Summary
O presente protocolo descreve a canonização aórtica e a perfusão retrógrada do coração murino neonatal ex-vivo . Uma estratégia de duas pessoas, usando um microscópio de dissecação e uma agulha de bitola pequena, permite a cannulação confiável. A quantificação da tensão contítil longitudinal é alcançada usando um transdutor de força conectado ao ápice do ventrículo esquerdo.
Abstract
O uso do coração perfumado ex-vivo tem sido uma pedra angular da investigação isquemia-reperfusão desde o seu desenvolvimento por Oskar Langendorff há mais de um século. Embora essa técnica tenha sido aplicada a camundongos nos últimos 25 anos, seu uso nesta espécie tem sido limitado a animais adultos. O desenvolvimento de um método bem-sucedido para cannular consistentemente a aorta murina neonatal permitiria o estudo sistemático do coração isolado perfusado retrógrado durante um período crítico de desenvolvimento cardíaco em uma espécie geneticamente modificável e de baixo custo. A modificação da preparação de Langendorff permite a canulação e o estabelecimento de reperfusão no coração murino neonatal, minimizando o tempo isquêmico. A otimização requer uma técnica de duas pessoas para permitir a cannulação bem sucedida da aorta do rato recém-nascido usando um microscópio de dissecação e uma agulha modificada comercialmente disponível. O uso desta abordagem estabelecerá de forma confiável a perfusão retrógrada dentro de 3 minutos. Como a fragilidade do coração do camundongo neonatal e o tamanho da cavidade ventricular impedem a medição direta da pressão intraventricular gerada usando um balão, é necessário o uso de um transdutor de força conectado por uma sutura ao ápice do ventrículo esquerdo para quantificar a tensão contratitil longitudinal. Este método permite aos pesquisadores estabelecer com sucesso uma preparação isolada de coração murino de fluxo constante, permitindo o estudo da biologia cardíaca do desenvolvimento de forma ex-vivo . É importante ressaltar que este modelo será uma poderosa ferramenta para investigar as respostas fisiológicas e farmacológicas à isquemia-reperfusão no coração neonatal.
Introduction
Os preparativos do coração ex-vivo têm sido um grampo de estudos fisiológicos, fisiopatológicos e farmacológicos há mais de um século. Decorrente do trabalho de Elias Cyon na década de 1860, Oskar Langendorff adaptou o modelo isolado de sapo para perfusão retrógrada, pressurizando a raiz aórtica para fornecer fluxo coronário com um perfusado oxigenado1. Usando sua adaptação, Langendorff foi capaz de demonstrar uma correlação entre circulação coronária e função mecânica2. O ex-vivo coração retrógrado perfumado, mais tarde homônimo apelidado de técnica Langendorff, tem permanecido uma pedra angular da investigação fisiológica, aproveitando sua simplicidade para estudar poderosamente o coração isolado na ausência de potenciais confundidores. A preparação de Langendorff foi modificada ainda mais para permitir que o coração ejete (o chamado "coração de trabalho") e permita que o perfusato recircular3. No entanto, os principais pontos de interesse fisiológicos permaneceram inalterados. Tais pontos finais incluem medidas de função contratil, condução elétrica, metabolismo cardíaco e resistência coronariana4.
Para avaliar a função cardíaca em sua preparação cardíaca original, Langendorff mediu a tensão gerada pela contração ventricular no eixo longitudinal usando uma sutura conectada entre o ápice do coração e um transdutor de força. 5 A contração isométrica foi quantificada desta forma com tensão basal aplicada ao coração na ausência de preenchimento ventricular. O refinamento da abordagem levou a balões cheios de fluidos colocados no ventrículo esquerdo através do átrio esquerdo para avaliar o desempenho do miocárdio durante a contração isovolumica6. Para avaliar o ritmo cardíaco e a frequência cardíaca, os condutores de superfície podem ser colocados nos polos do coração para permitir que os investigadores gravem o eletrocardiograma. No entanto, pode-se esperar bradicardia relativa, dada a denervação obrigatória. O ritmo extrínseco pode servir para superar isso e eliminar a variabilidade da frequência cardíaca entre os experimentos1. Outra medida de desfecho, o metabolismo do miocárdio, pode ser avaliada medindo o teor de oxigênio e substrato metabólico no perfusato coronário e efluente e calculando a diferença entre eles7. A quantificação de lactato no efluente coronário pode auxiliar na caracterização de períodos de metabolismo anaeróbico como é visto com hipóxia, hipoperfusão, isquemia-reperfusão ou perturbações metabólicas7.
O trabalho original de Langendorff possibilitou o estudo do coração mamífero ex-vivo, usando gatos como tema principal5. A avaliação do coração de rato isolado ganhou popularidade em meados da década de 1900 com Howard Morgan, que detalhou o modelo de rato "coração de trabalho" em 19675. O uso de camundongos começou há apenas 25 anos devido à complexidade técnica, fragilidade tecidual e tamanho relativamente pequeno do coração murino. Apesar dos desafios associados ao estudo dos camundongos, os custos mais baixos e a facilidade da manipulação genética aumentaram o apelo e a demanda de tais preparações ex-vivo murinas. Infelizmente, a aplicação da técnica tem sido limitada a animais adultos, com camundongos juvenis de 4 semanas de idade sendo os mais jovens utilizados para o estudo ex-vivo até recentemente 8,9. Embora os camundongos juvenis sejam "relativamente imaturos" em comparação com os adultos, sua utilidade como sujeitos para estudos de biologia do desenvolvimento é limitada porque eles têm, em geral, desmamado de sua represa de nascimento e em breve começará a puberdade10. A adolescência ocorre muito além da transição pós-natal na utilização do substrato miocárdio de glicose e lactato para ácidos graxos11. Assim, a maioria das informações sobre as mudanças metabólicas no coração neonatal tem historicamente resultado de trabalhos ex-vivos em espécies maiores, como coelhos ecobaias 11.
De fato, existem abordagens alternativas para a preparação de Langendorff. Estes incluem experimentação in vitro, que carece de dados e contexto funcionais de órgãos inteiros, ou estudos in vivo. Isso pode ser tecnicamente desafiador e complicado confundindo variáveis como os efeitos cardiovasculares e respiratórios de um agente anestésico necessário, a influência da entrada neurohumoral, as consequências da temperatura do núcleo, o estado nutricional do animal e a disponibilidade desubstratos 12,13. Como a abordagem de Langendorff permite o estudo do coração isolado perfumado de forma ex-vivo de forma mais controlada na ausência de tais confundimentos, tem sido e continua a ser considerado uma poderosa ferramenta investigativa. Portanto, a técnica aqui apresentada dá aos pesquisadores uma abordagem experimental para o estudo ex-vivo do coração murino recém-nascido e limita o tempo para a reperfusão.
Investigar o coração durante períodos de desenvolvimento é uma consideração importante, dadas as amplas transições bioquímicas, fisiológicas e anatômicas que ocorrem durante o amadurecimento do miocárdio. Mudanças do metabolismo anaeróbico para a fosforilação oxidativa, alterações na utilização do substrato e progressão da proliferação celular para a hipertrofia são processos dinâmicos que ocorrem exclusivamente no coração imaturo11,14. Outro aspecto crítico do coração em desenvolvimento é que os estressores encontrados durante os períodos necessários podem produzir respostas elevadas no coração recém-nascido e alterar a suscetibilidade futura a insultos na idade adulta15. Embora o trabalho anterior tenha utilizado ratos, cordeiros e coelhos recém-nascidos para estudar o coração neonatal perfusado de Langendorff, os avanços que permitem o uso de camundongos são necessários dada a importância desta espécie para a pesquisa de biologia do desenvolvimento16. Para atender a essa necessidade, o primeiro modelo de coração recém-nascido perfusado por Murine Langendorff usando animais de 10 dias de idade foi recentemente estabelecido6. Apresentado aqui é um método para permitir a canulação aórtica bem sucedida e estabelecer perfusão retrógrada do coração murino recém-nascido isolado. Essa abordagem pode ser utilizada para farmacologia, isquemia-reperfusão ou estudos de metabolismo com foco em toda a função do órgão ou pode ser adaptada para o isolamento de cardiomiócitos.
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Protocol
As aprovações do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro Médico da Universidade de Columbia foram obtidas para todos os métodos descritos. No estudo, foram utilizados 10 camundongos do pós-natal masculino do tipo selvagem 10 camundongos.
1. Preparação do aparelho Langendorff
- Para minimizar a complexidade, use perfusato oxigenado não recirculante dentro do aparelho Langendorff (ver Tabela de Materiais) através de fluxo constante ou pressão constante.
- Use tampão Krebs-Henseleit (KHB), contendo 120 mmol/L de NaCl, 4,7 mmol/L de KCl, 1,2 mmol/L de MgSO4, 1,2 mmol/L de KH2PO4, 1,25 mmol/L de CaCl2, 25 mmol/L de NaHCO3, e 11 mmol/L de glicose no pH 7.4 (ver Tabela de Materiais), equilibre-se com 95% de O2 e 5% de CO2 dentro do aparelho Langendorff e mantenha a 37 °C.
- Para a abordagem de fluxo constante, mantenha uma taxa de fluxo contínua em ~2,5 mL∙min-1.
NOTA: Esta taxa de fluxo irá aproximar o fluxo coronário de ~75-80 mL/g∙min, dado que o peso médio de um coração de rato de 10 dias de idade (P10) é de ~30mgs 17,18.
2. Fabricação de cânula aórtica
- Fabricar a cânula aórtica do rato recém-nascido a partir de uma agulha de aço inoxidável de 26 G (ver Tabela de Materiais). Usando uma tesoura afiada, corte a ponta da agulha para cortar a ponta. Tome cuidado para não amassar ou restringir o diâmetro do lúmen agulha. Suavize a borda de corte e remova as brocas raspando suavemente a extremidade emarada no banco do laboratório usando um movimento de ida e volta.
NOTA: As brocas microscópicas e as bordas afiadas devem ser removidas porque podem rasgar a aorta do rato recém-nascido e danificar a válvula aórtica. Alternativamente, use lixa de grão fino. - Conecte a cânula fabricada ao aparelho Langendorff e avalie o fluxo e a resistência. Meça as taxas de fluxo através da cânula coletando e medindo a quantidade de buffer durante um período de tempo conhecido. Certifique-se de que o fluxo real seja igual à taxa de fluxo definida de 2,5 mL min-1.
- Quantifique o diferencial de pressão através da cânula com khb fluindo seguindo os passos abaixo.
- Meça a pressão no sistema com e sem a cânula fabricada anexada.
- Divida o diferencial de pressão através da cânula pela taxa de fluxo para obter resistência à cânula conforme a lei15 de Ohm.
- Certifique-se de que a resistência à cânula fabricada compreende ~16,0 ± 1,9 mmHg∙minmin∙mL-1 da resistência total6. Resistência excessiva sugere um lúmen de cânula potencialmente comprometido.
NOTA: Cálculo da amostra: Pcom cânula - P sem cânula = ΔP. Se Pcom = 48 e Psem = 8, então ΔP = 40. Em uma taxa de fluxo (Q) de 2,5 mL min-1 e ΔP de 40 resistência à cânula é igual a 16 mmHg∙min∙mL-1 usando R = ΔP/Q = 40 / 2,5 = 16.
- Remova a cânula de 26 G e conecte o tubo de alta pressão (ver Tabela de Materiais) ao local da cannula no aparelho Langendorff. Coloque a cânula aorítica na extremidade distal da tubulação. Desarme o tubo e a cânula com tampão oxigenado, garantindo que todas as bolhas sejam removidas.
NOTA: O uso de tubos de alta pressão desta forma permite que a cânula seja estendida para uma posição mais remota. Isso é necessário para permitir a canulação aórtica com um microscópio dissecando adjacente à configuração (Figura 1).
3. Colheita de órgãos
- Camundongos anticoagulados através de injeção intraperitoneal (IP) de heparina (10 kU/kg) (ver Tabela de Materiais) para evitar a formação de microtrombibi coronariano usando uma agulha de 26 G em seringa de 1 mL. Deixe vários minutos para que a heparina circule antes de prosseguir com a injeção de qualquer anestésico.
- Anestesiar o animal com uma injeção ip usando uma agulha de 26 G em seringa de 1 mL.
NOTA: É essencial monitorar cuidadosamente o animal após a injeção anestésico para evitar apneia e hipoxia subsequente. Pentobarbital (70 mg/kg) é uma escolha confiável de anestésico, pois permite o início rápido da sedação sem induzir apneia19,20. Outros agentes anestésicos podem ser utilizados, desde que as doses utilizadas não causem apneia21. Os pesquisadores devem considerar os efeitos de sedativos-hipnóticos alternativos na função cardíaca22,23. A luxação cervical como um modo primário de eutanásia pode prolongar a hipoxia pré-cannulação e isquemia. - Coloque o rato na posição supina e proteja os membros imediatamente após a perda de consciência. Use agulhas hipodérmicas de pequeno calibre para fixar cada membro. Comece a colher assim que o animal não responder ao dedo do dedo do dedo do pedaço; o animal deve respirar espontaneamente durante a dissecção inicial.
- Faça uma incisão subxifóide transversal através da largura do animal para expor a cavidade abdominal usando tesouras dissecando reta (ver Tabela de Materiais).
NOTA: A técnica estéril não é necessária, uma vez que o procedimento representa cirurgia não-sutar.- Identifique o diafragma superiormente e incise a parte anterior completamente. Corte a caixa torácica bilateralmente ao longo da linha do meio do axilar em uma direção cefálica. Peça a um assistente para agarrar o processo xifoide com fórceps e refletir o esterno e as costelas cranialmente para expor os órgãos torácicos.
- Identifique a infra-diafragmática veia cava inferior (IVC) acima do fígado. Transecte o IVC com uma tesoura de íris curvada mantendo leve tensão anterior e cefálica no segmento proximal com fórceps de íris (ver Tabela de Materiais).
- Corte posteriormente ao longo da superfície anterior da coluna usando uma tesoura de íris curva enquanto puxa o IVC para cima e para fora da cavidade torácica. À medida que o coração é mobilizado, angule a tesoura anteriormente e corte os grandes vasos superiormente para remover completamente o coração e os pulmões.
NOTA: Este método permite a rápida explantação do coração e dos pulmões em bloco.
- Corte posteriormente ao longo da superfície anterior da coluna usando uma tesoura de íris curva enquanto puxa o IVC para cima e para fora da cavidade torácica. À medida que o coração é mobilizado, angule a tesoura anteriormente e corte os grandes vasos superiormente para remover completamente o coração e os pulmões.
- Submerse imediatamente o espécime em KHB gelado ou soro fisiológico. O coração deve parar de bater em segundos.
4. Cannulação
- Corte um pedaço de papel toalha e coloque-o no fundo de uma placa de Petri rasa para fornecer atrito para estabilizar o coração durante a cannulação. Umedeça com khb gelado para evitar que o coração aduste a ele.
- Coloque a placa de Petri preparada sob o microscópio de dissecação e ajuste o foco. Coloque a cânula aórtica presa à tubulação de extensão de alta pressão sob o microscópio de dissecação, juntamente com uma sutura de seda 5-0 vagamente amarrada ao redor de seu hub (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Deve-se tomar cuidado para limitar a quantidade de fluido na placa de Petri, pois os pulmões cheios de ar podem flutuar e fazer com que os órgãos excisados se movam.
- Coloque a placa de Petri preparada sob o microscópio de dissecação e ajuste o foco. Coloque a cânula aórtica presa à tubulação de extensão de alta pressão sob o microscópio de dissecação, juntamente com uma sutura de seda 5-0 vagamente amarrada ao redor de seu hub (ver Tabela de Materiais).
- Coloque os órgãos torácicos extirpados na placa de Petri. Sob o microscópio, identifique o timo pelo brilho branco e dois lóbulos e oriente o espécime de tal forma que o timo seja anterior e superior24. Isso garantirá a orientação adequada do coração.
- Usando fórceps, separe sem rodeios para expor os grandes vasos. Identifique a aorta localizando características distintas de ramificação do arco aórtico.
NOTA: Uma tonalidade roxa escura frequentemente demarca o ventrículo direito e a artéria pulmonar. A aorta ascendente está localizada entre a artéria pulmonar principal e o átrio direito. - Transectar a aorta com uma tesoura fina afiada (ver Tabela de Materiais) apenas proximal à decolagem da artéria subclávia.
NOTA: Se a aorta estiver transectada muito perto da válvula aórtica, não haverá tecido aórtico suficiente para permitir que a cânula seja presa. Alternativamente, se a aorta for transectada muito alta, o perfusato pode vazar de um ou mais ramos aórticos (como a artéria subclávia). - Segure suavemente a aorta transectada usando fórceps finos curvos no estilo joalheiro (ver Tabela de Materiais). Cannula cuidadosamente a aorta com uma agulha cega de 26 G, tomando cuidado para não danificar a válvula aórtica. Segure-se no lugar, agarrando a aorta com as fórceps curvas finas ao redor da cânula. Uma vez estabelecido o controle da aorta, inicie a perfusão retrógrada para limitar o tempo isquêmico.
NOTA: O coração deve começar a bater e ficará pálido à medida que o sangue é drenado do miocárdio e o KHB perfusa as artérias coronárias. A não batida espontânea, a presença de engorgement ventricular ou a falta de mudança de cor do coração indica uma cânula mal posicionada. - Peça ao assistente para agarrar as extremidades da sutura frouxamente amarrada e prender cuidadosamente a aorta ao redor da cânula. Cintile a sutura acima ou abaixo das fórceps finos curvados (segurando a cânula no lugar), dependendo da quantidade de tecido aórtico e considerações anatômicas. Aperte a sutura e confirme a adequação do fluxo coronário.
- Desconecte a tubulação de alta pressão do aparelho Langendorff. Segure o cubo da cânula e desconecte a agulha cega da tubulação de extensão de alta pressão. Conecte rapidamente o cubo da cânula ao aparelho.
NOTA: Deve-se tomar cuidado para não desalojar o coração ou entrar ar na cânula. - Uma vez que o coração é pendurado no aparelho Langendorff na posição usual, e a perfusão adequada é confirmada, corte cuidadosamente o pulmão, timo e excesso de tecido. Incisar o átrio direito para permitir que o efluente do seio coronário escorra livremente.
5. Medição funcional
- Faça um pequeno nó no final de uma sutura de seda 5-0 (presa a uma agulha curva). Fure um pequeno pedaço de filme de parafina (2-3 mm x 2-3 mm) com a agulha e deslize a parafina até a extremidade atada. Passe cuidadosamente a agulha através do ápice do ventrículo e puxe a sutura através do coração até que o filme de parafina esteja confortável contra a parede lateral do ventrículo.
NOTA: O filme de parafina ajuda a evitar que o nó rasgue o coração e puxe o ventrículo. - Passe a agulha através da abertura da jaqueta de aquecimento cheia de água do aparelho Langendorff. O coração agora pode ser envolto e aquecido.
- Conecte a agulha ao transdutor de força (ver Tabela de Materiais) de tal forma que evite o gotejamento do seio coronário. Ajuste a sutura para aplicar 1-2 g de tensão basal, conforme indicado pela tensão diastólica ou nadir no rastreamento de tensão.
NOTA: Evite tirar o coração da cânula ou torcer a aorta, comprometendo assim a perfusão coronária. - Coloque eletrodos de superfície nos polos superiores e inferiores do coração para registrar o eletrocardiograma.
NOTA: Use fio de ritmo epicárdica temporário pediátrico com a agulha removida para eletrodo de superfície flexível conectado ao Bio Amp (ver Tabela de Materiais). - Prove o efluente do seio coronário para análise utilizando um cateter iv de 24 G (ver Tabela de Materiais).
- Subtraia a resistência à cânula da resistência total do sistema para obter resistência coronária pela lei25 de Kirchhoff.
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Representative Results
Os ratos P10 foram usados para modelar um ponto de tempo na infância humana26,27. Quinze corações isolados de camundongos C57Bl/6 foram colhidos e culados com sucesso. Corações foram perfundidos com um fluxo contínuo de 2,5 mL min-1 de KHB oxigenado aquecido. Foram medidos parâmetros metabólicos, incluindo extração de glicose, consumo de oxigênio, produção de lactato e parâmetros fisiológicos, como frequência cardíaca, pressão de perfusão e resistência coronariana. Eletrodos de superfície foram utilizados para registrar um eletrocardiograma contínuo, o que permitiu determinar a taxa e o ritmo intrínsecos (Figura 2). A força contratil no eixo longitudinal foi determinada utilizando-se o método descrito por Langendorff 28.
A avaliação metabólica foi realizada para avaliação da adequação da perfusão. A extração percentual de oxigênio foi calculada subtraindo o teor de oxigênio no efluente coronário do perfusado. O consumo de oxigênio miocárdio foi determinado pela multiplicação da taxa de fluxo coronária pela diferença no teor de oxigênio entre o efluente perfusado e o efluente coronário multiplicado pela solubilidade do oxigênio (assumindo 24 μL/mL de H2O a 37 °C e 760 mmHg)29,30. Utilizando esses cálculos, foi determinado que essa estratégia de perfusão atendia às necessidades metabólicas do coração do camundongo recém-nascido, dada a produção insignificante de lactato e baixa extração de oxigênio e consumo de glicose (Tabela 1).
Todos os corações batem espontaneamente em ritmo sinuso (Figura 2). Como esperado, no entanto, a média da frequência cardíaca intrínseca foi mais lenta do que as taxas cardíacas murinas recém-nascidas relatadas in vivo31. As pressões de perfusão aórtica observadas médias correlacionam-se bem com as pressões arterials médias descritas em camundongos neonatais32. Outras médias variáveis fisiológicas foram registradas e calculadas (Tabela 2).
Com base nos dados observacionais, precisam ser considerados critérios de exclusão para garantir a consistência da preparação neonatal (Tabela 3). Um fator que é fundamental para a robustez da preparação é o tempo necessário para iniciar a reperfusão. A canulação é de longe o passo mais desafiador do procedimento, dado o tamanho minúsculo e a fragilidade da aorta do camundongo neonatal. Um atraso prolongado no estabelecimento de cannulação ou início da reperfusão prejudicará o coração saudável ou até mesmo a pré-condição do miocárdio1. Assim, sugere-se minimizar o tempo isquêmico para menos de 4 min (consistente com as diretrizes para o coração de roedor adulto)1. Após a cannulação bem sucedida, a avaliação da adequação da perfusão é primordial. Sinais de perfusão miocárdia inadequada incluem arritmias prolongadas, extremos de frequência cardíaca ou extremos de pressão de perfusão aórtica.
Figura 1: Configuração de canulação aórtica. (A) A extremidade proximal da tubulação de alta pressão está anexada ao local de posição da cânula "usual" (mostrado em B). A cânula é anexada à extremidade distal do tubo (ampliada em C). (B) posição de cânula "usual" no aparelho. (C) A cânula é anexada à extremidade "slip-tip" do tubo de alta pressão para facilitar a remoção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O coração do rato neonatais ex-vivo retrógrado. Imagem de um coração de rato pós-natal de 10 dias após canulação aórtica bem sucedida com uma agulha de 26 G. Efluente coronário pode ser visto pingando do coração através de uma incisão no átrio direito. Eletrodos de superfície de aço inoxidável foram colocados nos polos para medir continuamente o eletrocardiograma. O rastreamento representativo do ECG é exibido à direita em verde, demonstrando um ritmo sinusal e uma taxa de 194 batidas min-1. Não está retratado a sutura conectada entre o ápice do coração e transdutor de força, permitindo a medição da força contratil ventricular (forma de onda retratada em vermelho à direita). Adaptado com permissão do Reference6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Parâmetro metabólico | Afluente | Efluente | Consumo | Extração |
| Glicose, mg·dL−1 | 194,3 ± 3,8 | 193,0 ± 5,5 | 1.4 ± 0,8 mg·dL−1 | |
| Lactato, mmol· L−1 | < 0,3 ± 0,0 | < 0,3 ± 0,0 | ||
| P02, mmHg | 641 ± 7,9 | 295 ± 18,4 | 28,2 ± 1,3 μL·min−1 | 55,7 ± 2,3% |
Tabela 1: Parâmetros metabólicos de corações murinos recém-nascidos perfumados isolados. Os valores são ± se. Foi amostrado e efluente coronário, e PO2 (pressão parcial de oxigênio), glicose e lactato foram medidos. Foram calculadas captações de glicose, extração de oxigênio e consumo. A diferença entre afluentes e efluentes determina a extração. O consumo é calculado como fluxo coronário x (PaO2- PvO2) x O2 solubilidade a 760 mmHg (assumindo 24 μL/mL de H2O a 37 °C e 760 mmHg).
| Parâmetro Fisiológico | Significar |
| Pressão de perfusão aoórtica, mmHg | 47.9 ± 6.9 |
| Resistência coronária, mmHg·min·mL−1 | 19.2 ± 2.8 |
| Frequência cardíaca, bate·min−1 | 226 ± 8,9 |
| Força contratil ventricular, g | 7.2 ± 1.2 |
Tabela 2: Parâmetros fisiológicos de corações murinos recém-nascidos perfumados isolados. Os valores são meios ± se. A resistência coronária foi calculada com base na taxa de fluxo coronária de 2,5 mL min-1 e pressão aórtica usando a lei de Ohm. De acordo com a lei de resistência de Kirchoff em série, a pressão aórtica foi calculada como pressão acima da resistência da linha de base no sistema. A frequência cardíaca foi medida através do eletrodo superficial, e a força conjuntura foi medida através de uma sutura ligando o ápice do coração a um transdutor de força. Esta tabela foi reimpressa com permissão do Reference6.
| Parâmetro Fisiológico | Limite de exclusão |
| Hora de reperfusão, min | >4 |
| Pressão de perfusão aoórtica, mmHg | <20 ou >75 |
| Frequência cardíaca, bate·min−1 | <150 ou >300 |
| Duração da arritmia, min | >3 |
Tabela 3: Critérios de exclusão propostos para preparações de coração murino neonatal Langendorff. Esta tabela foi reimpressa com permissão do Reference6.
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Discussion
O presente trabalho descreve a canonização aórtica bem sucedida e a perfusão retrógrada no coração isolado do camundongo recém-nascido. É importante ressaltar que permite aos pesquisadores superar as barreiras que a idade de murina jovem e o pequeno tamanho do coração apresentaram anteriormente8. Embora não seja complexa no design, a abordagem requer um grau significativo de habilidade técnica. Os principais passos que inevitavelmente desafiarão até mesmo os investigadores mais tecnicamente proficientes serão a canulação da aorta e a garantia da cânula no lugar. A dificuldade com a canulação neonatal não se deve apenas ao pequeno tamanho do lúmen aórtico. O comprimento relativamente curto da aorta ascendente (tecido aórtico entre a válvula aórtica e a decolagem subclávia direita) pode desafiar os investigadores a controlar precisamente a cânula aórtica e exigir uma coordenação cuidadosa entre os companheiros de equipe. A não posição adequada e a segurança da cânula nesta região podem arruinar a preparação. Por exemplo, o avanço da cânula muito profunda pode danificar a válvula aórtica ou resultar em cannulação intraventricular. Colocar a cânula muito rasa dentro do arco aórtico pode levar a vazamento perfusado de um dos ramos, como a artéria subclávia. Além disso, a cannulação forçada pode rasgar a aorta. Tais consequências da cannulação inartful se manifestarão com altas taxas de fluxo ou baixas pressões de perfusão1. Alternativamente, baixas taxas de fluxo ou altas pressões de perfusão podem indicar a presença de trombo, embolia de ar, oclusão da cânula ou obstrução coronária1. Arritmias, bradicardia ou taquicardia são todos sinais de perfusão inadequada, independentemente da etiologia 1,33.
Uma estratégia de perfusão comum e direta deve ser escolhida inicialmente; fluxo constante usando perfusato cristaloide tampão com glicose como substrato em um coração espontaneamente batendo1. As adaptações a essa abordagem precisarão ser avaliadas em trabalhos futuros e devem incluir uma avaliação do efeito de diferentes abordagens de perfusão e estratégias alternativas de perfusato e substrato. Embora a perfusão do miocárdio nesta preparação tenha se mostrado adequada para os corações P10, a taxa de fluxo escolhida pode exceder as necessidades do coração recém-nascido. Isso ocorre porque a saída cardíaca em camundongos de 10 dias é de aproximadamente 5,3 mL min-1 31. Assim, o trabalho futuro deve investigar o efeito de diferentes taxas de fluxo e avaliar estratégias de pressão constantes.
Abordagens constantes de pressão podem envolver mecanismos de ajuste de fluxo em tempo real ou uma válvula pop-off para limitar a pressão máxima5. Isso pode ser particularmente importante ao estudar a lesão isquemia-reperfusão, dada a importância de avaliar a autoregulação coronária neste contexto5. Além disso, enquanto a frequência cardíaca intrínseca pode ser usada como biomarcador para a adequação da perfusão, estratégias de ritmo provavelmente serão viáveis e devem ser investigadas no futuro. Finalmente, o trabalho futuro também deve avaliar substratos de energia alternativa no perfusato oxigenado. Isso porque o coração recém-nascido passa do uso de glicose e lactato para o consumo de ácidos graxos no período neonatal11,14. Assim, substratos metabólicos alternativos podem ser mais fisiologicamente relevantes neste período crítico de desenvolvimento.
Avanços metológicos para avaliar a função cardíaca murina continuam a surgir. Embora o número total de estudos de pesquisa usando a preparação de Langendorff tenha permanecido consistente a cada ano desde a década de 1990, o percentual de trabalho utilizando práticas ex-vivo específicas de murina tem subidoconstantemente 5. Assim, a importância do coração murino isolado como modelo científico tem aumentado ao longo do tempo. Inovações, como o método aqui descrito, agora permitem que o campo amplie a abordagem ao coração do rato recém-nascido. Além de sua utilidade na pesquisa isquemia-reperfusão, tal método também poderia servir como um adjunto para outros tipos de técnicas de pesquisa. Por exemplo, a canonização bem sucedida do coração do camundongo recém-nascido poderia facilitar o isolamento do cardiomiócito. Até o momento, apenas métodos de digestão 'chunk' com rendimentos mais baixos foram disponibilizados para isolar cardiomiócitos de camundongosrecém-nascidos 34. Portanto, o uso da preparação neonatal de Langendorff com uma infusão retrógrada de agentes enzimáticos pode melhorar o rendimento e a qualidade dos cardiomiócitos isolados35.
A resposta neonatal à lesão isquêmica não é igual à do adulto, e o coração imaturo passa por várias transições durante o período de recém-nascido15,36. No entanto, é necessário uma melhor compreensão da biologia do desenvolvimento do coração neonatal em saúde e doença. Os efeitos diferenciais da hipóxia, isquemia e reperfusão entre corações neonatais e adultos têm sido investigados desde a década de 1970. No entanto, esses trabalhos anteriores foram limitados ao uso de espécies animais maiores que o camundongo37. A capacidade de gerar mutantes transgênicos para estudar caminhos específicos e proteínas de interesse requer estabelecer uma preparação ex-vivo murina recém-nascida. O método aqui detalhado permite que a canulação aórtica bem sucedida estabeleça perfusão retrógrada do coração murino recém-nascido isolado. Usando essa abordagem, os pesquisadores poderão estudar isquemia-reperfusão no que se refere ao camundongo neonatal. Tais pesquisas nos ajudarão a entender melhor os mecanismos de proteção específicos do neonatal durante a isquemia, a resposta do recém-nascido à hipóxia e as alterações anatômicas e metabólicas no coração imaturo durante os estados de saúde e doença 36,38,39. Portanto, o modelo de coração recém-nascido perfumado isolado provará ser uma poderosa ferramenta para a pesquisa de biologia cardíaca do desenvolvimento.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
NIH/NINDS R01NS12706 (R.L.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rodent Langendorff Apparatus | Radnoti | 130102EZ | |
| 24 G catheter | BD | 381511 | |
| 26 G needle on 1 mL syringe combo | BD | 309597 | |
| 26 G steel needle | BD | 305111 | |
| 5-0 Silk Suture | Ethicon | S1173 | |
| Bio Amp | ADInstruments | FE135 | |
| Bio Cable | ADInstruments | MLA1515 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| Circulating heating water Bath | Haake | DC10 | |
| curved iris scissor | Medline | MDS10033Z | |
| dissecting microscope | Nikon | SMZ-2B | |
| find spring scissors | Kent | INS600127 | |
| Force Transducer | ADInstruments | MLT1030/D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Heparin | Sagent | 400-01 | |
| High pressure tubing | Edwards Lifesciences | 50P184 | |
| iris dressing forceps | Kent | INS650915-4 | |
| Jeweler-style curved fine forceps | Miltex | 17-307-MLTX | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911-25G | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662-25G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-25G | |
| Roller Pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| straight dissecting scissors | Kent | INS600393-G | |
| Temporary cardiac pacing wire | Ethicon | TPW30 | |
| Wide Range Force Transducer | ADInstruments | MLT1030/A |
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