Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Betaalbare zuurstofmicroscopie-geassisteerde biofabricage van meercellige sferoïden

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63403
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1
1Tissue Engineering and Biomaterials Group, Department of Human Structure and Repair, Faculty of Medical and Health Sciences, Ghent University, 2Health and Happiness (H&H) Group, National Food Innovation Hub, 3Institute of Analytical Chemistry and Food Chemistry, Graz University of Technology
* These authors contributed equally

Summary

Het protocol beschrijft high-throughput sferoïde generatie voor bioprinting met behulp van de multi-parametrische analyse van hun oxygenatie en celdood op een standaard fluorescentiemicroscoop. Deze aanpak kan worden toegepast om de levensvatbaarheid van de sferoïden te controleren en standaardisatie uit te voeren, wat belangrijk is bij het modelleren van 3D-weefsel, tumormicro-omgeving en succesvolle (micro)weefselbiofabricage.

Abstract

Meercellige sferoïden zijn belangrijke hulpmiddelen voor het bestuderen van weefsel- en kankerfysiologie in 3D en worden vaak gebruikt in tissue engineering als weefselassemblage-eenheden voor biofabricage. Hoewel de belangrijkste kracht van het sferoïdemodel ligt in het nabootsen van fysisch-chemische gradiënten op de weefselmicroschaal, wordt de echte fysiologische omgeving (inclusief dynamiek van metabole activiteit, oxygenatie, celdood en proliferatie) in de sferoïden over het algemeen genegeerd. Tegelijkertijd zijn de effecten van de samenstelling van het groeimedium en de vormingsmethode op het resulterende sferoïde fenotype goed gedocumenteerd. Karakterisering en standaardisatie van het sferoïde fenotype zijn dus vereist om de reproduceerbaarheid en transparantie van de onderzoeksresultaten te waarborgen. De analyse van de gemiddelde sferoïde oxygenatie en de waarde van O 2-gradiënten in drie dimensies (3D) kan een eenvoudige en universele manier zijn voor karakterisering van het sferoïde fenotype, wijzend op hun metabole activiteit, algehele levensvatbaarheid en potentieel om in vivo weefselmicro-omgeving te recapituleren. De visualisatie van 3D-oxygenatie kan eenvoudig worden gecombineerd met multiparametrische analyse van aanvullende fysiologische parameters (zoals celdood, proliferatie en celsamenstelling) en worden toegepast voor continue oxygenatiemonitoring en / of eindpuntmetingen. De belasting van de O2-sonde wordt uitgevoerd tijdens het stadium van sferoïdevorming en is compatibel met verschillende protocollen voor het genereren van sferoïden. Het protocol omvat een high-throughput methode van sferoïde generatie met geïntroduceerde rode en nabij-infrarood emitterende ratiometrische fluorescerende O2 nanosensoren en de beschrijving van multi-parameter beoordeling van sferoïde oxygenatie en celdood voor en na bioprinting. De experimentele voorbeelden tonen vergelijkende O2 gradiënten analyse in homo- en heterocellulaire sferoïden, evenals op sferoïden gebaseerde bioprinted constructen. Het protocol is compatibel met een conventionele fluorescentiemicroscoop met meerdere fluorescentiefilters en een lichtgevende diode als lichtbron.

Introduction

Moleculaire zuurstof (O2) is een van de belangrijkste metabolieten die de levensvatbaarheid, functie en dood van cellen en weefsels reguleren. Onder fysiologische omstandigheden wordt lokale weefseloxygenatie dynamisch gereguleerd door weefselvascularisatie, bloedstroom en celmetabolisme, wat in sommige gevallen leidt tot de vorming van O 2-gradiënten, hypoxische micro-omgeving en / of oxidatieve stress 1,2. Cellen voelen de O 2-gradiënten door de directe betrokkenheid van de moleculaire O2 bij de signaleringsfunctie (via hypoxie-induceerbare factor (HIF)-gemedieerde signalering, histonlysine-demethylases KDM en op andere manieren), veranderingen in cellulair redoxpotentiaal (reactieve O2-soortendetectie via Nrf2 / Keap1-signalering of ijzerregulerende eiwitten), en kunnen vervolgens hun metabolisme, proliferatie aanpassen, potentie en differentiatie3. Heterogeniteit van cel- en weefseloxygenatie, de gradiënten en bijbehorende verschijnselen zijn dus belangrijke spelers in weefselontwikkeling en homeostase. Verschillende weefsels en celtypen vereisen vaak verschillende 'normale' fysiologische O2-niveaus, die de speciale weefselarchitectuur definiëren met cellen gepositioneerd volgens de weefsel O2 microgradiënten4. Sommige celtypen zijn gevoelig voor O2-afname (bijv. Neuronen, hepatocyten, pancreaseilandjescellen of spiercellen)5,6, terwijl andere bestand zijn tegen extreme hypoxie en steile O2-gradiënten vormen (bijvoorbeeld in de darm- en colonepithaliteit)7. Met de vooruitgang in weefselbio-engineering en biofabricage wordt de noodzaak van O 2-kwantificering in microaggregaten en sferoïde 3D-weefselconstructies belangrijk. Een van de zorgen is de standaardisatie van de fysiologische parameters van het meercellige sferoïde model, die afhankelijk zijn van de methode van sferoïdegeneratie en kweekomstandigheden8. Bovendien kan ongecontroleerde toepassing van O2 waarbij biomaterialen vrijkomen of O 2-perfusie in microtissues zonder functionele vascularisatie toxisch zijn voor cellen, leiden tot herprogrammering van hun metabolisme en verminderde overleving in de periode na transplantatie 9,10. De geloofwaardigheid van de O2-meetbenadering en optimalisatie van de oxygenatieomgeving om de efficiënte cultuur van fysiologisch relevante microaggregaten te bereiken, werd onlangs bewezen door wiskundige modellering van pluripotente stamcellen-afgeleide leversferoïden die als voorbeeld11 werden gebruikt. Een ander gebied waar de kennis van weefsel O2-niveaus wordt erkend, is kankertherapie12,13. Heterogene tumorhypoxie kan een succesvolle antikankertherapie schaden. Het meten en controleren van de exacte oxygenatieniveaus tijdens de behandeling van de patiënt of tumorhypoxiemodellering zou verbetering van individuele en gepersonaliseerde therapiestrategieën mogelijk maken14. Kwantitatieve monitoring van dynamische oxygenatie in biogefabriceerde constructies en 3D-tumormodellen is dus een prominent hulpmiddel voor fysiologische analyse van hun ademhalingsactiviteit, metabolisme en optimalisatie van weefselkweek, productieomstandigheden of basisstudies van de hypoxie-gemedieerde therapeutische respons.

Een aantal methoden maken multiplexed (of multi-parameter) analyse van celoxygenatie in sferoïde en microaggregate weefselconstructen mogelijk. De op fosforescentie lifetime imaging microscopie (PLIM) gebaseerde benadering is pionier met neurosferen en tumorsferoïden 15,16,17 en maakt directe kwantificering van celoxygenatie in levende microtissues mogelijk en stelt de correlatie met de levensvatbaarheid, proliferatie of distributie van de functionele celtypen vast. Ondanks de kracht van de aanpak is de PLIM-microscopie-upgrade nog steeds niet op grote schaal beschikbaar, zelfs niet bij de populaire microscopieleveranciers18,19. Gelukkig kan een groot aantal celdoordringende O2-gevoelige nanodeeltjessondes ook worden gebruikt voor de op fluorescentie-intensiteit gebaseerde ratiometrische meetmodus 15,17,20,21,22,23,24. Meestal zou de sonde twee emissiegolflengten weergeven, d.w.z. O2-gevoelig en ongevoelig (referentie), die kunnen worden gemeten op een fluorescentiemicroscoop, een screeningsbeeldcamera met een hoog gehalte of een microplaatlezer. Dergelijke O2-sensing nanodeeltjes kunnen worden geproduceerd door precipitatietechniek met de biocompatibele polymeren, O2-sensing en referentiekleurstoffen die zichtbare en nabij-infrarode spectra omvatten, of ze kunnen commercieel worden gekocht 2,25. Omdat de analyse van dikke 3D-microtissues baat zou hebben bij het gebruik van rood verschoven fluorescerende kleurstoffen, werd de ratiometrische O 2-sensing nanodeeltjessonde multimodaal infrarood nummer 1 (MMIR1), bestaande uit O2-sensing PtTPTBPF26 en referentie aza-BODIPY27 kleurstoffen geïmpregneerd in een positief geladen copolymeer op basis van polymethacrylaat, geconstrueerd28. Bij dit ontwerp is een O2-gevoelig signaal (nabij-infrarood, excitatie (exc.) = 635 nm, emissie (em.) = 760 nm; Isens) wordt beïnvloed door de [O2]-concentratie via het fosforescentie-dovende proces, terwijl de rode referentiekleurstofintensiteit (exc. = 580 nm, em. = 650 nm; Iref) blijft onaangetast (figuur 1A). Zo kan de Iref / Isens ratio (R) in gekleurde cellen O 2 kalibratie22 inschakelen.

Hier beschrijven we een semi-kwantitatieve benadering voor het monitoren van live celoxygenatie in sferoïden en bioprinted constructen, waardoor O 2-gradiënten in eindpunt- en kinetische metingen worden geschat. Dergelijke O2-beeldvorming kan worden uitgevoerd met andere soorten ratiometrische O 2-sondes (figuur 1B) en kan, afhankelijk van het aantal beschikbare lichtbronnen en fluorescentiefilters, worden gebruikt met andere kleurstoffen om informatie te verkrijgen over levende / dode cellen, mitochondriale functie en het traceren van andere celtypen. Geavanceerde meetmodi zoals fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) kunnen ook worden gebruikt19. De grootste uitdaging bij het gebruik van celkleurstoffen en O2-gevoelige nanodeeltjes is de optimalisatie van het kleurprotocol. In het geval van de MMIR1-sonde en gerelateerde nanodeeltjes worden cellen voorgekleurd of mede geïncubeerd tijdens het proces van sferoïdevorming. In het beschreven protocol werden O2 probe-stained sferoïden gegenereerd op laagaanhangend agaroseoppervlak 29,30,31,32 (figuur 1C), wat het mogelijk maakt om vervolgens op sferoïden gebaseerde bioprinting en multiparameteranalyse van O 2 en celdood mogelijk te maken. Om de toepasbaarheid van de benadering te illustreren, werden de oxygenatieniveaus in homo- of heterocellulaire (gevormd met de toevoeging van menselijke navelstrengaflagotcellen, HUVEC) humane tandpulmstamcel (hDPSC) sferoïden vergeleken voor en na bioprinting, met behulp van conventionele fluorescentiemicroscoop.

Protocol

1. Hoge doorvoer generatie van sferoïden met ingebouwde O2-gevoelige sonde

  1. Voorbereiding van micro-patroon agarose gecoate weefselkweekplaat
    OPMERKING: Micro-patroon agarose gecoate weefselkweekplaten worden gebruikt voor het gelijktijdig genereren van een groot aantal sferoïden (1585 per PDMS-stempel, zie Tabel met materialen) voor bioprinting en andere toepassingen, waarbij meerdere experimentele replicaties of grote sferoïde nummers nodig zijn.
    1. Bereid alle steriele materialen en instrumenten (spatels en pincetten) voor door waar mogelijk te autoclaveren of door filtersterilisatie. Reinig de recyclebare PDMS-stempels33 van agarose en bewaar ze aseptisch in 70% ethanol. Doe dit ten minste 1 dag voorafgaand aan het genereren van sferoïden.
    2. Breng PDMS-stempels met micropatronen over van een opslagflacon naar een steriele petrischaal en droog het gladde oppervlak gedurende 10 minuten aan de lucht onder de steriele laminaire luchtstroomomstandigheden.
    3. Plaats elke stempel met een micropatroonoppervlak omhoog (en glad oppervlak naar beneden) in het midden van de put van een 12-well steriele weefselkweekplaat. Droog 1-2 min aan de lucht met een open deksel.
      OPMERKING: Het is zeer belangrijk om de overtollige vloeistof te verdampen, omdat alleen droge stempels perfect aan het plastic oppervlak kleven en tijdens de procedure bevestigd blijven.
    4. Weeg 1,5 g agarose in een schone glazen fles van 200 ml, voeg 50 ml steriel gedestilleerd water toe, dek af met een deksel en smelt in een magnetron om 50 ml 3% homogene agarose-oplossing te maken.
      LET OP: De agarose-oplossing is extreem heet en moet met voorzichtigheid worden behandeld. Als het onmiddellijk na de smeltprocedure wordt geschud, kan de hete agarose-oplossing beginnen te borrelen en uit het vat barsten. Om incidentele trauma's te voorkomen, gebruikt u voldoende grote vaten gevuld met maximaal 50% van het volume met de agarose-oplossing.
    5. Voeg met behulp van een steriele serologische pipet onmiddellijk ~ 2 ml hete agarose-oplossing toe aan elke put van de 12-well celkweekplaten om de ingebrachte PDMS-stempel volledig te bedekken. Laat de agarose 20 minuten stollen door onder de steriele luchtstroom te broeden met het plaatdeksel geopend.
      OPMERKING: De agaroselaag moet minstens twee keer dikker zijn dan de PDMS-stempel om de integriteit van de agarose-microwells te garanderen na het verwijderen van de PDMS-stempel (figuur 1C).
    6. Gebruik een steriele kleine spatel om de agarose nauwkeurig met de ingebouwde PDMS-stempel ondersteboven in elke put te draaien om het gladde stempeloppervlak omhoog te hebben. Voeg ~ 200 μL steriel water toe aan de gladde bovenkant van de stempel, maak het voorzichtig los van de agarose met een spatel en verwijder het uit de put. Vermijd beschadiging van de microwells.
    7. Voeg 1 ml overeenkomstige steriele celkweekmedia toe aan de agarosestempels voor direct gebruik. Dek de plaat af met het deksel en incubeer een nacht bij 4 °C. Gebruik PBS-oplossing (in plaats van middellange) voor langdurige opslag (tot 2 weken bij 4 °C). Laat de agarose niet drogen. Verwarm voor gebruik de agarose-platen met micropatroon gedurende 1 uur bij 37 °C in een CO2-incubator .
      OPMERKING: Incubatie is nodig om luchtbellen uit agarose microwells in evenwicht te brengen en te verwijderen. Ga verder met protocolstap 1.2.
  2. Voorbereiding O2 sonde-geladen sferoïden
    1. Gebruik α-minimal essential medium (MEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en groeifactoren aangevuld endotheelcelgroeimedium 2 voor de teelt van respectievelijk hDPSC- en HUVEC-cellijnen. Bereid hDPSC / HUVEC heterocellulaire sferoïde groeimedium voor door HUVEC- en hDPSC-groeimedia toe te voegen in een verhouding van 1:1.
    2. Bereid 70% -90% confluente celcultuur voor (~ 3-4 dagen voorbereiding). Bereid voor het genereren van heterocellulaire sferoïden respectievelijk hDPSC- en HUVEC-culturen voor.
      OPMERKING: Het passagenummer van HUVEC en hDPSC mag niet hoger zijn dan 8. Om een snelle groei van celculturen te garanderen, splitst u zich altijd op 1/3 van de totale celcultuur (bij 70% -80% confluentie) met behulp van een nieuwe kolf om de 3 tot 4 dagen.
    3. Spoel 70%-90% confluente celcultuur met voorgewarmde (37 °C) PBS (10 ml per 75 cm2 kolf). Voeg dissociërende enzymoplossing toe (0,05% trypsine en 1 mM EDTA; 1 ml per 75 cm2 kolf) en incubeer gedurende 3-5 min bij 37 °C in 5% CO2, 95% vochtigheid voor celloslating en controleer celloslating onder de microscoop. Neutraliseer trypsine na gebruik met volledige celkweekmedia die 10% FBS bevatten (5 ml media per 1 ml dissociatieoplossing).
      OPMERKING: Voorkom overmatige blootstelling van cellen aan de dissociërende enzymoplossing, omdat dit hun levensvatbaarheid kan beïnvloeden.
    4. Voor HUVEC gekweekt in een laag FBS-medium, voert u trypsineneutralisatie uit door 0,5 ml 100% FBS toe te voegen aan de met trypsine behandelde celcultuur, gevolgd door centrifugatie om cellen over te brengen naar hun groeimedium.
      OPMERKING: De verkregen celsuspensie (sen) moet ~ 1 miljoen cellen per 1 ml bevatten. Indien nodig kan een extra centrifugatiestap worden toegevoegd aan het protocol om celsuspensie te concentreren.
    5. Dissociëren celaggregaten door pipetteren met behulp van een pipetpunt van 1000 μL op de bovenkant van een serologische pipet van 10 ml om eencellige suspensie te verkrijgen. Gebruik een telkamer (Neubauer-type hemocytometer of alternatieven) om het aantal cellen per 1 ml van de celsuspensie34 te tellen. Verdun de celsuspensie tot 500.000 cellen per ml. Voeg voor heterocellulaire hDPSC / HUVEC in 1:1 sferoïde verhouding gelijke volumes overeenkomstige celsuspensies toe om een uiteindelijke celconcentratie van 500.000 cellen per ml te hebben.
      OPMERKING: Variatie van celconcentratie in suspensie toegevoegd aan een micro-patroon agarose stempel maakt het mogelijk om de gemiddelde grootte van geproduceerde sferoïden te veranderen, die afhankelijk is van een celnummer per microwell van een agarose stempel. In de beschreven opstelling worden sferoïden van ~ 300 cellen gegenereerd uit 1 ml met 500.000 cellen op een agarose-stempel met 1585 microwells.
    6. Voeg geconcentreerde O 2-sondeoplossing (nanodeeltjes, 1 mg/ml stam) toe aan de bereide celsuspensie tot een eindconcentratie van 5 μg/ml.
      OPMERKING: Sferoïde vorming in de aanwezigheid van O2-sensing nanodeeltjes zorgt voor een efficiënte kleuring, die minimaal 5 dagen wordt bewaard (figuur 1D). Daarentegen zal het kleuren van voorgevormde meercellige sferoïden met nanodeeltjes minder efficiënt zijn15.
    7. Wissel 1 ml oude media uit in een microgepatterde put van 12-well agarose-gecoate celkweekplaten (zie stap 1.1.7) voor 1 ml van de geprepareerde celsuspensie (500.000 cellen per 1 ml, met 5 μg / ml O2-sonde ). Kweek de sferoïden in co2-incubator gedurende 2-5 dagen in de continue aanwezigheid van de O2-sonde om de belasting ervan tijdens sferoïdevorming en verdichting te garanderen.
      OPMERKING: Vermijd overmatige medium verdamping in sferoïde cultuur. Voeg indien nodig voorzichtig (verstoor de sferoïden in microwells) 0,2-0,5 ml kweekmedia toe met de extra O 2-sondeverdunning.
    8. Wissel na de sferoïde formatie het groeimedium uit met een nieuw medium zonder de sonde. De sondekleuring wordt gedurende 7-14 dagen of langer bewaard in gegenereerde sferoïden, waardoor de signalen in sferoïden op lange termijn kunnen worden gemonitord.

2. Bioprinting van sferoïden

OPMERKING: Sferoïden worden gebioprint in een bioink met methacrylamide-gemodificeerde gelatine (GelMA). Hieronder vindt u een beschrijving van de bioink-ingrediënten, de procedure van bioink-voorbereiding en bioprinting.

  1. Bioink bereiding
    1. Bereid een 10% (w/v) GelMA-oplossing (2 ml) in medium onder een laminaire luchtstroom35 als volgt: weeg 0,2 g steriele GelMA met een substitutiegraad van 78 in een buis van 15 ml, voeg 1,9 ml α-MEM toe en laat het oplossen door het te mengen op een roterende shaker bij 37 °C (~ 2 uur).
      OPMERKING: Voeg niet de volledige hoeveelheid medium toe, omdat andere verbindingen zoals sferoïden en foto-initiator Li-TPO-L later zullen worden toegevoegd.
    2. Resuspend sferoïden in de microgepatterde putten door pipetteren en verzamel ze in een buis van 15 ml. Voer een extra spoeling uit met PBS om ervoor te zorgen dat alle sferoïden worden verzameld uit de agarose microwells. Vermijd het aanraken/beschadigen van de agarose microwells, omdat vlokken agarose de naald kunnen blokkeren tijdens het bioprinten.
    3. Verzamel sferoïden door centrifugeren in een buis van 15 ml bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C. Zuig het supernatant op met een pipet, voeg 50 μL medium toe aan de sferoïden en resuspend ze door zachtjes pipetteren.
    4. Voeg het sferoïde mengsel toe aan de warme GelMA-oplossing en meng door zachtjes te pipetteren. Handhaaf de sferoïde concentratie tot 6340-12860 sferoïden (van 4-8 micropatronen) per ml bioink voor bioprinting. Vermijd hogere concentraties sferoïden omdat dit gemakkelijk blokkering van de druknaald veroorzaakt.
    5. Voeg filtergesteriliseerde foto-initiator Li-TPO-L stockoplossing (32 mg/ml) toe in een eindconcentratie van 2 mol% ten opzichte van het aantal dubbele bindingen en meng door zachtjes pipetteren 36,37.
      OPMERKING: De hoeveelheid Li-TPO-L kan worden berekend volgens de vergelijking:
      Volume van de foto-initiator (PI) = (0,000385 mol NH2- groepen / g GelMA x 294,10 g Li-TPO-L / mol x 0,78 x 0,02) / 0,032 g Li-TPO-L / ml x 0,2 g GelMA = 0,0107 ml Li-TPO-L voorraad
  2. Bioprinting procedure
    1. Zie de stappen in Aanvullend Protocol 1 voor het ontwerpen van steigers in CAD. Volg de onderstaande stappen om het ontwerp te bioprinten.
    2. Sluit het uiteinde van een steriele 3 cc patroon met een tipdop (luerslot) en vul met bioink door te pipetteren. Plaats een zuiger in de cartridge. Houd de cartridge ondersteboven en verwijder de dop, duw de zuiger in de richting van de bioink totdat alle lucht uit de cartridge is verwijderd.
      OPMERKING: Vermijd het contact tussen GelMA bioink en de zijkanten van de patroon, omdat dit de beweging van de zuiger kan remmen als gevolg van gelation van de bioink.
    3. Laat de bioink afkoelen in de verwarmingsmantel van de bioprinter bij 23 °C (20-30 min). Schroef een drukadapter aan de bovenkant van de cartridge. Sluit de clip op de inlaatbuis om te voorkomen dat de bioink lekt, monteer een conische PE-naald van 22 G op de patroon. Pas de grootte en diameter van de naald aan het ontwerp van de steiger en de diameter en concentratie van de sferoïden aan.
      LET OP: Draag een mondkapje en gespoten handschoenen om besmetting te voorkomen.
    4. Spuit de bioprinter in met 70% ethanol en veeg hem droog met absorberend papier. Installeer de cartridge in de verwarmingsmantel op de printkop op basis van extrusie. Sluit de drukinlaat aan en open de clip op de inlaat. Laad het G-code bestand van uw ontwerp in de afdruksoftware.
    5. Start naaldlengtemeting. Regel de drukdruk door een beetje bioink in een steriel petrischaaltje te doseren. Een drukdruk van 0,025-0,045 MPa is typisch voor het printen van op GelMA gebaseerde bioinks38.
    6. Installeer een 6-well plaat, open de putplaat, sluit de kap en begin met printen. Laat de steigers na het printen gedurende 10 minuten bij 5 °C fysiek worden verknoopt en bestraal de bedrukte steigers gedurende 60 s met een UV LED-lamp (365 nm; 500 mW volgens de fabrikant).
      OPMERKING: UV-crosslinkingtijd is afhankelijk van de eigenschappen van het UV-licht, foto-initiatortype en -concentratie, de gewenste scaffold crosslinking-graad, zwelling en elasticiteitsmodulus.
    7. Voeg onmiddellijk de overeenkomstige groeimedia met 100 E /ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine (P / S) toe aan alle putten met biogeprinte roosters (2 ml per put van een 6-well celkweekplaat).
    8. Kweek in een CO2-incubator van 37 °C totdat u met de microscopie begint. Voor biogeprinte constructmicroscopie brengt u een geprint wafelraster over in een microscopieschaal, bedekt u met beeldvormende media en gaat u verder met stap 3.2 en 3.3.
      OPMERKING: In het geval van zwevende biogeprinte constructies moeten ze in de microscopieschaal worden gefixeerd zonder effect op de levensvatbaarheid van cellen, bijvoorbeeld met cytocompatibele lijm. Voor omgekeerde microscoopoverdracht, de bioprint in een microscopie-schotel met glazen bodem en deksel met een beeldvormend medium (~ 200-500 μL, zie de opmerking bij stap 3.1 voor de samenstelling van de beeldvormende media) om ongewenst zweven van het monster te voorkomen. Kleuring met extra fluorescerende sondes kan worden gedaan in de celkweekschaal voorafgaand aan de overdracht van biogeprinte constructies naar microscopieschotels (zie stap 3.1.6).

3. Ratiometrische fluorescentie levende microscopie van sferoïde oxygenatie in het biogefabriceerde weefsel

OPMERKING: Om de ratiometrische intensiteitsrespons (R) van de O2-sonde om te zetten in de werkelijke hypoxieniveaus, moet de sonderespons worden gekalibreerd met behulp van procedures beschreven in24. Aangezien de ratiometrische kalibratie echter instrumentspecifiek is en de installatie van een T/O2/CO2-gestuurde incubator vereist (niet altijd beschikbaar), heeft het gebruik van semikwantitatieve ratiodetectie de voorkeur.

  1. Voorbereiding van sferoïden voor live imaging analyse
    1. Voor sferoïde hechting tijdens deze stap, pre-coat de steriele microscopie schotels met collageen IV en / of poly-D-lysine of gebruik in de handel verkrijgbare39. Controleer de compatibiliteit van microscopieschotels met de werkafstand en andere kenmerken van het objectief van uw microscoop.
      OPMERKING: In het geval van multiparameterbeeldvorming moeten alle aanvullende kleuringsprocedures worden uitgevoerd in de kweekplaatschalen met voldoende hoeveelheid media die cellen beschermen tegen verdamping, osmotische shock of andere stress. Prewarmen en voorwarmen van beeldvormingsmedium vóór gebruik: DMEM aangevuld met natriumbicarbonaat (1,2 g/l), HEPES-Na, pH 7,2 (10 mM), natriumpyruvaat (1 mM), L-glutamine (2 mM) en glucose (5 mM), zonder fenolrood.
    2. Gebruik een pipet van 1 ml om de voorgekleurde sferoïden van de O2-sonde voorzichtig uit de agarose-microwells te wassen. Terwijl de sferoïden nog steeds in de media zweven, breng ze over in een conische onderbuis van 15 ml.
    3. Om ervoor te zorgen dat alle sferoïden uit een microgepatterde put worden verzameld, spoelt u de put 1 tot 3 keer met de extra 1 ml kweekmedia, waarbij alle sferoïde suspensies in één injectieflacon worden gecombineerd. Laat de injectieflacon maximaal 10 minuten in een verticale positie staan om de sferoïden op de bodem van de injectieflacon te laten bezinken en een zichtbare pellet te vormen.
    4. Verwijder voorzichtig de media uit de buis en laat de sferoïden ongestoord. Geef ze voorzichtig opnieuw op in de hoeveelheid vers kweekmedium die voldoende is voor ten minste 20 sferoïden per microscopiemonsterschaal. Dit minimaliseert het gebruik van de kweekmedia en vereenvoudigt het lokaliseren van sferoïden tijdens beeldvorming.
      OPMERKING: Gebruik het autoclaveerbare siliconen deel van μ-kamer 12-well plaat (zie Tabel met materialen) bevestigd aan het afdekglas als een microscopie monsterschaal (24 x 60 mm, dikte # 1) met een maximaal mediavolume van 300 μL per put. Het siliciumgedeelte van deze kweekkamer kan worden gesteriliseerd en hergebruikt met andere plastic en glazen oppervlakken wanneer deze aan de schaal worden gehecht.
    5. Voeg onmiddellijk een gelijk volume sferoïde suspensie toe aan elke microscopieschaal / put. Laat de sferoïden gedurende 1 uur bij 37 °C in een CO2-incubator om aan het oppervlak van de microscopieschaal te bevestigen. Voor zuurstofanalyse in combinatie met het gebruik van andere kleurstoffen gaat u verder met stap 3.1.6. Voor een eenvoudige oxygenatieanalyse gaat u verder met stap 3.1.7.
      OPMERKING: Onvoldoende incubatietijd (<1 uur) kan leiden tot af en toe verwijderen van sferoïden en verlies tijdens de media-uitwisseling, waardoor uw experiment wordt afgebroken. Tegelijkertijd kan overincubatie (>3 uur) leiden tot het gedeeltelijke of volledige verlies van hun 3D-organisatie als gevolg van migratie van cellen van sferoïden naar het oppervlak van de microscopieschaal en hun real-time oxygenatie beïnvloeden.
    6. (optioneel) Wissel het medium zorgvuldig uit met een fluorescerende sonde (s) verdund tot kleuringsconcentratie en ga door met incubatie gedurende nog eens 1 uur om de optimale intensiteit te bereiken. Om te voorkomen dat sferoïden tijdens media-uitwisseling worden verwijderd, aspirateert u het medium zorgvuldig met een pipet van 200 μL van de randen van de microscopieschotels en voert u de toevoeging van het medium zijdelings uit in de microscopieschaal. Ga verder met stap 3.1.7.
      OPMERKING: Voor een efficiënte kleuring met sondes met een slechte diffusie in meercellige aggregaten, verlengt u de belastingsconcentratie en/of -tijd. Bepaal voor gebruik de optionele parameters voor het laden van sondes in voorbereidende experimenten.
    7. Verwijder het medium uit de microscopieschaal en spoel het eenmaal af met beeldvormende media. Voeg de exacte hoeveelheid beeldmedia toe aan het monster (bijv. 300 μL per microwell van μ kamer van een 12-well kweekplaat). Ga verder met stap 3.2.
  2. Beeldverwerving
    1. Schakel de microscoop en aangesloten apparaten (d.w.z. excitatielichtbron, camera, computer, incubator en andere werkende elektronische blokken) 30 minuten voor de beeldvorming in om op te warmen en in evenwicht te komen met de meetomstandigheden (temperatuur, verschillende waarden van O2, 5% CO2, vochtigheid indien nodig). Start de microscopie-bedieningssoftware die is meegeleverd met de exacte microscoopopstelling.
      OPMERKING: Het beschreven protocol is aangepast voor CellSens Dimension software v.3.
    2. Selecteer de juiste excitatie- (bron, vermogen) en emissiefilters en de belichtingstijd voor gekozen fluorescerende (of fosforescerende) sondes. Voor multiparameter-, 3D- en time-lapse-microscopie-analyses schrijft u de geautomatiseerde meetvolgordeprotocol(en) in de operationele microscoopsoftware.
    3. Bepaal empirisch de optimale beeldvormingsinstellingen voor elke sonde, experimenteel model en cellijn in voorlopige experimenten. Zorg ervoor dat de instellingen minimale fotobleaching in referentie (Iref) en O2 sensing (Isens) kanalen en minimaal effect op de intensiteitsverhouding (R = Iref / Isens), vooral in 3D en time-lapse meetexperimenten.
    4. Zet de microscopieschaal op met gekleurde sferoïden op het microscopiestadium. Gebruik het lage vergrotingsobjectief om een voorbeeld van het monster in transmissielicht te bekijken, vooraf te focussen op sferoïden en ze in het midden van de afbeelding te lokaliseren.
      OPMERKING: Standaard 4x tot 10x vergrotingsluchtobjectiviteiten zijn voldoende voor vooraf scherpstellen, terwijl we voor de werkelijke meting 20x tot 40x aanbevelen met numeriek diafragma (NA) van 0,6 of hoger (lucht- of wateronderdompeling) objectieven met voldoende werkafstand voor sferoïden die aan de schotel zijn bevestigd.
    5. Breng het objectief met de vereiste hoge vergroting naar de werkpositie. Focus op transmissielichtmodus in de middelste (equatoriale) doorsnede van de sferoïde. Oxygenatie in 3D-objecten is direct afhankelijk van de diepte van het beeldgedeelte. Om dit te garanderen, analyseert u vergelijkbare doorsneden in en tussen groepen, bijvoorbeeld midden- en boven- en onderdoorsneden van sferoïden.
      OPMERKING: Voor gedetailleerde en nauwkeurige analyse en reconstructie van O 2-gradiënten raden we aan om Z-stacks te scannen en te produceren met behulp van confocale microscopen, lichtbladen of microscopen met twee fotonen (beste optie). Voor conventionele widefield-microscopie, waarbij het signaal van alle doorsneden tegelijkertijd wordt verzameld, kan een gemiddelde schatting door de middelste doorsnede worden gedaan in plaats van een exacte analyse van O 2-gradiënten. In dit geval wordt de middelste doorsnede gedefinieerd als een brandpuntssectie, waarbij de sferoïden een maximale diameter hebben met een scherpe focus op hun randen.
    6. Pas de instellingen aan voor het verzamelen van fluorescentie-/fosforescentiesignalen van referentie- en gevoelige spectrale kanalen van de O 2-sonde en andere fluorescentiesondes die worden toegepast voor multiparametrische beeldvorming.
    7. Voor de kwantitatieve vergelijking op basis van intensiteit past u dezelfde gekozen beeldinstellingen toe van de belichtingstijd, het vermogen van de excitatielichtbron, de resolutie, de scansnelheid en de pinhole-grootte voor alle gemeten objecten in groepen.
      OPMERKING: Veel door de leverancier geleverde microscopiesoftwareversies maken automatische berekeningen van de intensiteitsverhouding mogelijk. Pas functiesamenvoeging toe op intensiteitsmetingen van referentie- en gevoelige kanalen van O 2-sonde, bij het schrijven van het imaging-acquisitieprogramma in de experimentele manager in de beeldvormingssoftware die hier wordt gebruikt.
    8. Verzamel beelden uit dezelfde optische sectie voor referentie- en gevoelige spectrale kanalen van de O2-sonde en, indien nodig, extra fluorescentiekanalen. Gebruik voor dit protocol MMIR1-sonde met de rode referentie (exc. = 580 nm, em. = 650 nm) en nabij-infrarode O2-gevoelige (exc. = 635 nm, em. = 760 nm) spectra.
    9. Herhaal stap 3.2.5-3.2.8 om voldoende gegevenspunten te verzamelen voor statistische analyse. Voor de dynamische analyse van de snel evoluerende cellulaire reacties op behandeling met verschillende geneesmiddelen, mitochondriale ontkoppelaars of remmers van elektronentransportketen en andere snelwerkende verbindingen, gebruikt u de time-lapse-meetmodus (stap 3.2.10).
    10. Voer de metingen uit in beeldvormende media, bij 37 °C met periodieke verlichting van het monster en verzamel signalen van de fluoroforen van belang (bijv. O 2-sondereferentie- en detectiekanalen), bijvoorbeeld elke 10 s gedurende meer dan 2 minuten.
    11. Voer een focuscontrole uit voor elke sferoïde zodra de periodieke meting is uitgevoerd om ervoor te zorgen dat er geen focusdrift was tijdens de beeldvorming. Herhaal indien nodig. Ga verder met stap 3.3 voor gegevensanalyse.
      OPMERKING: Zonder celstimulatie en toevoeging van geneesmiddelen kan time-lapse-meting worden uitgevoerd om de fotostabiliteit te beoordelen, in vergelijking met de referentiekleurstof, bijvoorbeeld fluoresceïne, calceïnegroen AM of tetramethylrhodaminemethylester.
  3. Beeldpresentatie
    OPMERKING: Hier beschrijven we hoe u automatisch O kunt berekenen2 probe intensity ratio (R) in sferoïden met behulp van ratio-analysefunctie in de beeldvormingssoftware en pixel voor pixel R-berekening toepassen om valse kleuren R-distributiebeelden van sferoïde microscopiesectie te genereren. R kan ook handmatig worden berekend op basis van de intensiteitsgegevens van referentie- en gevoelige spectrale kanalen die zijn verzameld uit hetzelfde interessegebied (ROI) van het sferoïde beeld door toepassing van de eenvoudige formule R = IRef/IKsens24,34. Als het niet mogelijk is om de intensiteitsgegevens uit de onbewerkte afbeelding in de bijbehorende microscopiesoftware te extraheren, kunnen de intensiteitsgegevens worden verkregen met behulp van programma's zoals ImageJ of Fiji (zie Discussie).
    1. Open het .vsi-bestand met O2-probe intensiteitsgegevens van referentie- en gevoelige spectrale kanalen die in samengevoegde modus zijn gemaakt. Open het functievenster voor verhoudingsanalyse vanuit het meetmenu. Kies de intensiteit van het referentiekanaal als teller en de intensiteit van het gevoelige kanaal als noemer voor R-berekening.
      OPMERKING: De omgekeerde verhouding van referentie- en gevoelige signalen voor het berekenen van R is ook mogelijk, maar in dit geval zal R afnemen met de toename van O2.
    2. Pas overeenkomstige intensiteitsdrempelinstellingen toe op elk spectraal kanaal om de achtergrond af te trekken van de samengevoegde intensiteitsafbeelding. Blijf de drempelwaarden verhogen totdat de achtergrond van de afbeelding uniform zwart is. Pas de parameter threshold gelijkelijk toe op alle sferoïde afbeeldingen in de gegevensset die wordt gebruikt voor vergelijkende analyse.
      OPMERKING: Gebruik het voorbeeldvenster om de drempelinstellingen te optimaliseren door de voorlopige berekende fout-kleur R-afbeelding van sferoïden te observeren. Alle pixels met een intensiteit lager dan de huidige waarde in het drempelveld worden uit de R-analyse verwijderd en gepresenteerd als zwarte vlekken. Na de drempeltoepassing moet alleen het gebied dat overeenkomt met sferoïde fluorescentie worden gevisualiseerd. De voorlopige schatting van de gemiddelde achtergrondintensiteit (gebieden zonder sferoïden) van de onafhankelijke spectrale kanalen vereenvoudigt de keuze van een geschikte drempel voor het beeld. Bovendien helpt de toepassing van sferoïde ROI-randen, geïdentificeerd uit het overeenkomstige sferoïde beeld van transmissielicht naar het samengevoegde fluorescentiebeeld, bij het nauwkeurig bepalen van de drempelparameters om overmatige aftrekking van de niet-achtergrondsignaalintensiteiten te voorkomen.
    3. Houd de achtergrondinstellingen voor de teller- en noemerintensiteiten op 0, omdat de achtergrond al was afgetrokken met drempeltoepassing.
    4. Pas de schaalfactor (Schaal) aan op de verhoudingsafbeelding totdat de voorbeeldafbeelding de gewenste resolutie van het R-verloop biedt. Pas de schaalparameter gelijkelijk toe op alle sferoïde afbeeldingen in de gegevensset die wordt gebruikt voor vergelijkende analyse.
      OPMERKING: De schaalparameter moet groot genoeg zijn (ten minste 1.000) om ervoor te zorgen dat de R-afbeelding zoveel mogelijk informatie bevat en kan worden gezien als een resolutiefactor voor numerieke R-gegevens.
    5. Pas aangepaste parameters toe op de sferoïde afbeelding door op Toepassen te drukken. Pas de helderheid en het contrast van de afbeelding in het weergavevenster aanpassen aan vanuit het menu met gereedschapsvensters.
    6. Bepaal handmatig de koppelings- en ontkoppellimieten van een histogram voor verhoudingsverdeling met behulp van de vaste schaaloptie in het venster Weergave aanpassen. Hiermee wordt het bereik van de valse kleurenbalk voor de presentatie van de R-parameter bepaald.
      OPMERKING: Om sferoïde afbeeldingen tussen verschillende groepen te vergelijken, is het belangrijk om een vergelijkbaar kleurenbalkbereik aan te houden voor alle analytische monsters. Aangezien een reeks veranderingen van de R-parameter tussen groepen kan verschillen, moet het gekozen valse kleurenbalkbereik universeel zijn voor distributiehistogrammen in alle analytische groepen.
    7. Sferoïden zijn vaak niet ideaal bolvormig, neem aan dat de sferoïde diameter de langste lijn is die door het centrum (vaak een hypoxische kern) van de sferoïde wordt getrokken. Bepaal met behulp van de lineaire liniaalfunctie in het metingsmenu de sferoïdediameter. Exporteer gegevens als een spreadsheettabelbestand.
    8. Kies de ROI van een vereiste grootte (zo klein mogelijk) en vorm (bijvoorbeeld rond) en breng deze aan op de periferie en de hypoxische kern van de sferoïde. Transformeer de ROI naar het meetobject om de gemiddelde R (perifere R-Rp en kern R-Rc) binnen de gekozen ROI te analyseren. Exporteer gegevens in een tabelindeling die compatibel is met spreadsheets.
      OPMERKING: Sferoïden hebben geen identieke O2-verdeling over de groep en de hypoxische kernen lokaliseren niet perfect samen met de sferoïde centra. Om de analyse te vereenvoudigen en te standaardiseren gaan we ervan uit dat de meest hypoxische gebieden overeenkomen met de ideale kern in het midden van de sferoïde. Rc gemeten in deze zones wordt toegepast voor berekeningen van O2 gradiëntbereik (Rp-R c) en steilheid (Rp-R c) /r, waarbij r (idealiter een afstand tussen periferie en hypoxische kern-ROI's) een geschatte straal van de sferoïde in μm is, berekend op basis van de diametermetingen. Optioneel kunnen sferoïde O 2-gradiënten worden gepresenteerd als lineaire lijnprofielen van R-parameterverandering (lijnprofielvenster in het maatmenu) gemaakt langs de sferoïde diameter. Deze gegevens kunnen ook worden geëxporteerd als een spreadsheettabelbestand.
    9. Pas metingen toe op elke microscopiesectie van sferoïden om de dataset van sferoïdediameters, Rc en Rp te verkrijgen om verdere berekeningen en statistische vergelijking uit te voeren. Combineer alle gegevens in één spreadsheetbestand.
    10. Voor time-lapse-analyse van fotobleaching of dynamische reacties op verschillende stimuli, past u de gekozen ROI toe op dezelfde coördinaten op elke afbeelding in een set. Als u R-parameters wilt vergelijken, presenteert u ze als een percentage van de R van de eerste cyclus in een time-lapse-afbeeldingsset.
    11. Gebruik voor fotobleachinganalyse R van verschillende ROI's om de gemiddelde R in percentages voor elke time-lapse-cyclus te berekenen en de veranderingen bij te houden.
    12. Stel dat het fotobleaching-effect niet kritisch is als er minder dan 5% afname van de initiële intensiteit was na 12 cycli van continue verlichting. Vergelijk dynamische veranderingen altijd met een fotobleachingcurve als controle om de significantie van ratiometrische time-lapse respons te garanderen (zie figuur 2A,B).
    13. Uit de verkregen parameters berekenen r, (Rp-R c) en (Rp-R c) / r voor individuele sferoïden in een dataset. Analyseer de normaliteit van de gegevensverdeling door de Kolmogorov-Smirnov of relevante tests. Kies de juiste statistische methode voor gegevensanalyse en ga verder met gegevenspresentatiecijfers.
      OPMERKING: De hier gepresenteerde gegevens waren normaal verdeeld en een onafhankelijke t-test bij p = 0,05 werd geïmplementeerd voor statistische vergelijking tussen sferoïde groepen.

Representative Results

De productie met hoge doorvoer van O 2-sonde voorgekleurde sferoïden met behulp van de microgepatterde agarosemethode wordt schematisch geïllustreerd in figuur 1C met voorbeelden van agarose-microwells zonder en met de voorgekleurde sferoïden. De efficiëntie van sferoïdevorming op agarosecoating en hun vorm /sfericiteit kunnen celspecifiek zijn. Menselijke colon HCT116-cellen vormden bijvoorbeeld nooit ideale bolvormige structuren met behulp van de agarose microwell-methode, in tegenstelling tot lipide-gecoat oppervlak17, terwijl hDPSCs alleen en samen gekweekt met HUVEC altijd sferoïden produceerden van zeer reproduceerbare vorm en grootte in verhouding tot de celsamenstelling, het initiële celnummer en de duur van sferoïde vorming / groei. Alle geteste celtypen verzamelden efficiënt O2-sonde nanodeeltjes tijdens sferoïdevorming (figuur 1B) en bewaarden deze kleuring gedurende ten minste 5 dagen, waardoor ze konden worden gebruikt voor bioprinting en daaropvolgende monitoring van de biogeprinte weefseloxygenatie (figuur 1D).

Figure 1
Figuur 1: Principe van de O 2-sondefunctie en de toepassing ervan voor sferoïde kleuring en bioprinting. (A) Een vereenvoudigd Yablonski-diagram, waarin het principe van O2-detectie door de fosforescerende nanodeeltjes (NP) probes wordt uitgelegd. De overdracht van energie naar moleculair O2 tijdens de verboden triplet aangeslagen toestand (T) leidt tot een afname van de fosforescentie-intensiteit omgekeerd evenredig met de fosforescentielevensduur tau, τ (veranderingen van τ1 bij 0% O2 tot τ2 bij 21% O2), wat de tijd is tussen excitatie naar singlettoestand (S1) en de terugkeer naar de grondtoestand (G0)42. Kwantitatieve O2-metingen kunnen worden uitgevoerd door ratiometrische meting of door het meten van τ (fosforescentielevensduurmetingen). (B) Een voorbeeld van kleuring van humane tandpulmstamcel (hDPSC) sferoïden gekleurd met verschillende soorten nanodeeltjes O 2-sondes, weergegeven in transmissielicht- en O2-gevoelige kleurstoffluorescentiekanalen. Schaalbalk is 100 μm. (C) Schema's van O 2-sonde voorgekleurde sferoïdegeneratie met hoge doorvoer met behulp van de microgepatterde agarosemethode. Van links naar rechts: PDMS-siliciumstempel geplaatst in een put van de kweekplaat, een voorbeeld van een microwellpatroon in agarose (4x vergroting) en een voorbeeld van MMIR1 voorgekleurde sferoïden geproduceerd uit HCT116 menselijke darmkankercellen op dag 2 na zaaien op microgepatterde agarose (4x vergroting). Schaalbalk is 100 μm. (D) Van links naar rechts: een biogeprinte wafelconstructie en microscopieanalyse van MMIR1 voorgekleurde sferoïde bioprinted construct op dag 1 en 5 na bioprinting. Het fluorescentiesignaal komt overeen met O2-gevoelige fosforescerende kleurstof in MMIR1-nanodeeltjes (exc. = 635 nm/em. = 760 nm). Schaalbalk is 400 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Op de beschreven microscopie-opstelling (conventionele widefield fluorescentiemicroscoop uitgerust met de light-emitting diode (LED) als lichtbron) werd rood / nabij-infrarood MMIR1-sonde gevonden als de beste in termen van fotostabiliteit van zijn referentie en gevoelige kleurstoffen met de minder dan 5% afname in helderheid van hun initiële intensiteitsverhouding (R = Iref / Isens ) na 12 cycli van continue verlichting. Dit maakte het gebruik van MMIR1-sonde mogelijk voor dynamische real-time studie van snelle respiratoire respons in hDPSC-sferoïden na behandeling met mitochondriale uncoupler (FCCP) en remmer van complexe I van elektronentransportketen (rotenon) (Figuur 2A,B). We vonden dat FCCP in de van stamcellen afgeleide sferoïden slechts een mild ontkoppelingseffect vertoonde met een lichte afname van de celademhaling binnen ~ 80 s na toevoeging van dit medicijn, in overeenstemming met eerder gerapporteerde metabole kenmerken van DPSC40. Aan de andere kant remde rotenon de ademhaling sterk, wat leidde tot reoxygenatie van sferoïden (weerspiegeld als de toename van Rp - sferoïde periferieverhouding en Rc - sferoïde kernverhouding) en dissipatie van de periferie-naar-kern O 2-gradiënten binnen ~ 80 s na stimulatie (figuur 2A). Tweepunts semi-kalibratie van MMIR1-sondeverhouding (R) bij hoge (atmosferische) en lage (in aanwezigheid van natriumsulfiet en glucoseoxidase in beeldvormende media) O2-niveaus bevestigden de afname van R, gerelateerd aan de afname van oxygenatie in sferoïden met voorlopige geremde ademhaling door antimycine A / rotenoncocktailbehandeling (figuur 2C ), ter illustratie van hoe de meting van MMIR1-sonde R kan worden toegepast voor semikwantitatieve monitoring van langdurige steady-state en snelle oxygenatieresponsen in 3D.

Figure 2
Figuur 2: Kinetische analyse van de O 2-sonderespons op verschillende stimuli. (A) Representatief resultaat van hDPSC sferoïde oxygenatie beeldvorming in rust en in reactie op FCCP en rotenon behandelingen. Schaalbalk is 100 μm. (B) Kinetische respons van MMIR1-intensiteitsverhouding tot FCCP- en rotenonbehandeling in vergelijking met de initiële kinetiek van de fotobleaching-intensiteitsverhouding (%). (C) Veranderingen in de intensiteitsverhoudingsbeelden van MMIR1-sonde in hDPSC-sferoïden bij zuurstofhoudende (antimycine A + rotenontoevoeging) en gedeoxygeneerde (glucoseoxidase-additie) toestanden. De kleurenbalk vertegenwoordigt de O 2-sonde-intensiteitsverhouding (R = Iref / Isens) verdeling over het beeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om de toepassing van de MMIR1-sonde voor live metabole beeldvorming te illustreren, werd de vergelijkende analyse van O 2-gradiënten in homocellulaire hDPSC versus heterocellulaire hDPSC/HUVEC (1:1) sferoïden uitgevoerd. Gebruikmakend van de beschikbaarheid van vrije blauwe en groene fluorescentie spectrale kanalen co-kleuring met Hoechst 34580 (HXT) en SYTOX Green (SYTOX) werd uitgevoerd om de toepassing van O2-sonde voor multiparametrische studies aan te tonen (figuur 3). Met behulp van het geautomatiseerde protocol van pixel-voor-pixel intensiteitsverhoudingsberekeningen van de beeldvormingssoftware werden valse-kleurverhoudingsbeelden van R-verdeling in sferoïden geproduceerd, waarbij real-time gedetecteerde periferie-tot-kern O 2-gradiënten in alle soorten sferoïden werden gevisualiseerd: met de zuurstofrijke periferie en hypoxische niches in het midden (figuur 2 en figuur 3A). De Rp- en Rc-waarden en de steilheid van de O2-gradiënt in de middelste doorsneden varieerden echter voor verschillende sferoïdetypen: zie de lijnprofielen van de middelste doorsneden in hDPSC versus hDPSC/HUVEC-sferoïden en hDPSC versus biogeprinte hDPSC-sferoïden (figuur 3B,C). Omdat er geen algemeen aanvaarde manier was om O 2-gradiënten te beschrijven, introduceerden we verschillende parameters die een eenvoudige vergelijking en gedetailleerde beschrijving van algemene sferoïde oxygenatie mogelijk maakten: Rp en Rc, en dergelijke kenmerken van O2-gradiënten als een verschil tussen de zuurstofrijke en hypoxische zones als (Rp-R c), en gemiddelde veranderingen van oxygenatie per μm als (Rp-R c) / r, waarbij r een afstand is tussen de periferie en de hypoxische kern, die in de middelste doorsnede correleert met de straal van de sferoïde (figuur 3D). Statistische vergelijking van deze parameters samen met de gegevens van necrotische dode cellen gevisualiseerd door SYTOX in sferoïden, hielp ons om voorlopige conclusies te trekken over de oorsprong van de sferoïde celtype-specifieke O 2-verdelingsgradiënten.

Figure 3
Figuur 3: Vergelijkende analyse van oxygenatiegradiënten in sferoïden. (A) Representatieve voorbeelden van levende microscopie van oxygenatie (ratiometrische fluorescentiemicroscopie van MMIR1) en levende/dode celkleuring (Hoechst 34580, HXT, blauw en SYTOX Green, SYTOX) in homocellulaire hDPSC-sferoïden voor en na het afdrukken, en heterocellulaire hDPSC/HUVEC (1:1) sferoïden. hDPSC's in alle soorten sferoïden waren afkomstig uit dezelfde celcultuur. Sferoïden werden vooraf gekleurd met 5 μg / ml MMIR1-sonde gedurende 2 dagen tijdens hun vorming en vervolgens gebruikt voor beeldvorming of bioprinting (alleen hDPSC-sferoïden), met daaropvolgende beeldvormingsanalyse op dag 1 na bioprinting. Valse kleurenbeelden van de intensiteitsverhouding (Iref/Isens) van MMIR1-gekleurde sferoïden komen overeen met hun periferie-tot-kern O 2-gradiënten. Schaalbalk is 100 μm. De kleurenbalk vertegenwoordigt de O 2-sonde-intensiteitsverhouding (R = Iref/Isens) verdeling over het beeld. De nummers 1 en 2 van de diameterdoorsneden komen overeen met de intensiteitsprofielen die worden weergegeven in B en C. (B,C) Vergelijking van intensiteitsverhoudingsprofielen tussen homogene hDPSC versus heterogene hDPSC/HUVEC-sferoïden (B) en homogene hDPSC-sferoïden voor en na bioprinting (C). Profielen werden gemeten voor doorsneden van sferoïden weergegeven op (A). (D) Schematische weergave van parameters die worden gebruikt voor de beschrijving van de periferie-tot-kern O 2-gradiënten in sferoïden, waarbij r een straal van sferoïde is en Rp en Rc intensiteitsverhoudingen van de periferie en het kerngebied van sferoïde dienovereenkomstig zijn. De kleurenbalk geeft schematisch de verdeling weer van O2-verloop van hoge (rode) naar lage (blauwe) niveaus in idealiter bolvormige sferoïde. (E,F) Vergelijkende analyse van perifery-to-core O 2-gradiënten (Rp-R c) / r-waarden in hDPSC/HUVEC- en hDPSC-sferoïden (E) en in hDPSC-sferoïden vóór en op dag 1 na bioprinting (F). Statistische analyse werd gedaan voor één experimentele herhaling (n = 18-23). Vakken komen overeen met standaarddeviaties. Asterisken geven het statistische verschil tussen groepen aan (bij p = 0,05); ** = p < 0,0005. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In vergelijking met homocellulaire hDPSC-sferoïden hadden hDPSC/HUVEC-sferoïden significant steilere gradiënten: hogere waarden van (Rp-R c) / r parameter en bereik (Rp-R c; Figuur 3F). Tegelijkertijd vertoonden ze een hogere oxygenatie van de periferie (Rp) en kern (Rc) (figuur 4A, tabel 1). Interessant is dat ze ook statistisch groter waren (figuur 4A, tabel 1), wat suggereert dat dergelijke verschillen in oxygenatie werden veroorzaakt door hun verschillende cellulaire bio-energetische profielen. Deze gegevens zijn in overeenstemming met de bekende metabole kenmerken van HUVEC-cellen met over het algemeen een lagere ademhalingsactiviteit van cellen met de sterke afhankelijkheid van glycolyse en pentose-fosfaatroutes als de belangrijkste bio-energetische bronnen van ATP en NAD (P) H41. Tegelijkertijd wordt de uitgesproken periferie-naar-kern O 2-gradiënt gevormd in heterogene sferoïden waarschijnlijk gegenereerd door hDPSC in hun samenstelling, gekenmerkt door hyperpolariseerde mitochondriën en actieve elektronentransportketen40 en, volgens de resultaten over hDPSC-sferoïdenoxygenatie, met sterke ademhalingsactiviteit (figuur 3, figuur 4A en tabel 1 ). Dus, over het algemeen hogere levensvatbaarheid van hDPSC / HUVEC-sferoïden bevestigd door de lagere intensiteit van hun dode cellen die kleuren met SYTOX (figuur 3A) is mogelijk gekoppeld aan hun hogere oxygenatieniveaus.

Om de toepasbaarheid van live microscopie beeldvorming van sferoïde oxygenatie in biofabricage te illustreren, werden MMIR1 O2-probe pre-stained sferoïden gebruikt voor bioprinting in GelMA bioink met de volgende vergelijking van O2 gradiënten in hDPSC sferoïden voor en op dag 1 na bioprinting (Figuur 3A,C,F, Figuur 4B en Tabel 2). Biogeprinte hDPSC-sferoïden hadden een significant zuurstofrijke periferie (hogere Rp) in vergelijking met sferoïden, gemeten vóór bioprinting, terwijl hun kernoxygenatie vergelijkbare waarden had (figuur 4B). Veranderingen in hun periferie-oxygenatie beïnvloeden het bereik (een toename van (Rp-R c) en steilheid (verhoogd (Rp-R c)/r) van hun periferie-tot-kern O 2-gradiënten, die statistisch verschilden van hDPSC-sferoïden gemeten vóór bioprinting (figuur 3F en figuur 4B). De kleuring van dode cellen was over het algemeen helderder in biogeprinte sferoïden, wat suggereert dat verminderde levensvatbaarheid van sferoïden betrokken is bij de verandering van sferoïde oxygenatie (figuur 3A).

Figure 4
Figuur 4: Vergelijkende analyse van MMIR1-gekleurde sferoïden diameter en intensiteitsverhouding. (A) Vergelijking tussen hetero-hDPSC/HUVEC en homocellulaire hDPSC-sferoïden. (B) Vergelijking van homocellulaire hDPSC-sferoïden voor en na bioprinting. Rp en Rc - intensiteitsverhouding aan de periferie en de kern van de sferoïden dienovereenkomstig; (Rp-R c) - het verschil in intensiteitsverhouding, overeenkomend met het bereik van O 2-gradiënt in sferoïden. Statistische analyse werd gedaan voor één experimentele replicaat (n = 18-23). Vakken komen overeen met standaarddeviaties. Asterisken geven het statistische verschil tussen groepen aan (bij p = 0,05), waarbij * = p < 0,005 en ** = p < 0,0005. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Type sferoïde (N) Diameter [μm] Rp [a.u.] Rc [a.u.] Rp-R c [a.u.] (Rp-R c)/r [a.u./μm]
hDPSC / HUVEC (18) 113,2 ± 10,6 0,779 ± 0,034 0,398 ± 0,055 0,982 ± 0,051 0,00677 ± 0,00091
hDPSC (18) 88,1 ± 9,9 0,558 ± 0,025 0,331 ± 0,034 0,227 ± 0,032 0,00520 ± 0,00090
p-waarde 1,5 x 10-8 * 1,5 x 10-21 * 1,3 x 10-4 * 1,4 x 10-12 * 9,2 x 10-6 *

Tabel 1. Sferoïde diameter, intensiteitsverhouding in de kern (Rc) en periferie (Rp) van de sferoïden, het verschil in intensiteitsverhouding (Rp-R c) en (Rp-R c) / r waarde in heterogene hDPSC/HUVEC en homogene hDPSC sferoïden. de p-waarde van een t-test op N-sferoïden toont statistisch verschil en wordt ook aangegeven met een sterretje.

Type sferoïde (N) Diameter [μm] Rp [a.u.] Rc [a.u.] Rp-R c [a.u.] (Rp-R c)/r [a.u./μm]
hDPSC (18) 88,1 ± 9,9 0,558 ± 0,025 0,331 ± 0,034 0,227 ± 0,032 0,00520 ± 0,00090
Biogeprinte hDPSC (23) 80,9 ± 12,5 0,584 ± 0,023 0,323 ± 0,038 0,261 ± 0,039 0,00658 ± 0,00144
p-waarde 0.054 0.0024 * 0.46 9,9 x 10-4 * 6,3 x 10-6 *

Tabel 2. Sferoïde diameter, intensiteitsverhouding in de kern (Rc) en periferie (Rp) van de sferoïden, het verschil in intensiteitsverhouding (Rp-R c) en (Rp-R c) / r waarde in homogene hDPSC sferoïden voor en na bioprinting. p-waarde van statistische analyse (N-sferoïden). Het statistische verschil wordt aangegeven met een sterretje.

Discussion

Betekenis. Weefseloxygenatiemeting geeft inzicht in cel- en weefselspecifiek metabolisme, weefselgroei en -ontwikkeling, levensvatbaarheid, tumorigenese en celmigratie, en interactie met microben en andere pathogenen. De gepresenteerde methode biedt een nieuw hulpmiddel voor een beter begrip van de fysiologie van meercellige sferoïde culturen: analyse van oxygenatie met ratiometrische nanodeeltjes O 2-sondes en biedt middelen voor het beoordelen van hypoxie, het visualiseren van de afhankelijkheid van bepaalde energieproductieroutes en het aanvullen van modelleringsstudies en alternatieve metabole beeldvormingsbenaderingen 43,44 op een algemeen verkrijgbare goedkope fluorescentiemicroscoop. Ratiometrische metingen kunnen worden uitgevoerd op een fluorescentiebreedveld (gepulseerde LED-excitatie heeft de voorkeur), laserscanning confocale, lichtplaat- en tweefotonenmicroscopen, ideaal uitgerust met T- en O 2-incubatorkamers. Belangrijk is dat gepresenteerde O 2-microscopiemeting gemakkelijk kan worden gecombineerd met de live multiparameteranalyse van verschillende fysiologische parameters en celtracers (in het geval van heterocellulaire sferoïde culturen), levensvatbaarheid (levende / dode kleuring), lipidemetabolisme (lipide-sensing fluorescerende sondes), dynamiek van pH (kleurstoffen, nanodeeltjes en fluorescerende eiwitten) of [Ca2 + ], uitgevoerd in beschikbare fluorescentiespectrische kanalen of parallel, waardoor een uitgebreid beeld wordt gegeven van de real-time celfunctie in sferoïden, bioprinted constructen en potentiële weefseltransplantaties.

Sferoïde culturen vinden gebruik in studies van kankercellen, tumor- en stamcelniche micro-omgeving, tumoroïden, geneesmiddelenefficiëntie en toxiciteitsscreening, en inderdaad als weefselbouwstenen voor weefselbiofabricage en zelfassemblage45. Ze kunnen worden gegenereerd uit meerdere celtypen door verschillende benaderingen46. De populariteit van het sferoïde model vereist hun standaardisatie vanuit het oogpunt van wetenschappelijke integriteit en verbetering van gegevensanalyse, die onlangs werd geprobeerd door de ontwikkeling van de eerste sferoïde database8.

Ons protocol zal naar verwachting helpen om het levende sferoïdemetabolisme beter te begrijpen, dit experimentele model te standaardiseren en vervolgens hun stabiliteit, reproduceerbaarheid en levensvatbaarheid op lange termijn te verbeteren in bioprinted en implanteerbare materialen.

Wijzigingen. Dit protocol beschrijft het gebruik van microgepatterde agarose laagklevende oppervlakte (micromold-gebaseerde formatie29) voor high yield generatie van O2 probe-loaded sferoïden voor oxygenatie analyse. De alternatieve methoden voor de productie van sferoïden, zoals hangende druppel, toepassing van ultralage bevestigingsplaten, lipidecoating of vrij zwevende formatie, zijn ook compatibel met het voorgestelde O 2-sondebelastingsprotocol. Het gepresenteerde protocol werd geoptimaliseerd voor hDPSC-sferoïden en co-cultuursferoïden van hDPSC met HUVEC (1:1). Andere cellijnen zijn zeker van toepassing 15,17,47,48; sommige protocoloptimalisatie kan echter nodig zijn vanwege de verschillende celadhesie-eigenschappen, kweekomstandigheden, metabole substraatvereisten en celcompatibiliteit met nanodeeltjeskleuring. De keuze van een geschikte op ratiometrische nanodeeltjes gebaseerde O2-gevoelige sonde moet worden gedaan afhankelijk van het specifieke celmodel en volgens de fotobleachingseigenschappen van de sonde bij de gebruikte microscopie-opstelling (intensiteit en type van de lichtbron, spectrale gevoeligheid van de camera) en beschikbaarheid van geschikte excitatie- / emissiefilters voor overeenkomstige referentie- en O2-gevoelige spectrale kanalen van de sonde.

Sommige ratiometrische O2 sondes zijn in de handelverkrijgbaar 2. Als alternatief kunnen ze in eigen huis worden bereid door co-precipitatie van referentie- en O2-gevoelige kleurstoffen met een polymeer zoals elders beschreven 24,25,49. Voor elk afzonderlijk model moeten de voorbereidende tests worden uitgevoerd om de juiste sonde en optimale microscopieomstandigheden te bepalen en om het effect van sondefotobleaching of foto-geïnduceerd O2-verbruik tijdens ratiometrische metingen te minimaliseren. Eerdere studies van O2-sensing nanodeeltjes toonden hun lage celtoxiciteit aan, waardoor toepassing in een breed scala aan kleuringsconcentraties (1-20 μg / ml) mogelijk was. Omdat sommige kationische nanodeeltjes zichzelf kunnen aggregeren tijdens opslag, raden we aan hun belastingsconcentratie zo laag mogelijk te houden om hun potentiële effect op de vorming van sferoïden te minimaliseren. Optioneel kan de nanodeeltjessuspensie vóór gebruik worden gefilterd (0,2 μm) of worden gewist door centrifugatie (10.000 x g, 5 min) om alle aggregaten uit de suspensie te verwijderen.

Hoewel de BioCAD- en HMI-software specifiek zijn voor de gepresenteerde bioprinter, is dit protocol van toepassing op andere bioprinters, omdat de voorbereiding van de bioink, assemblage, het vullen van een standaardpatroon en het ontwerp van een poreuze hydrogelsteiger worden geleverd. Bovendien moeten de bioprintparameters zoals afdruksnelheid en temperatuur vergelijkbaar zijn voor verschillende bioprinters op basis van extrusie. Drukdruk en veerpootdiameter zijn afhankelijk van het naaldtype en de diameter, de samenstelling van het bioink, de temperatuur en de resulterende viscositeit, maar ze kunnen een startpunt zijn om afdrukparameters te optimaliseren om op GelMA gebaseerde bioinks met verschillende bioprinters te bioprinten, hoewel sommige bioprinters spindels gebruiken in plaats van luchtdruk om de bioink50 te extruderen.

Kritieke stappen en probleemoplossing. Een van de kritieke stappen is de keuze van de O 2-sonde, die is gebaseerd op de volgende overwegingen: ten eerste, de beschikbare fluorescentiemicroscoopop (d.w.z. compatibele excitatielichtbron, filters voor excitatie en emissie, cameragevoeligheid en spectrale transmissie en numeriek diafragma van het objectief), die het aantal beschikbare sondes kan beperken met betrekking tot hun fotostabiliteit, helderheid en potentiële fototoxiciteit. Het is ook belangrijk op te merken dat sommige soorten onderdompelingsolie (in het geval van olie-onderdompelingsdoelstellingen) kunnen interfereren met rode en infrarode fluorescentiesignalen. Wij vinden de fotostabiliteitstesten van groot belang en dat deze tijdens de eerste set-up en voortesten moeten worden uitgevoerd. Er moet rekening worden gehouden met mogelijke spectrale overspraak tussen de fluorescerende kanalen en verschillende kleurstoffen. Inderdaad, de potentiële donkere en foto-geïnduceerde toxiciteit van de O 2-sonde en andere geselecteerde kleurstoffen, in relatie tot het specifieke celmodel, moet worden geëvalueerd tijdens protocoloptimalisatie51. Het specifieke probleem voor nanodeeltjes kan hun zelfaggregatie zijn, die kan worden verzacht door hun werkconcentratie, samenstelling van het kleuringsmedium (bijv. Serumgehalte), ultrasoonapparaat van nanodeeltjes te optimaliseren voordat ze met medium worden gemengd of door gebruik te maken van O 2-sonde voorgekleurde en gewassen cellen voor sferoïdevorming in plaats van sondebelasting tijdens de sferoïdevorming en verdichtingsprocedure.

We hebben geen problemen waargenomen die verband houden met de lichtpenetratiediepte met beschreven sferoïde modellen, maar dit moet worden overwogen bij het kiezen van ratiometrische intensiteitssignalen, grootte van sferoïde en biogefabriceerde constructies (weefseltransplantaten) en het optimaliseren van celkleuring met respectieve kleurstoffen. MMIR1-sonde met nauw overeenkomende rode en nabij-infrarode emissiegolflengten zal naar verwachting de laagste achtergrond en de beste weefsellichtpenetratie bieden, vergeleken met andere rood / blauwe of groen-emitterende fluorescerende biosensorsondes.

Productie en verwerking van ratiobeelden (en mogelijk spectrale ontmenging of deconvolutie) kan worden gedaan in een door de leverancier geleverde software of in de opensource-opties zoals ImageJ, Fiji52,53, napari (https://napari.org), MATLAB en anderen. Een cruciale stap is het aftrekken van achtergrond- en het meten van signaalintensiteitsveranderingen in een lineair bereik.

Kalibratie van O2-sonde: Rotenon en antimycine A zijn remmers van complexen I en III van de mitochondriale elektronentransportketen, respectievelijk blokkeren celademhaling 54,55,15 en induceren dissipatie van O 2-gradiënten in sferoïden en hun evenwicht met het milieu O2. Dus, het veranderen van de omgeving O2-concentratie (d.w.z. 20%, 15%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0% O2) zal ratiometrische intensiteit of fosforescentielevensduurkalibratie van de O2-gevoelige sonde in cellen mogelijk maken. Typisch, O2-gecontroleerde incubators zijn niet in staat om absolute 0% O2 te bereiken en in bepaalde situaties is een snelle test van de respons van sonde op deoxygenatie vereist. In dergelijke gevallen moet 25-100 μg/ml glucoseoxidase of Na2SO3/K2HPO4 mengsel (50 mg/ml voor elke verbinding voor 10x oplossing in gedestilleerd water) aan het monster worden toegevoegd. Belangrijk is dat als de cellijn een significante mate van niet-mitochondriale O2-consumptie heeft, dit in overweging wordt genomen bij het uitvoeren van remming van ademhaling en kalibratie-experimenten.

Beperkingen en toekomstig onderzoek. De belangrijkste beperking van de voorgestelde methode en de ratiometrische detectie in het algemeen is de kalibratie en conversie van waargenomen rationiveaus naar de werkelijke O2-niveaus, die vanwege intrinsieke verschillen in hardware en instellingen voor gebruikersbeeldacquisitie de verhoudingskalibratie-instrument- en celspecifiek zouden maken. Belangrijk is dat voor een widefield fluorescentiemicroscoop en beschreven opstelling, de verhoudingsbeelden gecombineerde projecties weerspiegelen in plaats van ideale optische secties en O 2-kalibratie zou niet logisch zijn. Aan de andere kant laten we zien dat semi-kwantitatieve ratiometingen statistisch significante en gemakkelijk te meten vergelijkende fenotypering van sferoïden geproduceerd uit verschillende bronnen en met verschillen in oxygenatie bieden.

Het toekomstige onderzoek naar het toegankelijker en betaalbaarder maken van microscopiebenaderingen die zijn ontworpen voor levende 3D-objecten zoals SPIM, lichtplaat, theta, tweefoton en luminescentielevende beeldvorming in combinatie met de machine learning 56,57,58,59,19, zal helpen om multiparametrische O2-beeldvorming naar nog meer kwantitatieve toepassingen te brengen.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de special research fund grant van de Universiteit Gent (BOF/STA/202009/003) en HET EU FP7 ITN Program "Chebana", subsidieovereenkomst nr. 264772 (voor AVK). Gegevens zijn op aanvraag beschikbaar. G-code voor bioprinting is beschikbaar om te delen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 Also available from Sigma
12 well cell-culture plates, sterile Greiner bio-one 665-180 Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removable Ibidi 81201 Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubes Nerbe plus 02-502-3001 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3cc Cartridge, UV secure, luer lock RegenHU C-033CC-UV Also available from CelIink and others
3D Discovery Bioprinter RegenHU N/A Bioprinter equiped with an extrusion based printhead, heating mantle, UV-LED curing lamp, 3D Discovery HMI software (CAD/CAM software with direct machine control) and BioCAD software (version 1.1-12)
6 well cell-culture plates, sterile Greiner bio-one 657160 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674-25MG Used as inhibitor of complex III of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration
B-Braun Tip Cap, luer lock RegenHU TC-BB-B Also available from Regemat, Cellink and others
Cell view cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment, sterile Greiner bio-one 627861 For microscopy of bioprinted spheroids
Collagen from human placenta, type IV Sigma C5533 For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
D(+)-Glucose Merck 8342 Prepare 1M stock solution, 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free Sigma-Aldrich D5030-10X1L For preparation of imaging medium
Endothelial Cell Growth Medium 2 PromoCell C-22011 Also available from Lonza and others
Endothelial Growth SupplementMix PromoCell C-39216 Also available from Lonza and others
FCCP, Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920-10MG Used as mitochondrial uncoupler
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-098 Also available from Sigma
GelMA N/A N/A GelMA was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent) [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961213011782] but are also available from Xpect Inx
Glucose-oxidase from Aspergillus nige (10000 u) Sigma-Aldrich G7141 Used to test the response of probe to deoxygenation
GlutaMAX 100x Supplement Gibco 35050-038 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 2mM)
HEPES (1M) Gibco 15630-080 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM)
Hoechst 34580 Invitrogen (Life Technologies) H21486 Also available from Sigma, BDBiosciences and others
Human dental pulp stem cells (hDPSC) Lonza PT-5025 Also available from ATCC or other vendors
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Lonza CC-2517 Also available from ATCC or other vendors
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) Merck 4873 For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily.
Li-TPO N/A N/A Li-TPO-L was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent)  [https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F97
8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination] but comparable photo-initiators are available from Sigma
MEM Alpha Medium + Glutamax Minimum essential medium Gibco 32561-029 Also available from Sigma and others
Micro-patterned 3D-printed PDMS stamps, wells with a diameter 400 µm, thickness, total well numbers 1585 Self-fabricated These stamps were self-fabricated by the Centre for Microsystems Technology (Professor Dr Jan Vanfleteren, University of Gent) but can also be obtained commercially from Merck (Z764094, Microtissues 3D Petri Dish micro-mold mixed spheroid kit)
Na2SO3 (sodium sulfite) Sigma-Aldrich 239321-500G For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily.
O2 probes: MMIR1, SI-0.2+, SII-0.2+ N/A N/A Can be prepared ‘in-house’ using commercially available dyes, polymers and precipitation method [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]. Some nanoparticles are available commercially as discussed in [https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-018-2840-x ]
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution Gibco 15140-122 Also available from Sigma . Apply in dilution 1:100
Petri dishes, sterile Greiner bio-one 633181 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Piston for 3cc cartridge RegenHU P-03CC-UV Also available from Cellink, Regemat and others
Poly-D-lysine Sigma P6407-5mg For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
PVDF syringe filter 0.22 µm Novolab A35149 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Rotenone Sigma-Aldrich R8875-1G Used as inhibitor of complex I of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SYTOX Green Invitrogen (Life Technologies) S7559 Also available from Sigma, Promega and others
Taper tip 22 gauge (conical PE needle Amada Myachi Europe 22K62222 Similar products are also available from RegenHU, Cellink, Regemat and others
Tissue culture flask (75 cm2) VWR 734-2313 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Ultrapure Agarose Invitrogen (Life Technologies) 16500-500 Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscope Olympus N/A Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Biological detection by optical oxygen sensing. Chemical Society Reviews. 42 (22), 8700-8732 (2013).
  2. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
  3. Cordeiro, I. R., Tanaka, M. Environmental oxygen is a key modulator of development and evolution: From molecules to ecology: Oxygen-sensitive pathways pattern the developing organism, linking genetic and environmental components during the evolution of new traits. BioEssays. 42 (9), 2000025 (2020).
  4. Wenger, R. H., Kurtcuoglu, V., Scholz, C. C., Marti, H. H., Hoogewijs, D. Frequently asked questions in hypoxia research. Hypoxia. 3, 35 (2015).
  5. Erecińska, M., Silver, I. A. Tissue oxygen tension and brain sensitivity to hypoxia. Respiration Physiology. 128 (3), 263-276 (2001).
  6. Gholipourmalekabadi, M., Zhao, S., Harrison, B. S., Mozafari, M., Seifalian, A. M. Oxygen-generating biomaterials: a new, viable paradigm for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 34 (12), 1010-1021 (2016).
  7. Zheng, L., Kelly, C. J., Colgan, S. P. Physiologic hypoxia and oxygen homeostasis in the healthy intestine. A review in the theme: cellular responses to hypoxia. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 309 (6), 350-360 (2015).
  8. Peirsman, A., et al. MISpheroID: a knowledgebase and transparency tool for minimum information in spheroid identity. Nature Methods. 18 (11), 1294-1303 (2021).
  9. Suvarnapathaki, S., Wu, X., Lantigua, D., Nguyen, M. A., Camci-Unal, G. Breathing life into engineered tissues using oxygen-releasing biomaterials. NPG Asia Materials. 11 (1), 1-18 (2019).
  10. Salazar-Noratto, G. E., et al. Understanding and leveraging cell metabolism to enhance mesenchymal stem cell transplantation survival in tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells. 38 (1), 22-33 (2020).
  11. Leedale, J. A., et al. Mathematical modelling of oxygen gradients in stem cell-derived liver tissue. Plos One. 16 (2), 0244070 (2021).
  12. Sutherland, R., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).
  13. Walenta, S., Dötsch, J., Bourrat-Flöck, B., Mueller-Klieser, W. Size-dependent oxygenation and energy status in multicellular tumor spheroids. Oxygen Transport to Tissue XII. , Springer. (1990).
  14. Hompland, T., Fjeldbo, C. S., Lyng, H. Tumor hypoxia as a barrier in cancer therapy: Why levels matter. Cancers. 13 (3), 499 (2021).
  15. Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
  16. Dmitriev, R. I., Borisov, S. M., Jenkins, J., Papkovsky, D. B. Multi-parametric imaging of tumor spheroids with ultra-bright and tunable nanoparticle O2 probes. Imaging, manipulation, and analysis of biomolecules, cells, and tissues XIII. , International Society for Optics and Photonics. (2015).
  17. Dmitriev, R. I., et al. Versatile conjugated polymer nanoparticles for high-resolution O2 imaging in cells and 3D tissue models. ACS Nano. 9 (5), 5275-5288 (2015).
  18. Okkelman, I. A., Puschhof, J., Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Visualization of Stem Cell Niche by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. Intestinal Stem Cells. , Springer. 65-97 (2020).
  19. Dmitriev, R. I., Intes, X., Barroso, M. M. Luminescence lifetime imaging of three-dimensional biological objects. Journal of Cell Science. 134 (9), 1-17 (2021).
  20. Yasukagawa, M., Yamada, K., Tobita, S., Yoshihara, T. Ratiometric oxygen probes with a cell-penetrating peptide for imaging oxygen levels in living cells. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry. 383, 111983 (2019).
  21. Xie, B. -R., et al. A near infrared ratiometric platform based π-extended porphyrin metal-organic framework for O2 imaging and cancer therapy. Biomaterials. 272, 120782 (2021).
  22. Düssmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O 2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death & Disease. 8 (6), 2853 (2017).
  23. Roussakis, E., et al. Theranostic biocomposite scaffold membrane. Biomaterials. 212, 17-27 (2019).
  24. Kondrashina, A. V., et al. A phosphorescent nanoparticle-based probe for sensing and imaging of (intra) cellular oxygen in multiple detection modalities. Advanced Functional Materials. 22 (23), 4931-4939 (2012).
  25. Borisov, S. M., et al. Precipitation as a simple and versatile method for preparation of optical nanochemosensors. Talanta. 79 (5), 1322-1330 (2009).
  26. Borisov, S., Nuss, G., Klimant, I. Red light-excitable oxygen sensing materials based on platinum (II) and palladium (II) benzoporphyrins. Analytical Chemistry. 80 (24), 9435-9442 (2008).
  27. Strobl, M., Rappitsch, T., Borisov, S. M., Mayr, T., Klimant, I. NIR-emitting aza-BODIPY dyes-new building blocks for broad-range optical pH sensors. Analyst. 140 (21), 7150-7153 (2015).
  28. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  29. Fukuda, J., et al. Micromolding of photocrosslinkable chitosan hydrogel for spheroid microarray and co-cultures. Biomaterials. 27 (30), 5259-5267 (2006).
  30. Thomsen, A. R., et al. A deep conical agarose microwell array for adhesion independent three-dimensional cell culture and dynamic volume measurement. Lab on a Chip. 18 (1), 179-189 (2018).
  31. Gevaert, E., et al. High throughput micro-well generation of hepatocyte micro-aggregates for tissue engineering. PloS One. 9 (8), 105171 (2014).
  32. De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
  33. Rivron, N. C., et al. Tissue deformation spatially modulates VEGF signaling and angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (18), 6886-6891 (2012).
  34. Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. Measuring phagosome pH by ratiometric fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (106), e53402 (2015).
  35. Billiet, T., Gevaert, E., De Schryver, T., Cornelissen, M., Dubruel, P. The 3D printing of gelatin methacrylamide cell-laden tissue-engineered constructs with high cell viability. Biomaterials. 35 (1), 49-62 (2014).
  36. Tytgat, L., et al. Photopolymerizable materials for cell encapsulation. 3D Printing and Biofabrication. Ovsianikov, A., Yoo, J., Mironov, V. , Springer International Publishing. Berlin. 353-396 (2018).
  37. Markovic, M., et al. Hybrid tissue engineering scaffolds by combination of three-dimensional printing and cell photoencapsulation. Journal of Nanotechnology in Engineering and Medicine. 6 (2), 0210011 (2015).
  38. De Moor, L., et al. Hybrid bioprinting of chondrogenically induced human mesenchymal stem cell spheroids. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 484 (2020).
  39. Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Hynes, J., Papkovsky, D. B. Kinetic analysis of local oxygenation and respiratory responses of mammalian cells using intracellular oxygen-sensitive probes and time-resolved fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 183-207 (2014).
  40. Uribe-Etxebarria, V., Agliano, A., Unda, F., Ibarretxe, G. Wnt signaling reprograms metabolism in dental pulp stem cells. Journal of Cellular Physiology. 234 (8), 13068-13082 (2019).
  41. Vizán, P., et al. Characterization of the metabolic changes underlying growth factor angiogenic activation: identification of new potential therapeutic targets. Carcinogenesis. 30 (6), 946-952 (2009).
  42. Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Quenched-phosphorescence detection of molecular oxygen: applications in life sciences. Royal Society of Chemistry. , (2018).
  43. Perottoni, S., et al. Intracellular label-free detection of mesenchymal stem cell metabolism within a perivascular niche-on-a-chip. Lab on a Chip. 21 (7), 1395-1408 (2021).
  44. Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) and extracellular flux analyses. Redox Biology. 30, 101420 (2020).
  45. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
  46. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), 20160877 (2017).
  47. Dmitriev, R. I., et al. Imaging oxygen in neural cell and tissue models by means of anionic cell-permeable phosphorescent nanoparticles. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (2), 367-381 (2015).
  48. Jenkins, J., Borisov, S. M., Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Sulforhodamine nanothermometer for multiparametric fluorescence lifetime imaging microscopy. Analytical Chemistry. 88 (21), 10566-10572 (2016).
  49. Fercher, A., Borisov, S. M., Zhdanov, A. V., Klimant, I., Papkovsky, D. B. Intracellular O2 sensing probe based on cell-penetrating phosphorescent nanoparticles. ACS Nano. 5 (7), 5499-5508 (2011).
  50. Wagner, M., Karner, A., Gattringer, P., Buchegger, B., Hochreiner, A. A super low-cost bioprinter based on DVD-drive components and a raspberry pi as controller. Bioprinting. 23, 00142 (2021).
  51. Golub, A. S., Pittman, R. N. Monitoring parameters of Oxygen transport to cells in the microcirculation. Quenched-Phosphorescence Detection of Molecular Oxygen. , 193-204 (2018).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Huang, C., Becker, M. F., Keto, J. W., Kovar, D. Annealing of nanostructured silver films produced by supersonic deposition of nanoparticles. Journal of Applied Physics. 102 (5), 054308 (2007).
  54. Foster, K. A., Galeffi, F., Gerich, F. J., Turner, D. A., Müller, M. Optical and pharmacological tools to investigate the role of mitochondria during oxidative stress and neurodegeneration. Progress in Neurobiology. 79 (3), 136-171 (2006).
  55. Schmidt, C. A., Fisher-Wellman, K. H., Neufer, P. D. From OCR and ECAR to energy: perspectives on the design and interpretation of bioenergetics studies. The Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101140 (2021).
  56. Stelzer, E. H., Lindek, S. Fundamental reduction of the observation volume in far-field light microscopy by detection orthogonal to the illumination axis: confocal theta microscopy. Optics Communications. 111 (5-6), 536-547 (1994).
  57. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
  58. Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
  59. von Chamier, L., et al. Democratising deep learning for microscopy with ZeroCostDL4Mic. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).

Tags

Bio-engineering Nummer 182 biofabricage bioprinting fluorescentiemicroscopie hypoxie metabolisme O2-gevoelige sonde oxygenatie stamcellen sferoïden
Betaalbare zuurstofmicroscopie-geassisteerde biofabricage van meercellige sferoïden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Okkelman, I. A., Vercruysse, C.,… More

Okkelman, I. A., Vercruysse, C., Kondrashina, A. V., Borisov, S. M., Dmitriev, R. I. Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids. J. Vis. Exp. (182), e63403, doi:10.3791/63403 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter