Summary
De kwaliteitscontrolebeoordeling van melkzuurbacteriën (LAB) culturen is bevestigd als een effectieve manier om de levensvatbaarheid en functionaliteit van LAB-stammen voor fermentatieprocedures te verbeteren. Om deze bewering kracht bij te zetten, hebben we een protocol ontwikkeld dat uitlegt hoe LAB-culturen worden geactiveerd en gekweekt voor fermentatie- en bioprocessingprocedures.
Abstract
Melkzuurbacteriën (LAB) zijn essentiële zuivelstartculturen die aanzienlijk worden gebruikt voor de vervaardiging van gefermenteerde zuivelproducten zoals yoghurt en kaas. LAB produceert voornamelijk melkzuur als een belangrijk eindproduct van fermentatie en ze synthetiseren belangrijke metabolieten die de organoleptische kenmerken van gefermenteerde voedingsproducten geven. LAB zijn kieskeurige bacteriën die in veel omgevingen gedijen wanneer aan adequate voedingsbehoeften wordt voldaan. De vraag naar superieure LAB-zuivelstartculturen voor fermentatietoepassingen in de voedings- en zuivelindustrie heeft geresulteerd in de noodzaak om levensvatbare en actieve culturen te bieden voor alle bioprocessing-activiteiten. De ontwikkeling van een standaardprotocol voor het waarborgen van de levensvatbaarheid en verbeterde functionaliteit van LAB-culturen in het laboratorium en zuivelverwerkingsomgevingen is daarom zeer kritisch. Bij het aanpakken van zorgen die verband houden met het reanimeren van zwakke, gestreste en gewonde LAB-kweekcellen, is een protocol dat op levendige wijze opvallende stappen schetst om te herstellen, celregeneratie te verbeteren en de metabole functionaliteit van LAB-stammen te verbeteren van het grootste belang. Het behoud van cultuurzuiverheid, functionaliteit en levensvatbaarheid voor LAB-starterculturen is eveneens van cruciaal belang. Daarom zal het naleven van een unieke protocolrichtlijn resulteren in de bevordering van fermentatieprestaties voor veel LAB-stammen die zich toeleggen op fermentatie- en biotechnologieprocessen. Als gevolg hiervan heeft het Food Microbiology and Biotechnology Laboratory van de North Carolina Agriculture and Technical State University een standaardprotocol ontwikkeld voor de activering en kwaliteitscontrole van geselecteerde LAB-stammen die hebben geresulteerd in zeer functionele en levensvatbare LAB-cultuurstammen die worden gebruikt voor fermentatieonderzoek. De aanpassing en aanbeveling van een dergelijk protocol voor gebruik in de zuivel- en voedingsindustrie zal helpen om de levensvatbaarheid en functionaliteit van LAB voor veel toepassingen te waarborgen.
Introduction
Melkzuurbacteriën (LAB) zijn een groep uniek diverse bacteriën die industrieel potentieel hebben. Stammen die behoren tot Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus en Streptococcus thermophilus worden meestal gebruikt als zuivelstartculturen voor gefermenteerde zuivelproducten zoals yoghurt1. Geselecteerde LAB-stammen worden ook geclassificeerd als probiotica omdat ze gezondheidsvoordelen bieden aan mensen wanneer doseringen adequaat worden toegediend2. Melkzuurbacteriën zijn ook grampositieve, niet-sporenvormende, niet-respiraterende maar aerotolerante micro-organismen die over het algemeen worden gekenmerkt door de productie van melkzuur als een belangrijk fermentatieproduct. LAB synthetiseert ook essentiële metabolieten, bijvoorbeeld organische zuren, bacteriocines en andere antimicrobiële verbindingen3 die een breed spectrum van door voedsel overgedragen pathogenen kunnen remmen4. Melkzuur, een belangrijk eindproduct van koolhydraatkatabolisme en een bijproduct van LAB-fermentatie, is een organische metaboliet die antimicrobiële eigenschappen bezit en potentieel nuttig is voor toepassingen voor biopreservatie van levensmiddelen 3,5,6. Bovendien geven de organische zuren geproduceerd door LAB de smaak, textuur en aroma van voedingsmiddelen, waardoor hun algehele organoleptische eigenschappen worden verbeterd 5,6. De verschillende voedingsbehoeften van LAB in combinatie met hun alomtegenwoordige aard, stellen de bacteriën uiteindelijk in staat om gemakkelijk te gedijen in verschillende omgevingen zoals op zuivel gebaseerde voedingsmiddelen, gefermenteerde voedingsmiddelen, groenten en in de menselijke darm7.
Er is een groeiende vraag naar starterculturen van LAB voor yoghurtproductie en veel verschillende zuiveltoepassingen 8,9, vandaar dat kritische aandacht en gevestigde wetenschappelijke technieken moeten worden nageleefd, in LAB-stammenteelt, evenals in de activering van zowel gelyofiliseerde als geïsoleerde stammen, omdat deze activiteit van vitaal belang is voor verbeterde fermentatieprestaties. Het laboratorium voor levensmiddelenmicrobiologie en biotechnologie houdt zich daarom actief bezig met geschikte technologieontwikkeling gericht op de activering, superieure groei en fermentatie die kenmerkend zijn voor LAB-stammen die zijn geïsoleerd uit gefermenteerde zuivelproducten en uit industriële starterculturen die worden gebruikt voor de productie van yoghurt. Bovendien is het opmerkelijk dat LAB-kweekstammen die industrieel worden geproduceerd conserverende activiteiten ondergaan, zoals vriesdrogen en bevroren opslag, waardoor celstress en letsel ontstaat, als gevolg van het koude schokproces waaraan ze worden onderworpen10. Bij het beperken van de levensvatbaarheidsuitdagingen en het verbeteren van de functionaliteit van LAB-stammen die zijn verkregen uit geïsoleerde voedingsmiddelen of gevriesdroogde producten, is het belangrijk om deze culturen op de juiste manier te activeren als een vorm van kwaliteitscontrole om hun fermentatieve eigenschap te verbeteren8. In deze studie was het doel om een intern kwaliteitscontroleprotocol te ontwikkelen voor de activering en groei van L. delbrueckii subsp. bulgaricus-cultuurstammen die uiteindelijk levensvatbare LAB-groei bevorderden, evenals de fermentatieprestaties en de metabole functionaliteit van LAB-stammen verbeterden. Dit protocol kan uiteindelijk worden aangepast (met behulp van optimale groeimedia en geschikte kweekomstandigheden) voor de teelt van andere LAB-stammen voor fermentatieonderzoek, evenals voor industriële doeleinden of bioverwerkingsactiviteiten. Dit LAB-activerings- en kwaliteitscontroleprotocol zal er daarom voor zorgen dat superieure levensvatbare zuivelstartculturen worden verkregen en mogelijk functioneel zijn voor diverse toepassingen in de wereldwijde zuivel- en voedingsindustrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Algemene materialen en methoden
- Bron van Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
- Verkrijg L. bulgaricus stammen uit betrouwbare bronnen.
OPMERKING: In deze studie werden in totaal vijf (5) L. bulgaricus stammen gebruikt in het kwaliteitscontroleonderzoek (tabel 1). Twee stammen van gevriesdroogde L. bulgaricus voor de industriële productie van gefermenteerde melkproducten werden geleverd door Dr. Albert Krastanov, Afdeling Biotechnologie aan de Universiteit voor Voedseltechnologieën, Plovdiv, Bulgarije. Twee stammen geïsoleerd uit commerciële yoghurtproducten die op de Amerikaanse markt verkrijgbaar zijn, werden verkregen uit de -80 °C-voorraad van het laboratorium voor levensmiddelenmicrobiologie en biotechnologie aan de North Carolina A &T State University en één gevriesdroogde stam werd geleverd door een verkoper C. Alle LAB-stammen werden tot verder gebruik op -80 °C gehouden. Een andere bacteriestam (Limosilactobacillus reuteri) werd verkregen uit de -80 °C-voorraad van het laboratorium voor levensmiddelenmicrobiologie en biotechnologie aan de North Carolina A &T State University werd ook geëvalueerd.
- Verkrijg L. bulgaricus stammen uit betrouwbare bronnen.
- Standaard L. MRS fermentatie bouillon medium
- Bereid deMan, Rogosa Sharpe (MRS) medium door 55 g MRS en 0,5 g L-cysteïne volledig op te lossen in 1 L gedeïoniseerd water (DW).
- Doseer 7 ml en 2 ml van de bereide MRS-oplossing in reageerbuizen, respectievelijk autoclaaf bij 121 °C gedurende 15 minuten en koel vervolgens af bij kamertemperatuur (RT).
- MRS agar medium
- Bereid MRS agar medium door 55 g MRS en 0,5 g L-cysteïne in 1 l DW volledig op te lossen. Voeg agarpoeder (15 g) toe, steriliseer het agarmedium bij 121 °C gedurende 15 minuten en koel het vervolgens af in een waterbad.
- Giet alle vers bereide media in steriele petrischalen en bewaar ze bij 4 °C totdat ze verder nodig zijn.
- Gemodificeerd versterkt clostridiaal medium-pyruvaat (mRCM-PYR)
- Optimaliseer een versterkt clostridiaal medium volgens Oyeniran et al.13 en Nwamaioha en Ibrahim18, voor selectiviteit en nauwkeurige opsomming van L. bulgaricus door 10 g pepton #3, 10 g rundvleesextract, 5 g gistextract, 5 g natriumchloride, 3 g natriumacetaat, 2 g kaliumfosfaat dibasisch, 0,1 g uracil, 0,25 g calciumchloride, 5 g dextrose, 5 g fructose, 10 g maltose, 2 g natriumpyruvaat, 0,2% Tween 80 en 0,5 g L-cysteïne in 1 l DW.
- Pas de uiteindelijke pH (6,0 ± 0,2) van de oplossing aan met 6 N HCl vóór de toevoeging van 0,008% anilineblauw en 15 g agar. Autoclaaf het medium bij 121 °C gedurende 15 minuten, koel af in een waterbad en giet in steriele petrischalen. Bewaar alle vers bereide media in steriele petrischalen bij 4 °C totdat ze nodig zijn.
- Glycerol voorraad van LAB culturen
- Bereid glycerolvoorraden (50% glycerol) door 100% glycerol in hetzelfde volume DW te verdunnen en steriliseer bij 100 °C gedurende 30 minuten met behulp van een droge sterilisatiecyclus. Koel de glycerolvoorraden af op RT en bewaar ze aseptisch voor verder gebruik.
- Gebruik bacteriegroei (een enkele kolonie L. bulgaricus verkregen met behulp van het ontwikkelde QC-protocol) uit nachtculturen.
- Pipetteer 500 μL van de nachtculturen in 50% glycerol in een centrifugebuis van 2 ml en meng ze voorzichtig met elkaar. Vries de glycerolbouillon met de LAB-culturen in en bewaar deze bij een ultralage temperatuur van -80 °C totdat het nodig is.
OPMERKING: Een grafisch schema van het protocol voor de kwaliteitscontrole en activering van LAB-culturen wordt weergegeven in figuur 1.
| Nee | Productcode | Monster | Bron | Bacteriële samenstelling zoals gelabeld1 |
| 1 | S9 | Pure industriële soort | Bulgarije | Lb. bulgaricus |
| 2 | LB6 | Pure industriële soort | Bulgarije | Lb. bulgaricus, |
| 3 | ATCC 11842 | Pure industriële soort | Atcc | Lb. bulgaricus |
| 4 | KAUW | Yoghurt | Verenigde Staten van Amerika | Lb. bulgaricus, andere levende cultuur |
| 5 | E22 | Yoghurt | Verenigde Staten van Amerika | Lb. bulgaricus, andere levende cultuur |
| 6 | Reuteri | Yoghurt | Verenigde Staten van Amerika | Limosilactobacillus reuteri |
| 1Lb. = Lactobacillus | ||||
Tabel 1: Probiotische stammen. De tabel geeft een overzicht van de probiotische stammen die in deze studie worden gebruikt.
2. Protocol voor de activering en kwaliteitscontrole van LAB-culturen
- Neem de bereide glycerolvoorraad labstammen (in 2 ml centrifugebuizen) uit de ultralage vriezer van -80 °C en laat ze niet ontdooien voor gebruik.
- Reinig en desinfecteer de opening van de centrifugebuizen met 70% alcohol en vortex voorzichtig voor gebruik.
- Pipetteer ongeveer 250 μL (0,25 ml) van de stock LAB-cultuur van de centrifugebuizen in verse 2 ml MRS-reageerbuizen.
- Vortex voorzichtig, parafilm de reageerbuizen en incubeer ze anaëroob gedurende 12-16 uur bij 42 °C.
- Neem ongeveer 500 μL (0,5 ml) uit de 's nachts gekweekte culturen uit de 2 ml MRS-reageerbuizen in verse 7 ml MRS-reageerbuizen, vortex en incubeer ze anaëroob gedurende 42 °C gedurende 12-16 uur.
- Beoordeel de microbiële groei door de optische dichtheid (OD) of groei van de culturen bij 610 nm te meten met een UV-zichtbare spectrofotometer en registreer acceptabele resultaten tussen 0,7 en 0,9.
- Strooi de nachtculturen uit de 7 ml MRS-buizen op MRS- en MRCM-PYR-agarplaten en incubeer ze anaëroob gedurende 72 uur bij 42 °C.
- Pluk geïsoleerde kolonies uit de agarplaten, breng ze over in verse MRS-reageerbuizen van 7 ml, vortex voorzichtig en incubeer ze anaëroob een nacht bij 42 °C gedurende 12-16 uur.
- Bewaar de agarplaten met de geïsoleerde stammen bij 4 °C gedurende een week in de koelkast.
- Meet en bevestig de OD (tussen 0,7 en 0,9) van de 7 ml MRS-reageerbuizen van de LAB-culturen geïsoleerd uit de gestreepte platen bij 610 nm en gebruik ze als werkculturen voor alle gerelateerde experimenten.
- Voer tienvoudige verdunningen (serieel verdund) uit van de gekweekte LAB-culturen uit de laatste 7 ml MRS-reageerbuizen met behulp van 9 ml peptonwater (een fysiologische buffer) om een verhouding van 1:10 te verkrijgen.
- Neem ten slotte ongeveer 250 μL (0,25 ml) uit geschikte seriële verdunningen voor alle fermentatie-experimenten.
- Activeer de bouillonhoudende stammen (250 μL) vanaf stap 2.12 door ze over te brengen in verse 7 ml MRS-bouillon en ze anaeroob te incuberen bij 42 °C gedurende 16 uur.
- Ga verder met het herhalen van stappen 2.6-2.12 om levensvatbare en superieure celgroei uit LAB-culturen te garanderen.
OPMERKING: Alle L. bulgaricus-stammen werden geactiveerd in de vers bereide MRS-bouillon en werden vervolgens anaëroob geïncubeerd bij 42 °C gedurende 16 uur om een optische dichtheid (OD610 nm) van bacteriegroei tussen 0,7 en 0,9 te bereiken. Bacteriegroei werd gemeten met een UV-zichtbare spectrofotometer bij 610 nm. De pH-waarden van de nachtculturen lagen in het bereik van 3,5 tot 5,3 als gevolg van de productie van melkzuur, een organisch eindproduct van LAB-fermentatie. Veiligheidsprocedures zoals een goede luchtstroomcirculatie in de bioveiligheidskap en het vermijden van brandwonden tijdens het gebruik van de bunsenbrander werden nageleefd en nageleefd.
Figuur 1: Een grafisch schema van het protocol voor de activering van melkzuurbacteriën (LAB) culturen. Het schema biedt details en de basisinstrumenten die nodig zijn voor de behandeling en activering van LAB-kweekstammen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De celgroei van de geëvalueerde LAB-stammen gekweekt met het kwaliteitscontroleprotocol was significant anders (P < 0,05) dan de stammen die zonder dit standaardprotocol werden gekweekt. Het QC-protocol voor zowel L. bulgaricus als L. reuteri gebruikte een multi-subculturing-benadering (drie keer subcultureren voordat er op agarplaten werd gestreept), terwijl de controleprocedure slechts één keer subcultureren had gedaan met alle andere omstandigheden constant gehouden. De koloniegroei was ook hoger en goed gedefinieerd op de groeimediaplaten die werden gekweekt met behulp van dit standaard QC-protocol. Dit bevestigde de effectiviteit van het protocol bij het waarborgen van verbeterde LAB-groei door celdeling in de fermentatieve bouillon, waardoor het verbeterde celmetabolisme in de LAB-stammen werd bevorderd. De groei van twee soorten gekweekt met en zonder het ontwikkelde kwaliteitscontroleprotocol is weergegeven in figuur 2. De stammen werden op agarplaten gestreept nadat intense groei (0,7-0,9 bij OD610 nm) was waargenomen en gemeten. De platen werden anaëroob geïncubeerd bij 42 °C gedurende 72 uur, waarna discrete kolonies werden waargenomen langs de lijnen van streaking. Een andere studie (figuur 3) bevestigde de efficiëntie van het kwaliteitscontroleprotocol op de groei van Lactobacillus reuteri gekweekt in TPY-medium en geïncubeerd bij 37 ° C, waarbij kolonies gegenereerd door de QC-protocoltechniek een stabiele steady-state groei bevestigden (gemiddeld 0,9 bij OD610 nm) op basis van historische gegevens. Een controlemethode van LAB-activering zonder meervoudige subkweek die geen gebruik maakte van de ontwikkelde QC-techniek resulteerde in een ongelijk groeipatroon (0,9-0,75 bij OD610 nm) van L. reuteri.
Figuur 2: Koloniale morfologie van de groei van L. bulgaricus stammen gekweekt met en zonder het ontwikkelde kwaliteitscontroleprotocol. De stammen werden gestreept in drievoud en werden anaëroob geïncubeerd bij 42 °C gedurende 72 uur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Gedrag van L. reuteri over een periode na groei in TPY-medium bij 37 °C met behulp van het gestandaardiseerde QC-protocol en de conventionele methode van bacteriële kweek (P < 0,05). De groei van L. reuteri werd periodiek gedurende een maand gemonitord en werd afgestemd op historische gegevens van voorgaande jaren op basis van cultuuractivatie met het standaard QC-protocol. De foutbalken geven de standaarddeviatie van de OD-waarden aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De resultaten van alle stammen geëvalueerd met het kwaliteitscontroleprotocol en zonder het gebruik van het protocol waren hetzelfde, en als zodanig werden resultaten gepresenteerd die alleen verband hielden met stammen (S9 en LB6). De geactiveerde LAB-stammen hadden een superieure celgroei die werd gekenmerkt door een hoge intensiteit van celbiomassa, waardoor de MRS-fermentatieve bouillon in de reageerbuis11 troebel werd weergegeven. De waargenomen celgroei na kweekactivatie was duidelijk tussen 12 uur en 16 uur bij een anaerobe fermentatieve temperatuur van 42 °C. Er werd ook bevestigd dat de LAB-stammen die op basis van dit protocol werden geactiveerd, voortdurend hun koloniemorfologieën hadden getransformeerd als gevolg van de multi-subkweekprocedure12 met discrete kolonies zichtbaar langs de lijnen van strepen. Het controle-experiment maakte geen gebruik van dit standaardprotocol en werd slechts één keer gesubcultureerd; het vertoonde echter niet ook intense troebelheid in de fermentatieve bouillon, hoewel de groei nog steeds binnen het geaccepteerde bereik van 0,7-0,9 bij OD610 nm lag. Het was ook opmerkelijk dat het strepen van de controleculturen op de agarplaten en het anaëroob incuberen ervan onder dezelfde omstandigheden als de standaardprocedure alleen kleinere en minder kolonies afbeeldde in vergelijking met die waargenomen in het standaardprotocol13.
Dit kan worden toegeschreven aan de zwakke en niet-levensvatbare kenmerken van de LAB-cellen. Bijgevolg resulteert het concept van het meerdere keren subkweken van LAB-stammen en strepen op agarplaten dus in het genereren van nieuwe cellen door celdeling en uitwisseling van genetisch materiaal in de bacteriën. Dit verbetert de cellulaire en metabole functionaliteit en bevordert de groei van cellen tijdens fermentatieoperaties14. Bovendien worden gestreste en gewonde LAB-cellen ook hersteld op basis van de steady-state van groeiomstandigheden (voedingsbehoeften, pH en temperatuur) die hen in staat stellen zich gemakkelijk aan te passen en de volledige cel- en metabole functionaliteit te herwinnen6. Bovendien beperkt strikte naleving van dit protocol de besmetting van celculturen in grotere mate, waardoor alleen zuivere en superieure celkolonies worden geïsoleerd voor fermentatiedoeleinden. Herhaalde streaking en herstel van LAB-celculturen uit agarplaten leverden dus een verbeterde celwand op die zeer geschikt was voor metabole activiteiten zoals voor LAB-fermentatieoperaties15. Bovendien bevestigt de studie naar de groei van L. reuteri op basis van het ontwikkelde kwaliteitscontroleprotocol (figuur 3) hoe het subcultureren van LAB via kolonie-naar-kweekmethode een stabiele gestage groei oplevert bij het optimale groeibereik (0,9-1,0 OD610 nm) over een periode in vergelijking met subculturatie rechtstreeks van cultuur naar cultuur (conventionele methode), wat resulteerde in een sterke groei van 0,75 tot 0,9 bij OD610 nm . Het was ook duidelijk dat het QC-protocol na verloop van tijd consequent een stabiel bacteriegroeipatroon opleverde, met een standaarddeviatie (SD) van 0,1. De ongelijke groei van L. reuteri had echter zijn SD groter dan 0,1 als gevolg van de ongelijke groei van de bacteriële cellen. Dit ongelijke groeipatroon, zoals reeds vermeld, werd toegeschreven aan zwakke en gewonde cellen; dus de metabole functionaliteit van de cellen nam af tijdens de fermentatieperiode14. De huidige studie werd ook bevestigd door een eerdere studie van Ahmed et al.16 , waarbij L. reuteri in hun studie gedurende 8 weken bij 37 °C werd vermeerderd in trypticase pepton gistextract (TPY) agar medium. Een factor die bijdraagt aan de gestage groei van L. reuteri werd toegeschreven aan de methode van celkweek en kwaliteitscontroletechniek die nieuwe en superieur actieve culturen genereerde, zelfs na verschillende subculturerende activiteiten tijdens de onderzoeksperiode.
De kritieke stappen in dit protocol omvatten altijd het gebruik van nieuwe en minder dan een dag oude fermentatieve culturen en altijd het fermentatieve bouillon of groeimedium nieuw laten bereiden voor aanvang van de fermentatie, en het niet gebruiken van opgeslagen groeimedium omdat de sterkte en potentie van het medium afneemt gedurende een langere opslagperiode. Bij gebruik van stamculturen van -80 °C of -20 °C moeten de culturen aseptisch worden gehanteerd. Bovendien, als voorraadculturen zwak blijken te zijn als gevolg van koude schok uit de vriezer, is reanimatie als volgt vereist. Alleen lage concentraties (ongeveer 100 μL) van de stamculturen moeten worden ingeënt in de aangevulde fermentatieve bouillon (MRS) van ongeveer 2 ml voor pre-anaerobe incubatie gedurende ongeveer 6 uur voordat extra aangevulde MRS van ongeveer 5-6 ml wordt toegevoegd voor uiteindelijke anaerobe incubatie gedurende ongeveer 16 h17. In het geval van het gebruik van gelyofiliseerde of gevriesdroogde culturen, wordt het ten zeerste aanbevolen om de gevriesdroogde culturen te herstellen in 3 ml magere vloeibare melk en ze anaëroob te incuberen gedurende ongeveer 4-5 uur voordat ze worden ingeënt in de aangevulde fermentatieve bouillon zoals MRS. Deze processen zijn essentieel om de levensvatbaarheid van LAB-cellen te allen tijde te waarborgen13.
Een andere cruciale stap is om ervoor te zorgen dat de celgroei van fermentatieve culturen altijd binnen het groeibereik van 0,7-0,9 ligt, wat meestal bij OD610nm ligt. Dit is belangrijk omdat dat groeibereik wordt aanbevolen als de juiste log- of exponentiële fase van de bacteriegroeicurve17. Elke optische dichtheid (OD) waarde boven 1, is onnauwkeurig omdat dit bevestigt dat de fermentatieve culturen hun doodsfase hebben bereikt met de meeste dode cellen en accumulatie van giftig cellulair afval voornamelijk aanwezig in het fermentatieve medium. In het geval van het bereiken van een OD-waarde boven 1 (OD610nm > 1)., wordt aanbevolen om de culturen 2 of 3-voudig of meer te verdunnen totdat deze een OD-waarde van minder dan 1 (OD610nm < 1) 18 bereikt. Een ander punt van zorg is om de gestreepte platen op de juiste manier anaëroob te incuberen met de fermentatieve culturen. Hoewel de meeste LAB facultatieve anaëroben zijn, is de verbeterde groei beperkt in de aanwezigheid van zuurstof; vandaar dat de voorkeur voor anaerobe omstandigheden nodig is om efficiënte groei te bevorderen. Het wordt aanbevolen om een CO2-kamer of een geïmproviseerd vat te gebruiken dat CO2 kan genereren tijdens de incubatietijd bij 42 °C. Voor de beste celgroeiresultaten op geïncubeerde platen wordt 72 uur aanbevolen voor optimale resultaten18.
Er zijn echter geen beperkingen aan deze standaardprocedure, omdat strikte naleving van de stappen zal zorgen voor levensvatbare en zuivere LAB-cellen voor fermentatieve procedures. Het belang van dit standaardprotocol is gebaseerd op de proactieve benadering om de levensvatbaarheid van probiotische cellen te waarborgen, vooral voor fermentatieve culturen. Het dient als een kwaliteitscontrolemechanisme dat verontreiniging probeert te elimineren en uiteindelijk sterke en zeer levensvatbare culturen te bevorderen die onder standaardomstandigheden wenselijke fermentatieopbrengsten kunnen produceren. Met betrekking tot bestaande of conventionele methoden elimineert dit standaardprotocol de kans op uitdagingen op de levensvatbaarheid van LAB-cellen (als gevolg van koude schokken en een slecht groeimedium) het probeert ook het eerste-tijd-juiste concept van het hebben van pure en levensvatbare probiotische culturen te garanderen, bespaart tijd en bevordert de productiviteit bij het werken met LAB-culturen.
De toekomstige toepassingen van deze techniek zijn enorm, omdat dit protocol kan worden gebruikt in zowel onderzoekslaboratoria, zuivel- en voedingsindustrieën, bioprocessing, fermentatie en biotechnologie-instituten. Het extra voordeel van dit protocol is gebaseerd op het simplistische karakter en vereist dus geen geavanceerd gebruik van laboratoriumapparatuur. Als zodanig kan dit protocol worden gebruikt voor demonstratie of pedagogisch leren op middelbare scholen met een basislaboratoriumomgeving om de interesse van studenten in wetenschap, technologie, engineering en wiskunde (STEM) gerelateerde gebieden aan te moedigen en op te bouwen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze publicatie is mede mogelijk gemaakt door subsidienummer NC. X-267-5-12-170-1 van het National Institute of Food and Agriculture (NIFA) en deels door NIZO Food Research BV, Nederland, Jarrow Formulas, VS, en het Department of Family and Consumer Sciences en het Agriculture Research Station aan de North Carolina Agriculture and Technical State University (Greensboro, NC, USA 27411). Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door subsidienummer 1890 van het Capacity Building Program (2020-38821-31113/projecttoetreding nr. 021765). Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door het Bulgaarse ministerie van Onderwijs en Wetenschap in het kader van het nationale onderzoeksprogramma 'Gezond voedsel voor een sterke bio-economie en kwaliteit van leven', goedgekeurd door DCM # 577 / 17.08.2018.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline Blue | Thermo Scientific | R21526 | 25 g |
| Beef extract | Research Products International | 50-197-7509 | 500 g |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Calcium Chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | 500 g |
| Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP350500 | 500 g |
| D-Fructose | ACROS Organics | AC161355000 | 500 g |
| Difco agar powder | Difco | DF0812-07-1 | 2 kg |
| TPY agar | Difco | 211921 | 500 g |
| Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock) | Fisher Scientific | 05-402-12 | 2 mL |
| Glycerol | Thermo Scientific | PI17904 | 500 mL |
| Infrared CO2 Incubator | Forma Scientific | ||
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 11842 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | S9 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | LB6 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | DAW | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | E22 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | RD2 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Maltose monohydrate | Fisher Scientific | M75-100 | 100 g |
| MRS broth | Neogen | 50-201-5691 | 5 kg |
| Peptone No. 3 | Hach | 50-199-6719 | 500 g |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Research Products International | 50-712-761 | 500 g |
| Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | S220-1 | 1 kg |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | 1 kg |
| Sodium pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | 100 g |
| Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps | Fisher Scientific | FB70125150 | 25 x 150 mm |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | 500 mL |
| Ultra low freezer | So-Low | ||
| Uracil | ACROS Organics | AC157301000 | 100 g |
| UV- visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Evolution 201 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | ||
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Ethanol | Fisher Scientific | T08204K7 | 4 L |
| Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical) | Fisher Scientific | SA56-500 | 500 mL |
References
- Karakas-Sen, A., Karakas, E. Isolation, identification and technological properties of lactic acid bacteria from raw cow milk. Bioscience Journal. 34 (2), 385-399 (2018).
- Martin, R., Langella, P. Emerging health concepts in the probiotics field: Streamlining the definitions. Frontiers in Microbiology. 10, 1047 (2019).
- Sadishkumar, V., Jeevaratnam, K. In vitro probiotic evaluation of potential antioxidant lactic acid bacteria isolated from idli batter fermented with Piper betle leaves. International Journal of Food Science & Technology. 52 (2), 329-340 (2017).
- Ayivi, R. D., et al. Lactic acid bacteria: Food safety and human health applications. Dairy. 1 (3), 202-232 (2020).
- Quinto, E. J., et al. Probiotic lactic acid bacteria: A review. Food and Nutrition Sciences. 5 (18), 1765-1775 (2014).
- Hayek, S. A., Gyawali, R., Aljaloud, S. O., Krastanov, A., Ibrahim, S. A. Cultivation media for lactic acid bacteria used in dairy products. Journal of Dairy Research. 86 (4), 490-502 (2019).
- Bintsis, T. Lactic acid bacteria as starter cultures: An update in their metabolism and genetics. Aims Microbiology. 4, 665-684 (2018).
- Shao, Y., Gao, S., Guo, H., Zhang, H. Influence of culture conditions and preconditioning on survival of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus ND02 during lyophilization. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1270-1280 (2014).
- Aryana, K. J., Olson, D. W. A 100-year review: Yogurt and other cultured dairy products. Journal of Dairy Science. 100 (12), 9987-10013 (2017).
- Kandil, S., El Soda, M. Influence of freezing and freeze-drying on intracellular enzymatic activity and autolytic properties of some lactic acid bacterial strains. Advances in Microbiology. 5 (6), 371-382 (2015).
- Malairuang, K., Krajang, M., Sukna, J., Rattanapradit, K., Chamsart, S. High cell density cultivation of Saccharomyces cerevisiae with intensive multiple sequential batches together with a novel technique of fed-batch at cell level (FBC). Processes. 8 (10), 1321 (2020).
- Jeanson, S., Floury, J., Gagnaire, V., Lortal, S., Thierry, A. Bacterial colonies in solid media and foods: A review on their growth and interactions with the micro-environment. Frontiers in Microbiology. 6, 1284 (2015).
- Oyeniran, A., et al. A modified reinforced clostridial medium for the isolation and enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus in a mixed culture. Journal of Dairy Science. 103, 5030-5042 (2020).
- Iguchi, A., et al. Effects of repeated subculturing and prolonged storage at room temperature of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 on pulsed-field gel electrophoresis profiles. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 3079-3081 (2002).
- Hayek, S. A., Ibrahim, S. A. Current limitations and challenges with lactic acid bacteria: a review. Food and Nutrition Sciences. 4 (11), 73-87 (2013).
- Ahmed, S. A., Ibrahim, S. A., Kim, C., Shahbazi, A. Significance of bile salt tolerant Lactobacillus reuteri. Proceedings of the 2007 National Conference on Environmental Science and Technology. , Springr, NY. 17-23 (2009).
- Gyawali, R., et al. A comparative study of extraction techniques for maximum recovery of β-galactosidase from the yogurt bacterium Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Research. 87 (1), 123-126 (2020).
- Nwamaioha, N. O., Ibrahim, S. A. A selective medium for the enumeration and differentiation of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Science. 101 (6), 4953-4961 (2018).
