Summary
O protocolo descreve uma modificação do método golgi rápido, que pode ser adaptado a qualquer parte do sistema nervoso, para colorir neurônios no hipocampo e córtex pré-frontal medial do rato.
Abstract
A impregnação de Golgi, utilizando o kit de coloração golgi com pequenas adaptações, é usada para impregnar espinhas dendríticas no hipocampo de ratos e córtex pré-frontal medial. Esta técnica é uma melhoria acentuada em relação aos métodos anteriores de impregnação de Golgi porque os produtos químicos pré-selecionados são mais seguros de usar, os neurônios são consistentemente bem impregnados, há muito menos detritos de fundo, e para uma determinada região, há desvios extremamente pequenos na densidade da coluna vertebral entre experimentos. Além disso, os cérebros podem ser acumulados após um certo ponto e mantidos congelados até um processamento mais aprofundado. Usando este método qualquer região de interesse cerebral pode ser estudada. Uma vez manchada e coberta escorregada, a densidade da coluna vertebral dendrítica é determinada contando o número de espinhas para um comprimento de dendrito e expressa como densidade da coluna vertebral por dendrito de 10 μm.
Introduction
O método de uso de dicromato de potássio e nitrato de prata para rotular neurônios foi descrito pela primeira vez por Camillo Golgi 1,2 e posteriormente usado por Santiago Ramon y Cajal para produzir um imenso corpo de trabalho diferenciando subtipos neuronais e gliais. Um livro recentemente publicado com suas ilustrações está agora disponível3. Após os estudos de Ramon e Cajal, publicados há mais de 100 anos, pouco golgi impregnação foi utilizada. A impregnação de Golgi é um processo trabalhoso que permite a visualização tridimensional de neurônios com um microscópio leve. Houve inúmeras modificações do método Golgi ao longo dos anos para facilitar o método e a coloração mais consistente4. Em 1984, Gabbott e Somogyi5 descreveram o procedimento de impregnação da seção única golgi que permitiu um processamento mais rápido. Este método de impregnação golgi requer perfusão com 4% de paraformaldeído e 1,5% de ácido picrico, pós-fixação seguida de vibratome seção em um banho de 3% de dicroma de potássio. As seções são montadas em lâminas de vidro, os quatro cantos de tampas colados de modo que, quando imersos em nitrato de prata, a difusão é gradual. As manchas são então retiradas, as seções são desidratadas e, eventualmente, cobrem o deslizamento permanentemente com o meio de montagem. Esta técnica foi usada com sucesso para rotular neurônios e glia 6,7,8 no hipocampo. O método golgi rápido descrito aqui é uma melhoria porque há muito menos exposição tanto ao dicromato de potássio quanto ao nitrato de prata e não são utilizados paraformaldeído e ácido picrico. Além disso, embora as células que foram impregnadas usando modificações do método Gabbott e Somogyi5 pudessem ser analisadas, muitas vezes as seções estavam sobreexe ou sub-expostas ou caíram dos slides durante a etapa de desidratação e, geralmente, vários experimentos tinham que ser agrupados para ter células suficientes para análise.
O presente protocolo descreve o uso do kit de coloração golgi (ver Tabela de materiais) para rotular dendritos e colunas dendríticas no hipocampo e córtex pré-frontal medial (mPFC) do rato. As vantagens desse método em relação aos anteriores são que ele é rápido, há menos exposição a produtos químicos nocivos para o pesquisador e há uma coloração consistente de neurônios. O protocolo descrito abaixo tem sido usado com pequenas modificações para avaliar a densidade da coluna vertebral dendrítica no hipocampo e mPFC do rato em muitos estudos 9,10,11,12,13,14,15.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Coração Sagrado e estão de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais.
1. Isolamento e infiltração do tecido cerebral
- Soluções Pré-x A e B do kit de coloração Golgi 24 horas antes de usar e manter em garrafas escuras e/ou no escuro. Faça aproximadamente 80 mL de mistura de solução A e B que é suficiente para mudar a solução após 24 horas. Guarde garrafas herméticas.
NOTA: A perfusão com soro fisiológico ou paraformaldeído não é necessária. - Sacrifique ratos por guilhotina após eutanásia de dióxido de carbono e remova cérebros em segundos. Enxágüe cérebros em soro fisiológico, se necessário, mas não é necessário.
- Coloque o cérebro, córtex para baixo para que o hipotálamo seja visível porque os cortes são feitos anteriores e posteriores a ele, em uma superfície não porosa. Corte em um bloco anterior (contém o córtex pré-frontal) e posterior (contém o hipocampo) como mostrado na Figura 1.
- Coloque blocos nas soluções pré-misturadas de A e B, certificando-se de que elas estejam bem imersas na solução. Certifique-se de que o volume das soluções A e B seja suficiente para imergir os blocos. Armazene blocos em garrafas marrons ou garrafas limpas cobertas com papel alumínio (para manter a luz fora) no escuro à temperatura ambiente.
- Substitua a solução após 24 horas e mantenha no escuro por mais 13 dias em temperatura ambiente.
NOTA: Se usado com cérebros de camundongos, não há necessidade de bloquear, e todo o cérebro pode ser colocado na solução. Se as áreas cerebrais de coloração, que são diferentes em tamanho, o tempo nas soluções A e B pode ter que ser determinado por tentativa e erro. - Após duas semanas o tecido é bem infiltrado com as soluções A e B, transfira os blocos para a solução crioprotetora (solução C no kit de coloração golgi), e deixe-os por 48-72 h a 4 °C.
NOTA: Após a proteção crioproteção, os blocos podem ser congelados até um processamento adicional. Além disso, note que todas as soluções do kit são coletadas e descartadas como resíduos perigosos. - Congele o cérebro, cortex para baixo, em um deslizamento de vidro em gelo seco. Uma vez congelado, corte o criostat ou armazene a -80 °C até seção usando um criostat.
NOTA: Não congele em nitrogênio líquido, pois isso produz rachaduras no tecido.
2. Secção de tecidos cerebrais
- Coloque uma pequena quantidade de tecido médio em um mandril criostat pré-resfriado. Monte blocos em mandris criostates descongelando um lado do bloco ligeiramente na mão (luvas) e colocando-o no meio de tecido.
NOTA: Não é necessário incorporar o tecido. O bloco que contém o hipocampo é um pouco mais fácil de cortar do que o bloco com o córtex pré-frontal porque este último é anterior ao caloso corpus e as duas metades são separadas. - Corte seções de 100 μm em um criostat a -22 °C e monte em lâminas subcoradas. Podem ser utilizadas seções de até 150 μm de espessura. Tente montar 3-4 seções coronais por slide à medida que isso diminui o número de slides que requerem processamento. Use uma das seguintes técnicas para manter as seções congeladas até que elas entrem no slide.
NOTA: Estas seções não são fixas da maneira usual e, portanto, tendem a derreter rapidamente. Deixe as seções derreterem no slide. Se eles começarem a derreter antes de serem colocados no escorregador, é impossível fazê-los ficar lisos no slide. Existem várias técnicas para fazer isso.- Use um spray de congelamento na faca e no bloco. Dependendo da temperatura e umidade na sala, isso pode ser necessário para cada seção. Use a placa antiroll ou um pincel para manter a seção plana durante o corte.
NOTA: Certifique-se de ter spray de congelamento suficiente. Várias latas podem ser usadas ao cortar 20 blocos. - Degelo montar, se possível, usando um slide de temperatura ambiente e rapidamente aponha-lo à seção. Com a prática, pode-se montar várias seções ao mesmo tempo. Se isso não funcionar, mantenha slides no criostat para que estejam muito frios e transfira a seção com fórceps frios ou um pincel frio e, em seguida, descongele o suporte.
- Use um spray de congelamento na faca e no bloco. Dependendo da temperatura e umidade na sala, isso pode ser necessário para cada seção. Use a placa antiroll ou um pincel para manter a seção plana durante o corte.
- Limpe a faca com lenços de papel entre as fatias. Se a faca precisar de mais limpeza, use 100% de etanol (EtOH) e deixe secar antes de cortar a próxima fatia.
- Uma vez montado no slide, coloque o slide plano em bandejas de slides de papelão e deixe que as seções sequem à temperatura ambiente (por várias horas a um máximo de 48 h) no escuro. Não cubra a bandeja de slides. Certifique-se de que as seções estão completamente secas antes da impregnação de Golgi. Guarde plana, no escuro, em bandejas de slides até a impregnação de Golgi.
NOTA: A secagem das seções não causa nenhum dano.
3. Coloração e desidratação do tecido cerebral
- Realizar coloração em pratos de coloração de vidro. Misture as soluções D e E imediatamente antes da coloração. De acordo com o protocolo, adicione uma parte da solução D, uma parte da solução E e duas partes de água destilada. Para pratos de coloração de vidro, faça uma solução de 200 mL para submergir completamente as seções. Para os frascos Koplin, isso requer menos volume.
- Coloque slides em racks espaçados o suficiente para permitir o acesso à solução às seções.
- Coloque seções em água destilada por 4 min (2x) antes de colocá-las na solução de coloração de impregnação de Golgi por 10 minutos. Altere a solução de coloração a cada 70 seções. Troque a água destilada quando ficar amarela.
NOTA: O tempo para a etapa de coloração é crítico. Muito curto não permite coloração suficiente e causas muito longas sobre a coloração, tornando os dendritos difíceis de separar ao fazer análise. Uma vez fora da solução de coloração, o tempo é menos crítico. - Desidratar as seções da seguinte forma: 70% EtOH (5 min), 95% EtOH (5 min; 2x), 100% EtOH (5 min; 2x), agente de compensação (5 min; 3x). Mude todas as soluções com frequência, especialmente o EtOH 100% e o agente de compensação para garantir que as seções permaneçam anidros.
NOTA: Não é necessário passar por uma etapa de 50% de EtOH. A contra-retenção não é necessária para visualização celular porque a impregnação de Golgi fornece contraste suficiente. O uso de outros agentes de compensação não funcionou tão bem quanto o utilizado aqui (ver Tabela de materiais). - Tampas com tampas de vidro que têm 60 mm de comprimento com uma quantidade generosa de meio de montagem. Certifique-se de que há.o menor número possível de bolhas de ar. Se necessário, remova cuidadosamente e refaça o deslizamento (pode ser feito até semanas depois). Faça isso muito lentamente para não danificar a seção (pode ser feito por causa da grande quantidade de meio de montagem).
NOTA: Uma grande quantidade de meio de montagem é um pouco confusa, mas ainda é necessária, pois o meio de montagem suficiente deve ser usado para cobrir as seções grossas de 100 μm. - Para garantir que apenas uma mancha de cobertura seja colocada nas seções, separe as tampas antes do processo.
- Uma vez que a tampa escorregou, desliza seco em qualquer papel não poroso por 3-5 dias, movendo-os ligeiramente, especialmente após o primeiro dia, para evitar furar. Após 3-5 dias transfira os slides para porta-slides e, idealmente, lâminas secas por pelo menos 3 semanas antes de examiná-los. Mantenha os slides planos para diminuir a possibilidade de formação de bolhas de ar.
4. Determinação da densidade da coluna vertebral dendrítica
- Para análise da densidade da coluna vertebral dendrítica em neurônios piramidais tanto do mPFC quanto da região do CA1 do hipocampo, examine os dendritos basais secundários mais laterais e os dendritos apical terciários mais laterais, conforme descrito na etapa 4.1.1 (Figura 2).
- Escolha um dendrito, meça o comprimento do dendrito usando um programa de análise de imagem, conte as espinhas nos dendritos usando um contador de mãos e registe tanto o comprimento quanto o número de colunas.
- Estude e analise seis células por região (mPFC, CA1) por cérebro. Quantifique um mínimo de seis cérebros por grupo como descrito anteriormente 7,8. Escolha neurônios que atendam aos seguintes critérios de análise: corpos celulares e dendritos estão bem impregnados; dendritos são distinguíveis das células adjacentes e são contínuos.
- Conte as espinhas a 1000x (imersão em óleo) por contagem manual com um microscópio leve e meça o comprimento dendrático usando um programa de análise de imagem. Calcule a densidade da coluna dividindo o número da coluna pelo comprimento do dendrite e expresse dados como o número de colunas/ 10 μm dendrite.
NOTA: Existem métodos muito mais sofisticados para diferenciar subtipos da coluna vertebral e arquitetura dendrítica que podem ser usados, mas a contagem manual com um microscópio leve em 1000x pode dar um resultado rápido que pode então determinar se uma investigação mais aprofundada é necessária. Embora todos os esforços sejam feitos para amostrar consistentemente dendritos semelhantes, há variações na espessura que podem afetar a contagem.
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Representative Results
Usando o método Golgi rápido, as células são consistentemente bem impregnadas para que haja muitas células para analisar. Trata-se de uma melhoria acentuada em relação aos métodos anteriores, onde os experimentos tiveram que ser agrupados para ter dados suficientes para análise. Portanto, mais amostras podem ser processadas de uma só vez e cérebros podem ser armazenados congelados até o processamento. Exemplos de células impregnadas de Golgi na região ca1 do hipocampo são mostrados em baixa e alta potência na Figura 3. A contagem de colunas em uma determinada região produz resultados consistentes com pequenos erros padrão. Isso também é importante porque pode-se fazer comparações entre experimentos. A Figura 4 ilustra um experimento no qual a densidade da coluna basal dendrítica foi aumentada em células piramidas em ratos adolescentes do sexo masculino e feminino após o enriquecimento ambiental (EE) tanto no CA1 quanto no mPFC. Resumidamente, ratos machos e fêmeas foram desmamados no dia pós-natal (PND) 21 e designados para controlar ou enriqueceram grupos. O grupo EE passou 2 horas/dia em habitações enriquecidas da PND 24-42, enquanto o grupo controle estava alojado em gaiolas comuns durante este período. EE induzida, em adolescentes de ambos os sexos, um aumento na densidade da coluna basal dendrítica tanto no CA1 quanto no mPFC. Observe o pequeno erro padrão da média (SEM) em todos os valores da coluna dendrítica.
Figura 1: Superfície ventral do cérebro de rato. Fotografia da superfície ventral de um cérebro de rato fresco indicando onde cortar em blocos anteriores e posteriores antes de submergir blocos em soluções iniciais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Célula típica do Pyramidal. Esquema de uma célula piramiápica, ilustrando dendritos apical e basais que são analisados para densidade dendrítica da coluna vertebral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Neurônio Impregnado golgi. Exemplos de neurônios impregnados de Golgi na região do CA1 do hipocampo de ratos. Esquerda: Várias células piramigráficas impregnadas. Barra de escala = 25 μm. Canto superior direito: dendritos basais. Barra de escala = 12,5 μm. Inferior direito: Exemplo de dendrite basal secundário. Flechas denotam espinhas. Barra de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Densidade da coluna vertebral. Um conjunto de dados ilustrando a densidade da coluna cínica e apical dendrítica na região do mPFC e CA1 do hipocampo (CA1) após o enriquecimento ambiental (EE) em comparação com o controle (CON) em ratos machos (M) e fêmeas (F). Os histogramas mostram o número médio de espinhas/10 μm dendrite + SEM. Os dados foram analisados por meio de software de análise estatística (ver Tabela de materiais). ANOVAs bidirecionais (sexo X EE) foram utilizadas para testar diferenças de grupo e os testes de LSD de Fisher foram utilizados para análise pós-hoc. Efeitos significativos são p<0,05. t denota uma diferença significativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O presente protocolo descreve um método de impregnação de Golgi que permite o processamento simultâneo rápido de muitas seções. É uma melhoria em relação aos5 métodos mais intensivos em mão-de-obra e produz consistentemente neurônios impregnados para análise. Além disso, há menos exposição a produtos químicos tóxicos usados na impregnação de Golgi. A parte mais desafiadora do processo é fazer com que as seções sejam planas nos slides, o que requer uma prática considerável. Manter tudo o mais frio possível com o uso de spray de congelamento é essencial.
Uma vez que os slides são secos e a análise pode ser realizada, é muito importante ser consistente na seleção das células que são contadas. Células piramicidas hipocampais são escolhidas a partir de CA1. Para o mPFC, que possui várias subpartas, são utilizadas células piramigráficas do córtex infralimico. Por razões que não são claras, menos células no mPFC estão manchadas do que na região do CA1 do hipocampo. Além disso, é possível combinar experimentos quando todas as seções não podem ser processadas juntas por razões logísticas. Para consistência, a mesma pessoa deve contar um determinado conjunto de células.
As limitações deste método são semelhantes a todos os métodos de impregnação de Golgi. O fato de que apenas um pequeno número de células estão manchadas é uma vantagem. O pequeno número de células impregnadas permite a visualização de toda a célula em três dimensões. A desvantagem do método Golgi é que não está claro qual subconjunto de células é rotulado. Portanto, em experimentos, deve-se supor que as células impregnadas para grupos de controle e experimentais são as mesmas. Embora este método resulte em uma coloração muito melhor do que os métodos anteriores, há sempre células que não podem ser analisadas porque estão cobertas por detritos, uma bolha de ar ou têm dendritos quebrados.
Em conclusão, o método rápido golgi descrito aqui é um método rápido e seguro para rotulagem consistente e reprodutível de neurônios que podem ser usados para qualquer região cerebral. Além de rotular células no córtex pré-frontal17,18 e no hipocampo 10,12,19, também tem sido usado na amígdala20, cerebelo21 e córtex22. Supondo que se esteja familiarizado com a anatomia e possa identificar rapidamente as células, a contagem manual da densidade da coluna vertebral pode fornecer um resultado rápido, mas não fornece informações sobre subtipos dendráticos que exigem métodos de análise mais sofisticados.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
References
- Pannese, E. The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences. Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).
- Bentivoglio, M., et al. The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3 (2019).
- Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal. , Abrams. 208 (2017).
- Dall'Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. The "single-section" Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The 'single' section Golgi-impregnation procedure: methodological description. Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone. Glia. 3 (4), 283-292 (1990).
- Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood. Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).
- Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).
- Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat. Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).
- Frankfurt, M., Luine, V. The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol. Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).
- Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age. Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).
- Bowman, R. E., et al. Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats. Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).
- Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats. Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).
- Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines. Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).
- Jacome, L. F., et al. Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats. Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).
- Frankfurt, M. Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory. Research Features. , https://researchfeatures.com/wp-content/uploads/2021/05/Maya-Frankfurt.pdf (2021).
- Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex. Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).
- Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats. Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).
- Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood. Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).
- Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density. Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).
- Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia. Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).
- Zemmar, A., et al. Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex. Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).
