Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Undersøgelse af membranproteinhandel i drosophila-fotoreceptorceller ved hjælp af eGFP-mærkede proteiner

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63375
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biology, Department of Biochemistry, University of Hohenheim

Summary

Her beskrives ikke-invasive metoder til lokalisering af fotoreceptormembranproteiner og vurdering af retinal degeneration i Drosophila-forbindelsens øje ved anvendelse af eGFP-fluorescens.

Abstract

Membranproteinhandel regulerer inkorporeringen og fjernelsen af receptorer og ionkanaler i plasmamembranen. Denne proces er grundlæggende vigtig for neuronernes cellefunktion og celleintegritet. Drosophila fotoreceptorceller er blevet en model til at studere membranproteinhandel. Udover rhodopsin, som ved belysning bliver internaliseret fra fotoreceptormembranen og nedbrydes, udviser den forbigående receptorpotentialelignende (TRPL) ionkanal i Drosophila en lysafhængig translokation mellem den rhabdomerale fotoreceptormembran (hvor den er placeret i mørket) og fotoreceptorcellelegemet (som det transporteres til ved belysning). Denne intracellulære transport af TRPL kan studeres på en enkel og ikke-invasiv måde ved at udtrykke eGFP-mærket TRPL i fotoreceptorceller. eGFP-fluorescensen kan derefter observeres enten i den dybe pseudopupil eller ved vandnedsænkningsmikroskopi. Disse metoder gør det muligt at detektere fluorescens i det intakte øje og er derfor nyttige til assays med høj gennemstrømning og genetiske skærme for Drosophila-mutanter , der er defekte i TRPL-translokation. Her forklares forberedelsen af fluer, de mikroskopiske teknikker samt kvantificeringsmetoder, der anvendes til at studere denne lysudløste translokation af TRPL, detaljeret. Disse metoder kan også anvendes til trafficking undersøgelser på andre Drosophila fotoreceptor proteiner, for eksempel rhodopsin. Derudover kan disse metoder ved hjælp af eGFP-mærkede rhabdomerale proteiner bruges til at vurdere degenereringen af fotoreceptorceller.

Introduction

Ved at levere og fjerne proteiner til og fra plasmamembranen styrer membranproteinhandel i neuroner plasmamembranudstyret med receptorer såvel som ionkanaler og regulerer som følge heraf neuronal funktion. Misregulering eller defekter i proteinhandel har typisk skadelige virkninger på celler og resulterer i neuronal degeneration. Hos mennesker kan dette forårsage neurodegenerative sygdomme som Alzheimers og Parkinsons sygdom eller Retinitis pigmentosa1. Fotoreceptorer i drosophila melanogasters sammensatte øje er blevet et in vivo-modelsystem til undersøgelse af membranproteinhandel2. Dette skyldes ikke kun Drosophilas genetiske alsidighed, der muliggør effektive genetiske skærme, men også fordi alle væsentlige komponenter i den lysabsorberende fotoreceptormembran er karakteriseret i detaljer, og der findes effektive mikroskopiske teknikker, der kan påføres flueøjet. Disse teknikker er i fokus i denne artikel.

I Drosophila fotoreceptorceller danner den apikale plasmamembran en tæt pakket stak mikrovilli langs den ene side af cellen, nævnt rhabdomere. Rhabdomeres af fotoreceptorceller R1-6 er arrangeret i et karakteristisk trapezformet mønster, mens fotoreceptorcellerne R7 og R8 danner en enkelt rhabdomere i midten af denne trapez3. Membranproteinhandel er nødvendig for en reguleret omsætning af rhabdomerale membranproteiner såsom rhodopsin og de lysaktiverede TRP (forbigående receptorpotentiale) og TRPL (TRP-lignende) ionkanaler for at sikre den korrekte mængde af disse fototransduktionsproteiner i rhabdomere. Fotoreceptormembranproteiner syntetiseres i det endoplasmatiske retikulum og transporteres via Golgi-apparatet til rhabdomere. Efter aktivering af rhodopsin ved lys kan et rhodopsinmolekyle enten blive inaktiveret ved absorption af en anden foton eller kan fjernes fra rhabdomere ved clathrinmedieret endocytose. Endocytosed rhodopsin bliver enten nedbrudt i lysosomet eller genbruges tilbage til rhabdomere 4,5. Ionkanalen TRPL internaliseres også efter aktivering af fototransduktionskaskaden og gennemgår en lysafhængig translokation mellem rhabdomere (hvor den er placeret, når fluer holdes i mørket) og et ER-beriget opbevaringsrum i cellelegemet (hvortil det transporteres inden for flere timer ved belysning)6,7,8,9,10 . I modsætning til endocytoseret rhodopsin nedbrydes kun små mængder TRPL via den endolysosomale vej, og størstedelen opbevares intracellulært i stedet og genbruges tilbage til rhabdomere ved mørk tilpasning6. TRPL kan således bruges til at analysere lysudløst handel med plasmamembranproteiner. Drosophila fotoreceptorceller anvendes også til at studere neuronal degeneration. Fotoreceptorcelledegeneration bestemmes ofte ved at vurdere strukturen af rhabdomeres, som opløses som følge af degenerative processer5.

For at studere den subcellulære lokalisering af TRPL og rhodopsin i fotoreceptorceller eller fotoreceptorcelledegeneration er der anvendt to fluorescensmikroskopimetoder, der adskiller sig med hensyn til analysehastighed og opløsning. En meget hurtig, ikke-invasiv metode, der kan bruges til genetiske skærme, men med en begrænset rumlig opløsning, er påvisning af fluorescens i den dybe pseudopupil (DPP). DPP er et optisk fænomen af leddyr sammensatte øjne, hvis geometriske oprindelse er blevet forklaret detaljeret af Franceschini og Kirschfeld i 197111. Kort sagt, på flere optiske planer under nethinden kan overlay-billeder af rhabdomeres fra tilstødende ommatidia observeres. På et brændplan gennem midten af øjets krumning danner disse overlejrede fremspring et billede, der ligner det trapezformede layout af rhabdomeres i et enkelt ommatidium, kun størrelsesordener større. Dette fænomen kan også observeres uafhængigt af eksogen ekspression af fluorescensproteiner (f.eks. TRPL::eGFP8), hvilket ikke desto mindre gør DPP lettere at detektere (figur 1A-A'')12. En anden ikke-invasiv metode er vandnedsænkningsmikroskopi, der er afhængig af billeddannelse af fluorescerende mærkede proteiner efter optisk neutralisering af øjnenes dioptriske apparat med vand (figur 1B-C'')12. Ved hjælp af vandnedsænkningsmetoden kan den relative mængde TRPL::eGFP i rhabdomeres eller cellelegemet vurderes kvantitativt for individuelle fotoreceptorceller. Desuden kan ikke-translokerende fluorescensmærkede proteiner anvendes til at evaluere rhabdomeral integritet og til at bestemme tidsforløbet for en potentiel degeneration på en kvantitativ måde, som beskrevet her.

Mens optagelser af DPP er langt den nemmeste og hurtigste af disse metoder at udføre, er den rumlige opløsning af data, de genererer, begrænset. Derudover er der mange grunde til, at en DPP kan være fraværende, som ikke nødvendigvis kan ses af DPP-billeddannelse selv. Da DPP repræsenterer en summation af flere ommatidia, går information om individuelle celler tabt. DPP-billeddannelse med lav opløsning tjener således en vigtig funktion ved screening af et stort antal fluer, men bør generelt efterfølges af optagelser med højere opløsning ved hjælp af vandnedsænkningsmikroskopi. Vandnedsænkningsmikrografer tillader fortolkninger om individuelle celler, udviklingsdefekter, øjenmorfologi, proteinfejllokalisering eller retinal degeneration samt kvantificering af disse effekter. Denne protokol beskriver disse to teknikker i detaljer.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over mikroskopivariationer for Drosophila-øjet, der præsenteres i denne protokol. Skematiske repræsentationer og eksemplariske mikrografer af (A-A'') fluorescerende dyb pseudopupil (DPP) billeddannelse, (B-B'') dødelig vandnedsænkningsmikroskopi af fluorescerende rhabdomere og (C-C'') ikke-dødelig vanddråbemikroskopi af fluorescerende rhabdomere. Skalabjælke (A''): 100 μm. Vægtstænger (B''-C''): 10 μm. Figuren er ændret i forhold til reference13. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generelle betragtninger

  1. Brug Drosophila-bestande , der udtrykker et permanent rhabdomeralt placeret fluorescensprotein til morfologisk analyse (f.eks. TRP::eGFP, eGFP::NINAC) og translokerende proteiner til analyser vedrørende proteinhandel (f.eks. TRPL::eGFP, Arr2::eGFP).
  2. Forudbestemme lyseksponeringsbetingelser for udvalgte fluer til den eksperimentelle tilgang.
    1. For mørk tilpasning skal fluerne opbevares i mørke kasser i den ønskede periode ved 25 °C. Til belysning op til 16 timer i translokationsforsøg (f.eks. TRPL::eGFP, der udtrykker fluer), skal fluer holdes under et fluorescerende rør ved stuetemperatur.
    2. I forsøg, der vurderer fotoreceptordegeneration (f.eks. TRP::eGFP,-ekspression af fluer), skal fluerne holdes under et lysstofrør ved 25 °C i en 12 timers lys/12 timers mørk cyklus for langsigtet belysning på op til 28 dage med hvidt lys.
    3. Til belysning af fluer med farvet lys skal du bruge forskellige farvede gennemsigtige plastkasser sammen med lysstofrøret.
  3. Hvis der anvendes fluebestande med pigmenterede øjne, skal dyrene ældes præcist til sammenlignende analyse, da øjenpigmenteringen kan stige betydeligt med alderen.
    BEMÆRK: Til datafortolkning er det vigtigt at bemærke, at der eksisterer en signalbias på grund af den optiske bølgelende effekt af den rhabdomerale struktur. Følgelig vil fluorescenssignalet fra rhabdomere altid blive forstærket til en vis grad i DPP-billeddannelse og vandnedsænkningsmikroskopi i forhold til signaler opnået fra cellelegemet. Dette ses mest fremtrædende i pigmenterede øjne, hvor fluorescens uden for rhabdomeres absorberes af disse pigmenter og er af særlig betydning, når intracellulært translokerende fusionsproteiner skal detekteres. Med hensyn til kritiske trin betragter denne undersøgelse således hvid- og rødøjede fluer separat.
  4. Med hensyn til vandnedsænkningsmikroskopi beskrives to variationer. En hurtigere dødelig variation samt en ikke-dødelig variation, der muliggør genopretning til efterfølgende undersøgelser.

2. DPP-billeddannelse

  1. Forbered arbejdsområdet med det nødvendige udstyr og reagenser som vist i figur 2. Bedøvelse af fluer (1-3 dage gamle) af en genotype, der udtrykker et fluorescensprotein i fotoreceptorceller med CO2 på en flypad. Vælg dyr til billeddannelse under et stereomikroskop med en konventionel lyskilde og lav forstørrelse (f.eks. 10x).

Figure 2
Figur 2: DPP-billedbehandlingsarbejdsområde. Nødvendige materialer er (A) CO2 anæstesiapparat, (B) stereomikroskop med en UV-lampe og fluorescensfiltersæt, (C) lyskilde, (D) mikroskopmonteret kamera med (E) software, (F) pensel, (G) sort pap og (H) fluehætteglas. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Til DPP-billeddannelse skal du holde de valgte fluer anæstetiserede og placere en af dem i midten af mikroskopmålet på sin side, så enten venstre eller højre øje vender mod målet nøjagtigt radialt (figur 3A).
    BEMÆRK: Da fotoreceptorcellernes ommatidiale layout viser spejlsymmetri ved den dorsoventrale midterlinje, observeres DPP bedst lidt over eller under øjets ækvator (figur 3B).

Figure 3
Figur 3: Placering af fluen under stereomikroskopet til DPP-billeddannelse. (A) Illustration af fluen på siden med det ene øje vendt mod mikroskopobjektet radialt. (B) Fluehovedet skal drejes lidt op eller ned, således at målet fokuserer på et punkt lidt over eller under øjets ækvator som angivet med de røde pile. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Forøg forstørrelsen, så den passer til hele øjet (f.eks. 100x), og centrer øjets centrale ommatidia. Reducer mikroskopets dybdeskarphed, f.eks. ved at justere dobbelt-iris-membranen til en lav indstilling (figur 4A-B').
  2. Sluk for den konventionelle lyskilde, og tænd for mikroskopets UV-lampe ved maksimal intensitet, og vælg mikroskopets fluorescensfiltersæt i henhold til fluorescensproteinet udtrykt i øjnene (figur 4C-E). Indstil lysstien mod det mikroskopmonterede kamera.
  3. Brug live imaging-funktionen i softwaren til at justere billedets lysstyrke til en indstilling, der kun registrerer specifikke signaler fra øjet ved at justere eksponeringstiden og forstærkningsværdien (f.eks. Henholdsvis 80 ms og 12x). Justering af mikroskopfokus "ind i" øjet (under hornhinden) for at generere det overlejrede billede af DPP (figur 4C-E').

Figure 4
Figur 4: Illustration af DPP og fluorescerende DPP-billeddannelse. Eksemplariske billeder af Drosophila øjne under konventionel og UV-belysning med GFP-filtersæt, taget med varierende fokusplaner illustreret i skematiske tværsnit gennem øjet. (A) Mikrograf optaget med lyse indstillinger af en konventionel lyskilde, 30 ms eksponeringstid, 1x forstærkning, dyb dybdeskarphed og brændplan nær hornhindens overflade som illustreret i (A'). B) Mikrograf optaget med lyse indstillinger af en konventionel lyskilde, 30 ms eksponeringstid, 1x forstærkning, lav dybdeskarphed og brændplan ca. 180 μm under hornhindens overflade som illustreret i (B'). DPP angivet. (C-E) Mikrograf optaget med højintensitetsindstillinger for UV-lyskilde og GFP-filtersæt, 80 ms eksponeringstid, 12x forstærkning, lav dybdeskarphed og brændplanet (C') nær, (D') lidt under eller (E') ca. 180 μm under hornhindens overflade. Fluorescerende DPP er angivet med en buet pil. Skalabjælke 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Tag et øjebliksbillede af den fluorescerende DPP. Skift mikroskopet tilbage til synligt lys, og lyset går tilbage mod kikkerten. Genvind det afbildede dyr i et fluehætteglas til videre behandling i henhold til dets DPP-fænotype (f.eks. Krydsninger). Fortsæt med det næste dyr i trin 2.2.

3. Mikroskopi af vandnedsænkning

  1. Flyve forberedelse
    1. Forbered arbejdsområdet med det nødvendige udstyr og reagenser som vist i figur 5. Overfør fluer med forudbestemt alder og belysningsforhold til et forkølet 15 ml centrifugerør og besnøm dem ved at inkubere dem på is i 15 til 30 minutter.
      BEMÆRK: Medbring 1 dag gamle, mørketilpassede fluer som reference. Generelt skal mørktilpassede fluer overføres til en isboks med låg i mørket. Lystilpassede fluer kan overføres til isen i rumlys.

Figure 5
Figur 5: Arbejdsområde til vandnedsænkningsmikroskopi. Nødvendige materialer er: (A) 15 ml centrifugerør, (B) isflager, (C) kølet destilleret vand, (D) stereomikroskop, (E) petriskål, (F) plasticin, (G) objektglide, (H) insektstifter eller pipettespidser og skalpel, (I) fluorescensmikroskop med (J) software. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Vælg det relevante præparat blandt de to, der er beskrevet nedenfor (3.1.3 dødelig variation eller 3.1.7 ikke-dødelig variation), og når der skelnes mellem pigmenterede og ikke-pigmenterede øjne, skal du følge de respektive trin.
  2. Forbered fluer til den dødelige variation som følger.
  3. Sæt et stykke plasticin på et objektglide og et andet stykke ind i midten af en petriskål (f.eks. 94 mm Ø) og hold dem adskilt indtil videre. Fyld petriskålen med iskølet destilleret vand og nogle isflager (figur 6A).
  4. Sæt en isabestet flue under et stereomikroskop oven på det plasticinbelagte objektglide. Drej fluen på ryggen og gennembor en insektstift gennem midten af brystkassen (figur 6B). Fastgør stiften vandret på det plasticinbelagte objektskred, og orienter enten fluens venstre eller højre øje opad (figur 6C).
  5. Fastgør forsigtigt objektets dias med den plasticinfrie side nedad i petriskålen, der forhindrer fluens rotation. Sørg for, at flueøjet er dækket af vand (figur 6D). Brug en forberedelsesnål til forsigtigt at fjerne eventuelle luftbobler, der måtte have dannet sig omkring øjet, og fortsæt straks til billedoptagelse for at få de bedste resultater.
    BEMÆRK: Betydelig forsinkelse i billedoptagelse resulterer i genopvågning og bevægelser af fluen, hvilket kan føre til slørede billeder.

Figure 6
Figur 6: Forberedelse til dødelig vandnedsænkningsmikroskopi. Illustration af (A) plasticinbelagt objektglider og petriskål, (B) fastgørelse af en flue gennem thorax på plasticinjord, (C) flueorientering på det plasticinbelagte objektdias og (D) endelig eksperimentel opsætning. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Forbered fluer til den ikke-dødelige variation som følger.
  2. Overfør en isa bedøvet flue med hovedet først til en 200 μL pipettespids og skub fluen forsigtigt mod spidsen med trykluft.
  3. Skær pipettespidsen af lige foran hovedet ved hjælp af en skalpel. Brug en pincet til forsigtigt at skubbe fluen et par millimeter væk fra spidsen. Skær pipettespidsen af igen, og skub fluen tilbage mod spidsen med trykluft, så kun fluens hoved stikker ud fra pipettespidsen.
  4. Sæt et stykke plasticin fast på en genstand, og tryk pipettespidsen ind i den, så enten fluens venstre eller højre øje vender opad (figur 7A). Lige før billedoptagelse skal du bruge en laboratoriepipette til at klæbe en stor dråbe kølet vand til undersiden af et vandnedsænkningsmål (figur 7B). Fortsæt straks til billedoptagelse for de bedste resultater.
    BEMÆRK: Betydelig forsinkelse i billedoptagelse resulterer i genopvågning og bevægelser af fluen, hvilket kan føre til slørede billeder.

Figure 7
Figur 7: Forberedelse til ikke-dødelig vanddråbemikroskopi. Illustration af (A) en koldabestet flue fastgjort inde i en 200 μL pipettespids monteret på plasticinbelagt objektglide og (B) påføring af kølevandsdråbe på undersiden af vandnedsænkningsmålet. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Erhvervelse af billeder
    1. Anbring forsigtigt petriskålen (trin 3.1.3) eller objektglideren (trin 3.1.7) med den tilberedte flue på mikroskoptrinnet, og vælg et vandnedsænkningsmål.
    2. Sænk vandnedsænkningsmålet manuelt, indtil det kommer i kontakt med vandoverfladen (trin 3.1.3), eller fluens øje rører dråben (trin 3.1.7) (figur 8A,B).
    3. Tænd for mikroskopets UV-lampe, og vælg det relevante filtersæt. Brug okularerne til at placere fluen under målet og fokusere mikroskopet på øjets overflade.
    4. Skift lysstien mod mikroskopkameraet, og generer et levende billede i den tilsvarende software. Justere kameraets fokus igen og evaluere øjets orientering, idet øjet skal vende mod mikroskopets mål radialt som illustreret mere detaljeret i figur 8C-E.

Figure 8
Figur 8: Placering af fluen under fluorescensmikroskopet til billeddannelse af vandnedsænkning. Opsætning og endelig orientering til billedoptagelse ved hjælp af protokollerne (A) dødelig eller (B) ikke-dødelig flueforberedelse. (C) Illustration af flueorientering for at opnå de bedste resultater af billeder af vandnedsænkningsmikroskopi. Det ideelle punkt at fokusere på øjet er ikke det nøjagtige centrum med hensyn til de forreste / bageste og dorsale / ventrale akser, men er lidt over øjets ækvator, som angivet med den røde pil. (D) Eksempel på vandnedsænkningsbillede for et perfekt placeret øje. Alle tre symmetriakser i den sekskantede ommatidiafliser fremstår som lige linjer, og den maksimale mængde ommatidia kan være i fokus på samme tid. (E) Eksempel på vandnedsænkningsbillede af et forkert placeret øje. Billedet indeholder buede akser og en lav dybdeskarphed. Skalabjælke: 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Brug den relevante LUT (opslagstabel) i billedbehandlingssoftwaren til at registrere overmætning (angivet som røde pixels).
  2. I tilfælde af ikke-pigmenterede fluer skal du justere eksponeringstiden, så de lyseste pixels er lige under mætningsgrænsen for hvert billede.
  3. I tilfælde af pigmenterede fluer og den dødelige variation justeres eksponeringstiden, så alle de lyseste pixels er lige under mætningsgrænsen i mindst fem individuelle 1-dages gamle, mørketilpassede fluer. Anvend den beregnede gennemsnitlige eksponeringstid på alle andre forsøgsbetingelser (genotyper, belysningsbetingelser, tidspunkter osv.).
  4. I tilfælde af pigmenterede fluer (f.eks. rødøjede) og den ikke-dødelige variation justeres eksponeringstiden, således at alle de lyseste pixels er lige under mætningsgrænsen for hver 1 dag gammel, mørktilpasset flue individuelt. Anvend denne eksponeringstid på alle andre forsøgsbetingelser (belysningsforhold, tidspunkter osv.) for denne flue.
  5. Optag et billede, og gem det som en raw-fil for at arkivere alle tilsvarende metadata for optagelsen. Eksporter billedet i et .tif format til følgende kvantificering.
    BEMÆRK: I tilfælde af den ikke-dødelige variation skal fluerne belyses i 5 minutter med rødt lys (f.eks. 630 nm) umiddelbart efter billedoptagelsen, hvis de er beregnet til at blive brugt til yderligere forsøg. Rødt lys deaktiverer fototransduktionskaskaden, der er blevet aktiveret overdrevent af intenst kortbølget lys under billedoptagelse.

  1. Dataanalyse og kvantificering af relativ eGFP-fluorescens i rhabdomeres af mikrografer til nedsænkning af vand
    1. Download, installer og udfør softwaren ImageJ/Fiji.
    2. Juster ImageJ-indstillingerne ved at klikke på Analysér > Indstil målinger... , og marker kun afkrydsningsfeltet for Gennemsnitlig grå værdi. Importer et .tif billede ved at klikke på Filer > Åbn ... eller ved at trække og slippe. Vælg et repræsentativt område af billedet, der er i fokus, og forstør det til 200% -300% ved gentagne gange at trykke på Ctrl og + sammen .
    3. Vælg det ovale værktøj, og mens du trykker på Shift-tasten , skal du generere et cirkulært valg i billedet, der er betydeligt mindre end en fluorescerende rhabdomere. Før du slipper museknappen, skal du kigge efter den nøjagtige størrelse, der vises under værktøjslinjen i ImageJ-hovedvinduet. Brug den samme størrelse cirkulær udvælgelse til alle analyser.
      BEMÆRK: Den nøjagtige størrelse af det cirkulære valg i pixels eller mikron afhænger af den specifikke opsætning. Brug en cirkel ca. 1/3 eller 1/4 af den rhabdomerale diameter på 1 dag gamle, mørketilpassede kontrolfluer.
    4. Flyt det cirkulære valg enten ved at klikke på det og trække eller ved at trykke på piletasterne på tastaturet.
    5. For at måle fluorescensintensiteterne inden for det cirkulære valg skal du flytte cirklen til den første rhabdomere (r1) og klikke på Analysér > mål eller bruge genvejen Ctrl + M. Et resultatvindue , der viser den målte grå værdi, vises.
    6. Fortsæt med målinger af r2-r6 som gentagne målinger og en måling af baggrundssignalet (b). I tilfælde af ikke-pigmenterede fluer foretages yderligere målinger af de tilsvarende cellelegemeområder (c1-c6) (figur 9).

Figure 9
Figur 9: Kvantificering af relativ rhabdomeral fluorescens til translokationsundersøgelser. En illustration vedrørende kvantificering af relativ eGFP-fluorescens i rhabdomeres ved at måle fluorescensintensiteten af rhabdomere (r), cellelegeme (c) og baggrund (b) af tre forskellige repræsentative ommatidia (hvide cirkler) i et vandnedsænkningsmikroskopibillede; skala bar: 10 μm. Et forstørret ommatidium er vist til højre; skalabjælke: 2 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Gentag trin 3.3.5 og 3.3.6 for yderligere to ommatidia, hvilket resulterer i tre tekniske replikater. Marker den analyserede ommatidia ved hjælp af blyantværktøjet , og gem dette billede til dokumentation.
  2. Vælg og kopier de målte grå værdier fra vinduet Resultat, og indsæt dem i regnearkssoftwaren for yderligere beregninger. Sorter værdierne for fluorescensintensitet efter deres oprindelse i kategorierne rhabdomere (r), cellelegeme (c) og baggrund (b). Beregn gennemsnitsintensiteten fra hver kategori (Ir, Ic, Ib).
  3. Beregn den relative mængde eGFP, der er til stede i rhabdomere (R), ved hjælp af følgende formel (1) for ikke-pigmenterede og formel (2) for pigmenterede øjne:
    Equation 1(1)
    Equation 2(2)
  4. Fortsæt med det næste billede i trin 3.3.3. Det anbefales at bruge billeder fra mindst fem individer i hver eksperimentel gruppe som biologiske replikater for at få en pålidelig måling.
  1. Dataanalyse og kvantificering af øjenmorfologi ved hjælp af eGFP-fluorescens i mikrografer af vandnedsænkning
    1. Download, installer og udfør ImageJ/Fiji-softwaren. Importer et .tif billede ved at klikke på Filer > Åbn ... eller ved at trække og slippe. Vælg tre tilstødende ommatidia i et repræsentativt område af billedet, der er i fokus.
    2. Evaluer de 18 rhabdomeres af udvælgelsen individuelt i henhold til deres eGFP-intensitet, kantskarphed og kontrast med hensyn til det omgivende baggrundssignal for at generere et degenerationsindeks. Score tydeligt synlige rhabdomeres med en værdi på 2, svagt synlige rhabdomeres med en værdi på 1 og fraværende rhabdomeres med en værdi på 0 (figur 10).
      BEMÆRK: Denne måde at kvantificere på resulterer i en score på 36 for fuldt intakte øjne og en score på 0 for fuldt degenererede øjne. Det anbefales at indstille scoren på 36 til 100% på degenerationsindekset.

Figure 10
Figur 10: Kvantificering via rhabdomere-evaluering til degenerationsundersøgelser. En illustration vedrørende kvantificering af øjenmorfologi ved at score rhabdomeres af tre forskellige repræsentative ommatidia (hvide cirkler) i et vandnedsænkningsmikroskopibillede med værdier på 2 (tydeligt synlig; blå cirkel), 1 (svagt synlig; orange cirkel) eller 0 (fraværende; rød cirkel). Vægtstang: 10 μm. Et forstørret ommatidium er vist til højre; skalabjælke: 2 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Åbn det næste billede, og fortsæt med trin 3.4.2. Det anbefales at bruge billeder fra mindst otte individer i hver eksperimentel gruppe som biologiske replikater for at få en pålidelig måling.
    BEMÆRK: Da denne kvantificeringsmetode er mindre objektiv end metoden til kvantificering af translokation ved fluorescensintensitet, er det anbefalede antal replikater højere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Transgene Drosophila fluer, der udtrykker et TRPL: : eGFP fusionsprotein under kontrol af rhodopsin 1 promotoren er blevet genereret. I disse fluer udtrykkes TRPL::eGFP i fotoreceptorceller R1-6 i det sammensatte øje og viser en belysningsafhængig lokalisering. Når fluer holdes i mørke, er TRPL::eGFP inkorporeret i de ydre rhabdomeres. Efter belysning i flere timer translokerer TRPL ind i cellelegemet, hvor det opbevares i et ER-beriget rum. 8,10 Når TRPL::eGFP er placeret i rhabdomeres, kan dets fluorescens observeres i DPP. Imidlertid forsvinder rhabdomeral fluorescens i lyset som følge af translokation af TRPL::eGFP (figur 11A,B). Dette er blevet brugt til at udføre en genetisk skærm for mutanter, der er defekte i internaliseringen af TRPL::eGFP (figur 11C,D)14,15. For at muliggøre isolering af potentielt homozygote dødelige mutationer blev denne skærm udført ved hjælp af gær Flp / FRT-systemet til generering af somatiske cellekloner i det udviklende øjenvæv (dvs. mosaikøjne). Ud over DPP-analysens enkelhed er andre store fordele ved denne fluorescensdetektionsmetode dens høje gennemstrømning såvel som dens ikke-invasive karakter, der muliggør identifikation af mutationer i levende fluer og at bruge disse fluer til generering af stabile mutante fluebestande.

Figure 11
Figur 11: Repræsentative resultater fra en genetisk undersøgelse af TRPL-translokationsdefekter. Hanfluer blev mutageniseret med ethylmethanulfonat (EMS) og krydset til hunner, der udtrykte TRPL::eGFP i fotoreceptorceller R1-6. Den resulterende F1-generation med homozygot mutant Flp/FRT-inducerede mosaikøjne blev screenet for defekter i TRPL-translokation ved billeddannelse af fluorescerende dybe pseudopupile (DPP) efter en periode med mørk tilpasning (venstre kolonne) samt lystilpasning (højre kolonne). (A,B) Ikke-muterede fluer blev båret med som kontrol for regelmæssig lysinduceret TRPL-translokation. Den ikke-fluorescerende DPP er angivet med en pil. (C,D) Et eksemplarisk resultat af isolerede mutanter, der er defekte i lysudløst TRPL-translokation. Skalabjælke: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

TRPL translokationsdefekte (ttd) mutanter, der blev isoleret fra denne genetiske skærm, er senere blevet identificeret, og deres defekter karakteriseres mere detaljeret ved hjælp af billeddannelse af vandnedsænkning. Vandnedsænkningsmikroskopi er blevet anvendt til at vurdere lokaliseringen af proteiner i rhabdomeres og cellelegemer eller til at spore defekter i den rhabdomerale struktur på grund af fotoreceptordegeneration kvantitativt som beskrevet i protokollen. Figur 12A,B illustrerer kvantificering af mængden af TRPL::eGFP, der er til stede i rhabdomeres af fluer med ikke-mutante og lolattd12 mutante mosaikøjne i mørket, i lys og efter en anden mørk tilpasning. I kontrolfluer (ikke-mutante) translokerer TRPL::eGFP ud af rhabdomeres ind i cellelegemet efter 16 timers belysning, hvilket resulterer i et fald i rhabdomeral TRPL::eGFP til ca. 45% sammenlignet med den mørketilpassede tilstand. Den anden mørke inkubation hæver den rhabdomerale fluorescens igen til 95% af den oprindelige værdi. Lola ttd12-mutanten blev isoleret ved DPP-screening på grund af dens TRPL-translokationsdefekt. Følgelig synes TRPL::eGFP-fluorescensmønsteret i vandnedsænkningsbilleder af rhabdomeres ikke at ændre sig så drastisk efter 16 timers belysning og efterfølgende mørktilpasning i 24 timer. Billederne afslører dog også, at lolattd12-mutanter er udviklingsmæssigt defekte, hvilket fremgår af det lejlighedsvise fravær af fotoreceptorceller som beskrevet tidligere for andre lola-mutanter 16. Disse morfologiske defekter resulterer i en manglende evne til at måle et gyldigt baggrundssignal, hvilket forhindrer en korrekt kvantificering ved hjælp af formel (1). I modsætning hertil er vps35MH20 en mutant, der viser en TRPL-translokationsdefekt uden at påvirke den ommatidielle morfologi på denne måde10. I denne mutant kan kvantificeringsmetoden, der er beskrevet her, påvise en statistisk meget signifikant genanvendelsesfejl (figur 12C,D).

Figure 12
Figur 12: Repræsentative resultater af en TRPL-translokerende defekt i lola - og vps35-mutantfluer og grænser for kvantificeringsmetoden. (A) TRPL::eGFP-ekspresserende ikke-mutante og lolattd12 mutante mosaikøjede fluer blev inkuberet i mørket i 3 dage, oplyst med orange lys i 16 timer og mørkt tilpasset i 24 timer for anden gang. Billeder af fluorescerende rhabdomere blev taget ved hjælp af vandnedsænkningsmikroskopi for at registrere subcellulær TRPL::eGFP-lokalisering som beskrevet i trin 3.2.6. B) Kvantificering af rhabdomeral fluorescens hos ikke-mutante (grå) og lolattd12-mutante (grønne) dyr som beskrevet i trin 3.3.9 ved hjælp af formel (1). Fejlbjælker repræsenterer SEM. (C) TRPL::eGFP-ekspresserende ikke-mutant og vps35MH20 mutant mosaikøjede fluer blev inkuberet i mørket i 3 dage, oplyst med orange lys i 16 timer og mørkt tilpasset i 24 timer for anden gang. Billeder af fluorescerende rhabdomere blev taget ved hjælp af vandnedsænkningsmikroskopi for at registrere subcellulær TRPL::eGFP-lokalisering som beskrevet i trin 3.2.6. D) Kvantificering af rhabdomeral fluorescens hos ikke-mutante (grå) og vps35MH20-mutante (røde) dyr som beskrevet i trin 3.3.9 ved hjælp af formel (1). Statistisk signifikans blev beregnet som flere sammenligninger med Bonferroni-korrektion efter ANOVA (ns, ikke signifikant; *, p ≤ 0,05; ***, p ≤ 0,001). Vægtstang: 10 μm. Panel C og D er blevet ændret fra reference10. Klik her for at se en større version af denne figur.

Som allerede nævnt i protokollen påvirker øjenpigmentering signifikant det resulterende vandnedsænkningsbillede. Hvidøjede fluer tillader påvisning af fluorescenssignaler fra både rhabdomere og cellelegemet, hvilket muliggør en ret præcis bestemmelse af TRPL: : eGFP fordelingsforholdet. I modsætning hertil er TRPL::eGFP-signalet i rødøjede fluer kun detekterbart i rhabdomeres, men ikke i cellelegemerne (figur 13A). Dette skyldes, at pigmentmolekyler absorberer det udsendte lys fra TRPL::eGFP. Ikke desto mindre afslører kvantificering ved at bruge formel (2) til pigmenterede øjne pænt TRPL::eGFP translokationsadfærd i hvide såvel som rødøjede fluer. Følgelig falder de tilsvarende værdier af rhabdomere fluorescens fra 100% i mørktilpasset tilstand til 25% og 5% efter belysning og stiger igen til 80% og 90% som følge af en anden mørk inkubation (figur 13B).

Figure 13
Figur 13: Repræsentative resultater af TRPL::eGFP fluorescens i hvide og rødøjede fluer. (A) TRPL::eGFP-ekspresserende hvid- og rødøjede fluer blev inkuberet i mørke i 1 dag, oplyst med orange lys i 16 timer og mørkt tilpasset i 24 timer for anden gang. Billeder af fluorescerende rhabdomere blev taget ved hjælp af ikke-dødelig vanddråbemikroskopi for at registrere subcellulær TRPL::eGFP-lokalisering som beskrevet i trin 3.2.6 (hvidøjede fluer) og 3.2.8 (rødøjede fluer). (B) Kvantificering af rhabdomeral fluorescens i hvidøjede (grå) og rødøjede (røde) fluer. Hvidøjede fluer blev kvantificeret ved hjælp af formel (1) og rødøjede fluer ved hjælp af formel (2) som beskrevet i trin 3.3.9. Skalalinje: 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Til vurdering af fotoreceptordegeneration kan et degenerationsindeks baseret på fluorescensen af TRP::eGFP i rhabdomeres bestemmes (se protokol). Denne kvantificeringsmetode er illustreret i figur 10. I de repræsentative resultater her blev ikke-mutante og sdhAttd11 mutante mosaikøjede fluer holdt i en 12 timers lys / 12 timers mørk cyklus i 2 uger, og integriteten af rhabdomeres blev undersøgt hver 2-4 dage ved at observere TRP: : eGFP ved hjælp af vandnedsænkningsmikroskopi (figur 14A). Den resulterende kurve viser et fald i degenerationsindekset i mutanten, men ikke i kontrolfluer (figur 14B).

Figure 14
Figur 14: Repræsentative resultater af lysinduceret retinal degeneration i sdhA mutant fluer. (A) TRP::eGFP-ekspresserende ikke-mutant og sdhAttd11 mutante mosaikøjede fluer blev inkuberet i 14 dage i en 12 timers lys / 12 timers mørk cyklus ved 25 °C. Billeder af fluorescerende rhabdomeres blev taget ved hjælp af vandnedsænkningsmikroskopi med regelmæssige tidsintervaller for at registrere retinal sundhed. B) Kvantificering af rhabdomeral fluorescens af vildtype (grå) og sdhAttd11 mutante (orange) fluer som beskrevet i trin 3.4. Skalalinje: 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anvendeligheden af fluorescensproteiner og enkelheden ved screening ved DPP-billeddannelse og retinal vandnedsænkningsmikroskopi har vist sig at være vellykket af mange grupper12. Strategier svarende til dem, der præsenteres her, er blevet brugt i flere genetiske skærme til at detektere defekter i rhodopsinekspressionsniveauer, homeostase, retinal organisation eller cellulær integritet ved hjælp af Rh1::eGFP 17,18,19,20,21. Som forklaret ovenfor kan translokerende fusionsproteiner som TRPL::eGFP anvendes til at påvise, om proteinhandelsprocesser fra og til rhabdomere er svækkede, f.eks. i mutageneseskærme. På den anden side kan permanent rhabdomerale fusionsproteiner som TRP::eGFP bruges til at undersøge rhabdomere morfologi. DPP og vandnedsænkningsmikroskopi betragtes som fremragende metoder til analyser og skærme med høj gennemstrømning inden for modellen af Drosophila-øjet. Det anbefales dog i sidste ende at udføre (immun)histokemiske analyser af isoleret ommatidia eller kryo-sektioneret retinalvæv for at bekræfte resultater opnået ved DPP eller vandnedsænkningsmikroskopi. Parret med fluorescensmikroskopi med høj opløsning tillader disse teknikker fortolkninger mod præcise subcellulære lokaliseringer. I det følgende tilbydes et par retningslinjer for, hvordan man foretager fejlfinding af billeddannelsesprocesserne i DPP og retinal vandnedsænkningsmikroskopi, der er særlig vigtig for korrekte kvantitative analyser.

Med hensyn til DPP, hvis overlejringen af fluorescens er sløret eller utydelig, er indstillingerne muligvis ikke rigtige. En mulighed er, at øjet ikke vender mod målet præcist radialt, eller at fokus er indstillet til øjets perifere områder. Da det ommatidiale layout af fotoreceptorceller viser spejlsymmetri ved den dorsoventrale midterlinje, kan der ses et usædvanligt mønster i DPP, hvis signalerne detekteres fra begge halvkugler i øjet. Kvaliteten af DPP er også stærkt afhængig af en lav dybdeskarphed for at generere en optisk sektion gennem det sammensatte øje. Hvis overfladen på flypad viser autofluorescens, kan fluen placeres på et lille stykke sort ikke-fluorescerende pap oven på flypad'en. En manglende evne til at registrere en DPP kan være forbundet med en række underliggende årsager, herunder suboptimal fluepositionering, lave ekspressionsniveauer af det fluorescerende protein, en uorganiseret retinal arkitektur eller degenerative processer. Ved billeddannelse af DPP skal det også bemærkes, at cytoplasmatisk fluorescens i hvidøjede fluer kan diffundere grænserne for signalet fra rhabdomeres, og ekspressionsniveauerne af protein kan variere betydeligt mellem individer og påvirke kvaliteten af den resulterende DPP. I tilfælde af fluorescerende DPP-billeddannelse er det således fordelagtigt at anvende fluer med pigmenterede øjne. På grund af absorptionen af fluorescenssignaler fra cellelegemerne kan den resulterende DPP forekomme skarpere end i hvide øjne.

For at undgå slørede billeder i vandnedsænkningsmikroskopien skal billedoptagelse udføres hurtigt efter flueforberedelse for at forhindre genopvågning og bevægelse af fluen. For billeder af høj kvalitet skal de lyseste fluorescenssignaler fra øjet næsten nå mætning i alle billeder, hvis du bruger hvide øjne. Dette kan opnås ved at justere eksponeringstiden under billeddannelsen. Da pigmentering hindrer påvisning af cytosolisk eGFP-fluorescens, vil den beskrevne fremgangsmåde for hvidøjede fluer til justering af eksponeringstiden altid resultere i stærke rhabdomerale fluorescenssignaler i pigmenterede øjne, hvilket forvrænger efterfølgende fortolkning og kvantificering. Derudover kan fotoblegning på grund af stærk eksponering for blåt lys ved hjælp af pigmenterede øjne føre til svagere signaler og dermed fejlfortolkning af data. Afhængigt af konteksten (dvs. dødelig eller ikke-dødelig) præsenteres to alternative procedurer i protokollen for pigmenterede øjne. Generelt foretrækkes den ikke-dødelige variation med pigmenterede øjne, da den samme flue kan måles gentagne gange, og vurderingen af en specifik eksponeringstid for hver enkelt flue resulterer i mere præcise kvantificeringer og højere reproducerbarhed end bestemmelse af en gennemsnitlig eksponeringstid genereret fra en prøve. Den ikke-dødelige variation kræver dog også mere omhu i håndteringen af dyr for at sikre deres overlevelse under gentagne målinger. Dette kan opnås ved kun at bruge lavtryksluft til at flytte fluer ind i pipettespidsen og omhyggeligt bruge pincet til at frigøre fluen fra pipettespidsen efter billeddannelse. Da fluerne ikke er nedsænket i iskølet vand under proceduren, er der en øget risiko for genopvågning. Som et resultat af de gentagne målinger fra de enkelte prøver er hele rækken af målinger kun gyldig, hvis fluen forbliver uskadt fra start til slut. Som følge heraf er den ikke-dødelige variation meget arbejdskrævende og tidskrævende. Den dødelige variation tillader derimod en højere gennemstrømning, da flere fluer kan fastgøres efter hinanden på den samme insektstift og registreres sekventielt i en billedoptagelsesrunde. Imidlertid kræver flere fluer på den samme stift også endnu hurtigere billeddannelse for at undgå genopvågning og bevægelser. En sidste ulempe ved den dødelige variation er naturligvis manglende evne til at genvinde dyrene efter billeddannelse til efterfølgende anvendelser (f.eks. Krydsninger, gentagne målinger).

Med hensyn til kvantificering af translokation præsenterer denne protokol formel (1), som tager hensyn til fluorescenssignaler fra rhabdomere såvel som cellelegemet og dermed genererer et meget godt skøn for den relative fordeling af det translokerende protein i cellen (figur 12D). På grund af manglen på fluorescensmålinger fra cellelegemet i tilfælde af pigmenterede øjne tilbydes formel (2), hvilket fungerer godt for dette ofte forekommende problem (figur 13B). Bortset fra øjenpigmentering er der andre omstændigheder, der forhindrer kvantificeringen med en af disse formler. Et af disse tilfælde er vist i figur 12A,B i form af lolattd12-mutanten. I denne mutant påvirker fraværet af fotoreceptorcelle R7 signifikant den ommatidielle morfologi og dermed evnen til at opnå rimelige intensitetsmålinger af baggrundsfluorescens fra denne region. Hvis den samme metode til translokationskvantificering anvendes på trods af disse problemer, viser resultaterne store mængder varians, er vanskelige at sammenligne med kontroller og kan potentielt blive fejlfortolket. Eksemplet med lolattd12-mutanten illustrerer således grænserne for denne kvantificeringsmetode, som uundgåeligt er afhængig af en "vildtype"-lignende morfologi for korrekte intensitetsmålinger. I sjældne tilfælde, hvor proteintranslokationsdefekter skal kvantificeres i morfologisk defekte ommatidia, mislykkes den protokol, der præsenteres her, og den skal tilpasses i overensstemmelse hermed. Dette omfatter passende ændringer af formlen for at udelukke målinger, der ikke med rimelighed kan opnås, eller for at medtage yderligere målinger af andre repræsentative regioner.

I tilfælde af kvantificering af degenerative processer viste fluorescensintensitetstærskler sig ikke at være en god indikator, da der er for meget varians inden for og mellem rhabdomeres. Denne varians er gennemsnitlig over alle 18 målte rhabdomeres i metoden til kvantificering af translokation. På grund af den individuelle evaluering af hver rhabdomere i vurderingen af degeneration kan variansen i fluorescensintensiteter imidlertid ikke gennemsnitsvis. Desuden er intensitet kun en af de egenskaber, der skal overvejes. Andre vigtige aspekter er kontrast og skarphed af kanter. Følgelig præsenterer denne protokol en kvantificeringsmetode baseret på kategorisering af morfologien af rhabdomeres i henhold til deres fluorescens ved øjet. Dette er nødvendigvis subjektivt til en vis grad. Ikke desto mindre har denne protokol i betragtning af tilstrækkelig erfaring vist sig at være en nyttig, hurtig og reproducerbar metode til kvantificering for degeneration (figur 14) og er blevet offentliggjort flere gange22,10. Som med alle subjektive evalueringer er det altid tilrådeligt at udføre dem i en blindet sammenhæng. Protokoller fra andre grupper bruger normalt kun to kategorier til at kvantificere retinal degeneration i Drosophila (tilstedeværelse eller fravær af rhabdomeres), hvilket kan være mindre subjektivt, men også mindre præcist. Derudover har denne form for kvantificering stadig spørgsmålet om at definere et skæringspunkt mellem de to kategorier, som kan være lige så svært at definere objektivt.

Med hensyn til modifikationer og avancerede anvendelser af de metoder, der præsenteres her, er det også muligt at vurdere den relative mængde af to fluorescerende fusionsproteiner samtidigt ved hjælp af dobbeltfarvebilleddannelse. Ved hjælp af TRPL::HcRed og TRP::eGFP er TRPL::HcRed-translokation f.eks. blevet vurderet under hensyntagen til rhabdomeral integritet i samme flue23. Dobbelt farvebilleddannelse bruges også i Tomat/GFP-FLP/FRT-metoden, f.eks. til at identificere faktorer, der inducerer apoptose24. Denne variation gør det muligt at visualisere degenereringen af fotoreceptorceller via ninaC::eGFP i fluorescerende mærkede cellekloner markeret med ninaC::tdTomato. En anden anvendelse af vandnedsænkningsmikroskopi er overvågningen af phosphoinoitidomsætning i fotoreceptorer. Til dette formål anvendes fluorescerende mærkede phosphoinositidbindende domæner såsom pleckstrin homology (PH) domænet fra PLCδ1. Disse fluorescensprober tillader sporing af phosphoinositidnedbrydning over tid ved at detektere faldet i rhabdomeral fluorescens forårsaget af diffusion af sonden fra rhabdomere til cytosol25,26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke vores studenterforskere gennem årene. Især Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim og Laura Jaggy, hvis data er blevet brugt i denne protokol som repræsentative resultater. Forskning fra vores gruppe, der blev præsenteret her, blev finansieret af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) til Armin Huber.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tube Greiner Bio-One 188271
CO2 anaesthesia fly pad Flystuff 59-172
Cold light lamp (KL 1500 LCD) Zeiss
Fiji/ImageJ NIH
Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition) Zeiss
Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13)
[1750 Lux, Ee470nm = 298 µW cm-2, Ee590nm = 215 µW cm-2]
and [760 Lux, Ee470nm = 173 µW cm-2, Ee590nm = 147 µW cm-2]		 Osram 4050300518039
Laboratory pipette (20-200 µL) Eppendorf
Object slide Roth 0656.1
Petri dish (94 mm) Greiner Bio-One 633102
Pipette tips (200 µL) Labsolute 7695844
Plasticine (Blu-Tack) Bostik 30811745
Stereo microscope (SMZ445) Nikon
Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12) Leica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration. Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31 (2014).
  2. Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).
  3. Hardie, R. C. The photoreceptor array of the dipteran retina. Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).
  4. Wang, T., Montell, C. Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).
  5. Xiong, B., Bellen, H. J. Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly. Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).
  6. Bähner, M., et al. Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current. Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).
  7. Cronin, M. A., Lieu, M. -H., Tsunoda, S. Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).
  8. Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade. Journal of Cell Science. 119, Pt 12 2592-2603 (2006).
  9. Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin. European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).
  10. Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum. Traffic. , (2021).
  11. Franceschini, N., Kirschfeld, K. Les phénoménes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila. Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).
  12. Pichaud, F., Desplan, C. A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia. Development. 128 (6), 815-826 (2001).
  13. Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).
  14. Meyer, N. Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat. University of Karlsruhe (TH). , Karlsruhe. (2005).
  15. Meyer, N., Oberegelsbacher, C., Dürr, T. D., Schäfer, A., Huber, A. An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL. Fly. 2 (1), 36-46 (2008).
  16. Zheng, L., Carthew, R. W. Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye. Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).
  17. Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).
  18. Huang, Y., Xie, J., Wang, T. A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila. PloS One. 10 (12), 0144925 (2015).
  19. Zhao, H., Wang, J., Wang, T. The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).
  20. Xiong, L., et al. ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice. Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).
  21. Zhao, H., Wang, T. PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila. PLoS Genetics. 16 (10), 1009070 (2020).
  22. Cerny, A. C., et al. The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells. PLoS Genetics. 11 (10), 1005578 (2015).
  23. Richter, D. Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat. University of Karlsruhe (TH). , Karlsruhe. (2007).
  24. Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).
  25. Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).
  26. Chakrabarti, P., et al. A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors. PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).

Tags

Biologi udgave 179
Undersøgelse af membranproteinhandel i <em>drosophila-fotoreceptorceller</em> ved hjælp af eGFP-mærkede proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger,… More

Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins. J. Vis. Exp. (179), e63375, doi:10.3791/63375 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter