Summary
L'obiettivo di questo documento di metodo è dimostrare una metodologia robusta e riproducibile per l'arricchimento, la generazione e l'espansione di linee cellulari tumorali primarie da mesotelioma pleurico resecato chirurgicamente.
Abstract
Mancano le attuali metodologie per l'espansione delle linee cellulari tumorali primarie da tipi di tumore rari. Questo protocollo descrive i metodi per espandere le cellule tumorali primarie dal mesotelioma pleurico maligno (MPM) resecato chirurgicamente fornendo una panoramica completa del processo dalla digestione all'arricchimento, all'espansione, alla crioconservazione e alla caratterizzazione fenotipica. Inoltre, questo protocollo introduce concetti per la generazione di tumori che possono essere utili per più tipi di tumore come la tripsinizzazione differenziale e l'impatto dei metodi di dissociazione sulla rilevazione di marcatori di superficie cellulare per la caratterizzazione fenotipica. Il principale limite di questo studio è la selezione di cellule tumorali che si espanderanno in un sistema di coltura bidimensionale (2D). Variazioni a questo protocollo, inclusi sistemi di coltura tridimensionali (3D), integratori di supporti, rivestimento di piastre per migliorare l'adesione e metodi di disaggregazione alternativi, potrebbero migliorare questa tecnica e il tasso di successo complessivo della creazione di una linea tumorale. Nel complesso, questo protocollo fornisce un metodo di base per stabilire e caratterizzare le cellule tumorali da questo raro tumore.
Introduction
Il mesotelioma pleurico maligno (MPM) è un tumore raro altamente associato all'esposizione all'amianto. Sebbene gli approcci basati sull'immunoterapia abbiano mostrato risultati incoraggianti, c'è una scarsità di opzioni di trattamento disponibili per i pazienti che sviluppano questa malattia e il tasso di sopravvivenza complessivo a 5 anni è basso 1,2. Sono in corso sforzi in più istituzioni per comprendere meglio questa malattia e identificare nuovi bersagli terapeutici che possono migliorare i risultati dei pazienti. Mentre ci sono più modelli murini di mesotelioma, l'accesso alle cellule tumorali del mesotelioma primario è più limitato3. L'espansione in vitro delle cellule tumorali del mesotelioma primario fornirebbe un prezioso sistema modello che può essere utilizzato per studiare direttamente le cellule tumorali e la loro interazione con le cellule immunitarie autologhe come i linfociti infiltranti il tumore. Mentre ci sono state segnalazioni sull'espansione delle linee di cellule tumorali del mesotelioma primario, queste sono poche e non forniscono una procedura operativa standard dettagliata (SOP). Inoltre, poche linee cellulari sono disponibili da fonti commerciali come American Type Culture Collection (ATCC). Mentre la disponibilità di linee tumorali primarie è limitata, è stato dimostrato che le cellule tumorali possono essere espanse da versamenti pleurici e direttamente dal tessuto tumorale 4,5. Inoltre, le linee cellulari tumorali espanse hanno dimostrato di preservare il profilo molecolare del tumore originale 4,5,6.
Il nostro laboratorio sta studiando il microambiente immuno-tumorale del MPM e ha sviluppato un metodo per espandere le linee primarie di cellule tumorali MPM da casi resecati chirurgicamente. Questo metodo è adattato dalla nostra esperienza nello stabilire linee cellulari tumorali di melanoma metastatico primario. L'obiettivo di questo lavoro è quello di fornire un approccio dettagliato e pratico all'espansione della linea tumorale del mesotelioma primario utilizzando un sistema di modelli 2D e la successiva profilazione fenotipica. Dato il recente successo delle strategie di blocco dei checkpoint mirate a CTLA4 e PD-1 nell'impostazione di prima linea2, la capacità di generare molte linee tumorali primarie potrebbe favorire la comprensione di entrambi i meccanismi intrinseci di resistenza del tumore e fornire un importante sistema modello per valutare il riconoscimento delle cellule T, approfondendo così la nostra comprensione della risposta immunitaria nel MPM.
Il principale limite di questo protocollo è che ogni tumore contiene un microambiente diverso e c'è un alto grado di variabilità del successo dell'espansione. Inoltre, questo metodo seleziona le cellule tumorali che possono espandersi in un sistema di coltura 2D. Altri metodi che prevedono la produzione di una coltura sferoide o organoide 3D potrebbero fornire un approccio alternativo che potrebbe consentire un più alto tasso di successo di espansione o comportare la capacità di derivare linee cellulari che non sono in grado di espandersi in un sistema 2D tradizionale. Tali colture 3D hanno dimostrato di essere utili per la generazione di tipi di tumore che sono difficili da espandere, ad esempio il cancro del pancreas7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institution Review Board (IRB) dell'Università del Texas MD Anderson Cancer Center. Ciò riguarda i tumori MPM standard-of-care, resecati chirurgicamente, rimossi a seguito del consenso informato.
1. Preparazione dei mezzi di digestione tumorale e di altri mezzi associati
- Per preparare i mezzi di digestione tumorale, aggiungere 5 ml di 100% Pen/Strep (Penicillina/Streptomicina) a 500 mL di mezzo sterile Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 in una cappa a flusso laminare.
- Trasferire il mezzo in un filtro sterile da 500 mL, 0,22 μm in polietersolfone (PES) per la filtrazione sotto vuoto.
NOTA: le fasi di filtrazione e aspirazione devono essere eseguite con una pressione di vuoto standard di 75-150 torr. - Etichettare e datare il mezzo di digestione del tumore e conservarlo a 4 °C.
NOTA: Il supporto può essere conservato per 1 mese a 4 °C.
- Trasferire il mezzo in un filtro sterile da 500 mL, 0,22 μm in polietersolfone (PES) per la filtrazione sotto vuoto.
- Per preparare il cocktail enzimatico che digerisce il tumore, aggiungere 2,5 mL di collagenasi al 3% di tipo 1, 1 mL di 1,5 mg/mL di ialuronidasi, 20 μL di 250.000 unità/mL di DNAse da 1 a 16,5 mL di mezzo di digestione in un tubo conico da 50 mL in una cappa a flusso laminare.
NOTA: Il volume totale del cocktail enzimatico che digerisce il tumore è di 20 ml; tuttavia, sono necessari solo 10 ml per campione di tumore. Pertanto, il cocktail rimanente può essere conservato a -20 °C fino a quando necessario. Non ricongelare le aliquote. - Per preparare il mezzo tumorale completo, aggiungere 5 mL di 100% Pen/Strep e 50 mL di siero bovino fetale (FBS) a 500 mL di RPMI 1640 sterile in una cappa a flusso laminare.
- Trasferire il mezzo in un filtro sterile PES da 500 mL, 0,22 μm per la filtrazione sotto vuoto.
- Etichettare e datare il mezzo tumorale completo e conservarlo a 4 °C.
NOTA: Il supporto può essere conservato per 1 mese a 4 °C.
- Per preparare il mezzo sierico ridotto per la fame, aggiungere 5 mL di 100% Pen/Strep e 5 mL di FBS a 500 mL di RPMI 1640 sterile in una cappa a flusso laminare.
- Trasferire il mezzo in un filtro sterile PES da 500 mL, 0,22 μm per la filtrazione sotto vuoto.
- Etichettare e datare il mezzo a siero ridotto e conservarlo a 4 °C.
NOTA: Il supporto può essere conservato per 1 mese a 4 °C.
- Per preparare il mezzo di congelamento, aggiungere 5 mL di dimetilsolfossido (DMSO) a 45 ml di FBS in una cappa a flusso laminare.
- Trasferire il mezzo in un filtro sterile PES da 50 ml e 0,22 μm per la filtrazione sotto vuoto.
- Etichettare e datare cinque tubi conici da 15 mL.
- Trasferire 10 mL di mezzo di congelamento in ciascun tubo e conservare i tubi a -20 °C.
- Per preparare un mezzo privo di antibiotici per il test del micoplasma, aggiungere 50 ml di FBS a 500 ml di RPMI 1640 sterile in una cappa a flusso laminare.
- Trasferire il mezzo in un filtro sterile PES da 50 ml e 0,22 μm per la filtrazione sotto vuoto.
- Etichettare e datare il mezzo privo di antibiotici e conservarlo a 4 °C.
NOTA: Il supporto può essere conservato per 1 mese a 4 °C.
- Per preparare il tampone di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) per l'analisi fenotipica, aggiungere 16,6 ml di albumina sierica bovina sterile a 500 ml di soluzione salina sterile tamponata con 1x fosfato (PBS) in una cappa a flusso laminare.
- Etichettare e datare il buffer FACS e conservarlo a 4 °C.
NOTA: il buffer FACS non richiede la sterilizzazione del filtro finché entrambi i componenti sono conservati sterili. Il buffer FACS può essere conservato prima dell'apertura per 6 mesi a 4 °C.
- Etichettare e datare il buffer FACS e conservarlo a 4 °C.
2. Digestione del tessuto tumorale
- Trasferire 10 ml di cocktail enzimatico che digerisce il tumore dalla fase 1.2 a un tubo di dissociazione.
- Trasferire il pezzo di tessuto tumorale in un coperchio sterile a 6 pozzetti usando un bisturi sterile.
NOTA: La quantità di mezzo che viene trasferita con il tessuto tumorale è sufficiente per l'elaborazione.- Rimuovere tutto il tessuto adiposo, il tessuto necrotico e / o i coaguli di sangue utilizzando un nuovo bisturi sterile e una pinza.
NOTA: Il tessuto adiposo è normalmente di aspetto giallastro e semisolido. Il tessuto necrotico è più scuro del tessuto circostante in apparenza e molto morbido; sia il tessuto grasso che quello necrotico si rompono facilmente. Il tessuto sanguinante appare rosso vivo e può rilasciare sangue nel mezzo quando manipolato. Una volta rimosso, il tessuto tumorale risultante dovrebbe mantenere la forma ed essere pallido o rosa, a seconda del tipo di tessuto. - Tagliare l'intero tessuto tumorale in 1 mm3 piccoli frammenti. Per garantire che il tessuto non si asciughi, aggiungere 500 μL di 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) sterile al tessuto tumorale.
- Rimuovere tutto il tessuto adiposo, il tessuto necrotico e / o i coaguli di sangue utilizzando un nuovo bisturi sterile e una pinza.
- Trasferire frammenti tumorali nel tubo di dissociazione contenente 10 ml di cocktail enzimatico che digerisce il tumore (fase 2.1). Chiudere saldamente il tubo, posizionarlo con il cappuccio verso il basso sul dissociatore tissutale e aggiungere l'apparato riscaldante applicandolo come un manicotto sul tubo di dissociazione e premendo per fare clic per fare clic su di esso in posizione.
NOTA: La capacità massima per ogni tubo è di 4 g di tumore e 10 ml di volume. - Selezionare l'impostazione preprogrammata sul dissociatore 37C_h_TDK_1. Controllare lo stato dopo 10 minuti per assicurarsi che non vi sia alcun errore di intasamento come indicato dalla luce rossa lampeggiante.
NOTA: questo programma lavora a 1.865 giri/min per 1 ora con temperatura accesa a 37 °C.
NOTA: se si verifica l'intasamento, rimuovere il tubo di dissociazione e ruotarlo manualmente per rimuovere qualsiasi tessuto catturato nel coperchio; quindi sostituire il tubo sul dissociatore e riprendere il programma. - Dopo la digestione di 1 ora, rimuovere il tubo di dissociazione e metterlo in una cappa a flusso laminare. Filtrare il tumore digerito posizionando un filtro a cellule da 70 μm sopra un tubo conico da 50 ml e pipettando il tumore digerito utilizzando una pipetta da 10 ml sul filtro. Se il filtro si intasa, passare a un nuovo filtro.
- Risciacquare il tubo di dissociazione con 10 ml di mezzi di digestione tumorale freschi e passare il lavaggio attraverso il filtro.
- Rimuovere il filtro da 70 μm ed eliminarlo.
- Portare il volume totale a 40 ml con mezzo di digestione tumorale.
- Centrifugare a 500 × g per 5 min a temperatura ambiente.
- Utilizzando una pipetta aspirante da 2 ml collegata a una fonte di vuoto, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet e risospescere le cellule utilizzando 10 mL di mezzo tumorale completo sterile.
- Ripetere il passaggio 2.6.
- Aspirare il surnatante come descritto al punto 2.7. Risospesere le cellule in 3 mL di mezzo tumorale sterile completo e trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra sterile a 6 pozzetti.
- Tenere la piastra in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2.
- Dopo 24 ore, trasferire il mezzo usato dal tumore digerito in ben 1 a un nuovo pozzo (bene 2) nella stessa piastra a 6 pozzetti. Aggiungere 3 ml di terreno tumorale completo sterile al pozzo 1.
- Trasferire il mezzo usato dai pozzetti 1 e 2 e combinarlo nel pozzo 3 nella stessa piastra a 6 pozzetti 24 ore dopo il passaggio 2.11. Aggiungere 3 ml di mezzo tumorale completo sterile nei pozzetti 1 e 2.
- Aspirare il mezzo da tutti e 3 i pozzetti e pipettare 3 mL di mezzo tumorale completo in ciascun pozzetto 48 ore dopo il passaggio 2.12.
3. Generazione della linea cellulare tumorale primaria
- Utilizzando un microscopio a fase invertita, determinare la percentuale di contaminazione da fibroblasti nella coltura di passaggio precoce.
NOTA: I fibroblasti sono generalmente lunghi e irregolari e hanno una membrana cellulare mal definita. Appaiono sottili o piatti su una scala Z.- Se la contaminazione dei fibroblasti è superiore al 20% delle cellule nella coltura a passaggio precoce, continuare la coltura dopo aver sostituito il mezzo completo con un mezzo sierico ridotto.
- Ripetere la sostituzione con mezzo sierico ridotto nel passaggio 3.1.1 due volte a settimana per 3-4 settimane.
- Quando la coltura raggiunge l'80% di confluenza, passare le cellule dividendo 50:50 in 2 nuovi pozzetti di una piastra a 6 pozzetti. Continuare a passare 50:50 in mezzi sierici ridotti una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza.
- Ripetere il passaggio 3.1.3 per un massimo di 4 settimane, passando in palloni di coltura più grandi secondo necessità dividendo 50:50 una volta che la coltura raggiunge l'80% di confluenza. Se la popolazione di fibroblasti non è ridotta al 10% o meno, continuare al passo 3.2 per tentare il metodo di tripsinizzazione differenziale per rimuovere la contaminazione da fibroblasti. In caso contrario, procedere al passaggio 3.3.
- Per arricchire le cellule tumorali, sciacquare delicatamente il pozzetto con 1x PBS per rimuovere il siero contenente il mezzo.
- Aggiungere la tripsina come segue: 1 mL per pozzetto se in una piastra a 6 pozzetti, 2 mL per un matraccio T25, 3 mL per un pallone T75.
- Posizionare la piastra o il matraccio a 6 pozzetti in un'incubatrice a 37 °C per 1 minuto. Rimuovere la piastra o il pallone dall'incubatrice e controllare l'adesione delle cellule utilizzando un microscopio invertito. Se le cellule sono parzialmente sollevate o galleggianti, rimuovere delicatamente le cellule sospese e solo la tripsina. Posizionare le cellule in un tubo conico da 15 ml contenente un volume uguale o maggiore di mezzo tumorale completo.
NOTA: questa raccolta parziale di celle basata sulle proprietà di adesione è la prima di più frazioni. - Ripetere i passaggi 3.2.1 e 3.2.2 fino a quando tutte le celle non vengono sollevate o vengono rimosse 4 frazioni.
- Centrifugare tutte le frazioni indipendenti a 500 × g per 5 min a temperatura ambiente.
- Aspirare il surnatante come descritto nel passaggio 2.7 e risospesare le cellule utilizzando 5 mL di terreno sterile a ridotto siero.
- Placcare le celle in un matraccio T25 per ogni frazione e porre i palloni in un'incubatrice a 37 °C.
- Valutare la coltura dopo 48 ore per determinare quale frazione è arricchita per le cellule tumorali rispetto ai fibroblasti. Scartare i palloni ricchi di fibroblasti. Se la contaminazione da fibroblasti è <10%, continuare l'espansione nel mezzo tumorale completo e procedere alla fase 4. Se la contaminazione da fibroblasti è del 10-30%, ripetere i passaggi 3.1.2-3.1.4. Se la contaminazione dei fibroblasti è superiore al 30%, ripetere i passaggi 3.2-3.2.7.
- Se pochi o nessun fibroblasto viene rilevato all'interno della coltura di passaggio precoce, continuare a passare le cellule in mezzo tumorale completo dividendo 50:50 una volta che le cellule sono confluenti all'80% nella loro piastra o pallone a 6 pozzetti.
4. Espansione della linea cellulare tumorale primaria a passaggio precoce
- Una volta che la coltura tumorale primaria contiene il 10% o meno di contaminazione da fibroblasti, aspirare il mezzo e sostituirlo con un mezzo tumorale completo sterile due volte a settimana.
NOTA: il volume medio ottimale per un T25 è di 5 ml; T75 è di 12 ml; T150 è di 25 ml.- Passare la coltura 50:50 in palloni più grandi secondo necessità una volta raggiunta l'80% di confluenza nel piatto o nel pallone.
NOTA: potrebbe essere necessario passare la coltura a un rapporto più elevato a seconda della sua crescita. Regola in modo che la cultura raggiunga l'80% di confluenza ogni 3-5 giorni.
- Passare la coltura 50:50 in palloni più grandi secondo necessità una volta raggiunta l'80% di confluenza nel piatto o nel pallone.
- Passaggio fino a quando la cultura è al passaggio 4 o superiore. Una volta che la coltura è confluente all'80% in un minimo di due palloni T75, continuare con la fase 5.
5. Caratterizzazione e banking di linee cellulari tumorali primarie consolidate
- Crioconservare un pallone T75 come congelamento a passaggio precoce. Per il test del micoplasma dei restanti palloni T75, continuare con il punto 5.2.
- Per la crioconservazione delle cellule a passaggio precoce, scongelare 1 tubo di terreno di congelamento aliquotato preparato nella fase 1.5.
- Raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione lavando prima la piastra con 1x PBS come descritto nel passaggio 3.2 e aggiungendo tripsina come descritto nel passaggio 3.2.1.
- Mettere il matraccio in un'incubatrice a 37 °C per 3 minuti. Rimuovere il pallone dall'incubatrice e controllare l'adesione delle cellule utilizzando un microscopio invertito. Se le cellule si sollevano o galleggiano, rimuovere delicatamente le cellule sospese e la tripsina. Posizionare le cellule in un tubo conico da 15 ml contenente un volume uguale o maggiore di mezzo tumorale completo.
NOTA: Se le cellule rimangono aderenti dopo 3 minuti, riposizionare il pallone nell'incubatrice per altri 2 minuti. - Mescolare bene il tubo pipettando delicatamente e rimuovere 20 μL per il conteggio.
- Centrifugare il tubo a 500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Mentre le cellule girano, contare utilizzando un protocollo di conteggio specifico per il laboratorio come il blu di tripano o l'acridina arancione / ioduro di propidio (AO / PI).
- Risospesere le cellule dopo centrifugazione in mezzo di congelamento con un minimo di 2 × 106 celle/1 mL di terreno di congelamento.
- Trasferire 1 mL della sospensione cellulare dal punto 5.1.7 a crioviali premarcati da 1,5 mL.
- Posizionare i criocerali in una camera di congelamento a velocità controllata e trasferirli immediatamente a -80 °C.
- Conservare le celle a -80 °C per un massimo di 1 settimana prima di trasferirle in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
- Dividere un pallone T75 50:50 per il test del micoplasma. Cambiare il mezzo in mezzo privo di antibiotici preparato nel passaggio 1.6.
- Dopo 72 ore, scongelare il reagente di rilevamento del micoplasma, il substrato e i controlli a temperatura ambiente per 15 minuti prima del test.
- Raccogliere 1 mL del surnatante da ogni coltura da testare e posizionarlo in un tubo conico da 15 mL.
- Pellet le celle sospese centrifugando il surnatante a 500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Caricare 100 μL di supernatanti campione e controlli in una piastra bianca a 96 pozzetti. Aggiungere 100 μL di reagente per il rilevamento del micoplasma a ciascun campione e controllo.
- Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Posizionare la piastra in un lettore di piastre e leggere la luminescenza (lettura A, cioè prima lettura).
NOTA: il protocollo del produttore del kit mycoplasma indica il mantenimento delle impostazioni predefinite sui lettori di piastre multifunzionali. La lettura è impostata sull'endpoint di luminescenza con un tempo di integrazione di 1 s e un guadagno di 135. Il lettore di piastre utilizza una routine di scalabilità automatica per ottimizzare il segnale di guadagno per ogni esperimento. Il tempo di integrazione di 1 s è predefinito standard. Entrambe le impostazioni vengono utilizzate per regolare l'intensità del segnale luminescente interpretato dal lettore di piastre e potrebbe essere necessario regolarle in base al singolo lettore di piastre. - Rimuovere la piastra dal lettore di piastre e aggiungere 100 μL del substrato di rilevamento del micoplasma a ciascun campione e ai controlli.
- Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Posizionare la piastra nel lettore di piastre e leggere la luminescenza (lettura B, cioè seconda lettura).
- Per determinare la positività al micoplasma, determinare il rapporto tra la lettura B e la lettura A.
NOTA: i rapporti di positività del micoplasma sono descritti nel protocollo del produttore del kit mycoplasma. Le letture A e B vengono acquisite con le stesse impostazioni e riflettono semplicemente l'ordine di lettura.- Si consideri un rapporto < 1 come micoplasma-negativo.
- Considerare un rapporto di 1-1,2 come inconcludente e ripetere il passaggio 5.2.
- Considerare un rapporto > 1,2 per essere micoplasma-positivo e monitorare questa coltura; terminare la lingua, se necessario.
- Caratterizzazione della citometria a flusso di cellule tumorali micoplasma-negative
- Rimuovere le cellule tumorali utilizzando il tampone di dissociazione cellulare.
- Contare le celle e risospesce le celle a 1 × 106/mL nel buffer FACS dal passaggio 1.7.
- Rimuovere 100 μL di sospensione cellulare in singoli tubi per la colorazione superficiale.
- Centrifugare a 500 × g per 5 min a temperatura ambiente.
- Aspirare il surnatante e bloccare i recettori Fc incubando le cellule in 500 μL di siero di capra al 5% in tampone FACS a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Aggiungere 2 mL di tampone FACS e centrifugare la sospensione a 500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare il surnatante e aggiungere la miscela superficiale di anticorpi (Tabella 1) e tampone FACS in modo che il volume finale sia di 100 μL. Coprire i campioni e macchiarli sul ghiaccio per 30 minuti.
- Ripetere il passaggio 5.3.6.
- Aspirare il surnatante e fissare le cellule riesuscendo in 200 μL di paraformaldeide (PFA) all'1% più 0,25% di EtOH. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti con i campioni al riparo dalla luce.
- Ripetere il passaggio 5.3.6. Risospesare le cellule in 200 μL di tampone FACS per l'acquisizione utilizzando un citometro a flusso appropriato.
NOTA: Le cellule tumorali del mesotelioma dovrebbero essere positive per mesotelina e N-caderina. Alcuni possono anche esprimere CD90.
- Espandere nel mezzo tumorale completo e nella banca come descritto nei passaggi 4.1 e 5.1, rispettivamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Per determinare la contaminazione dei fibroblasti delle colture a passaggio precoce, le cellule vengono valutate utilizzando un microscopio a fase invertita per identificare la frequenza dei fibroblasti rispetto alle altre cellule aderenti presenti. La Figura 1 mostra esempi di aumento della contaminazione da fibroblasti dell'80% (Figura 1A), del 50% (Figura 1B) e del 30% (Figura 1C), rispetto a una coltura senza contaminazione da fibroblasti (Figura 1D). Sulla base di questa valutazione visiva, vengono apportate modifiche alle condizioni di espansione come descritto sopra. Una volta stabilita una coltura priva di micoplasma con contaminazione da fibroblasti <10%, viene utilizzata la citometria a flusso per determinare la purezza della linea tumorale del mesotelioma.
La Figura 2A, B mostra la colorazione rappresentativa della superficie della citometria a flusso di due linee tumorali primarie del mesotelioma (MESO171 e MESO176) rispetto alle linee tumorali del mesotelioma stabilite dall'ATCC (NCI-H2452 e MSTO-211H) con una linea tumorale del melanoma (MEL526) come controllo negativo. Le cellule tumorali del mesotelioma possono esprimere mesotelina (Figura 2A) e N-caderina (Figura 2B). Informazioni dettagliate relative al pannello di citometria a flusso utilizzato sono riportate nella Tabella 1. La strategia di gating è mostrata nella Figura supplementare 1. Da notare, CD90 non può essere utilizzato come marcatore specifico dei fibroblasti in quanto può anche essere espresso dalle cellule tumorali del mesotelioma. L'importanza di testare l'impatto del distacco enzimatico sull'espressione dei marcatori proteici di superficie è anche mostrata in quanto sia la tripsina che la miscela proteasi-collagenasi hanno provocato la perdita dell'espressione superficiale di N-caderina (Figura 2C) mentre CD90 non è stato influenzato (Figura 2D).
Figura 1: Immagini rappresentative della crescente frequenza della contaminazione dei fibroblasti nelle colture a passaggio precoce e una linea tumorale stabilita. (A) immagine della coltura a passaggio precoce contenente l'80% di contaminazione da fibroblasti. (B) Immagine della coltura a passaggio precoce contenente il 50% di contaminazione da fibroblasti. (C) Immagine di coltura a passaggio precoce contenente il 30% di contaminazione da fibroblasti. (D) Immagine di una linea tumorale primaria del mesotelioma stabilita. Barre di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Fenotipizzazione rappresentativa della citometria a flusso della linea cellulare del mesotelioma stabilita. (A e B) Istogrammi che mostrano il modello di espressione superficiale di mesotelina e N-caderina su linee cellulari di mesotelioma ATCC, linea tumorale di melanoma di controllo e linee tumorali di mesotelioma primario. (C e D) Impatto della tripsina, della miscela proteasi-collagenasi e del tampone di dissociazione cellulare su N-caderina e CD90. Abbreviazioni: Comp-X-A = area compensata del fluoroforo X; PE = ficoeritrina; APC = allococianina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Anticorpo di superficie | Canale Fortessa X20 | Laser | Clone | Isotype | Volume/Campione (μL) |
| Giallo vivo/morto | BV510 · | VIOLA | N/D | N/D | 1 |
| apc anti-mesotelina | Apc | Rosso | REA1057 · | IgG1 · | 2 |
| anti-CD325 (N-Caderina) PE | Pe | YG · | 8C11 · | IgG1 · | 5 |
| anti-CD90 PE-Cy7 | PE-Cy7 · | YG · | 5E10 · | IgG1 · | 5 |
Tabella 1: Anticorpi della citometria a flusso utilizzati per le linee tumorali fenotipiche. Abbreviazioni: PE = ficoeritrina; APC = allococianina.
Figura supplementare S1: Strategia di Gating per l'analisi fenotipica delle linee tumorali. I dot plot sono mostrati per ogni fase della strategia di gating che porta alla valutazione dell'espressione dei marcatori di interesse. Qualsiasi gate iniziale che utilizza le proprietà di dispersione in avanti e di scatter laterale viene creato per identificare le celle di interesse, seguito da un gate QC basato sulla caratteristica temporale. Le celle vengono quindi sottoposte a subgate per rimuovere eventuali doppietti utilizzando le proprietà di dispersione in avanti e lateralmente. Il cancello QC finale si basa sulla vitalità, con le cellule morte che si colorano positive per il colorante. Seguendo il cancello di viabilità, è possibile eseguire la subgazione in base al pannello. Fare clic qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mentre questo protocollo è semplice, ci sono alcuni passaggi critici che devono essere seguiti da vicino. Il congelamento del passaggio precoce è importante per preservare la capacità di ripetere il processo di arricchimento delle cellule tumorali se inizialmente non ha successo. La capacità di valutare la contaminazione fibroblastica ad occhio per decidere la corretta tecnica di scissione e fame dei media è vitale per prevenire la crescita eccessiva dei fibroblasti nella coltura. Inoltre, il metodo di tripsinizzazione differenziale richiede un'attenta osservazione delle cellule durante l'incubazione. Le cellule possono sollevarsi dalla piastra di plastica a velocità diverse, e questo varierà da linea cellulare a linea cellulare. Durante l'apprendimento di questo processo e il perfezionamento di questa fase decisionale, una parte della coltura originale può essere conservata in una piastra a 6 pozzetti utilizzando un mezzo di fame sierico ridotto (RPMI 1640 con 1% Penna / Streptococco e 1% FBS) fino a quando non si può osservare l'arricchimento delle cellule tumorali.
Un fattore importante notato nella caratterizzazione fenotipica convalidata delle linee tumorali del mesotelioma è stato l'impatto della tripsinizzazione e della miscela proteasi-collagenasi sull'espressione del marcatore di superficie cellulare del mesotelioma, N-caderina8. Abbiamo osservato una perdita del marcatore di superficie se le cellule sono state staccate usando questi enzimi, che è stato precedentemente descritto9. Mentre è stato dimostrato che la maggior parte delle proteine di superficie non sono influenzate negativamente dalla tripsina, è importante testare ogni marcatore di superficie durante la progettazione del pannello di flusso10. Inoltre, si consiglia vivamente di coltivare o espandere le cellule tumorali fino a quando le cellule raggiungono una fase di espansione e hanno il tempo di riesprimere questi marcatori. L'uso del mezzo di dissociazione cellulare ha permesso la ritenzione dell'espressione di N-caderina per il rilevamento mediante citometria a flusso. Altri tipi di mezzi di dissociazione possono anche consentire la ritenzione del marcatore; tuttavia, i singoli laboratori dovrebbero testare attentamente questi mezzi prima di stabilire un pannello di citometria a flusso.
Una delle principali limitazioni di questo studio è che il tasso di successo della creazione di una linea cellulare è solo del 50%. Ciò potrebbe essere dovuto alla natura eterogenea del microambiente tumorale. Le strade per migliorare questo processo potrebbero includere l'uso di sistemi di coltura 3D, l'aggiunta di integratori di media per promuovere l'espansione delle cellule tumorali, metodi di disaggregazione migliorati, l'uso di xenotrapianti derivati dal paziente o rivestimento di piastre per migliorare l'adesione delle cellule tumorali11. In effetti, le colture 3D hanno dimostrato di avere successo nella generazione di linee cellulari tumorali impegnative come il cancro del pancreas7.
Una via di selezione che non è inclusa in questo protocollo è l'arricchimento delle cellule tumorali mediante l'ordinamento cellulare basato su un marcatore tumorale del mesotelioma come la mesotelina. Poiché le cellule tumorali del mesotelioma possono esprimere il marcatore standard dei fibroblasti, CD90, la selezione positiva può essere un'alternativa migliore. L'avvertimento a questo metodo è il basso grado di cellularità nelle colture precoci, che richiederebbe lo smistamento in un piccolo volume, piastra multiwell come una piastra a 384 o 96 pozzetti. Inoltre, poiché questo protocollo prevede l'uso della collagenasi per la digestione dei tessuti, non è noto se ciò possa anche influire sull'espressione superficiale di N-caderina o mesotelina. Mentre il meccanismo di espressione della mesotelina è relativamente sconosciuto, la N-caderina svolge un ruolo importante nell'adesione cellulare e la rimozione di questa proteina potrebbe avere un impatto negativo sulla creazione di una linea tumorale12. Questo è attualmente in fase di valutazione.
Questo metodo è significativo in quanto consente la generazione di un sistema modello in vitro per studiare questo raro tipo di tumore. Ciò può includere studi che identificano nuovi bersagli di superficie del mesotelioma come la mesotelina con cellule CAR-T e scoprono proprietà intrinseche del tumore di resistenza a terapie mirate o immunoterapie. Inoltre, se queste cellule possono essere espanse in vivo in modelli murini, ciò creerebbe anche una fonte per testare terapie a base cellulare e anticorpale, nonché piccole molecole. Una direzione futura per questo protocollo sarà testare la capacità di espandere altri sottotipi di MPM come i sottoinsiemi sarcomatoidi e bifasici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CH è membro del SAB for Briacell Therapeutics e della Mesothelioma Applied Research Foundation. Tutti gli altri autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Raquel Laza-Briviesca per il suo contributo all'avvio di questo protocollo e i dottori Boris Sepesi, Reza Mehran e David Rice per la collaborazione sulle collezioni di tessuti. Non ci sono finanziamenti aggiuntivi associati a questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
References
- Guzman-Casta, J., et al. Prognostic factors for progression-free and overall survival in malignant pleural mesothelioma. Thoracic Cancer. 12 (7), 1014-1022 (2021).
- Baas, P., et al. First-line nivolumab plus ipilimumab in unresectable malignant pleural mesothelioma (CheckMate 743): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 397 (10272), 375-386 (2021).
- Testa, J. R., Berns, A.
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Kobayashi, M., Takeuchi, T., Ohtsuki, Y. Establishment of three novel human malignant pleural mesothelioma cell lines: morphological and cytogenetical studies and EGFR mutation status. Anticancer Research. 28 (1), 197-208 (2008).
- Chernova, T., et al. Molecular profiling reveals primary mesothelioma cell lines recapitulate human disease. Cell Death and Differentiation. 23 (7), 1152-1164 (2016).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Han, A. C., et al. Differential expression of N-cadherin in pleural mesotheliomas and E-cadherin in lung adenocarcinomas in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Human Pathology. 28 (6), 641-645 (1997).
- Tachibana, K. N-cadherin-mediated aggregate formation; cell detachment by Trypsin-EDTA loses N-cadherin and delays aggregate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (2), 414-418 (2019).
- Donnenberg, V. S., Corselli, M., Normolle, D. P., Meyer, E. M., Donnenberg, A. D. Flow cytometric detection of most proteins in the cell surface proteome is unaffected by trypsin treatment. Cytometry A. 93 (8), 803-810 (2018).
- Pham, K., et al. Isolation of pancreatic cancer cells from a patient-derived xenograft model allows for practical expansion and preserved heterogeneity in culture. American Journal of Pathology. 186 (6), 1537-1546 (2016).
- Derycke, L. D., Bracke, M. E. N-cadherin in the spotlight of cell-cell adhesion, differentiation, embryogenesis, invasion and signalling. International Journal of Developmental Biology. 48 (5-6), 463-476 (2004).
