклонение значений OD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Результаты всех штаммов, оцененных с помощью протокола контроля качества и без использования протокола, были одинаковыми, и поэтому были представлены результаты, связанные только с штаммами (S9 и LB6). Активированные штаммы LAB имели превосходный рост клеток, который характеризовался высокой интенсивностью клеточной биомассы, что вызывало мутное появление ферментативного бульона MRS в пробирке11. Наблюдаемый рост клеток после активации культуры был очевиден между 12 ч и 16 ч при анаэробной ферментативной температуре 42 °C. Было также подтверждено, что штаммы LAB, активированные на основе этого протокола, непрерывно трансформировали свою колониальную морфологию в результате процедуры мульти-субкультурирования12 с дискретными колониями, видимыми вдоль линий стрекинга. Контрольный эксперимент не использовал этот стандартный протокол и был субкультурирован только один раз; он, однако, также не проявлял интенсивной мутности в ферментативном бульоне, хотя рост все еще находился в пределах допустимого диапазона 0,7-0,9 при OD610 нм. Следует также отметить, что нанесение контрольных культур на агаровые пластины и их анаэробная инкубация в тех же условиях, что и стандартная процедура, изображают только меньшие и меньшие колонии по сравнению с теми, которые наблюдаются в стандартном протоколе13.
Это может быть связано со слабыми и нежизнеспособными характеристиками клеток LAB. Следовательно, концепция субкультурирования штаммов LAB несколько раз и растяжения на агаровых пластинах, таким образом, приводит к генерации новых клеток путем деления клеток и обмена генетическим веществом в бактериях. Это усиливает клеточную и метаболическую функциональность и способствует росту клеток во время ферментационных операций14. Кроме того, стрессовые и поврежденные клетки LAB также восстанавливаются на основе устойчивого состояния условий роста (потребности в питании, рН и температура), которые позволяют им легко адаптироваться и восстанавливать полноценную клеточную и метаболическую функциональность6. Более того, строгое соблюдение этого протокола в большей степени ограничивает загрязнение клеточных культур, тем самым обеспечивая выделение только чистых и превосходных клеточных колоний для целей ферментации. Таким образом, повторное растяжение и восстановление клеточных культур LAB из агаровых пластин обеспечили улучшенную клеточную стенку, которая хорошо подходила для метаболической деятельности, такой как для операций ферментации LAB15. Кроме того, исследование роста L. reuteri на основе разработанного протокола контроля качества (рисунок 3) подтверждает, как субкультурирование LAB методом колонии к культуре дает стабильный устойчивый рост в оптимальном диапазоне роста (0,9-1,0 OD610 нм) в течение определенного периода по сравнению с субкультурированием непосредственно от культуры к культуре (традиционный метод), что привело к резкому росту от 0,75 до 0,9 при OD610 нм. . Было также очевидно, что протокол КК с течением времени последовательно давал стабильную картину роста бактерий, которая имела стандартное отклонение (SD) 0,1. Неравномерный рост L. reuteri, однако, имел свой SD более 0,1 из-за неравномерного роста бактериальных клеток. Эта неравномерная картина роста, как уже говорилось, объяснялась слабыми и поврежденными клетками; таким образом, метаболическая функциональность клеток снижалась в течение ферментационного периода14. Текущее исследование было также подтверждено предыдущим исследованием Ahmed et al.16 , в соответствии с которым в их исследовании L. reuteri размножался в агаровой среде с экстрактом пептоновых дрожжей триптиказы (TPY) в течение 8 недель при 37 ° C. Фактор, способствующий устойчивому росту L. reuteri , был отнесен к методу культивирования клеток и методу контроля качества, который генерировал новые и превосходно активные культуры даже после нескольких субкультурных мероприятий в течение периода исследования.
Критические этапы в этом протоколе включают в себя всегдае использование новых и менее чем дневной ферментативных культур и всегда наличие ферментативного бульона или питательной среды, вновь приготовленных до начала ферментации, и не использование хранимой питательной среды, поскольку сила и эффективность среды уменьшаются в течение длительного периода хранения. В случае использования стоковых культур при температуре -80 °C или -20 °C культуры следует обрабатывать асептически. Кроме того, если наблюдается слабость стоковых культур из-за холодного шока от морозильной камеры, требуется реанимация следующим образом. Только низкие концентрации (около 100 мкл) бульонных культур следует инокулировать в добавленном ферментативном бульоне (МРС) примерно 2 мл для преанаэробной инкубации в течение примерно 6 ч, прежде чем добавить дополнительную МРС примерно 5-6 мл для окончательной анаэробной инкубации в течение примерно 16 ч17. В случае использования лиофилизированных или лиофилизированных культур настоятельно рекомендуется восстановить сублимированные культуры в 3 мл обезжиренного жидкого молока и анаэробно инкубировать их в течение примерно 4-5 ч перед инокуляцией их в добавленный ферментативный бульон, такой как MRS. Эти процессы являются ключевыми в обеспечении жизнеспособности клеток LAB в любое время13.
Другим важным шагом является обеспечение роста клеток ферментативных культур всегда в пределах диапазона роста 0,7-0,9, который обычно составляетOD 610 нм. Это важно, так как этот диапазон роста рекомендуется в качестве соответствующей логарифмической или экспоненциальной фазы кривой роста бактерий17. Любое значение оптической плотности (OD) выше 1 является неточным, поскольку это подтверждает, что ферментативные культуры достигли своей фазы смерти с большинством мертвых клеток и накоплением токсичных клеточных отходов, преимущественно присутствующих в ферментативной среде. В случае достижения значения OD выше 1 (OD610 нм > 1), рекомендуется разбавлять культуры в 2 или 3 раза или более до тех пор, пока оно не достигнет значения OD ниже 1 (OD610 нм < 1)18. Еще один момент, вызывающий озабоченность, заключается в том, чтобы соответствующим образом анаэробно инкубировать полосатые пластины с ферментативными культурами. Хотя большинство LAB являются факультативными анаэробами, усиленный рост ограничен в присутствии кислорода; следовательно, предпочтение анаэробных условий необходимо для содействия эффективному росту. Рекомендуется использовать камеру CO2 или импровизированный сосуд, который мог бы генерировать CO2 в течение инкубационного периода при 42 °C. Для достижения наилучших результатов роста клеток на инкубированных пластинах рекомендуется 72 ч для достижения оптимальных результатов18.
Однако нет никаких ограничений этой стандартной процедуры, так как строгое соблюдение этапов обеспечит жизнеспособные и чистые клетки LAB для ферментативных процедур. Значение этого стандартного протокола основано на его проактивном подходе к обеспечению жизнеспособности пробиотических клеток, особенно для ферментативных культур. Он служит механизмом контроля качества, который стремится устранить загрязнение и в конечном итоге способствовать созданию сильных и очень жизнеспособных культур, которые могут обеспечить желаемые результаты ферментации в стандартных условиях. В отношении существующих или обычных методов этот стандартный протокол устраняет вероятность проблем жизнеспособности клеток LAB (из-за холодового шока и плохой среды роста), он также стремится обеспечить первую правильную концепцию наличия чистых и жизнеспособных пробиотических культур, экономит время и повышает производительность при работе с культурами LAB.
Будущие применения этого метода огромны, так как этот протокол может быть использован как в исследовательских лабораториях, молочной и пищевой промышленности, биообработке, ферментации и биотехнологических институтах. Дополнительное преимущество этого протокола основано на его упрощенном характере и, следовательно, не требует сложного использования лабораторного оборудования. Таким образом, этот протокол может быть использован для демонстрационного или педагогического обучения в средних школах, которые имеют базовую лабораторную среду для поощрения и повышения интереса студентов к областям, связанным с наукой, технологией, инженерией и математикой (STEM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта публикация стала возможной благодаря грантовому номеру NC. X-267-5-12-170-1 от Национального института продовольствия и сельского хозяйства (NIFA) и частично от NIZO Food Research BV, Нидерланды, Jarrow Formulas, США, а также Департамента семейных и потребительских наук и Сельскохозяйственной исследовательской станции в Сельскохозяйственном и техническом государственном университете Северной Каролины (Гринсборо, Северная Каролина, США 27411). Эта работа также была поддержана, в частности, грантом Программы по наращиванию потенциала 1890 года No (2020-38821-31113 /присоединение к проекту No 021765). Эта работа также была частично поддержана Министерством образования и науки Болгарии в рамках Национальной исследовательской программы «Здоровое питание для сильной биоэкономики и качества жизни», утвержденной DCM # 577 / 17.08.2018.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline Blue | Thermo Scientific | R21526 | 25 g |
| Beef extract | Research Products International | 50-197-7509 | 500 g |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Calcium Chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | 500 g |
| Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP350500 | 500 g |
| D-Fructose | ACROS Organics | AC161355000 | 500 g |
| Difco agar powder | Difco | DF0812-07-1 | 2 kg |
| TPY agar | Difco | 211921 | 500 g |
| Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock) | Fisher Scientific | 05-402-12 | 2 mL |
| Glycerol | Thermo Scientific | PI17904 | 500 mL |
| Infrared CO2 Incubator | Forma Scientific | ||
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 11842 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | S9 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | LB6 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | DAW | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | E22 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | RD2 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Maltose monohydrate | Fisher Scientific | M75-100 | 100 g |
| MRS broth | Neogen | 50-201-5691 | 5 kg |
| Peptone No. 3 | Hach | 50-199-6719 | 500 g |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Research Products International | 50-712-761 | 500 g |
| Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | S220-1 | 1 kg |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | 1 kg |
| Sodium pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | 100 g |
| Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps | Fisher Scientific | FB70125150 | 25 x 150 mm |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | 500 mL |
| Ultra low freezer | So-Low | ||
| Uracil | ACROS Organics | AC157301000 | 100 g |
| UV- visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Evolution 201 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | ||
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Ethanol | Fisher Scientific | T08204K7 | 4 L |
| Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical) | Fisher Scientific | SA56-500 | 500 mL |
References
- Karakas-Sen, A., Karakas, E. Isolation, identification and technological properties of lactic acid bacteria from raw cow milk. Bioscience Journal. 34 (2), 385-399 (2018).
- Martin, R., Langella, P. Emerging health concepts in the probiotics field: Streamlining the definitions. Frontiers in Microbiology. 10, 1047 (2019).
- Sadishkumar, V., Jeevaratnam, K. In vitro probiotic evaluation of potential antioxidant lactic acid bacteria isolated from idli batter fermented with Piper betle leaves. International Journal of Food Science & Technology. 52 (2), 329-340 (2017).
- Ayivi, R. D., et al. Lactic acid bacteria: Food safety and human health applications. Dairy. 1 (3), 202-232 (2020).
- Quinto, E. J., et al. Probiotic lactic acid bacteria: A review. Food and Nutrition Sciences. 5 (18), 1765-1775 (2014).
- Hayek, S. A., Gyawali, R., Aljaloud, S. O., Krastanov, A., Ibrahim, S. A. Cultivation media for lactic acid bacteria used in dairy products. Journal of Dairy Research. 86 (4), 490-502 (2019).
- Bintsis, T. Lactic acid bacteria as starter cultures: An update in their metabolism and genetics. Aims Microbiology. 4, 665-684 (2018).
- Shao, Y., Gao, S., Guo, H., Zhang, H. Influence of culture conditions and preconditioning on survival of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus ND02 during lyophilization. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1270-1280 (2014).
- Aryana, K. J., Olson, D. W. A 100-year review: Yogurt and other cultured dairy products. Journal of Dairy Science. 100 (12), 9987-10013 (2017).
- Kandil, S., El Soda, M. Influence of freezing and freeze-drying on intracellular enzymatic activity and autolytic properties of some lactic acid bacterial strains. Advances in Microbiology. 5 (6), 371-382 (2015).
- Malairuang, K., Krajang, M., Sukna, J., Rattanapradit, K., Chamsart, S. High cell density cultivation of Saccharomyces cerevisiae with intensive multiple sequential batches together with a novel technique of fed-batch at cell level (FBC). Processes. 8 (10), 1321 (2020).
- Jeanson, S., Floury, J., Gagnaire, V., Lortal, S., Thierry, A. Bacterial colonies in solid media and foods: A review on their growth and interactions with the micro-environment. Frontiers in Microbiology. 6, 1284 (2015).
- Oyeniran, A., et al. A modified reinforced clostridial medium for the isolation and enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus in a mixed culture. Journal of Dairy Science. 103, 5030-5042 (2020).
- Iguchi, A., et al. Effects of repeated subculturing and prolonged storage at room temperature of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 on pulsed-field gel electrophoresis profiles. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 3079-3081 (2002).
- Hayek, S. A., Ibrahim, S. A. Current limitations and challenges with lactic acid bacteria: a review. Food and Nutrition Sciences. 4 (11), 73-87 (2013).
- Ahmed, S. A., Ibrahim, S. A., Kim, C., Shahbazi, A. Significance of bile salt tolerant Lactobacillus reuteri. Proceedings of the 2007 National Conference on Environmental Science and Technology. , Springr, NY. 17-23 (2009).
- Gyawali, R., et al. A comparative study of extraction techniques for maximum recovery of β-galactosidase from the yogurt bacterium Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Research. 87 (1), 123-126 (2020).
- Nwamaioha, N. O., Ibrahim, S. A. A selective medium for the enumeration and differentiation of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Science. 101 (6), 4953-4961 (2018).
