Summary
Здесь мы описываем выделение, усиление и дифференцировку первичных эпителиальных клеток носа человека (HNE) на границе раздела воздух-жидкость и протокол биобанкинга, позволяющий успешно замораживать, а затем размораживать усиленный HNE. Протокол анализирует электрофизиологические свойства дифференцированных клеток HNE и связанную с CFTR коррекцию секреции хлорида при различных модуляторных обработках.
Abstract
Клетки эпителия носа человека (HNE) легко собрать с помощью простой, неинвазивной чистки носа. Полученные от пациента первичные клетки HNE могут быть усилены и дифференцированы в псевдостратифицированный эпителий в условиях взаимодействия воздух-жидкость для количественной оценки циклического переноса хлорида (Cl-), опосредованного AMP, в качестве индекса функции регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR). Если критические шаги, такие как качество чистки носа и плотность клеток при криоконсервации, выполняются эффективно, клетки HNE могут быть успешно биобанкированы. Кроме того, исследования тока короткого замыкания показывают, что замораживание-оттаивание существенно не изменяет электрофизиологические свойства HNE-клеток и реакцию на модуляторы CFTR. В условиях культивирования, используемых в этом исследовании, когда замораживаются менее 2 х 106 клеток на криовиал, частота отказов очень высока. Мы рекомендуем замораживать не менее 3 х 106 клеток на криовиал. Показано, что двойные методы лечения, сочетающие корректор CFTR с потенциатором CFTR, имеют сопоставимую эффективность коррекции активности CFTR в F508del-гомозиготных клетках HNE. Тройная терапия VX-445 + VX-661 + VX-770 значительно увеличила коррекцию активности CFTR по сравнению с двойной терапией VX-809 + VX-770. Измерение активности CFTR в клетках HNE является многообещающим доклиническим биомаркером, полезным для руководства модуляторной терапией CFTR.
Introduction
Муковисцидоз (CF) является аутосомно-рецессивным расстройством, возникающим в результате мутаций в гене регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR), приводящих к отсутствию или дисфункции белка CFTR, анионного канала, расположенного на апикальной поверхности эпителия 1,2. Последние достижения в терапии CFTR улучшили прогноз заболевания, а последние одобренные препараты, сочетающие корректоры CFTR и потенциаторы CFTR, привели к значительному улучшению функции легких и качества жизни пациентов с муковисцидозом, несущих наиболее частую мутацию p.Phe508del (F508del)3,4. Несмотря на этот многообещающий терапевтический прогресс, около 10% пациентов с муковисцидозом не имеют права на участие, поскольку они несут мутации, которые не могут быть спасены этими модуляторами CFTR. Для этих пациентов необходимо протестировать другие лекарства или комбинации лекарств, чтобы найти наиболее эффективную комбинацию для конкретных мутаций, подчеркивая важность персонализированной терапии.
Клетки эпителия носа человека (HNE) легко собираются с помощью простой, неинвазивной чистки носа и позволяют количественно оценивать циклический транспорт хлорида (Cl−), опосредованный AMP, как индекс функции CFTR. Клетки HNE дают точную модель дыхательных путей человека, но их продолжительность жизни ограничена в культуре. Благодаря оптимизации методов культивирования полученные от пациента первичные клетки HNE могут быть условно перепрограммированы ингибитором Rho-ассоциированной киназы (ROCKi), усилены и дифференцированы в псевдостратифицированный эпителий в условиях воздушно-жидкостного интерфейса (ALI) на микропористых фильтрах 5,6. Существуют многочисленные протоколы культивирования для культуры HNE (коммерчески доступные, без сыворотки, «домашние», совместные культуры с фидерными клетками и т. Д.), И был описан выбор среды и условий культивирования, влияющих на рост, дифференцировку клеточной популяции и функцию эпителия 7,8. Протокол здесь представляет упрощенный, не содержащий фидера метод амплификации ROCKi, который позволяет успешно получить большое количество HNE-клеток, которые затем дифференцируются в ALI для анализа функции CFTR.
Мы продемонстрировали, что в дифференцированных клетках HNE 48-часовое лечение модуляторами CFTR является достаточным для индуцирования электрофизиологической коррекции CL-тока , зависящего от CFTR, и что коррекция, наблюдаемая in vitro , может коррелировать с клиническим улучшением пациента9. Таким образом, клетки HNE представляют собой подходящую модель не только для фундаментальных исследований муковисцидоза, но и для доклинических исследований с тестированием модулятора CFTR для конкретного пациента. В этом контексте персонализированной терапии цель протокола состояла в том, чтобы подтвердить, что криоконсервированные клетки HNE у пациентов с муковисцидозом, выращенные в наших условиях, были подходящей моделью для исследований коррекции CFTR, и аналогичные результаты можно было ожидать при сравнении CFTR-зависимого Cl-транспорта из свежих и замороженных размороженных клеток. В исследовании также оценивалась эффективность различных модуляторов CFTR при использовании двойной и тройной терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами и правилами, описанными в Хельсинкской декларации и законе Хуриета-Серуслата об этике исследований человека.
1. Приготовление колб и различных сред
- Подготовьте амплификацию, воздушно-жидкую и морозильную среду, как описано в таблице 1.
- Готовят готовый раствор человеческого коллагена IV путем растворения 50 мг коллагена в 100 мл 0,2% ледниковой уксусной кислоты. Перемешать на магнитной мешалке не менее 1 ч, а раствор стерилизовать фильтром. Хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев в стеклянной бутылке, защищенной от света.
- Готовят рабочий раствор коллагена IV путем разведения бульонного раствора 1:5 в двухдистиллированной воде. Хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев.
- Покройте пластиковые колбы для культивирования клеток или трансвелл-фильтры рабочим раствором коллагена. Равномерно распределите 100 мкл на 0,33 см2 трансвелл-фильтра, 500 мкл на25 см 2 колбы и 1 мл на 75 см 2 колбы навсю поверхность роста колбы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этого можно достичь, осторожно наклонив колбу из стороны в сторону. Альтернативно, для облегчения покрытия колб можно использовать увеличенный объем, а когда вся поверхность равномерно покрыта, раствор коллагена аспирируют, чтобы оставить только указанный объем. Аспирированный раствор коллагена затем можно сразу же использовать для покрытия следующей колбы (т.е. для трех колбразмером 75 см 2 равномерно распределить 3 мл раствора коллагена в первой колбе, аспирировать 2 мл, которые затем используют для следующей колбы и так далее). - Оставьте колбы для посева клеток в инкубаторе минимум на 2 ч или на ночь. Тщательно аспирируйте коллаген и оставьте колбы сохнуть в инкубаторе или под капюшоном минимум на 20 минут или на ночь.
- Промыть 10 мл Mg2+ и Ca2+ без DPBS, дать высохнуть в инкубаторе и хранить в алюминиевой фольге для защиты от света. Хранить колбы до 6 месяцев при комнатной температуре (RT).
2. Расчесывание носа
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что расчесывание носа выполняется, пока у участника нет острой инфекции. Если у пациентов с муковисцидозом присутствует легочная инфекция, обратитесь к антибиотикограмме пациента и добавьте дополнительные антибиотики в амплификационную среду. Эпителиальные клетки носа человека были собраны путем чистки носа у пациентов F508del/F508del, как описано ранее9.
- Попросите больного сморкаться, затем местно обезболить слизистую оболочку обеих ноздрей с помощью ватных сеток, смоченных в 5% ксилокаине раствором нафазолина.
- Аккуратно расчешите медиальную стенку и нижнюю носовую раковину обеих ноздрей с помощью цитологической щетки. Замочите щетку в пробирке объемом 15 мл с 2 мл коммерчески доступной промывочной среды; аккуратно встряхните, чтобы отсоединить клетки. Повторите расчесывание во второй ноздре.
- Добавьте следующие антибиотики в промывочную среду: пенициллин (100 Ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), тазоциллин (10 мкг/мл), амфотерицин В (2,5 мкг/мл) и колимицин (16 мкг/мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Носовые щетки могут быть отправлены в RT в специализированные лаборатории для расширения и культивирования и могут быть посеяны до 72 ч после чистки щеткой.
3. Изоляция HNE
ПРИМЕЧАНИЕ: HNE выделяли из цитологической щетки, промывали Mg2+ и Ca2+ dpBS, диссоциировали с 0,25% трипсина и высевали на пластиковую колбу размером 25см2 , как описано ранее10.
- Отделите клетки от цитологической щетки, многократно пропуская щетку через конус пипетки 1000 мкл и промывая 2 мл Mg2+ и Ca2+ без DPBS. Центрифугу при 500 х г в течение 5 мин при 4 °С и выбросьте супернатант.
- Повторно суспендируют гранулу в 0,25% трипсина в течение 8-12 мин для диссоциации клеток. Остановить ферментативную реакцию путем добавления 5 мл амплификационной среды.
- Центрифугу при 500 х г в течение 5 мин при 4 °С и выбросьте супернатант. Повторно суспендируйте гранулы в 8 мл амплификационной среды и помейте в колбу с коллагеновым покрытиемобъемом 25 см2 . Растут при 37 °C и 5% CO2. Это соответствует отрывку 0.
- На следующий день замените среду 5 мл свежей амплификационной среды и ежедневно контролируйте клетки на предмет прикрепления, морфологии (клетки должны иметь сплоченный булыжный вид) и количества.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начальная плотность посева варьируется в зависимости от качества расчесывания носа и доли эпителиальных клеток. Свежеизолированные клетки HNE обычно достигают 80%-90% конфлюзии в течение 3-10 дней. Более медленная скорость роста наводит на мысль о недостаточном количестве эпителиальных клеток в образце и должна быть отброшена.
4. Усиление и прохождение эпителиальных клеток носа человека
- Выращивают эпителиальные клетки носа человека в среде амплификации при 37 °C и 5% CO2 на колбах, покрытых коллагеном, до 80%-90% конфлюзии, меняя среду каждые 48-72 ч. Для колб размером25 см 2 используйте 5 мл амплификационной среды и 10 мл для колб размером 75см2 .
- Когда клетки достигнут 80%-90% конфлюзии, промыть клетки 10 мл Mg2+- и Ca2+ свободных DPBS, аспиратом и выбросить.
- Добавьте 1 мл 0,25% трипсина на колбу 25см2 (или 2 мл трипсина на колбу 75см2 ) и верните в инкубатор (37 °C, 5% CO2) в течение 8-12 мин.
- Плотно постучите по колбе ладонью, чтобы помочь клеткам отсоединиться.
- Добавьте 10 мл амплификационной среды, чтобы остановить ферментативную реакцию. Энергично промойте колбу, используя пипетку объемом 10 мл, чтобы вытянуть и вывести амплификационную среду по поверхности колбы для промывки и отсоединения клеток.
- Центрифугу при 500 х г в течение 5 мин при 4 °С и выбросьте супернатант.
- Повторно суспендировать гранулу в 5-10 мл амплификационной среды.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клетки могут быть заморожены (см. шаги 5.1-5.3). Если требуется дальнейшее усиление, повторно посейте на колбы, покрытые коллагеном (колбуразмером 25 см2 можно расширить на три колбы размером 75см2 , большее разбавление не рекомендуется).
5. Криоконсервация первичных эпителиальных клеток носа
ПРИМЕЧАНИЕ: Выращивайте клетки HNE до прохождения 1 перед биобанкингом, чтобы получить достаточное количество клеток для облегчения роста клеток при оттаивании. Биобанкинг, однако, возможен при начальном прохождении 0 или прохождении 2. Следующие этапы криоконсервации адаптированы ко всем проходам.
- После подсчета клеток центрифугу при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте супернатант
- Повторно суспендируют гранулу в обогащенной морозильной среде (таблица 1) с получением 3 х 106-5 х 106 клеток на мл и на криовиал.
- Медленно замораживайте клетки, снижая температуру при ~1 °C в минуту в соответствующем криозамораживающем контейнере при -80 °C. На следующий день переместите сохраненный образец в контейнер для хранения азота для длительного хранения (настоящее исследование ограничено 17 месяцами хранения).
6. Оттаивание замороженных амплифицированных HNE клеток
- Разогрейте водяную баню до 37 °C. Подготовьте амплификационную среду, как описано в таблице 1 , и нагрейте среду до 37 °C.
- Извлеките криовиалы из резервуара для хранения азота и быстро поместите их на водяную баню, следя за тем, чтобы не погрузить весь флакон в воду. Удалите криовиалы с водяной бани, когда останется только небольшая замороженная капля. Протрите флакон 70% спиртом, вытрите насухо и поместите под капот.
- Используя пипетку 1 мл, переместите размороженные клетки в пустую трубку объемом 15 мл.
- По каплям добавьте 1 мл теплой амплификационной среды. Через 1 мин добавьте еще 1 мл амплификационной среды и подождите еще минуту.
- Добавьте 10 мл амплификационной среды и центрифуги в течение 2 мин при 500 х г.
- Аспирировать и выбросить супернатант. Повторное суспендирование клеточной гранулы в объеме амплификационной среды, необходимом для достижения плотности ячейки не менее 1 х 106 ячеек/мл.
- Поместите клетки в колбу, покрытую коллагеном, содержащую амплификационную среду.
- Если криовиал содержит более 4 х 106 клеток, посейте в колбу размером 75см2 в 10 мл амплификационной среды
- Если криовиал содержит менее 4 х 106 клеток, семенные клетки на колбуразмером 25 см2 , в 5 мл амплификационной среды
- Инкубируют при 37 °C, 5% CO2 и визуально наблюдают расширение клеток в течение следующих 2-3 дней.
- Затем выполните амплификацию клеток, как описано в разделе 4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если на этапе 4.7 было собрано несколько клеток. (т.е. если замораживание в проходе 0 перед расширением), этапы 6.5. и 6.6. могут быть опущены, а клетки могут быть посеяны непосредственно на колбу с коллагеновым покрытием25 см2 без центрифугирования. Затем среду необходимо заменить на следующий день, чтобы удалить диметилсульфоксид (ДМСО).
7. Дифференцировка эпителиальных клеток носа человека на границе воздух-жидкость
ПРИМЕЧАНИЕ: HNE были дифференцированы на границе раздела воздух-жидкость, как описано ранее10.
- Засейте клетки плотностью 330 000 клеток/фильтр на 0,33см2 коллагеновых пористых фильтрах и дополните 300 мкл амплификационной среды на апикальной стороне и 900 мкл воздушно-жидкой среды на базолатеральной стороне.
- Через 3 дня аспирируют аспиральную среду и культивируют клетки на границе раздела воздух-жидкость в течение 3-4 недель в воздушно-жидкой среде для создания дифференцированного эпителия. Менять базальную среду каждые 48-72 ч.
8. МОДУЛЯТОРЫ CFTR
- Готовят воздушно-жидкую среду, содержащую МОДУЛЯТОРЫ CFTR. Используйте VX-445, VX-661 и VX-809 в конечной концентрации 3 мкМ и VX-770 при 100 нМ. Используйте корректор ABBV-2222 при конечной концентрации 1 мкМ и потенциатор ABBV-974 при 10 мкМ. Используйте 100% DMSO для растворения всех модуляторов CFTR.
- Готовят воздушно-жидкую среду, содержащую такое же количество 100% ДМСО, как и в корректирующей среде.
- Добавляют среду, содержащую лекарственные средства или ДМСО, к базолатеральной стороне поляризованных HNE-клеток, выращенных на границе раздела воздух-жидкость, и инкубируют в течение 24 ч в 5% CO2 при 37°C.
- Через 24 ч аспирируют и выбрасывают среду и заменяют свежей средой, приготовленной как на этапах 8.1-8.2,, и далее инкубируют в течение 24 ч в 5% CO2 при 37°С.
9. Использование камерных исследований
- Измерение тока короткого замыкания (Isc) в условиях зажима напряжения, как описано ранее9.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) культур измеряли с помощью вольтметра для еды, и только культуры, достигающие не менее 200 Ω·см2 , рассматривались для следующих экспериментов. В камерах Ussing были установлены фильтры поляризованных HNE-ячеек, а измерения тока короткого замыкания (Isc) измерялись в условиях напряжения-зажима.
10. Иммуноцитохимия
- Выполняют иммунодетекторию, как описано ранее9.
ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунодетектирование CFTR проводили с использованием анти-CFTR C-концевых (24-1) моноклональных антител в течение ночи в разведении 1/100. Зона-окклюдены-1 (ZO-1) (разведение 1/500), альфа-тубулин (разведение 1/300), Muc 5AC (разведение 1/250) и цитокератин 8 (разведение 1/250) проводились на дополнительных фильтрах. После промывки PBS-Triton-X100 0,1% козеляные вторичные антитела, конъюгированные с Alexa 488 или 594, добавляли в течение 30 мин в 10% козьей сыворотке (1/1000 разведение). После окончательной промывки фильтры были вырезаны из опоры и смонтированы с монтажным носителем Vectashield, содержащим DAPI. Конфокальный микроскоп (63x/1.4 масляный дифференциальный интерференционный контраст λ синий объектив PL APO) использовался для захвата изображений, которые анализировались с помощью программного обеспечения ImageJ.
11. Статистический анализ
- Выполняйте статистический анализ с помощью соответствующего программного обеспечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения S.A.S. Поскольку было получено несколько фильтров HNE на пациента и на каждое состояние, количественные параметры были выражены в виде медианных значений (± SEM) на пациента. Сравнения (среднее ± SD) проводились с использованием уилкоксоновских пар, подписанных ранговым тестом или непарным t-тестом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Свежие клетки HNE, культивируемые на границе раздела воздух-жидкость, демонстрируют типичные особенности поляризованного и дифференцированного респираторного эпителия, оцениваемые иммуноокрашиванием (рисунок 1). Клетки HNE повторно дифференцируются в гетерогенный слой эпителиальных клеток (положительное иммуноокрашивание кератина 8), которые имитируют ситуацию in vivo псевдостратифицированного респираторного эпителия, состоящего из реснитчатых (положительное окрашивание альфа-тубулина) и нереснитильных клеток кубка, продуцирующих слизь (положительное иммуноокрашивание Muc5Ac). Общий эпителий представляет собой плотные соединения (оценивается по окрашиванию ZO-1, зона-окклюденс-1). Сильное апикальное окрашивание CFTR наблюдается в клетках HNE дикого типа (WT), а снижение окрашивания CFTR как на поверхности апикального сустава, так и в цитоплазме наблюдается в F508del/F508del HNE.
Мы рассмотрели положительные результаты, поскольку образцы не только успешно расширяются, но и успешно дифференцируются в псевдостратифицированный эпителий через 3 недели на границе раздела воздух-жидкость и представляют TEER выше 200 Ω·см2, что позволяет измерять ток короткого замыкания. Поскольку только несколько специализированных лабораторий выполняют связанные с CFTR анализы Cl-секреции путем измерения тока короткого замыкания, образцы часто требуют транспортировки из больниц в специализированные учреждения.
В 78 свежих образцах клеток HNE показатели успеха сравнивались при носовых щетках, посеянных сразу, и в щетках, посеянных после 1-7 дней транспортировки в промывочной среде при комнатной температуре. Большинство образцов (55%) были посеяны через 1 день после чистки щеткой, а 82% образцов были посеяны в течение 48 ч. Средний процент успешных культур во всех 78 образцах составил 82% и достиг 87% в образцах, посеянных между 0 и 5 днем (таблица 2).
Сравнивались показатели успешности и неудачи для идентичных образцов, дифференцированных как в свежих, так и в морозостойких условиях. 83% образцов, которые успешно дифференцировались в свежих условиях, также были успешными в криоконсервированных образцах. Аналогичным образом, в образцах, которые не смогли дифференцироваться в свежих условиях, 71% также не увенчались успехом в условиях замораживания-оттаивания (таблица 2).. Все эти данные свидетельствуют о том, что качество расчесывания носа является ключевым фактором успешной культуры.
Мы также хотели определить оптимальное количество клеток на криовиал. Образцы, замороженные при прохождении 0, из одного 25см2 обычно позволяют достичь только 1-1,5 х 106 клеток на колбу. Образцы, замороженные при прохождении 1 и усиленные до трех колбразмером 75 см2 , обычно позволяли достичь 10 х 106 клеток, что позволило заморозить несколько флаконов, содержащих, по меньшей мере, 3 х 106 клеток. В условиях культивирования, описанных в этом протоколе, 50% образцов, замороженных между 2 x 106 и 3 x 106 клетками на криовиаль, не росли при размораживании, достигая 80% при температуре ниже 2 x 106 клеток на криовиаль (таблица 2).
Cl-секреция, связанная с CFTR, отражает функцию CFTR и может быть измерена с помощью экспериментов с током короткого замыкания (Isc) в камерах Ussing. Вариация Isc в ответ на Форсколин (ΔIscForskolin) и ингибитор CFTR inh172 (ΔIscCFTRinh172) являются основными конечными точками для оценки эффективности корректора CFTR.
Эксперименты с коротким замыканием и током проводили либо на свежем HNE, расширенном в амплификационной среде и засеянном на фильтры при прохождении 2 и выращенном на границе раздела воздух-жидкость в течение 3 недель в воздушно-жидкой среде, либо из HNE, который ранее был заморожен в проходе 1 в обогащенной морозильной среде, разморожен, расширен и засеян на пористых фильтрах при проходе 3. Время криоконсервации варьировалось от 3 месяцев до 16 месяцев, в среднем 9,8 месяцев. В условиях культивирования и криоконсервации, подробно описанных в этом исследовании, не наблюдалось значительных изменений в росте или морфологии между различными проходами или свежими или замороженными размороженными культурами F508del/F508del HNE.
Как для среднего значения ΔIscForskolin (рисунок 2A), так и для среднего значения ΔIscCFTRinh172 (рисунок 2B) в клетках, обработанных ДМСО, не наблюдалось существенной разницы между свежим или замороженным размороженным HNE. Чтобы оценить, влияла ли на функциональную коррекцию CFTR криоконсервация, средние изменения Isc были измерены в клетках, обработанных VX-809 + VX-770, по сравнению с клетками, обработанными DMSO HNE в свежих (клетки HNE, полученные от n = 78 пациентов) или замороженно-размороженных HNE (клетки HNE, полученные от n = 9 пациентов) (Рисунок 2). Как замороженные-размороженные, так и свежие клетки демонстрировали значительную коррекцию при лечении, со значительным увеличением ΔIscForskolin (p < 0,05) (Рисунок 2A) и значительным снижением ΔIscCFTRinh172 (p < 0,05) (Рисунок 2B). Среднее увеличение кратности для ΔIscForskolin (ΔIscForskolin VX-809 + VX-770/ΔIscForskolin DMSO) достигло 2,9 ± 1,6 в замороженно-размороженных клетках HNE и существенно не отличалось от увеличения складки в свежих клетках HNE (2,5 ± 2,0). Аналогичным образом, на кратное снижение ΔIscCFTRinh172 (ΔIscCFTRinh172 VX-809 + VX-770/ΔIscCFTRinh172 DMSO) не оказала существенного влияния криоконсервация: 1,49 ± 0,9 в замороженно-размороженном HNE по сравнению с 2,5 ± 3,7 в свежем HNE.
Функциональная коррекционная активность нескольких модуляторных терапий была дополнительно исследована, чтобы оценить, может ли эта модель клеток HNE различать различные методы лечения. Результаты здесь объединяют клетки HNE как из свежих, так и из замороженных-размороженных состояний, поскольку реакция на лечение не была значительно изменена криоконсервацией (рисунок 2)..
Сначала мы оценили корректирующий ответ двух одобренных модуляторов CFTR на Cl-транспорте после 48-часового лечения либо VX-809 (3 мкМ) + VX-770 (100 нМ), либо VX-661 (3 мкМ) + VX-770 (100 нМ) в клетках HNE у 10 пациентов с F508del/F508del (рисунок 3). По сравнению с клетками HNE, обработанными DMSO, ΔIscForskolin (рисунок 3A) и ΔIscCFTRinh172 (рисунок 3B) были значительно улучшены как VX-809 + VX-770, так и VX-661 + VX-770. Оба метода лечения функционально корректировали CL-секрецию, связанную с CFTR, до аналогичного уровня, со значительным средним увеличением ΔIscForskolin на 1,75 ± 1,39 для VX-809 + VX-770 (p < 0,001) и 0,97 ± 0,93 для VX-661 + VX-770 (p < 0,01). Среднее снижение ΔIscCFTRinh172 составило 1,79 ± 2,04 для VX-809 + VX-770 (p < 0,001) и существенно не отличалось от среднего снижения ΔIscCFTRinh172 в 1,16 ± 1,44 для VX-661 + VX-770 (p < 0,001 против DMSO).
Далее сравнивались три различных модулятора CFTR в HNE у шести пациентов с F508del/F508del (рисунок 4). Результаты здесь объединяют клетки HNE как из свежих, так и из замороженных-размороженных условий. Модуляторы CFTR Vertex и Abbvie при использовании в качестве комбинации корректора CFTR и потенциатора CFTR корректировали ΔIscForskolin (Рисунок 4A) и ΔIscCFTRinh172 (Рисунок 4B) в аналогичной степени. Частичная коррекция, наблюдаемая на рисунке 3 VX-809 + VX-770, была подтверждена в этих ячейках HNE со средним увеличением ΔIscForskolin fold 2,87 ± 1,67 (p < 0,05). Лечение ABBV-2222 (1 мкМ) + ABBV-974 (10 мкМ) вызвало аналогичную коррекцию, представляющую собой 91% коррекции VX-809 + VX-770 для ΔIscForskolin (среднее увеличение ΔIscForskolin fold на 2,6 ± 1,4, p < 0,05 по сравнению с DMSO) и 85% VX-809 + VX-770 для ΔIscCFTRinh172 (среднее снижение ΔIscCFTRinh172 на 4,2 ± 5,7, p < 0,05 против DMSO).
Интересно, что при лечении HNE тройной комбинацией VX-445 (3 мкМ) + VX-661 (3 мкМ) + VX-770 (100 нМ) эффективность коррекции значительно улучшалась, достигая 312% VX-809 + VX-770 коррекции ΔIscForskolin (среднее увеличение ΔIscForskolin fold на 9,0 ± 4,1, p < 0,05 против VX-809 + VX-770) и 372% ΔIscCFTRinh172 (среднее ΔIscCFTRinh172 кратное снижение 15,5 ± 10,5, p < 0,05 против VX-809 + VX-770).
Рисунок 1: Маркеры дифференциации в культурах HNE. Репрезентативные конфокальные микроскопические изображения иммунофлуоресцентного окрашивания CFTR (зеленый), Zona-Occludens-1 (ZO-1, красный), альфа-тубулин (зеленый), Muc5AC (красный) и цитокератин 8 (K8, зеленый) в клетках дикого типа (WT) (первая панель) и F508del (панели 2-4) HNE, выращенных на воздушно-жидком интерфейсе в течение 3 недель. Ядра были окрашены в синий цвет с помощью DAPI. Проекции конфокальных микроскопических изображений, вид сверху (верхние панели) и вид сбоку (нижние панели) трехмерных (3D) реконструкций Z-стеков. Шкала (20 мкм) применяется как к верхней, так и к нижней панелям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Влияние замораживания-оттаивания на CL-секрецию, связанную с CFTR, в клетках HNE. Резюме записей тока короткого замыкания (Isc) (средняя ± SD) в культурах HNE, полученных от пациентов f508del/F508del и выращенных на воздушно-жидкостном интерфейсе в течение 3 недель. Клетки обрабатывали в течение 48 ч только с помощью транспортного средства (DMSO) или VX-809 (3 мкМ) + VX-770 (100 нМ) в свежих (светло-серых, полученных пациентом HNE-клетках от 78 пациентов) или замороженных-размороженных (темно-серые, полученные от пациента HNE клетки от 9 пациентов). Данные представляют собой среднюю (± SD) реакцию на остро добавленный (A) Форсколин (10 мкМ)/3-изобутил-1-метилксантин (IBMX, 100 мкМ), ΔIscForskolin или (B) ингибитор CFTR inh172 (5 мкМ) ΔIscCFTRinh172. Минимум два фильтра были проанализированы на одного пациента и на каждое состояние. Звездочками обозначена статистическая разница между корректорами и контрольными (обработанными ДМСО) * p < 0,05 (непарный т-тест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Коррекция функции CFTR с помощью двойной терапии. Резюме записей тока короткого замыкания (Isc) (среднее ± SD) в культурах HNE, полученных от 10 пациентов F508del/F508del и выращенных на границе раздела воздух-жидкость в течение 3 недель (комбинированные результаты как свежих, так и замороженных-размороженных культур). Клетки обрабатывали в течение 48 ч только с помощью транспортного средства (DMSO); VX-809 (3 мкМ) + VX-770 (100 нМ) или VX-661 (3 мкМ) + VX-770 (100 нМ). Данные представляют собой среднюю (± SD) реакцию на остро добавленный (A) Форсколин (10 мкМ)/IBMX (100 мкМ), ΔIscФорсколин или (В) ингибитор CFTR inh172 (5 мкМ), ΔIscCFTRinh172. Минимум два фильтра были проанализированы на одного пациента и на каждое состояние. Звездочки указывают на статистическую разницу между корректорами и контролем (обработанными ДМСО) ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 (Уилкоксон соответствовал парам, подписанным ранговым тестом). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Эффективность тройной терапии по сравнению с двойной терапией по коррекции CFTR. Резюме записей тока короткого замыкания (Isc) (среднее ± SD) в культурах HNE, полученных от 6 пациентов с F508del/F508del и выращенных на воздушно-жидком интерфейсе в течение 3 недель (комбинированные результаты как свежих, так и замороженных размороженных клеток). Клетки обрабатывали в течение 48 ч только с помощью транспортного средства (DMSO); VX-809 (3 мкМ) + VX-770 (100 нМ); ABBV-2222 (1 мкМ) + ABBV-974 (10 мкМ); или VX-661 (3 мкМ) + VX-445 (3 мкМ) + ВХ-770 (100 нМ). Данные представляют собой средний (± SD) ответ на остро добавленный (A) форсколин (10 мкМ)/IBMX (100 мкМ), ΔIscФорсколин или (В) ингибитор CFTR inh172 (5 мкМ), ΔIscCFTRinh172. Минимум два фильтра были проанализированы на одного пациента и на каждое состояние. Звездочки указывают на статистическую разницу между методами лечения. * p < 0,05 (Уилкоксон соответствовал парам, подписанным ранговым тестом). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Медиа-компонент | Конечная концентрация |
| СРЕДА УСИЛЕНИЯ | |
| Усовершенствованная питательная смесь DMEM/F-12 | 86% |
| Фетальная бычья сыворотка | 10% |
| Пенициллин | 100 Ед/мл |
| Стрептомицин | 100 мкг/мл |
| Тазоциллин | 10 мкг/мл |
| Амфотерицин B | 2,5 мкг/мл |
| Колимицин | 16 мкг/мл |
| Ципрофлоксацин | 3 мкг/мл |
| Гидрокортизон | 0,2 мкМ |
| Инсулин | 5 мкг/мл |
| Адреналин | 0,5 мкг/мл |
| ЭГФ | 10 нг/мл |
| Y-27632 (ингибитор Rho-ассоциированной киназы) | 10 мкМ |
| ВОЗДУШНО-ЖИДКАЯ СРЕДА | |
| Усовершенствованная питательная смесь DMEM/F-12 | 94% |
| УльтросерГ | 2% |
| Пенициллин | 100 Ед/мл |
| Стрептомицин | 100 мкг/мл |
| Тазоциллин | 10 мкг/мл |
| Амфотерицин B | 2,5 мкг/мл |
| Колимицин | 16 мкг/мл |
| ОБОГАЩЕННАЯ МОРОЗИЛЬНАЯ СРЕДА | |
| F12 Питательная смесь | 77% |
| ХЕПЕС | 3% |
| Фетальная бычья сыворотка | 10% |
| ДМСО | 10% |
Таблица 1: Амплификационный, воздушно-жидкий и обогащенный состав морозильной среды. Перечень реагентов и соответствующих конечных концентраций.
| Продолжительность консервации носовой щетки перед посевом (n = 78) | |
| Дни до посева | Показатели успешности (%) |
| 0 | 83 |
| 1 | 84 |
| 2 | 67 |
| 3 | 100 |
| 4 | 89 |
| 5 | 100 |
| 7 | 0 |
| Результаты от одной и той же первоначальной чистки носа, выращенной как в свежих, так и в замороженно-размороженных условиях (n = 13) | |
| Результат в свежих условиях | Показатели успеха при замораживании-оттаивании (%) |
| успех | 83 |
| неудача | 29 |
| Влияние числа ячеек на показатели успешности (n = 36) | |
| Количество ячеек на криовиал | Показатели успеха при замораживании-оттаивании (%) |
| <2 х 106 | 20 |
| 2–3 х 106 | 50 |
| 3–4 х 106 | 67 |
| >4 х 106 | 79 |
Таблица 2: Параметры, влияющие на показатели успешности в свежих и замороженных размороженных культурах клеток HNE. Показатели успеха были определены как носовые щетки, которые успешно расширялись и дифференцировались в псевдостратифицированный эпителий через 3 недели на границе раздела воздух-жидкость и представляли TEER выше 200 Ω·см2. Перед посевом образцы отгружали при комнатной температуре в промывочной среде антибиотиками. Результаты представляют собой данные из 78 свежих образцов и 36 замороженных-размороженных образцов. 13 носовых расчесок были проанализированы как в свежих, так и в замороженно-размороженных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Было предложено использование носовых эпителиальных клеток, полученных от пациента, в качестве суррогатов эпителиальных клеток бронхов человека (HBE) для измерения активности CFTR в контексте персонализированной медицины, поскольку свойства клеток HNE воспроизводят в культуре 9,11. Сильное преимущество HNE перед клеточными культурами HBE заключается в том, что они легко и неинвазивно сэмплируются. Измерения тока короткого замыкания в культурах клеток HNE позволяют оценить CFTR-зависимый Cl-транспорт через эпителий, который, как было показано, значительно коррелирует с активностью CFTR in vivo, оцениваемой по разнице носовых потенциалов у пациентов с различными генотипами9. Спасение активности CFTR в клетках HNE при лечении VX-809 также достоверно коррелировало с улучшением клинического исходаFEV 1 у люмакафтор-ивакафтор, получавших F508del гомозиготных пациентов12.
Важно отметить, что это исследование показывает, что свежесобранные клетки HNE легко переносят транспортировку и стандартные условия транспортировки (то есть они выживают 72 ч при комнатной температуре), что позволяет тестировать клетки пациента, происходящие из различных географических мест. Решающими факторами для успешного культивирования являются, главным образом, качество расчесывания носа и количество живых клеток при отборе проб. Был опубликован ряд протоколов по выращиванию и дифференцировке HNE клеточных культур; некоторые без условного перепрограммирования во время фазы расширения 13,14,15,16,17,18,19,20, некоторые с условным перепрограммированием в фидере 9,11,12,21,22,23,24,25 ,26 или без кормушки 5,8,27,28,29 условий, а также несколько сравнений различных методов 7,8. Все они позволяют получить относительно большое количество культур ALI с правильной дифференциацией и поляризацией, а также хорошими значениями TEER. Подобно этому исследованию, многие использовали криоконсервированные клетки HNE, замороженные при прохождении1 13,28. Интересно, что несколько авторов сообщают, что ROCKi может улучшить выживаемость после криоконсервации при добавлении в культуральную среду после оттаивания и увеличить количество клеток, которые остаются прикрепленными 5,29, предполагая, что среда амплификации, используемая в этом исследовании, особенно подходит для криоконсервации.
Здесь исследование показывает, что клетки HNE могут быть успешно биобанкированы, критическим фактором снова является качество чистки носа. Показана хорошая корреляция между результатами свежих образцов и замороженных-размороженных образцов, предполагая, что для оптимизации качества клеток HNE, которые будут биобанковскими для дальнейших исследований, предварительное исследование может быть проведено на свежих образцах, если они не достигают правильной дифференциации ALI и приемлемого значения TEER; вторая чистка носа была бы предпочтительнее, чем замораживание клеток, которые имеют высокую вероятность плохого исхода. Вторым критическим фактором криоконсервации является количество клеток; в условиях культуры, используемых в этом исследовании, когда замораживаются менее 2 х 106 клеток на криовиал, частота отказов очень высока. Рекомендуется замораживание не менее 3 х 106 клеток на криовиал.
Результаты этого исследования показывают, что замораживание-оттаивание существенно не изменяет электрофизиологические свойства клеток HNE или реакцию на модуляторы CFTR. Диапазон измерений в культурах клеток HNE от того же F508del-гомозиготного пациента, полученного без замораживания или после оттаивания, не отличался при лечении VX-809 + VX-770. Аналогичные результаты были ранее сообщены для клеток HBE, где Isc, стимулируемый Форсколином, был стабилен после нескольких циклов оттаивания / культивирования необработанных клеток F508del30. Это свидетельствует о том, что клетки HNE могут быть заморожены и сохранены в биобанке и изучены позже.
Все большее число исследований показывает, что культуры клеток HNE могут быть использованы для проверки эффективности различных методов лечения в контексте персонализированной медицины. Анализ показал, что двойные методы лечения, сочетающие корректор с потенциатором, имеют сопоставимую эффективность коррекции для CFTR-зависимой Cl-секреции в F508del-гомозиготных клетках HNE. Однако была отмечена важная межпациентная вариабельность, подтверждающая опубликованные результаты 9,12,20,25. Напротив, VX-445 + VX-661 + VX-770 утроили коррекцию активности CFTR по сравнению с VX-809 + VX-770. Аналогичный уровень коррекции F508del-CFTR в клетках HNE при тройной комбинации также наблюдался Laselva et al.28. Как сообщает Veit et al.26, коррекция функции Cl-канала при лечении VX-445 + VX-661 + VX-770 была еще выше, достигнув 62% от средней активности WT-CFTR (диапазон 19-36 мкА/см2 в скорректированном F508del-HNE и 14-50 мкА/см2 в WT-HNE)26.
Клеточные культуры HNE также служили для проверки эффективности модуляторов CFTR для других мутаций класса II. Значительное улучшение активности CFTR по VX-445 + VX-661 + VX-770 наблюдалось в культурах HNE ALI, содержащих генотипы G85E/G85E, V520F/1717-1G>A, Y569/Y569D, M1101K/M1101K и N1303K/N1303K26. Аналогичным образом, Laselva et al.28 показали значительную коррекцию CFTR с мутациями M1101K и N1303K, но не показали значительной коррекции в клетках G85E HNE. Корректоры Галапагосских островов/AbbVie были оценены для этих люмакафтор-ивакафтор-устойчивых мутантов31. Корректор AbbVie AC2-1 и особенно бикорректор AC1+AC2-1 эффективно улучшали Cl-секрецию в клетках M1101K и G85E HNE, тогда как клетки, полученные из N1303K, корректировали комбинацией AC1+AC2-2.
Показатели активности CFTR в клетках HNE являются перспективными доклиническими биомаркерами, прогностическими для ответа пациента на протестированное лечение. Доказательства того, что циклы замораживания-оттаивания не изменяют уровень коррекции, свидетельствуют о том, что эти клетки могут быть биобанковскими и использоваться в качестве мощного инструмента в контексте программ персонализированной медицины. Таким образом, уникальная чистка носа может позволить получить достаточный материал для сравнения эффективности лекарств, а клетки HNE пациента могут быть разморожены по мере появления новых лекарств без необходимости ресамплинга пациентов; это особенно интересно у младенцев.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы сообщают об отсутствии конкурирующих финансовых интересов, связанных с этой публикацией или производством научного видео.
Acknowledgments
Мы тепло благодарим всех пациентов и их семьи за участие в исследовании. Эта работа была поддержана грантами Французской ассоциации Vaincre la Mucoviscidose; Французская ассоциация ABCF 2 и Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABBV-2222 | Selleckchem | S8535 | |
| ABBV-974 | Selleckchem | S8698 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies | 12634010 | |
| Alexa 488 goat secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A11012 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290026 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody | Abcam | ab80779 | |
| Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1) | R&D Systems | MAB25031 | |
| Anti-cytokeratin 8 antibody | Progen | 61038 | |
| Anti-Muc5AC antibody | Santa Cruz Biotech | sc-20118 | |
| Anti-ZO-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-10804 | |
| Ciprofloxacin | provided by Necker Hospital Pharmacy | ||
| Colimycin | Sanofi | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Collagen type IV | Sigma-Aldrich Merck | C-7521 | |
| cytology brush | Laboratory GYNEAS | 02.104 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich Merck | D2650 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Epinephrin | Sigma-Aldrich Merck | E4375 | |
| F12-Nutrient Mixture | Life Technologies | 11765054 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Ferticult | Fertipro NV | FLUSH020 | |
| Flasks 25 | Thermo Scientific | 156.367 | |
| Flasks 75 | Thermo Scientific | 156.499 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 20104.298 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Merck | H3375 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich Merck | SLCJ0893 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich Merck | I0516 | |
| Mg2+ and Ca2+-free DPBS | Life Technologies | 14190094 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140130 | |
| Tazocillin | Mylan | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Transwell Filters | Sigma-Aldrich Merck | CLS3470-48EA | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich Merck | T8787 | |
| Trypsin 0,25% | Life Technologies | 25200056 | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| VX-445 | Selleckchem | S8851 | |
| VX-661 | Selleckchem | S7059 | |
| VX-770 | Selleckchem | S1144 | |
| VX-809 | Selleckchem | S1565 | |
| Xylocaine naphazoline 5% | Aspen France | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Kim, S. J., Skach, W. R. Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum. Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).
- Lukacs, G. L., Verkman, A. S. CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR. The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).
- Griese, M., et al. Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
- Liu, X., et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
- Bukowy-Bieryłło, Z. Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we. Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).
- Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).
- Noel, S., et al. Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl− currents in human nasal epithelial cells. The Journal of Physiology. , (2021).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Pranke, I., et al. Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).
- McDougall, C. M., et al. Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).
- Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance. PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).
- Schögler, A., et al. Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling. Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).
- Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).
- Awatade, N. T., et al. Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis. EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).
- Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
- Veit, G., et al. Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination. JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).
- Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research. Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).
- Laselva, O., et al. Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator. The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).
- Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods in Molecular Biology. 741, Clifton, N.J. 39-54 (2011).
- Laselva, O., et al. Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).
