Summary
このプロトコルは、標準的な蛍光顕微鏡での酸素化および細胞死のマルチパラメトリック分析を使用して、バイオプリンティングのためのハイスループットスフェロイド生成を記述している。このアプローチは、スフェロイドの生存率を制御し、3D組織、腫瘍微小環境、および成功した(マイクロ)組織バイオファブリケーションのモデリングにおいて重要な標準化を実行するために適用することができる。
Abstract
多細胞スフェロイドは、組織および癌生理学を3Dで研究するための重要なツールであり、バイオファブリケーションのための組織組立ユニットとして組織工学において頻繁に使用されている。回転楕円体モデルの主な力は、組織マイクロスケールでの物理化学的勾配を模倣することにあるが、スフェロイド内部の実際の生理学的環境(代謝活性、酸素化、細胞死、および増殖のダイナミクスを含む)は一般に無視される。同時に、得られたスフェロイド表現型に対する増殖培地組成物および形成方法の影響は十分に文書化されている。したがって、研究成果の再現性と透明性を確保するためには、回転楕円体表現型の特性評価と標準化が求められています。平均スフェロイド酸素化および3次元(3D)におけるO2勾配の値の分析は、スフェロイド表現型特性評価のための簡単で普遍的な方法であり得、それらの代謝活性、全体的な生存率、およびインビボ組織微小環境を再現する可能性を指摘する。3D酸素化の視覚化は、追加の生理学的パラメータ(細胞死、増殖、細胞組成など)のマルチパラメトリック分析と簡単に組み合わせることができ、継続的な酸素化モニタリングおよび/またはエンドポイント測定に適用できます。O2プローブの装填は、スフェロイド形成の段階で行われ、スフェロイド生成の様々なプロトコルと互換性がある。このプロトコルには、導入された赤色および近赤外発光レシオメトリック蛍光O2ナノセンサによるスフェロイド生成のハイスループット法と、バイオプリンティング前後のスフェロイド酸素化および細胞死のマルチパラメータ評価の説明が含まれる。実験例は、ホモおよびヘテロ細胞スフェロイドならびにスフェロイドベースのバイオプリント構築物における比較O2勾配分析を示す。このプロトコルは、複数の蛍光フィルターと発光ダイオードを光源として有する従来の蛍光顕微鏡と互換性がある。
Introduction
分子状酸素(O2)は、細胞および組織の生存率、機能、および死を調節する重要な代謝産物の1つである。生理学的条件下では、局所的な組織酸素化は、組織血管新生、血流、および細胞代謝によって動的に調節され、場合によってはO2勾配、低酸素微小環境、および/または酸化ストレスの形成につながる1,2。細胞は、シグナル伝達機能における分子O2の直接関与(低酸素誘導因子(HIF)媒介シグナル伝達、ヒストンリジンデメチラーゼKDMおよび他の手段による)、細胞酸化還元電位の変化(Nrf2/Keap1シグナル伝達または鉄調節タンパク質を介して感知する反応性O2種を介して)を介してO2勾配を感知し、その後、それらの代謝、増殖を調節し、 効力、および分化3.したがって、細胞および組織の酸素化の不均一性、その勾配、および関連する現象は、組織発生および恒常性において重要なプレーヤーである。異なる組織および細胞型は、しばしば、異なる「正常な」生理学的O2レベルを必要とし、これは、組織O2マイクログラジエント4に従って配置された細胞を有する特別な組織アーキテクチャを定義する。一部の細胞型はO2の減少に敏感であり(例えば、ニューロン、肝細胞、膵島細胞、または筋肉細胞)5,6、他の細胞は極端な低酸素症に耐え、急峻なO2勾配(例えば、腸および結腸上皮)を形成することができる7。組織生物工学およびバイオファブリケーションの進歩に伴い、微小凝集体および回転楕円体3D組織構築物におけるO2定量の必要性が重要になる。懸念事項の1つは、生理学的パラメータの多細胞スフェロイドモデルの標準化であり、これはスフェロイド生成および培養条件8の方法に依存する。さらに、機能的な血管新生を欠くミクロ組織におけるO2放出生体材料またはO2灌流の制御されない適用は、細胞に有毒であり、それらの代謝のリプログラミングをもたらし、移植後期間における生存率を低下させる可能性がある9,10。生理学的に関連する微小凝集体の効率的な培養に到達するためのO2測定アプローチおよび酸素化環境の最適化の信頼性は、実施例11として用いた多能性幹細胞由来肝臓スフェロイドの数学的モデリングによって最近証明された。組織O2レベルの知識が認識される別の分野は、癌治療12、13である。不均一な腫瘍低酸素症は、成功した抗癌療法を損なう可能性がある。患者の治療または腫瘍低酸素モデリング中に正確な酸素化レベルを測定および制御することは、個別および個別化治療戦略の改善を可能にするであろう14。したがって、生体加工コンストラクトおよび3D腫瘍モデルにおける動的酸素化の定量的モニタリングは、それらの呼吸活性、代謝、および組織培養、製造条件、または低酸素媒介性治療応答の基礎研究の最適化の生理学的分析のための重要なツールである。
多くの方法は、スフェロイドおよび微小凝集組織構築物における細胞酸素化の多重化(またはマルチパラメータ)分析を可能にする。ニューロスフェアおよび腫瘍スフェロイド15,16,17の先駆者であるリン光寿命イメージング顕微鏡(PLIM)ベースのアプローチは、生きたミクロ組織における細胞酸素化の直接定量化を可能にし、細胞生存率、増殖、または機能的な細胞型の分布との相関関係を確立することを可能にする。このアプローチの力にもかかわらず、PLIM顕微鏡のアップグレードは、人気のある顕微鏡ベンダーの間でもまだ広く利用できません18,19。幸いなことに、多数の細胞透過性O2感受性ナノ粒子プローブを、蛍光強度ベースのレシオメトリック測定モード15、17、20、21、22、23、24に使用することもできる。典型的には、プローブは、蛍光顕微鏡、高含有量スクリーニングイメージャ、またはマイクロプレートリーダー上で測定することができる2つの発光波長、すなわち、O2感受性および非感受性(基準)を表示するであろう。このようなO2センシングナノ粒子は、可視スペクトルおよび近赤外スペクトルにまたがる生体適合性ポリマー、O2センシング、および参照色素を用いた沈殿技術によって製造することができ、またはそれらは商業的に購入することができる2,25。厚い3Dミクロ組織の分析は、赤方偏移蛍光色素の使用から利益を得るであろうので、O2センシングPtTPTBPF26および基準アザ−BODIPY27色素からなる比重計O2センシングナノ粒子プローブマルチモーダル赤外番号1(MMIR1)28を構築した。この設計では、O2感受性信号(近赤外線、励起(exc.)=635nm、発光(em.)=760nm;Isens)は、燐光消光工程を介して[O2]濃度の影響を受け、一方、赤色基準色素強度(exc. = 580 nm, em. = 650 nm;I参照)は影響を受けないままである(図1A)。これにより、染色細胞におけるIref/Iセン比(R)がO2校正22を可能とすることができる。
ここでは、スフェロイドおよびバイオプリント構築物における生細胞酸素化をモニタリングするための半定量的アプローチについて説明し、エンドポイントおよび動力学的測定におけるO2勾配の推定に役立つ。このようなO2イメージングは、他のタイプのレシオメトリックO2プローブ(図1B)を用いて行うことができ(図1B)、利用可能な光源および蛍光フィルターの数に応じて、他の色素と共に使用して、生細胞/死細胞、ミトコンドリア機能、および他の細胞タイプのトレースに関する情報を得ることができる。蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)などの高度な測定モードも使用することができます19。細胞染色色素およびO2感受性ナノ粒子の使用における最大の課題は、染色プロトコールの最適化である。MMIR1プローブおよび関連ナノ粒子の場合、細胞は、回転楕円体形成のプロセス中に予め染色されるか、または共インキュベートされる。記載されたプロトコルでは、O2プローブ染色されたスフェロイドが低接着性のアガロース表面29、30、31、32上に生成され(図1C)、これはその後のスフェロイドベースのバイオプリンティングおよびO2および細胞死のマルチパラメータ分析を可能にする。アプローチの適用性を例示するために、ヒト歯髄幹細胞(hDPSC)スフェロイド(ヒト臍帯静脈内皮細胞、HUVEC)のホモまたはヘテロ細胞における酸素化レベルを、従来の蛍光顕微鏡を用いてバイオプリンティングの前後で比較した。
Protocol
1.O2感受性プローブを内蔵したスフェロイドの高スループット生成
- マイクロパターンアガロース被覆組織培養プレートの作製
注:マイクロパターン化されたアガロースコーティング組織培養プレートは、複数の実験複製または大きな回転楕円体数が必要なバイオプリンティングおよびその他の用途のために、多数のスフェロイド(PDMSスタンプあたり1585、 材料表を参照)の同時生成に使用されます。- すべての滅菌材料および器具(ヘラおよびピンセット)は、可能な場合はオートクレーブ処理またはフィルター滅菌によって準備します。リサイクル可能なPDMSスタンプ33 をアガロースから洗浄し、70%エタノールに無菌的に保管する。回転楕円体生成の少なくとも1日前にこれを行う。
- マイクロパターンのPDMSスタンプを保管バイアルから滅菌ペトリ皿に移し、滅菌層流気流条件下で滑らかな表面を10分間風乾します。
- マイクロパターン化された表面を有する各スタンプを12ウェル滅菌組織培養プレートのウェルの中央に上方(および平滑表面下方)に置く。開いた蓋で1〜2分間空気乾燥させる。
メモ:乾燥スタンプだけがプラスチック表面に完全に固執し、手順中に取り付けられたままになるため、余分な液体を蒸発させることは非常に重要です。 - きれいな200mLのガラス瓶に1.5gのアガロースを秤量し、50mLの滅菌蒸留水を加え、蓋をして電子レンジで溶かして50mLの3%均質アガロース溶液を作る。
警告: アガロース溶液は非常に高温であるため、取り扱いには注意が必要です。溶融手順の直後に振とうすると、熱いアガロース溶液がバブリングを開始し、容器から爆発する可能性があります。時折の外傷を避けるために、アガロース溶液で最大50%の体積で満たされた十分に大きな容器を使用してください。 - 滅菌血清学的ピペットを用いて、挿入されたPDMSスタンプを完全に覆うために、12ウェル細胞培養プレートの各ウェルに〜2mLの熱いアガロース溶液を直ちに加える。アガロースを放置し、プレート蓋を開けた状態で滅菌気流下でインキュベートして20分間固化させる。
注:PDMSスタンプ除去後のアガロースマイクロウェルの完全性を確保するために、アガロース層はPDMSスタンプよりも少なくとも2倍厚くする必要があります(図1C)。 - 滅菌された小さなヘラを使用して、各ウェルに埋め込まれたPDMSスタンプでアガロースを正確に裏返し、滑らかなスタンプ表面を上にします。スタンプの滑らかな上面に約200μLの滅菌水を加え、ヘラでアガロースから静かに取り外し、ウェルから取り出します。マイクロウェルの損傷は避けてください。
- 直接使用するために、対応する滅菌細胞培養培地1mLをアガローススタンプに加える。プレートを蓋で覆い、4°Cで一晩インキュベートした。 長期保存(4°Cで最大2週間)には、PBS溶液(培地の代わりに)を使用してください。アガロースを乾燥させないでください。使用前に、アガロースマイクロパターンプレートをCO2 インキュベーター内で37°Cで1時間温める。
注:インキュベーションは、アガロースマイクロウェルから気泡を平衡化および除去するために必要です。プロトコルステップ 1.2 に進みます。
- Oの準備2 プローブ搭載回転楕円体
- hDPSCおよびHUVEC細胞株の培養には、それぞれ10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したα最小必須培地(MEM)、および増殖因子補充内皮細胞増殖培地2を使用する。hDPSC/HUVECヘテロ細胞スフェロイド増殖培地を調製するには、HUVECとhDPSC増殖培地を1:1の比率で添加する。
- 70%〜90%コンフルエントな細胞培養物を調製する(〜3〜4日間の調製)。ヘテロ細胞スフェロイドの生成のために、hDPSCおよびHUVEC培養物をそれぞれ調製する。
注: HUVEC および hDPSC の通過番号は 8 を超えてはなりません。細胞培養物の急速な増殖を確実にするために、3〜4日ごとに新しいフラスコを使用して、常に全細胞培養物の1/3(70%〜80%コンフルエント)で分割する。 - 70%〜90%コンフルエントな細胞培養物を、予め加温した(37°C)PBS(75cm2フラスコあたり10mL)ですすいでください。解離酵素溶液(0.05%トリプシンおよび1 mM EDTA;75 cm2フラスコあたり1 mL)を加え、細胞剥離のために5%CO2、湿度95%で37°Cで3〜5分間インキュベートし、顕微鏡下で細胞剥離を確認する。完了したら、10%FBSを含む完全な細胞培養培地(解離溶液1mLあたり5mLの培地)でトリプシンを中和する。
注:解離酵素溶液への細胞の過剰暴露は、生存率に影響を与える可能性があるため、防止してください。 - 低FBS培地で培養したHUVECの場合、トリプシン処理した細胞培養物に100%FBSを0.5 mL添加してトリプシン中和を行い、遠心分離を行い、細胞をそれらの増殖培地に移した。
注:得られた細胞懸濁液は、1mLあたり約100万個の細胞を含むべきである。必要に応じて、追加の遠心分離工程をプロトコールに追加して、細胞懸濁液を濃縮することができる。 - 10 mL血清学的ピペットの上部に1000 μLのピペットチップを用いたピペッティングによって細胞凝集物を解離させ、単一細胞懸濁液を得た。計数チャンバー(ノイバウアー型血球計数器または代替物)を使用して、細胞懸濁液34の1mLあたりの細胞数を計数する。細胞懸濁液を1mLあたり500,000細胞に希釈する。1:1のスフェロイド比のヘテロセルhDPSC/HUVECの場合、等量の対応する細胞懸濁液を加えて、1mLあたり500,000細胞の最終細胞濃度を有する。
注:マイクロパターン化されたアガローススタンプに添加された懸濁液中の細胞濃度の変化は、アガローススタンプのマイクロウェルあたりの細胞数に依存する産生されたスフェロイドの平均サイズを変更することを可能にする。記載されたセットアップでは、〜300個の細胞のスフェロイドが、1585個のマイクロウェルを有するアガローススタンプ上の500,000個の細胞を含む1mLから生成される。 - 濃縮O2 プローブ(ナノ粒子、1mg/mLストック)溶液を調製細胞懸濁液に終濃度5μg/mLとなるように加える。
注:O2センシングナノ粒子の存在下での回転楕円体形成は、効率的な染色を提供し、最低5日間保存される(図1D)。対照的に、ナノ粒子による予め形成された多細胞スフェロイドの染色は効率が悪くなる15。 - 12ウェルのアガロースコーティングされた細胞培養プレートのマイクロパターン化されたウェル(ステップ1.1.7を参照)の1mLの古い培地を、調製した細胞懸濁液1mL(1mLあたり500,000細胞、5μg/mLのO2 プローブ)と交換する。スフェロイドをCO2インキュベーター内でO2 プローブの連続存在下で2 〜5日間培養し、スフェロイド形成および圧縮中のその負荷を確実にする。
注: スフェロイド培養では、培地の過剰な蒸発を避けてください。必要に応じて、慎重に(マイクロウェル内のスフェロイドを乱さないでください)、追加のO2 プローブ希釈液とともに0.2〜0.5mLの培養培地を加えます。 - スフェロイド形成後、成長培地をプローブのない新鮮なものと交換する。プローブ染色は、生成されたスフェロイド中に7〜14日以上保存され、スフェロイド中のシグナルの長期モニタリングが可能になります。
2. 回転楕円体バイオプリンティング
注:スフェロイドは、メタクリルアミド修飾ゼラチン(GelMA)ベースのバイオインクでバイオプリントされています。以下、バイオインク成分、バイオインク調製の手順、およびバイオプリンティングについて説明する。
- バイオインク調製
- 層流35下の培地中に10%(w/v)GelMA溶液(2mL)を調製する:15mL チューブに置換度78の滅菌GelMAを0.2g秤量し、1.9mLのα-MEMを加え、37°C(〜2時間)のロータリーシェーカー上で混合して溶解させる。
注:スフェロイドや光開始剤Li-TPO-Lなどの他の化合物は後で添加されるため、培地の全量を加えないでください。 - ピペッティングによってマイクロパターン化されたウェルにスフェロイドを再懸濁し、15mLチューブに集める。PBSで追加のすすぎを行い、すべてのスフェロイドがアガロースマイクロウェルから収集されるようにします。アガロースのフレークがバイオプリンティング中に針を塞ぐ可能性があるため、アガロースマイクロウェルに触れたり傷つけたりしないでください。
- スフェロイドを遠心分離により、15 mL チューブで 300 x g で 20 °C で 5 分間収集します。 上清をピペットで吸引し、スフェロイドに50μLの培地を加え、穏やかなピペッティングによってそれらを再懸濁する。
- スフェロイド混合物を温かいGelMA溶液に加え、穏やかなピペッティングによって混合する。スフェロイド濃度を、バイオプリンティング用バイオインク mL あたり 6340 ~ 12860 個のスフェロイド (4 ~ 8 個のマイクロパターンから) に維持します。高濃度の回転楕円体は印刷針のブロッキングを引き起こしやすいため、避けてください。
- フィルター滅菌した光開始剤Li-TPO-L原液(32mg/mL)を二重結合数に対して終濃度2モル%で加え、穏やかなピペッティング36、37により混合する。
注: Li-TPO-L の量は、次の式に従って計算できます。
光開始剤の体積(PI)=(ゲルMAの0.000385モルNH2-基/g×294.10gのLi-TPO-L/モル×0.78×0.02)/0.032gのLi-TPO-L/mLの0.2gのゲルMA=0.0107mLのLi-TPO-Lストック
- 層流35下の培地中に10%(w/v)GelMA溶液(2mL)を調製する:15mL チューブに置換度78の滅菌GelMAを0.2g秤量し、1.9mLのα-MEMを加え、37°C(〜2時間)のロータリーシェーカー上で混合して溶解させる。
- バイオプリンティング手順
- CAD での足場の設計については、 補足プロトコル 1 の手順を参照してください。デザインをバイオプリントするには、次の手順に従います。
- 滅菌された3ccカートリッジの端をチップキャップ(ルアーロック)で閉じ、ピペッティングでバイオインクで満たします。プランジャーをカートリッジに挿入します。カートリッジを逆さまにして先端キャップを取り外し、カートリッジからの空気がすべて取り除かれるまでプランジャーをバイオインクの方に押します。
注:GelMAバイオインクとカートリッジの側面との接触は、バイオインクのゲル化によるプランジャーの動きを妨げる可能性があるため、避けてください。 - バイオインクをバイオプリンターの加熱マントルで23°C(20~30分)で冷却させます。カートリッジ上部の圧力アダプタをねじ込みます。バイオインクが漏れないように入口チューブのクリップを閉じ、カートリッジに22Gの円錐形PEニードルを取り付けます。針のサイズと直径を足場の設計と回転楕円体の直径と濃度に適合させます。
注:汚染を防ぐために、口内マスクとスプレー手袋を着用してください。 - バイオプリンターに70%エタノールをスプレーし、吸収紙で拭き取ってください。カートリッジを押出ベースのプリントヘッドの加熱マントルに取り付けます。圧力インレットを差し込み、インレットのクリップを開きます。デザインのGコードファイルを印刷ソフトウェアにロードします。
- 針の長さ測定を開始します。滅菌ペトリ皿に少量のバイオインクを分配して印刷圧力を調整します。0.025〜0.045MPaの印刷圧力は、GelMAベースのバイオインク38の印刷に典型的である。
- 6穴プレートを取り付け、ウェルプレートを開けてフードを閉じ、印刷を開始します。印刷後、足場を5°Cで10分間物理的に架橋させ、印刷した足場にUV LEDランプ(365nm、メーカーによると500mW)を60秒間照射します。
注:UV架橋時間は、UV光の特性、光開始剤の種類および濃度、所望の足場架橋度、膨潤、および弾性率に依存する。 - 100 U/mLのペニシリンおよび100 μg/mLのストレプトマイシン(P/S)を含む対応する増殖培地を、バイオプリントグリッド(6ウェル細胞培養プレートのウェルあたり2 mL)を有するすべてのウェルに直ちに添加する。
- 顕微鏡観察を開始するまで37°CのCO2 インキュベーター内で培養する。バイオプリントされたコンストラクト顕微鏡では、印刷されたワッフルグリッドを顕微鏡観察皿に移し、イメージングメディアで覆い、ステップ3.2および3.3に進みます。
注:浮遊バイオプリント構築物の場合、それらは、細胞生存率に影響を与えることなく、例えば、細胞適合性接着剤を用いて顕微鏡ディッシュ内で固定されなければならない。倒立顕微鏡転写の場合、バイオプリントを顕微鏡製ガラス底ディッシュに、試料の望ましくない浮遊を避けるために、イメージング媒体(〜200〜500μL、画像化媒体組成についてはステップ3.1への注を参照)で覆う。追加の蛍光プローブによる染色は、バイオプリントされた構築物を顕微鏡ディッシュに移す前に、細胞培養ディッシュ内で行うことができる(ステップ3.1.6を参照のこと)。
3. 生体作製組織におけるスフェロイド酸素化のレシオメトリック蛍光生顕微鏡
注:O2プローブのレシオメトリック強度応答(R)を実際の低酸素レベルに変換するには、プローブ応答を24に記載した手順を使用して較正する必要があります。ただし、レシオメトリック校正は機器固有であり、T/O2/CO2制御インキュベーター(常に利用できるとは限らない)の設置が必要なため、半定量比検出の使用が好ましい選択肢です。
- ライブイメージング解析のための回転楕円体の準備
- この工程中のスフェロイド付着のために、滅菌顕微鏡ディッシュをコラーゲンIVおよび/またはポリ−D−リジンで予めコーティングするか、または市販のもの39を使用する。顕微鏡皿と顕微鏡の対物レンズの作動距離やその他の特性との互換性を確認してください。
注:マルチパラメータイメージングの場合、すべての追加の染色手順は、蒸発、浸透圧ショック、またはその他のストレスから細胞を保護する十分な量の培地を含む培養プレート皿で行う必要があります。使用前にイメージング培地を調製し、予備温めてください:DMEMに炭酸水素ナトリウム(1.2 g/L)、HEPES-Na、pH 7.2(10 mM)、ピルビン酸ナトリウム(1 mM)、L-グルタミン(2 mM)、およびグルコース(5 mM)を添加(フェノールレッドなし)。 - 1mLピペットを用いて、予め染色されたO2プローブスフェロイドをアガロースマイクロウェルから穏やかに洗い流す。回転楕円体がまだ媒体中に浮かんでいる間、それらを15mLの円錐形の底管に移す。
- マイクロパターン化されたウェルからのすべてのスフェロイドの収集を確実にするために、追加の1mLの培養培地でウェルを1〜3回すすぎ、すべてのスフェロイド懸濁液を1つのバイアルに組み合わせる。バイアルを垂直位置に最大10分間放置して、スフェロイドがバイアルの底に落ち着き、目に見えるペレットを形成します。
- 回転楕円体を乱さないようにチューブからメディアを慎重に取り出します。顕微鏡サンプル皿あたり少なくとも20個のスフェロイドに十分であるであろう量の新鮮な培養培地にそれらを穏やかに再懸濁する。これにより、培養培地の使用が最小限に抑えられ、イメージング中のスフェロイドの位置が簡素化されます。
注: カバーガラスに取り付けられたμチャンバー 12 ウェルプレート ( 材料表を参照) のオートクレーブ可能なシリコン部分を、ウェルあたり最大メディア容量 300 μL の顕微鏡サンプル皿 (24 x 60 mm、厚さ #1) として使用します。この培養チャンバのシリコン部分は、皿に付着させたときに滅菌し、他のプラスチックおよびガラス表面と共に再利用することができる。 - 直ちに等量の回転楕円体懸濁液を各顕微鏡検査皿/ウェルに加える。スフェロイドをCO2 インキュベーター内で37°Cで1時間放置し、顕微鏡観察皿の表面に付着させた。他の色素の使用と相まって酸素化分析のためにステップ3.1.6を続行する。簡単な酸素化分析を行うには、ステップ 3.1.7 に進みます。
注: インキュベーション時間 (<1 時間) が不十分な場合、培地交換中に時折回転楕円体が除去および失われ、実験が中止される可能性があります。同時に、オーバーインキュベーション(>3時間)は、スフェロイドから顕微鏡ディッシュ表面への細胞の移動およびそれらのリアルタイム酸素化の影響により、3D組織の部分的または完全な喪失をもたらし得る。 - (オプション)染色濃度に希釈した蛍光プローブを含むプローブと培地を慎重に交換し、最適な強度に達するまでさらに1時間インキュベーションを続けます。培地交換中のスフェロイドの除去を避けるため、顕微鏡ディッシュの端から200μLのピペットで培地を慎重に吸引し、顕微鏡ディッシュ内で培地添加を横向きに行う。ステップ 3.1.7 に進みます。
注:多細胞凝集体における拡散の悪いプローブで効率的に染色するには、ローディング濃度および/または時間を延長してください。使用前に、予備実験でオプションのプローブ負荷パラメータを決定します。 - 顕微鏡観察皿から培地を取り出し、イメージングメディアで1回すすいでください。正確な量のイメージング培地をサンプルに加える(例えば、12ウェル培養プレートのμチャンバーのマイクロウェルあたり300μL)。ステップ 3.2 に進みます。
- この工程中のスフェロイド付着のために、滅菌顕微鏡ディッシュをコラーゲンIVおよび/またはポリ−D−リジンで予めコーティングするか、または市販のもの39を使用する。顕微鏡皿と顕微鏡の対物レンズの作動距離やその他の特性との互換性を確認してください。
- 画像取得
- イメージングの30分前に顕微鏡および接続されたデバイス(すなわち、励起光源、カメラ、コンピュータ、インキュベーター、およびその他の動作電子ブロック)の電源を入れてウォームアップし、測定条件(温度、O2の異なる値、5%CO2、必要に応じて湿度)に平衡化します。正確な顕微鏡セットアップで提供される顕微鏡オペレーティングソフトウェアを起動します。
メモ: 記載されているプロトコルは、CellSens Dimension ソフトウェア v.3 に適合しています。 - 適切な励起(光源、電力)および発光フィルタ、および選択した蛍光(または燐光)プローブの露光時間を選択します。マルチパラメータ、3D、およびタイムラプス顕微鏡分析の場合は、自動測定シーケンスプロトコルを操作顕微鏡ソフトウェアに記述します。
- 予備実験において、各プローブ、実験モデル、および細胞株に最適なイメージング設定を経験的に決定する。特に3Dおよびタイムラプス測定実験において、設定が基準(I参照)およびO2 センシング(Iセン)チャネルにおける最小のフォトブリーチングおよび強度比(R = I参照 /Iセン)への影響を最小限に抑えていることを確認してください。
- 顕微鏡検査ステージ上に染色された回転楕円体を含む顕微鏡皿をセットアップする。低倍率対物レンズを使用して、透過光でサンプルをプレビューし、回転楕円体に予備的な焦点を合わせ、画像の中心に配置します。
注:標準の4倍から10倍の倍率の空気対物レンズはプリフォーカスに十分ですが、実際の測定では、皿に取り付けられた回転楕円体に十分な作動距離を持つ開口数(NA)が0.6以上(空気または水浸漬)の対物レンズで20倍から40倍をお勧めします。 - 必要な高倍率の対物レンズを作業位置に持参してください。回転楕円体の中央(赤道)断面の透過光モードに注目します。3Dオブジェクトにおける酸素化は、イメージングセクションの深さに直接依存します。これを確実にするには、グループ内およびグループ間の類似の断面 (スフェロイドの中央断面、上部/下部断面など) を分析します。
注:O2 勾配の詳細かつ正確な分析と再構成のために、コンフォカル、ライトシート、または2光子(最良の選択肢)顕微鏡を使用してZスタックをスキャンして生成することをお勧めします。すべての断面からの信号が同時に収集される従来の広視野顕微鏡では、O2 勾配の正確な分析ではなく、中間断面による平均推定を行うことができます。この場合、中央の断面は焦点断面として定義され、回転楕円体は最大直径を持ち、境界に鋭い焦点が当てられます。 - マルチパラメトリックイメージングに適用されるO2 プローブおよびその他の蛍光プローブの基準および高感度スペクトルチャネルの蛍光/リン光シグナルの収集に関する設定を調整します。
- 定量的な強度ベースの比較では、グループ内のすべての測定対象物に対して、露光時間、励起光源電力、解像度、スキャン速度、ピンホールサイズなど、選択した同じイメージング設定を適用します。
メモ:ベンダーが提供する多くの顕微鏡ソフトウェアバージョンでは、強度比の自動計算が可能です。O2プローブの基準および高感度チャネルの強度測定にマージする機能を適用し、ここで用いるイメージングソフトウェアで実験マネージャにイメージング取得プログラムを書き込む場合。 - O2プローブの参照および高感度スペクトルチャネル、および必要に応じて追加の蛍光チャネルのために、同じ光学セクションから画像を収集します。このプロトコルでは、赤色リファレンス(例 = 580 nm、em. = 650 nm)および近赤外 O2 感受性スペクトル (例: 635 nm、em. = 760 nm) スペクトルを持つ MMIR1 プローブを使用します。
- 手順 3.2.5 ~ 3.2.8 を繰り返して、統計分析に十分な数のデータ ポイントを収集します。異なる薬物、ミトコンドリアのアンカプラーまたは電子輸送鎖の阻害剤および他の速効性化合物による治療時に急速に進化する細胞応答の動的分析のために、タイムラプス測定モードを使用する(ステップ3.2.10)。
- サンプルの定期的な照明を伴う37°Cでイメージング媒体中で測定を行い、目的の蛍光色素(例えば、O2 プローブリファレンスおよびセンシングチャネル)のシグナルを、例えば、2分間にわたって10秒ごとに収集する。
- 定期的な測定が完了したら、すべての回転楕円体のフォーカスチェックを実行して、イメージング中にフォーカスドリフトがなかったことを確認します。必要に応じて繰り返します。ステップ 3.3 に進んでデータ分析を行います。
注:細胞刺激および薬物添加なしで、タイムラプス測定を行って、参照色素、例えば、フルオレセイン、カルセイングリーンAMまたはテトラメチルローダミンメチルエステルと比較して、光安定性を評価することができる。
- イメージングの30分前に顕微鏡および接続されたデバイス(すなわち、励起光源、カメラ、コンピュータ、インキュベーター、およびその他の動作電子ブロック)の電源を入れてウォームアップし、測定条件(温度、O2の異なる値、5%CO2、必要に応じて湿度)に平衡化します。正確な顕微鏡セットアップで提供される顕微鏡オペレーティングソフトウェアを起動します。
- 画像プレゼンテーション
注:ここでは、Oを自動的に計算する方法について説明します2 スフェロイドにおけるプローブ強度比(R)は、撮像ソフトウェアにおける比解析機能を用いて、画素別R計算を適用し、回転楕円体顕微鏡断面の偽色R分布画像を生成する。Rは、単純な式R=Iを適用することによって、回転楕円体画像の同じ関心領域(ROI)から収集された参照スペクトルチャネルおよび高感度スペクトルチャネルの強度データから手動で計算することもできる。参照/Iセンス24,34.対応する顕微鏡ソフトウェアで生画像から強度データを抽出できない場合、強度データは、ImageJまたはフィジーなどのプログラムを使用して取得することができる(「考察」を参照)。- マージモードで作成された参照および敏感なスペクトルチャンネルからのO2プローブ強度データを含む.vsiファイルを開きます。メジャーメニューから比分析機能ウィンドウを開きます。参照チャンネルの強度を分子として選択し、感度チャンネルの強度を R 計算の分母として選択します。
注:Rを計算するための基準信号と敏感な信号の逆の比率も可能ですが、この場合、RはO2の増加とともに減少します。 - 対応する強度しきい値設定を各スペクトルチャンネルに適用して、マージされた強度イメージから背景を減算します。画像の背景が均一に黒くなるまで、しきい値を増やし続けます。しきい値パラメーターは、比較分析で使用されるデータ セット内のすべての回転楕円体画像に等しく適用します。
メモ: プレビューウィンドウを使用して、スフェロイドの予備計算された偽色 R 画像を観察することにより、しきい値設定を最適化します。しきい値フィールドの現在の値よりも低い強度を持つすべてのピクセルは、R 分析から削除され、黒い斑点として表示されます。閾値適用後、スフェロイド蛍光に対応する領域のみを可視化すべきである。独立したスペクトルチャンネルの平均背景強度(回転楕円体のない領域)の予備推定は、画像に対する適切な閾値の選択を簡素化します。さらに、対応する透過光スフェロイド画像からマージされた蛍光画像に同定されたスフェロイドROI境界の適用は、非バックグラウンド信号強度の過度の減算を防止する閾値パラメータの正確な決定に役立つ。 - 分子と分母の強度の背景設定は、しきい値アプリケーションで背景が既に減算されているため、0 のままにします。
- プレビュー画像がRグラデーションの所望の解像度を提供するまで、比率画像に対するスケーリング係数(Scale)を調整します。スケーリングパラメータは、比較解析で使用されるデータセット内のすべての回転楕円体画像に等しく適用します。
注: スケーリング パラメーターは、R イメージにできるだけ多くの情報が含まれ、R 数値データの解像度係数として表示できるように、十分な大きさ (少なくとも 1,000) にする必要があります。 - 調整されたパラメータを回転楕円体画像に適用するには、「 適用」を押します。ツールウィンドウメニューから表示調整ウィンドウで画像の明るさとコントラストを調整します。
- 比率分布ヒストグラムのリンク制限とリンク解除限界を手動で決定するには、「表示の調整」ウィンドウの固定スケーリング・オプションを使用します。これにより、R パラメーターの表示の偽色バーの範囲が決まります。
注: 異なるグループ間で回転楕円体画像を比較するには、すべての分析サンプルで同様のカラーバー範囲を維持することが重要です。Rパラメータの変更の範囲はグループ間で異なる可能性があるため、選択した偽色バーの範囲は、すべての分析グループの分布ヒストグラムに対して普遍的である必要があります。 - 回転楕円体は、しばしば理想的には球状ではなく、回転楕円体直径が回転楕円体の中心(しばしば低酸素コア)を通って引かれた最長の線であると仮定する。測定メニューの線形定規機能を使用して、回転楕円体の直径を決定します。データをスプレッドシートのテーブルファイルとしてエクスポートします。
- 必要なサイズ(できるだけ小さい)および形状(例えば、円形)のROIを選択し、それを回転楕円体の周囲および低酸素コアに適用する。ROIを測定対象物に変換して、選択したROI内の平均R(周辺R-Rp およびコアR-Rc)を分析します。スプレッドシートと互換性のある表形式でデータをエクスポートします。
注:回転楕円体はグループ間で同一のO2分布を持たず、低酸素コアは回転楕円体中心と完全に共局在化しない。解析を単純化および標準化するために、最も低酸素領域が回転楕円体の中心にある理想的なコアに対応すると仮定します。これらのゾーンで測定されたRcは、O2勾配範囲(Rp−Rc)および急峻度(Rp−Rc)/rの計算に適用され、ここでr(理想的には、周辺と低酸素コアROIとの間の距離)は、直径測定値から計算されたμm単位の回転楕円体のおおよその半径である。任意選択で、回転楕円体O2勾配は、回転楕円体直径に沿ってなされるRパラメータ変更(測定メニューの線プロファイルウィンドウ)の線形ラインプロファイルとして提示することができる。このデータは、スプレッドシートのテーブルファイルとしてエクスポートすることもできます。 - 回転楕円体の各顕微鏡セクションに測定値を適用して、回転楕円体直径、Rc およびRp のデータセットを取得し、さらなる計算および統計的比較を実行する。すべてのデータを 1 つのスプレッドシート ファイルに結合します。
- 異なる刺激に対するフォトブリーチングまたは動的応答のタイムラプス解析では、選択したROIをセット内の各画像の同じ座標に適用します。R パラメーターを比較するには、タイムラプス イメージ セットの最初のサイクルの R からのパーセンテージとして表示します。
- フォトブリーチング解析では、複数のROIからRを使用して、各タイムラプスサイクルの平均Rをパーセンテージで計算し、変化を追跡します。
- 連続照明の12サイクル後の初期強度の減少が5%未満であった場合、フォトブリーチング効果は重要ではないと仮定する。動的変化をコントロールとしてフォトブリーチング曲線と常に比較して、レシオメトリックタイムラプス応答の有意性を確認します( 図2A、Bを参照)。
- 得られたパラメータから、データセット内の個々のスフェロイドについてr、(Rp−Rc)および(Rp−Rc)/rを計算する。コルモゴロフ-スミルノフまたは関連する検定によるデータ分布の正規性を分析します。データ分析に適した統計手法を選択し、データ表示の数値に進みます。
注:ここに提示されたデータは正規分布しており、回転楕円体群間の統計的比較のためにp = 0.05での独立した t検定が実装された。
- マージモードで作成された参照および敏感なスペクトルチャンネルからのO2プローブ強度データを含む.vsiファイルを開きます。メジャーメニューから比分析機能ウィンドウを開きます。参照チャンネルの強度を分子として選択し、感度チャンネルの強度を R 計算の分母として選択します。
Representative Results
マイクロパターン化アガロース法を用いて予め染色されたスフェロイドのO2プローブのハイスループット生産を、予め染色されたスフェロイドを有さずかつそれを用いたアガロースマイクロウェルの例を示す図1Cに模式的に示されている。アガロースコーティング上の回転楕円体形成の効率およびそれらの形状/真球度は、細胞特異的であり得る。例えば、ヒト結腸HCT116細胞は、脂質コーティングされた表面17とは対照的に、アガロースマイクロウェル法を用いて理想的な球状構造を形成することはなかったが、hDPSC単独でHUVECと共培養すると、細胞組成、初期細胞数、およびスフェロイド形成/増殖の持続時間に比例した再現性の高い形状およびサイズのスフェロイドが常に産生された。試験されたすべての細胞型は、スフェロイド形成中にO2プローブナノ粒子を効率的に蓄積し(図1B)、この染色を少なくとも5日間にわたって保存し、バイオプリンティングおよびその後のバイオプリント組織酸素化のモニタリングにそれらを使用することを可能にする(図1D)。
図1:O2プローブ機能の原理とスフェロイド染色およびバイオプリンティングへの応用 (A)燐光発光ナノ粒子(NP)プローブによるO2センシングの原理を説明する単純化されたヤブロンスキー図。禁制三重項励起状態(T)中の分子O2へのエネルギーの移動は、励起から一重項状態(S1)への励起と基底状態(G0)42との間の時間であるリン光寿命τ(0%O2のτ1から21%O2への変化)に反比例するリン光強度の減少をもたらす。定量的O2測定は、レシオメトリック測定またはτの測定(リン光寿命測定)によって行うことができる。(b)異なる種類のナノ粒子O2プローブで染色されたヒト歯髄幹細胞(hDPSC)スフェロイドの染色の一例を、透過光、参照、およびO2感受性色素蛍光チャネルに示す。(C)マイクロパターン化アガロース法を用いて予め染色されたスフェロイド生成のハイスループットO2プローブの概略図。左から右へ:培養プレートのウェルに入れたPDMSシリコンスタンプ、アガロースでマイクロウェルパターンの例(倍率4倍)、およびマイクロパターンアガロース上に播種後2日目にHCT116ヒト大腸癌細胞から産生されたMMIR1プレ染色スフェロイドの例(倍率4倍)。(D)左から右へ:バイオプリントワッフルコンストラクトと、バイオプリント後の1日目および5日目にMMIR1プレ染色されたスフェロイドバイオプリントコンストラクトの顕微鏡分析。蛍光シグナルは、MMIR1ナノ粒子中のO2感受性燐光発光色素(例:635nm/em. = 760nm)に対応する。スケール バーは 400 μm です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
記載された顕微鏡セットアップ(光源として発光ダイオード(LED)を搭載した従来の広視野蛍光顕微鏡)では、赤色/近赤外MMIR1プローブは、その基準および感度色素の光安定性の点で最高であることが判明しました。)連続照明の12サイクル後。これにより、電子輸送鎖の複合体Iのミトコンドリアアンカプラ(FCCP)および阻害剤による治療時のhDPSCスフェロイドにおける迅速な呼吸応答の動的リアルタイム研究にMMIR1プローブを使用せた(図2A、B)。幹細胞由来スフェロイドでは、FCCPは、DPSC40の以前に報告された代謝特性と一致して、この薬物を添加した後〜80秒以内に細胞呼吸のわずかな減少を伴う軽度の脱共役効果しか示さなかった。一方、ロテノンは、刺激後〜80秒以内のスフェロイド間O2勾配のスフェロイド再酸素化(Rp−スフェロイド周辺比およびRc−スフェロイドコア比の増加として反映される)および周辺コアO2勾配の散逸をもたらす呼吸を強く阻害した(図2A)。高(大気)および低(イメージング媒体中の亜硫酸ナトリウムおよびグルコースオキシダーゼ存在下)におけるMMIR1プローブ比(R)の2点半較正により、アンチマイシンA/ロテノンカクテル処理による予備呼吸を伴うスフェロイドにおける酸素化の減少に関連するRの減少が確認された(図2C)、MMIR1プローブRの測定が、3Dにおける長期定常状態および迅速な酸素化応答の半定量的モニタリングにどのように適用できるかを示す。
図2:異なる刺激に対するO2 プローブ応答の速度論的解析。 (a)安静時およびFCCPおよびロテノン処置に応答したhDPSCスフェロイド酸素化画像化の代表的な結果。(B)初期フォトブリーチング強度比速度論と比較したFCCPおよびロテノン処理に対するMMIR1強度比の速度論的応答(%)。(c)酸素化(アンチマイシンA+ロテノン添加)および脱酸素化(グルコースオキシダーゼ添加)状態におけるhDPSCスフェロイドにおけるMMIR1プローブの強度比の変化画像。カラーバーは、画像全体のO2 プローブ強度比(R=Iref /Iセン)分布を表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
生代謝イメージングのためのMMIR1プローブの適用を説明するために、ホモセルhDPSC対ヘテロセルhDPSC/HUVEC(1:1)スフェロイドにおけるO2勾配の比較分析を行った。フリーの青色および緑色蛍光スペクトルチャネルの利用可能性を利用して、ヘキスト34580(HXT)およびSYTOX Green(SYTOX)との共染色を行い、マルチパラメトリック研究のためのO2プローブの適用を実証した(図3)。イメージングソフトウェアによって提供されるピクセルごとの強度比計算の自動プロトコルを使用して、スフェロイド中のR分布の偽色比画像が作製され、すべてのタイプのスフェロイドにおいてリアルタイムで検出された周辺からコアへのO2勾配を視覚化する:酸素化された周辺および低酸素ニッチを中央に有する(図2および図3A)。しかしながら、RpおよびRc値、ならびに中央断面におけるO2勾配の急峻さは、異なる回転楕円体タイプについて変化した:hDPSC対hDPSC/HUVECスフェロイドおよびhDPSC対バイオプリントhDPSCスフェロイドにおける中央断面の線プロファイルを参照されたい(図3B、C)。O2勾配を記述する広く受け入れられている方法はなかったので、我々は、一般的な回転楕円体酸素化の容易な比較および詳細な説明を可能にするいくつかのパラメータを導入した:RpおよびRc、ならびに酸素化ゾーンと低酸素ゾーンとの間の差としてのO2勾配のそのような特性(Rp−Rc)、およびμm当たりの酸素化の平均変化を(Rp−Rc)/ rとして、 ここで、rは周辺コアと低酸素コアの間の距離であり、中央断面において回転楕円体半径と相関する(図3D)。これらのパラメータを、スフェロイド中のSYTOXによって視覚化された壊死死細胞からのデータと共に統計的に比較することは、スフェロイド細胞型特異的O2分布勾配の起源に関する予備的な結論を引き出すのに役立った。
(A)印刷前後のホモセルhDPSCスフェロイド、およびヘテロセルラーhDPSC/HUVEC(1:1)スフェロイドにおける酸素化のライブ顕微鏡(MMIR1のレシオメトリック蛍光顕微鏡)および生/死細胞染色(ヘキスト34580、HXT、ブルーおよびSYTOX Green、SYTOX)の代表例。全てのタイプのスフェロイドにおけるhDPSCsは、同じ細胞培養物由来であった。スフェロイドは、形成中に5μg/mLのMMIR1プローブで2日間予備染色された後、イメージングまたはバイオプリンティング(hDPSCスフェロイドのみ)に使用され、バイオプリンティング後1日目にその後のイメージング分析が行われた。MMIR1染色されたスフェロイドの強度比(Iref/Iセン)画像の偽色画像は、それらの周辺対コアO2勾配に対応する。スケールバーは100μmである。カラーバーは、画像全体のO2プローブ強度比(R = Iref/Iセン)分布を表す。直径断面の番号1および2は、BおよびCに示す強度プロファイルに対応する(B,C)バイオプリンティングの前後の均質hDPSC/HUVECスフェロイド(B)および均質hDPSC スフェロイド間の強度比プロファイルの比較(C)。プロファイルは、(A)に示す回転楕円体の断面について測定した。(d)スフェロイドにおける周辺コアO2勾配の説明に用いたパラメータの概略図、ここでrは回転楕円体の半径であり、RpおよびRcは、それに対応して回転楕円体の周辺およびコア領域の強度比である。カラーバーは、理想的には球面回転楕円体における高(赤)レベルから低(青)レベルまでのO2勾配の分布を模式的に表す。(E,F)hDPSC/HUVECおよびhDPSCスフェロイド(E)およびバイオプリンティング後1日目の前後のhDPSCスフェロイド(F)における末梢-コアO2勾配(Rp-Rc)/r値の比較分析。統計解析は、1回の実験反復(n=18〜23)について行った。ボックスは標準偏差に対応します。アスタリスクは、グループ間の統計的差を示す(p = 0.05)。** = p < 0.0005 です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ホモセルhDPSCスフェロイドと比較して、hDPSC/HUVECスフェロイドは有意に急な勾配を有していた:(Rp−Rc)/rパラメータおよび範囲(Rp−Rc;図3F)。同時に、それらは、周囲(Rp)およびコア(Rc)のより高い酸素化を示した(図4A、表1)。興味深いことに、それらは統計的にも大きく(図4A、表1)、酸素化のそのような差異は、それらの異なる細胞生体エネルギープロファイルによって引き起こされたことを示唆している。これらのデータは、ATPおよびNAD(P)H41の主な生体エネルギー源として解糖系およびペントース - リン酸経路に強い依存を有する細胞の呼吸活性が一般的に低いHUVEC細胞の周知の代謝特性と一致している。同時に、不均一なスフェロイドに形成された顕著な末梢-コアO2勾配は、それらの組成中のhDPSCによって生成される可能性が高く、過分極ミトコンドリアおよび活性電子輸送鎖40を特徴とし、hDPSCスフェロイドの酸素化に関する結果によれば、強い呼吸活性を有する(図3、図4A、および表1).したがって、一般的に、SYTOXによる死細胞染色の強度が低いことによって確認されたhDPSC/HUVECスフェロイドのより高い生存率は(図3A)、それらのより高い酸素化レベルと潜在的に関連している。
バイオファブリケーションにおけるスフェロイド酸素化のライブ顕微鏡イメージングの適用性を説明するために、MMIR1O2プローブプレ染色スフェロイドをGelMAバイオインク中のバイオプリンティングに使用し、バイオプリンティング後1日目の前後のhDPSCスフェロイド中のO2勾配を以下のように比較した(図3A、C、F、図4B、および表2)。バイオプリントされたhDPSCスフェロイドは、バイオプリント前に測定されたスフェロイドと比較して、周辺部を有意に酸素化(より高いRp)していたが、それらのコア酸素化は同様の値を有していた(図4B)。それらの周辺酸素化の変化は、バイオプリンティング前に測定されたhDPSCスフェロイドとは統計的に異なっていた、それらの周辺からコアへのO2勾配の範囲((Rp−Rc)および急峻さの増加(Rp−Rc)/rの増加)に影響を及ぼす(図3Fおよび図4B)。死細胞染色は、バイオプリントされたスフェロイドにおいて一般により明るく、スフェロイド生存率の低下がスフェロイド酸素化の変化に関与していることを示唆している(図3A)。
図4:MMIR1染色スフェロイドの直径および強度比の比較解析。 (A)ヘテロhDPSC/HUVECとホモセルhDPSCスフェロイドとの比較。(b)バイオプリンティング前後のホモセルhDPSCスフェロイドの比較。RpおよびRc-スフェロイドの周囲およびコアにおける強度比は、それに対応して;(Rp-Rc)-強度比の差は、スフェロイドにおけるO2勾配の範囲に対応する。統計解析は、1つの実験反復について行った(n=18〜23)。ボックスは標準偏差に対応します。アスタリスクは、グループ間の統計的差(p = 0.05)を示し、* = p < 0.005、** = p < 0.0005です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 回転楕円体の種類(N) | 直径 [μm] | Rp [a.u.] | Rc [a.u.] | Rp-R c [a.u.] | (Rp-R c)/r [a.u./μm] |
| hDPSC / ヒューベック (18) | 113.2 ± 10.6 | 0.779 ± 0.034 | 0.398 ± 0.055 | 0.982 ± 0.051 | 0.00677 ± 0.00091 |
| hDPSC (18) | 88.1 ± 9.9 | 0.558 ± 0.025 | 0.331 ± 0.034 | 0.227 ± 0.032 | 0.00520 ± 0.00090 |
| p値 | 1.5 x 10-8 * | 1.5 x 10-21 * | 1.3 x 10-4 * | 1.4 × 10から12 * | 9.2 x 10-6 * |
表 1. 回転楕円体径は、スフェロイドのコア(Rc)および周辺部における強度比(Rp)および(Rp−Rc)および(Rp−Rc)/r値の差を、不均一なhDPSC/HUVECおよび均質なhDPSCスフェロイドにおける。N個の回転楕円体上のt検定のp値は統計的差を示し、同様にアスタリスクで示される。
| 回転楕円体の種類(N) | 直径 [μm] | Rp [a.u.] | Rc [a.u.] | Rp-R c [a.u.] | (Rp-R c)/r [a.u./μm] |
| hDPSC (18) | 88.1 ± 9.9 | 0.558 ± 0.025 | 0.331 ± 0.034 | 0.227 ± 0.032 | 0.00520 ± 0.00090 |
| バイオプリントhDPSC (23) | 80.9±12.5 | 0.584 ± 0.023 | 0.323 ± 0.038 | 0.261 ± 0.039 | 0.00658 ± 0.00144 |
| p値 | 0.054 | 0.0024 * | 0.46 | 9.9 X 10-4 * | 6.3 x 10-6 * |
表 2. スフェロイド径は、スフェロイドのコア(Rc)および周辺部(Rp)における強度比、バイオプリント前後の均質なhDPSCスフェロイドにおける強度比(Rp−Rc)および(Rp−Rc)/r値の差である。統計解析のp値(N個の回転楕円体)。統計的な違いはアスタリスクで示されます。
Discussion
意味。組織酸素化測定は、細胞および組織特異的代謝、組織の成長および発達、生存率、腫瘍形成および細胞移動、ならびに微生物および他の病原体との相互作用に関する洞察を与える。提示された方法は、多細胞スフェロイド培養の生理機能をよりよく理解するための新しいツールを提供する:レシオメトリックナノ粒子O2プローブによる酸素化の分析および低酸素状態を評価するための手段を提供し、特定のエネルギー生産経路への依存を視覚化し、モデリング研究および代替代謝イメージングアプローチを補完する43,44 広く利用可能な低コストの蛍光顕微鏡で。レシオメトリック測定は、蛍光広視野(パルスLED励起が好ましい)、レーザー走査コンフォカル、ライトシートおよび2光子顕微鏡、理想的にはTおよびO2インキュベーターチャンバーを備えた顕微鏡で行うことができる。重要なことに、提示されたO2顕微鏡測定は、様々な生理学的パラメータおよび細胞トレーサー(異細胞スフェロイド培養の場合)、生存率(生/死染色)、脂質代謝(脂質感知蛍光プローブ)、pHの動態(色素、ナノ粒子、および蛍光タンパク質)または[Ca2+]のライブマルチパラメータ分析と容易に組み合わせることができる。]で、利用可能な蛍光スペクトルチャネルで、または並列に実施し、スフェロイド、バイオプリント構築物、および潜在的な組織移植におけるリアルタイムの細胞機能に関する拡張ビューを提供します。
スフェロイド培養物は、癌細胞、腫瘍および幹細胞ニッチ微小環境、腫瘍性、薬物効率および毒性スクリーニングの研究において、そして実際に組織バイオマブリケーションおよび自己組織化のための組織ビルディングブロックとしての使用を見出す45。それらは、様々な異なるアプローチ46によって複数の細胞型から生成され得る。回転楕円体モデルの普及は、研究の完全性とデータ解析の改善の観点から標準化が必要であり、これは最近、最初の回転楕円体データベース8の開発によって試みられた。
我々のプロトコールは、生きた回転楕円体代謝をよりよく理解し、この実験モデルを標準化し、その後、バイオプリントおよび移植可能な材料におけるそれらの長期安定性、再現性、および生存率を改善するのに役立つと期待されている。
変更。このプロトコルは、酸素化分析のためのO2プローブ負荷スフェロイドの高収率生成のためのマイクロパターン化されたアガロース低付着性表面(マイクロモールドベースの形成29)の使用を記載している。ハンギングドロップ、超低アタッチメントプレートの適用、脂質コーティング、または自由浮遊形成などのスフェロイド産生の代替方法も、提案されたO2プローブローディングプロトコルと互換性があります。提示されたプロトコルは、hDPSCスフェロイドおよびhDPSCの共培養スフェロイドとHUVECとのために最適化された(1:1)。他の細胞株は確かに適用可能である15、17、47、48;しかしながら、異なる細胞接着特性、培養条件、代謝基質要件、およびナノ粒子染色との細胞適合性のために、いくつかのプロトコル最適化が必要な場合がある。適切なレシオメトリックナノ粒子ベースのO2感受性プローブの選択は、特定の細胞モデルに応じて、および使用される顕微鏡セットアップにおけるプローブのフォトブリーチング特性(光源の強度およびタイプ、カメラのスペクトル感度)、およびプローブの対応する基準およびO2感受性スペクトルチャネルのための適切な励起/発光フィルタの入手可能性に応じて行われなければならない。
いくつかのレシオメトリックO2プローブは市販されている2。あるいは、それらは、参照およびO2感受性色素とポリマーとの共沈によって社内で調製することができる24、25、49 他の場所に記載されている。個々のモデルごとに、適切なプローブと最適な顕微鏡観察条件を決定し、レシオメトリック測定中のプローブのフォトブリーチングまたは光誘起O2消費の影響を最小限に抑えるために、予備試験を行う必要があります。O2センシングナノ粒子の以前の研究では、その低い細胞毒性が実証され、広範囲の染色濃度(1〜20μg/mL)での適用が可能であった。一部のカチオン性ナノ粒子は保存中に自己凝集する可能性があるため、回転楕円体形成に対する潜在的な影響を最小限に抑えるために、負荷濃度をできるだけ低く抑えることをお勧めします。任意選択で、ナノ粒子懸濁液を濾過(0.2μm)するか、または使用前に遠心分離(10,000 x g、5分間)によって透明化して、懸濁液からすべての凝集体を除去することができる。
BioCADおよびHMIソフトウェアは提示されたバイオプリンタに特異的であるが、このプロトコルは、バイオインクの調製、組み立て、標準カートリッジの充填、および多孔質ヒドロゲル足場の設計として、他のバイオプリンタにも適用可能である。さらに、印刷速度および温度などのバイオプリンティングパラメータは、異なる押出ベースのバイオプリンタに対して同等であるべきである。印刷圧力および支柱直径は、針の種類および直径、バイオインク組成物、温度、および結果として生じる粘度に依存するが、それらは、異なるバイオプリンタを有するバイオプリントGelMAベースのバイオインクに印刷パラメータを最適化するための出発点となり得るが、一部のバイオプリンタは、空気圧の代わりにスピンドルを使用してバイオインク50を押し出す。
重要な手順とトラブルシューティング。 重要なステップの1つは、以下の考慮事項に基づくO2 プローブの選択である:まず、利用可能な蛍光顕微鏡のセットアップ(すなわち、互換性のある励起光源、励起および発光のためのフィルタ、カメラ感度および分光透過率および対物レンズの開口数)、これは、それらの光安定性に関して利用可能なプローブの数を制限することができ、 明るさと潜在的な光毒性。また、一部のタイプの浸漬油(油浸対物レンズの場合)は、赤色および赤外蛍光シグナルを妨害する可能性があることに注意することも重要です。光安定性試験は非常に重要であり、初期セットアップと予備試験中に実行する必要があると考えています。蛍光チャネルと異なる色素との間の潜在的なスペクトルクロストークを考慮する必要があります。実際、O2 プローブおよび他の選択された色素の潜在的な暗色および光誘導毒性は、特定の細胞モデルに関連して、プロトコル最適化51の間に評価されなければならない。ナノ粒子の特定の問題は、それらの作業濃度、染色媒体の組成(例えば、血清含有量)、培地と混合する前のナノ粒子の超音波処理、またはスフェロイド形成およびコンパクト化手順中のプローブ負荷の代わりに、スフェロイド形成のために細胞を予め染色および洗浄したO2プローブを使用することによって、それらの自己凝集であり得る。
記載されたスフェロイドモデルでは光の浸透深さに関連する問題は観察されなかったが、レシオメトリック強度シグナル、スフェロイドおよび生体作製コンストラクト(組織移植片)のサイズ、および各色素による細胞染色の最適化を行う際には、これを考慮する必要がある。赤色および近赤外発光波長が密接に一致するMMIR1プローブは、他の赤色/青色または緑色発光蛍光バイオセンサプローブと比較して、最も低いバックグラウンドおよび最良の組織光透過を提供することが期待される。
比率画像(および潜在的にスペクトルアンミキシングまたはデコンボリューション)の作成と処理は、ベンダーが提供するソフトウェア、またはImageJ、Fiji52,53、napari(https://napari.org)、MATLABなどのオープンソースオプションで行うことができます。重要なステップは、バックグラウンドを減算し、線形範囲での信号強度の変化を測定することです。
O2プローブの較正:ロテノンおよびアンチマイシンAは、それぞれミトコンドリア電子輸送鎖の複合体IおよびIIIの阻害剤であり、細胞呼吸54、55、15を遮断し、スフェロイド中のO2勾配の散逸および環境O2との平衡化を誘導する。したがって、環境O2濃度(すなわち、20%、15%、10%、5%、2.5%、1%、0%O2)を変更することは、細胞内のO2感受性プローブのレシオメトリック強度またはリン光寿命較正を可能にするであろう。典型的には、O2制御インキュベーターは絶対0%O2を達成することができず、特定の状況では、脱酸素に対するプローブの応答の迅速な試験が必要である。このような場合、25〜100μg/mLのグルコースオキシダーゼまたはNa2SO3/K2HPO4混合物(蒸留水中の10x溶液に対して各化合物に対して50mg/mL)をサンプルに添加しなければならない。重要なことに、細胞株が有意な程度の非ミトコンドリアO2消費を有する場合、呼吸の阻害および較正実験を行う際にこれを考慮する。
限界と将来の研究。 提案された方法および一般的なレシオメトリック検出の主な制限は、観察された比レベルの較正および実際のO2 レベルへの変換であり、これはハードウェアおよびユーザ画像取得設定の本質的な違いのために、比較正を機器および細胞特異的にする。重要なことに、広視野蛍光顕微鏡および記載されたセットアップの場合、比画像は、理想的な光学切片およびO2 較正ではなく、結合された投影を反映しており、意味をなさないであろう。一方、我々は、半定量比測定が、様々な供給源から産生され、酸素化に差を有するスフェロイドの統計的に有意で測定が容易な比較表現型を提供することを示す。
SPIM、ライトシート、シータ、2光子、ルミネッセンス寿命イメージングなどのライブ3Dオブジェクト用に設計された、よりアクセスしやすく手頃な価格の顕微鏡アプローチを機械学習56,57,58,59,19と組み合わせる将来の研究は、マルチパラメトリックO2イメージングをさらに定量的なアプリケーションにもたらすのに役立ちます。
Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、ゲント大学(BOF/STA/202009/003)の特別研究基金助成金とEU FP7 ITNプログラム「Chebana」、助成金契約第264772号(AVK用)によって支援されています。データはご要望に応じて入手可能です。バイオプリンティング用のGコードは共有可能です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Also available from Sigma |
| 12 well cell-culture plates, sterile | Greiner bio-one | 665-180 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies. |
| 12 Well Chamber slide, removable | Ibidi | 81201 | Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others |
| 15 mL centrifuge tubes | Nerbe plus | 02-502-3001 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
| 3cc Cartridge, UV secure, luer lock | RegenHU | C-033CC-UV | Also available from CelIink and others |
| 3D Discovery Bioprinter | RegenHU | N/A | Bioprinter equiped with an extrusion based printhead, heating mantle, UV-LED curing lamp, 3D Discovery HMI software (CAD/CAM software with direct machine control) and BioCAD software (version 1.1-12) |
| 6 well cell-culture plates, sterile | Greiner bio-one | 657160 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | Used as inhibitor of complex III of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration |
| B-Braun Tip Cap, luer lock | RegenHU | TC-BB-B | Also available from Regemat, Cellink and others |
| Cell view cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment, sterile | Greiner bio-one | 627861 | For microscopy of bioprinted spheroids |
| Collagen from human placenta, type IV | Sigma | C5533 | For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes |
| D(+)-Glucose | Merck | 8342 | Prepare 1M stock solution, 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM) |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free | Sigma-Aldrich | D5030-10X1L | For preparation of imaging medium |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Also available from Lonza and others |
| Endothelial Growth SupplementMix | PromoCell | C-39216 | Also available from Lonza and others |
| FCCP, Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | Used as mitochondrial uncoupler |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-098 | Also available from Sigma |
| GelMA | N/A | N/A | GelMA was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent) [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961213011782] but are also available from Xpect Inx |
| Glucose-oxidase from Aspergillus nige (10000 u) | Sigma-Aldrich | G7141 | Used to test the response of probe to deoxygenation |
| GlutaMAX 100x Supplement | Gibco | 35050-038 | Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 2mM) |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM) |
| Hoechst 34580 | Invitrogen (Life Technologies) | H21486 | Also available from Sigma, BDBiosciences and others |
| Human dental pulp stem cells (hDPSC) | Lonza | PT-5025 | Also available from ATCC or other vendors |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2517 | Also available from ATCC or other vendors |
| KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) | Merck | 4873 | For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily. |
| Li-TPO | N/A | N/A | Li-TPO-L was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent) [https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F97 8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination] but comparable photo-initiators are available from Sigma |
| MEM Alpha Medium + Glutamax Minimum essential medium | Gibco | 32561-029 | Also available from Sigma and others |
| Micro-patterned 3D-printed PDMS stamps, wells with a diameter 400 µm, thickness, total well numbers 1585 | Self-fabricated | These stamps were self-fabricated by the Centre for Microsystems Technology (Professor Dr Jan Vanfleteren, University of Gent) but can also be obtained commercially from Merck (Z764094, Microtissues 3D Petri Dish micro-mold mixed spheroid kit) | |
| Na2SO3 (sodium sulfite) | Sigma-Aldrich | 239321-500G | For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily. |
| O2 probes: MMIR1, SI-0.2+, SII-0.2+ | N/A | N/A | Can be prepared ‘in-house’ using commercially available dyes, polymers and precipitation method [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]. Some nanoparticles are available commercially as discussed in [https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-018-2840-x ] |
| Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution | Gibco | 15140-122 | Also available from Sigma . Apply in dilution 1:100 |
| Petri dishes, sterile | Greiner bio-one | 633181 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
| Piston for 3cc cartridge | RegenHU | P-03CC-UV | Also available from Cellink, Regemat and others |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5mg | For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes |
| PVDF syringe filter 0.22 µm | Novolab | A35149 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | Used as inhibitor of complex I of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM) |
| SYTOX Green | Invitrogen (Life Technologies) | S7559 | Also available from Sigma, Promega and others |
| Taper tip 22 gauge (conical PE needle | Amada Myachi Europe | 22K62222 | Similar products are also available from RegenHU, Cellink, Regemat and others |
| Tissue culture flask (75 cm2) | VWR | 734-2313 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
| Ultrapure Agarose | Invitrogen (Life Technologies) | 16500-500 | Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma) |
| Widefield fluorescence inverted microscope | Olympus | N/A | Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water |
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