Summary
Hier präsentieren wir ein einfaches Protokoll für die nichtinvasive genetische Probenahme von Schmetterlingspopulationen, die auf der Feldsammlung von Resteierresten basiert. Es kann verwendet werden, um die Identität von Arten zu bestätigen und genetische Variation zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann leicht an breitere Gruppen für die Beteiligung der Community Science angepasst werden.
Abstract
Der weltweite Insektenrückgang beschleunigt sich weiter. Eine effektive genetische Probenahme ist von entscheidender Bedeutung, um das Verständnis vieler Taxa zu verbessern und bestehende Wissenslücken zu schließen. Dieses Protokoll stellt eine demonstrierte Methode zur zerstörungsfreien Probenahme seltener Schmetterlinge für populationsgenetische Struktur- oder DNA-Barcoding-Analysen dar. Es verwendet das Chorion von geschlüpften Schmetterlingseizellen, um ausreichend hohe Quantität und Qualität der DNA für eine erfolgreiche Gensequenzierung zu erhalten, um die Artidentität zu bestätigen und die genetische Variation zu quantifizieren. Es kann besonders nützlich sein, wenn andere Gewebeprobenahmetechniken nicht praktikabel oder nicht verfügbar sind. Obwohl es für einen Schmetterling entwickelt wurde, könnte es dennoch leicht für die Verwendung mit anderen Insektenarten angepasst werden. Es wurde speziell mit Benutzerfreundlichkeit entwickelt, um die breite Implementierung durch Personen mit unterschiedlichen Erfahrungen und Fähigkeiten, wie z. B. Gemeindewissenschaftler, Naturschutzpraktiker und Studenten, zu maximieren und über große geografische Gebiete hinweg zu verwenden, um eine breite Populationsprobenahme zu erleichtern. Die generierten Daten können dazu beitragen, taxonomische und Listungsentscheidungen, Erhaltungs- und Managementmaßnahmen zu treffen und die ökologische Grundlagenforschung zu verbessern.
Introduction
Eine effektive populationsgenetische Probenahme seltener, rückläufiger und/oder gelisteter Insektentaxa ist oft entscheidend, um Erhaltungs- und Managementmaßnahmen zu unterstützen. Tödliche oder schädliche Gewebeentnahmemethoden werden routinemäßig für viele genetische Analysen verwendet. Diese Methoden sind jedoch unerwünscht oder nicht erlaubt, da sie gefährdeten Bevölkerungsgruppen Schaden zufügen oder Verhalten und Fitness negativ beeinflussen können. Verschiedene nichtletale oder nichtinvasive Probenahmetechniken mit Gewebe wie ganzen Beinen, Antennen- oder Flügelschnitt, Larvenexuvien oder Hämolymphen aus Abwehrsekreten und anderen Produkten wie Frass waren für die insektengenetische Forschung geeignet 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Die allgemeine Durchführbarkeit und Anwendbarkeit dieser verschiedenen Gewebeprobenahmetechniken variiert erheblich je nach Biologie, Ökologie, Verhalten, Größe und Seltenheit des fokalen Organismus, der Situation und der Personen, die das Material sammeln. Zum Beispiel erfordern ganze Beine oder Anhangsausschnitte die vorübergehende Erfassung und sorgfältige Handhabung mehrerer Personen einer geeigneten Lebensphase, typischerweise durch erfahrenes Personal. Ebenso sind Gewebequellen wie Larvenexuvien oder Frass wahrscheinlich nur dann praktikabel, wenn sich die Organismen in Gefangenschaft befinden oder vorübergehend für einen angemessenen Zeitraum gehalten werden.
Für Forschungsfragen, die auf Populationsebene gestellt werden, z. B. in Bezug auf mögliche taxonomische Differenzierung oder genetische Struktur, ist häufig eine Stichprobe auf einer breiteren zeitlichen oder geografischen Skala (d.h. regional oder kontinental) erforderlich. Infolgedessen können bestimmte nichtinvasive Gewebequellen völlig unpraktisch oder zumindest ineffizient in der Menge gesammelt werden. Die Probenentnahme in solchen Größenordnungen kann zusätzlich logistisch oder finanziell unpraktisch oder für einzelne Forscher oder sogar kleinere Feldteams unerschwinglich sein. Während das direkte Engagement von Community-Wissenschaftlern zunehmend von der Forschungsgemeinschaft übernommen wurde, um viele dieser Herausforderungen anzugehen und die Sammlung von Big Data zu beschleunigen, war die Akzeptanz für Studien mit zerstörungsfreien, nichtinvasiven oder eDNA-Proben begrenzt10,11,12.
Um einige dieser potenziellen Einschränkungen zu überwinden, haben wir gezeigt, dass das Chorion aus geschlüpften Schmetterlingseizellen eine ausreichend hohe Quantität und Qualität der DNA für eine erfolgreiche Gensequenzierung liefern kann, um die Artidentität zu bestätigen und die genetische Variation zu quantifizieren. Anschließend testeten wir verschiedene Sammelprotokolle mit dieser Technik13. Diese Pilotarbeiten dienten als Grundlage für eine weitere methodische Verfeinerung. Dieses Papier beschreibt detailliert das daraus resultierende einfache, aber umfassende überarbeitete Feldsammlungsprotokoll, das für Gemeindewissenschaftler und anderes nicht-fachkundiges Personal eingeführt wurde. Dieses Protokoll ist Teil einer bereichsweiten Populationsstrukturanalyse des Milchelfenfalters (Callophrys irus), um zukünftige Erhaltungsmaßnahmen und eine bundesweite Entscheidung über eine mögliche Aufnahme in die Liste unter dem U.S. Endangered Species Act zu unterstützen. Obwohl es potenziell arbeitsintensiver ist als einige nichtinvasive Methoden, machen der Mangel an notwendigem Organismenkontakt und die Benutzerfreundlichkeit es zu einem potenziell praktikablen Modell, das auf andere populationsgenetische Forschungsprogramme angewendet werden kann, die auf eine Auswahl sowohl gewöhnlicher Insekten als auch solcher von Naturschutzbesorgnis abzielen, die Reste von Eierresten von kürzlich geschlüpften Nymphen oder Larven hinterlassen. Die hier vorgestellte Protokollsprache wurde speziell für Schmetterlinge der Familie Lycaenidae entwickelt und für die Verwendung durch Nicht-Experten, die hier als Community-Wissenschaftler oder andere Personen (z. B. Agenturbiologen, Praktikanten) mit begrenzter entomologischer Erfahrung definiert sind.
Protocol
1. Verteilung von Hilfsgütern an Wissenschaftler der Gemeinschaft
- Überprüfen und sammeln Sie sorgfältig die vollständige Liste der sammlungsbezogenen Materialien, die benötigt werden, indem Sie das vollständige Materialverzeichnis konsultieren.
- Wenn die Probenentnahme an mehreren Standorten und/oder durch mehrere Personen/Teams erfolgt, sammeln und organisieren Sie alle benötigten Vorräte in separaten einsatzfähigen Einheiten (Abbildung 1 und Abbildung 2).
- Transportmaterial (verlegefähige Einheiten) an Wissenschaftler der Gemeinde oder anderes Personal, das für die Feldsammlung verantwortlich ist.
- Wenn das Personal nicht vor Ort ist, verpacken Sie die Vorräte (jede einsatzfähige Einheit) sorgfältig in einen separaten Versandkarton mit einem vollständigen Versandetikett und Versand.
HINWEIS: Ein beschleunigter Versand ist zu diesem Zeitpunkt nicht erforderlich.
2. Vorbereitung der Sammlung von Gemeinschaftswissenschaftlern
- Überprüfen Sie nach Erhalt der Sammelvorräte, einschließlich der Sammelbehälterbox, sorgfältig die laminierte Lieferliste und führen Sie eine vollständige Bestandsaufnahme durch. Benachrichtigen Sie den Projektleiter, wenn Vorräte fehlen.
- Füllen Sie 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 180 μL Lysepuffer vor, bringen Sie Etiketten mit einem vorgedruckten eindeutigen ID-Etikett auf jedes Mikrozentrifugenröhrchen auf und legen Sie alle Röhrchen in die Aufbewahrungsbox für 64-Well-Mikrozentrifugenröhrchen. Verschließen Sie den Deckel nach dem Beladen fest.
HINWEIS: Wenn keine Etikettendrucker verfügbar sind, bringen Sie eindeutige ID-Nummern an der Seite und dem Deckel jeder Durchstechflasche mit einem ethanolbeständigen Marker an. - Stellen Sie sicher, dass alle digitalen Geräte (z. B. Smartphone oder Kamera) vollständig aufgeladen sind und alle Ersatzbatterien verpackt sind.
- Füllen Sie einen kleinen Kühler teilweise mit Eis für die Feldlagerung und den lokalen Transport der gesammelten Proben.
- Verpacken Sie alle Sammelutensilien in die Sammelbox oder einen ähnlichen stabilen, wetterfesten Behälter für sicheren Transport und konsolidierte Lagerung.
- Überprüfen Sie das zerstörungsfreie Protokoll zur Entnahme genetischer Proben im Detail, bevor Sie ins Feld gehen.
HINWEIS: Verwenden Sie das laminierte und komprimierte, illustrierte Protokoll für zusätzliche Anleitungen im Feld (Zusatzfigur S1 und Zusatzfigur S2).
3. Probenentnahme im Feld
- Wenn Sie am Einsatzort ankommen, notieren Sie mit einem Bleistift oder Allwetterstift im wetterfesten Feldnotizbuch die Tageszeit, das Datum, den Namen des gesamten Grundstücks (z. B. Apalachicola National Forest), den Namen oder die Beschreibung des Standorts des spezifischen Feldstandorts und den GPS-Messwert, falls verfügbar, sowie den vollständigen Namen und die Rollen aller anwesenden Personen.
- Finden Sie einen geeigneten Lebensraum mit der Anwesenheit von Larvenwirtspflanzenarten, die für den Zielschmetterling spezifisch sind.
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, um Auswirkungen auf empfindliche Lebensräume, Pflanzenpopulationen und Wildtiere zu vermeiden oder zu minimieren. Stellen Sie außerdem sicher, dass Sie alle entsprechenden Genehmigungen und/oder Genehmigungen des Landbesitzers einholen, bevor Sie auf einen Standort zugreifen und Proben sammeln. - Machen Sie mit einem Smartphone oder einer Kamera detaillierte Fotos von allen Feldstandorten, Probenentnahmeorten, Wirtspflanzen und allen anderen Informationen, die für das Projekt relevant sein könnten. Verwenden Sie Smartphones oder andere Kameras, die GPS-Koordinaten aufzeichnen.
HINWEIS: Foto-Geotagging muss auf allen Smartphones aktiviert sein. - Durchsuchen Sie umfassend alle Larvenwirtspflanzenteile wie Blätter, Blütenknospen, Blüten oder sich entwickelnde Früchte, von denen bekannt ist, dass sie durch Eiablegen (Eiablegen) erwachsener weiblicher Schmetterlinge nach geschlüpften Eiern ausgewählt werden. Suchen Sie bei den meisten Lycaenidae nach weißen, geschlüpften Eiern mit einem deutlichen Loch in der Mitte, das einem Donut ähnelt, aus dem die neugeborene Larve hervorgegangen ist (Abbildung 3). Suchen Sie nach nicht geschlüpften Eiern, die etwas dunkler gefärbt sind, oft grün oder bläulich, und ohne ein Loch in der Mitte vollständig intakt sind (Abbildung 4). Verwenden Sie eine Handlinse oder ein anderes Vergrößerungsgerät, um jedes Ei genau zu untersuchen.
- Sobald ein geschlüpftes Ei gefunden wurde, legen Sie Nitrilhandschuhe an beide Hände.
- Nehmen Sie das geschlüpfte Ei mit einer sauberen, sterilen, spitzen Pinzette und ziehen Sie es vorsichtig von der Wirtspflanze und legen Sie es direkt in ein beschriftetes Mikrozentrifugenröhrchen, das mit Lysepuffer aus der 64-Well-Aufbewahrungsbox gefüllt ist.
HINWEIS: Einige Wirtspflanzenverschleppungsmaterialien (kleiner als 15 mm Durchmesser) sind während der Sammlung akzeptabel und normal. - Sammeln Sie insgesamt mindestens 5 Proben pro Wirtspflanzenbeet/-standort (jede mit 1-20 geschlüpften Eiern), wobei insgesamt >50 Eier an einem Standort angestrebt werden, falls verfügbar.
HINWEIS: Dies wird dazu beitragen, dass zumindest ein Teil des Gewebes in jeder Probenpflanze / jedem Pflaster gesammelt wird, und erhöht die Chancen, DNA zu erkennen (persönliche Beobachtung). - Reinigen Sie die Pinzettenspitzen nach jeder Eientnahme sorgfältig, indem Sie sie in eine Durchstechflasche mit 95% Ethanol tauchen oder mit 95% Ethanol aus einer Quetschflasche übergießen oder Alkoholtücher verwenden.
HINWEIS: Dies trägt dazu bei, die Gewebeverschleppung zwischen den Probenahmeereignissen zu minimieren. - Falls verfügbar, sammeln Sie mehrere geschlüpfte Eier (1-20 Eier) von mehreren Pflanzen im selben Wirtsbeet in einem einzigen Mikrozentrifugenröhrchen und schließen Sie den Deckel fest. Für Schmetterlingsarten, die größere krautige oder holzige Wirtsarten verwenden, sammeln Sie mehrere Eier von verschiedenen Standorten derselben Pflanze, wenn die Wirtsflecken begrenzt sind.
HINWEIS: Pflanzen befinden sich im selben Wirtsbeet, wenn sich ihre Blätter berühren. Wenn es eine spürbare physische Trennung zwischen Pflanzen oder Flecken gibt, sollte dies als eine andere Probe betrachtet werden. Wenn Sie einen anderen Gewebetyp sammeln, z. B. Larvenexuvien oder ein einzelnes Bein, legen Sie nur ein einzelnes Bein, ein Beinfragment oder ein Larvenexuvie in ein Mikrozentrifugenröhrchen (eine Probe pro Person). - Stellen Sie sicher, dass das gesamte gesammelte Material vollständig in den Lysepuffer in jedem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen eingetaucht ist. Klopfen Sie den Boden des betreffenden Röhrchens auf eine harte Oberfläche, um bei Bedarf alle Proben wieder einzutauchen.
- Wischen Sie die Pinzette zum Trocknen mit einem sauberen Einweg-Labortuch ab.
HINWEIS: Eine sorgfältige Pinzettenreinigung ist unerlässlich, um Kreuzkontaminationen zwischen den Proben zu vermeiden. - Wenn Sie eine neue Probe entnehmen, werfen Sie gebrauchte Nitrilhandschuhe weg und ersetzen Sie sie durch ein sauberes Paar.
- Verwenden Sie in einem wetterfesten Feldnotizbuch einen Bleistift oder Allwetterstift, um das eindeutige ID-Etikett aufzuzeichnen, das dem Mikrozentrifugenröhrchen zugewiesen wurde, zusammen mit der Art der Probe (z. B. Eier, Larvenexuvien oder Bein), der ungefähren Anzahl der geschlüpften Eier und Sammlungsinformationen wie Sammlername(n), Datum, Ort, Wirtspflanzenart und zusätzlichen Notizen (Abbildung 2).
- Legen Sie das geschlossene Mikrozentrifugenröhrchen mit der Eirestprobe zurück in die 64-Well-Mikrozentrifugen-Aufbewahrungsbox.
- Bewahren Sie die 64-Well-Mikrozentrifugen-Aufbewahrungsbox in einem Kühler mit Eis auf, während Sie auf dem Feld sind.
- Bewahren Sie alle anderen Sammelmaterialien in der Sammelausrüstung auf, während Sie sich im Feld befinden, um eine sichere und konsolidierte Lagerung und den Transport zwischen den Standorten zu gewährleisten.
4. Wenn die Felderfassung abgeschlossen ist
- Stellen Sie sicher, dass sich alle Mikrozentrifugenröhrchen mit Proben in der 64-Well-Mikrozentrifugen-Aufbewahrungsbox in einem Kühler mit Eis für den Transport befinden.
- Legen Sie alle Feldsammelmaterialien wieder in die Sammelbox.
- Transportieren Sie alle Proben zurück ins Büro oder Labor und überprüfen Sie sorgfältig jedes Mikrozentrifugenröhrchen, um sicherzustellen, dass das gesamte Probenmaterial vollständig in den Lysepuffer eingetaucht ist.
- Legen Sie die 64-Well-Mikrozentrifugen-Aufbewahrungsbox mit Proben bis zum Versand oder zur Verarbeitung in einen Gefrierschrank.
HINWEIS: Ein durchschnittlicher handelsüblicher Gefrierschrank von -18 °C ist für die kurzfristige Lagerung akzeptabel. - Bewerten Sie sorgfältig alle Verbrauchsmaterialien in der Sammel-Toolbox und ersetzen Sie sie bei Bedarf.
Hinweis: Dies ist besonders wichtig, wenn mehrere Feldsammlungsereignisse geplant sind. - Bewahren Sie die Erfassungs-Tacklebox bis zum nächsten Feldsammelereignis an einem sicheren Ort auf.
- Laden Sie alle digitalen Bilder herunter und stellen Sie sicher, dass alle sicher auf einem Server oder Cloud-basierten Speichersystem gesichert sind.
- Scannen oder fotografieren Sie die originalen wetterfesten Notizbuchseiten oder Felddatenblätter mit Sammlungsdaten, bis alle Informationen in eine Projekttabelle oder Datenbank eingegeben werden können.
5. Einreichen von Mustern und Daten
- Nehmen Sie alle 64-Well-Mikrozentrifugen-Aufbewahrungsboxen mit Proben aus dem Gefrierschrank.
- Verpacken Sie die 64-Well-Mikrozentrifugen-Lagerboxen sorgfältig mit Proben und dem Feldnotizbuch oder den Felddatenblättern in einem Standard-Versandkarton, kleben Sie das mitgelieferte Versandetikett mit der Kontonummer des ursprünglichen Absenders an und senden Sie die Lieferung per Express-Spediteur über Nacht am nächsten Tag an den Projektleiter.
- Senden Sie die Paketverfolgungsnummer und eine Kopie der gescannten Notizbuchseiten oder Felddatenblätter per E-Mail an den Projektleiter.
6. DNA-Extraktion
- Sobald die 64-Well-Mikrozentrifugen-Aufbewahrungsboxen eingegangen sind, lagern Sie sie bei -20 ° C für die Konservierung von DNA in Proben, bis sie für die DNA-Extraktion bereit sind.
- Extrahieren Sie im Labor DNA, indem Sie Insektengewebe mahlen, das nach dem Auftauen von -20 °C im Lysepuffer gelagert wurde. 20 μL Proteinase K zugeben und die Probe über Nacht bei 56 °C in einem beheizten Inkubator für nicht mehr als 24 h einweichen lassen.
- Fügen Sie die entsprechenden Reinigungs- und Waschpuffer gemäß der Empfehlung des Herstellershinzu 13.
- Die im Puffer suspendierte Probe wird in eine Spin-Säule überführt, die an einem 2-ml-Sammelfläschchen befestigt ist.
- Mit einer Zentrifuge bei 6.021 × g für 60 s herunterdrehen. Fügen Sie die entsprechenden Waschpuffer hinzu und schleudern Sie sie entsprechend herunter.
- Freisetzen Sie gebundene DNA mit einem Elusionspuffer (30 μL) frei und schleudern Sie die Probe in ein frisches 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Bei -20 °C lagern.
HINWEIS: Fahren Sie mit der Sequenzierung fort, wenn die DNA-Konzentration 0,010 ng / ml überschreitet. Siehe Abbildung 5 für die DNA-Konzentration nach Gewebetyp.
7. Datenanalyse von DNA-Sequenzen
- Kürzen oder bearbeiten Sie Basisaufrufe mit geringer Qualität in resultierenden Sequenzen.
- Abfrage von Sequenzen gegen öffentliche Datenbanken zur Bestätigung der Artidentifizierung.
- Richten Sie Sequenzen aneinander aus, um Unterschiede zwischen Individuen zu vergleichen.
Representative Results
Materialien zum Sammeln von bis zu 563 Proben wurden an acht Naturschutz- und Gemeindewissenschaftler aus neun Staaten des gesamten Artenspektrums im Osten Nordamerikas geschickt. Die Materialien wurden im Jahr 2021 über drei Monate vor den lokalen Spitzenflugzeiten verschickt. Bis heute haben wir insgesamt 160 C. irus Gewebeproben erhalten, die gesammelt wurden (Tabelle 1). Genomische DNA wurde nach einem Protokoll für diesen Probentyp extrahiert, das von Storer et al.14 detailliert beschrieben wurde. Aus diesen 160 Proben wurde erfolgreich DNA aus 88 mit einer durchschnittlichen Konzentration von 1,67 ng / μL (SE ± 2,98) extrahiert, und die höchste DNA-Ausbeute betrug 26,8 ng / μL. Die Konzentrationen wurden mit einem hochempfindlichen Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers mit 2 μL Extrakt quantifiziert.
Während die Gesamtzahl der erhaltenen Proben wesentlich niedriger ist als die Gesamtzahl der für die Sammlung bereitgestellten Materialien, ist dies in erster Linie ein Artefakt der Bereitstellung eines Überangebots an Sammlungsmaterialien für den primären Sammler oder Teamleiter, um ihnen die maximale Flexibilität zu ermöglichen, mehrere Sammelstellen und / oder beteiligte Wissenschaftler der Gemeinschaft einzubeziehen, falls gewünscht. Darüber hinaus ist C. iris ein seltenes und abnehmendes Taxon, das durch begrenzte und oft relativ kleine Populationen in seinem gesamten Verbreitungsgebiet repräsentiert wird. Trotz dieser Einschränkung ist die Gesamtzahl der erhaltenen Gewebeproben beträchtlich, insbesondere im Vergleich zu dem, was bei einer traditionelleren Probenahme einzelner erwachsener Schmetterlinge zu erwarten wäre.
Abbildung 1: Einzelne verlegefähige Einheiten aller notwendigen Vorräte, die auf den Versand an Gemeindewissenschaftler oder anderes für die Feldsammlung verantwortliches Personal warten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Einzelne einsetzbare Einheit einschließlich aller Vorräte, durchsichtige Plastiksammelbox und ausgefülltes Express-Trägeretikett, das auf den Versand an Gemeindewissenschaftler oder anderes für die Feldsammlung verantwortliches Personal wartet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Foto des geschlüpften Eies des gefrosteten Elfenfalters (Callophrys irus) auf wilder Lupine (Lupinus perennis) mit einem deutlichen Loch in der Mitte, aus dem die neugeborene Larve hervorging. Beachten Sie, dass die Gesamtfarbe des geschlüpften Eies weiß ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Foto von ungeschlüpften gefrosteten Elfenfaltern (Callophrys irus) Eiern auf wilder Lupine (Lupinus perennis). Beachten Sie, dass nicht geschlüpfte Eier kein auffälliges zentrales Loch haben und dass ihre Gesamtfarbe bläulichgrün ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: DNA-Konzentration nach Gewebetyp. Die Box-Mittellinien stellen den Median dar, jede Box erweitert den IQR und die Box-Whisker sind 1,5 × IQR, wobei alle Punkte außerhalb Ausreißer sind. Proben, die eine einzelne Eihülle enthielten, hatten nur eine Eizelle, und Proben, die mehrere Eizellen enthielten, hatten mindestens zwei Fälle, wobei die Anzahl der Fälle zwischen 2 und 20 (Durchschnitt = 5,3) pro Probe lag. Abkürzung: IQR = Interquartilsbereich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Zustand | Etui | Etuis | Frass | Bein | Sich häuten | Gesamtsumme |
| Arkansas | 2 | 2 | ||||
| Florida | 3 | 10 | 7 | 22 | 42 | |
| Michigan | ||||||
| New Hampshire | 24 | 6 | 15 | 45 | ||
| New York | 30 | 30 | ||||
| Ohio | ||||||
| Wisconsin | 9 | 5 | 5 | 19 | ||
| Oklahoma | 16 | 6 | 22 | |||
| Gesamtsumme | 36 | 21 | 16 | 65 | 22 | 160 |
Tabelle 1: Anzahl und Art des gesammelten Gewebematerials nach Staat.
Ergänzende Abbildung S1: Titelseite eines beidseitigen, laminierten, komprimierten und illustrierten Protokolls für den Einsatz im Feld. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2. Rückseite des beidseitigen, laminierten, komprimierten, illustrierten Protokolls für den Einsatz im Feld. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Feldmethode zur zerstörungsfreien Probenahme seltener Schmetterlinge für populationsgenetische Struktur- oder DNA-Barcoding-Analysen. Die allgemeinen Vorteile dieses Protokolls wurden speziell entwickelt, um die breite Implementierung durch Personen mit unterschiedlichen Erfahrungen und Fähigkeiten wie Gemeindewissenschaftler, Naturschutzpraktiker und Studenten zu maximieren. Dazu gehören relativ niedrige Gesamtkosten, einfach zu beschaffende Verbrauchsmaterialien und Ausrüstung, eine einfache und zugängliche Methode ohne zahlreiche übermäßig komplexe Schritte und eine einfache Bereitstellung in einem breiten geografischen Gebiet. Es zielt auch auf organisches Restmaterial ab, das die Notwendigkeit beseitigt, vorübergehend zu fangen oder zu manipulieren, und dabei möglicherweise lebende Organismen schädigt, um genetische Proben zu erwerben. Darüber hinaus verlängert es den potenziellen Zeitraum, der für die Probenentnahme zur Verfügung steht, über die traditionelle Phänologie oder Lebensdauer einer bestimmten Lebensphase hinaus, wodurch die Flexibilität und die allgemeine Sammelmöglichkeit verbessert werden, um die Probenzahlen zu maximieren.
Während das zentrale Taxon für diese Bemühungen der gefrorene Elfenfalter war, ein weit verbreiteter, aber rückläufiger Habitatspezialist, kann dieses Protokoll breiter auf viele andere Insekten angewendet werden, einschließlich derjenigen, die für den Naturschutz von Belang sind. Während das Protokoll auf die Sammlung von geschlüpften Eiern als Quelle für genetisches Material abzielt, kann es leicht an andere, möglicherweise traditionellere Proben (z. B. Beine, Flügelfragmente, Antennenclips) oder sogar ganze Organismen angepasst werden. Dieser Aspekt ist jedoch auch eine mögliche Einschränkung des Protokolls. Obwohl die überwiegende Mehrheit der Schritte relativ einfach und schnell durchzuführen ist, ist die umfassende Suche nach Larvenwirtspflanzen, die einzeln typischerweise <1,0 mm Durchmesser haben, zeit- und arbeitsintensiv. Nichtsdestotrotz ist eine solche umfangreiche Probenahmeaktivität besonders ideal für ein größeres Netzwerk von Teilnehmern wie Community Scientists.
Wie bei anderen Projekten vor Ort ist eine sorgfältige Vorbereitung unerlässlich. Dazu gehört die Durchführung einer vollständigen Bestandsaufnahme der benötigten Vorräte, um sicherzustellen, dass keine Artikel fehlen, alle erforderlichen Vorbereitungsarbeiten abgeschlossen sind und sie gut organisiert, sicher verpackt und für den Feldeinsatz bereit sind. Darüber hinaus sollten alle Mitarbeiter vor Ort, insbesondere diejenigen, die die Gewebeentnahme durchführen, das Entnahmeprotokoll vor jeder Entnahmeveranstaltung im Detail überprüfen und Fragen an Personen richten, die das Projekt beaufsichtigen. Einmal vor Ort, erfordert der Probenentnahmeteil des Protokolls akribische Liebe zum Detail. Dazu gehört das Auffinden und sorgfältige Inspizieren von Eizellen, um sicherzustellen, dass sie geschlüpft sind und somit für die Entnahme geeignet sind, die gründliche Reinigung der Pinzette, das Ersetzen von Handschuhen, um die Gewebeverschleppung zwischen den Probenahmeereignissen zu reduzieren, und die Sicherstellung, dass Gewebeproben vollständig in den Lysepuffer in jedem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen eingetaucht sind. Schließlich ist die Aufzeichnung genauer und detaillierter Daten unerlässlich, einschließlich der Verknüpfung des eindeutigen ID-Etiketts, das aus dem Mikrozentrifugenröhrchen zugewiesen wurde, mit der spezifischen entnommenen Probe und allen anderen relevanten Entnahmeinformationen. Während dieser Schritt in der wissenschaftlichen Forschung Routine ist, muss er für ein Community-Science-Publikum oft gründlich geklärt und verstärkt werden.
Hier demonstrieren wir das Potenzial von Community-Wissenschaftlern für die nicht-tödliche Probensammlung von kleinen, seltenen und bedrohten Arten. Es gibt jedoch einige mögliche Einschränkungen, die bei der Analyse der resultierenden genetischen Daten zu beachten sind. Während beispielsweise das Poolen von Proben aus einem einzigen Pflaster die Chancen erhöht, genügend DNA für den Nachweis zu gewinnen, führt es möglicherweise auch zu Heterozygotie. Da das Protokoll das Sammeln des Chorions aus geschlüpften Eizellen beinhaltet, können nur weibliche Schmetterlinge, die elterliche DNA repräsentieren, innerhalb einer Population entnommen werden. Da jedoch keine genetischen Daten auf Populationsebene für C. irus verfügbar waren, können die daraus gewonnenen Erkenntnisse nur dem Artenschutz und -management zugute kommen. Während beispielsweise ein gründliches, detailliertes Studiendesign und eine sorgfältige Auswahl der Marker erforderlich wären, um die Populationsstruktur angemessen zu beurteilen, könnten das hier beschriebene Probenahmeprotokoll und die Verwendung von Cytochrom-c-Oxidase-Untereinheit 1 (CO1) DNA-Barcoding verwendet werden, um das Auftreten seltener oder gefährdeter Taxa nachzuweisen. Weitere Erörterungen des Nutzens und der Anwendung der DNA-Sequenzierung aus nicht-letalen Proben, die hier beschrieben werden, werden von Storer et ausführlich beschrieben. al.14.
Neben dem primären Ziel, Proben für die genetische Analyse zu sammeln, betont das Protokoll auch, dass die Teilnehmer detaillierte digitale Fotos aller Feldstandorte, Sammelorte, vorhandenen Larvenwirtspflanzen und aller anderen Elemente des umgebenden Lebensraums machen, die relevant sein könnten. Eine solche Dokumentation hilft bei der Erstellung einer allgemeinen Bewertung des Lebensraums, die nützlich ist, um bestehende Standortbedingungen wie Pflanzenphänologie, Wirtsressourcendichte und Managementgeschichte (z. B. kürzlich vorgeschriebene Brände) zu veranschaulichen. Solche Informationen sind besonders nützlich für Projekte, bei denen Feldproben über einen längeren Zeitraum entnommen werden, um detailliertere Umweltvergleiche zu ermöglichen.
Da sich der weltweite Insektenrückgang weiter beschleunigt, sind schließlich erweiterte Artenbewertungs- und Überwachungsbemühungen dringend erforderlich15,16. Die Nutzung eines breiteren partizipativen Engagements von Gemeindewissenschaftlern, Studenten (z. B. Praktikanten und Stipendiaten des U.S. Fish and Wildlife Service) und Naturschutzpraktikern bietet zunehmend praktikable Optionen für eine umfassende Datensammlung vieler Arten, einschließlich DNA-Proben. Dementsprechend haben die aus diesem Protokoll generierten Daten viele Einsatzmöglichkeiten. Dazu gehören die Unterstützung von Erhaltungsmaßnahmen (z. B. Planung, Wiederherstellung und Management), Listenentscheidungen oder Bewertungen des Artenstatus sowie ökologische, populationsbezogene und taxonomische Forschung.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken David Cuthrell, Amanda Dillon, Steve Fuller, Neil Gifford, Heidi Holman, Dean Jue, Sally Jue, Daniel Kennedy, Genevieve Kozak, Rebecca Longenecker, Maureen McClung, Matt Moran, Robin Niver, Brenda Smith, Hunter Trowbridge und Jessup Weichelt für die Hilfe bei verschiedenen Aspekten des Projekts, einschließlich Logistik, Koordination, Genehmigung und / oder Probenentnahme. Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss des U.S. Fish and Wildlife Service (Federal Award Identification Number F20AC00356) finanziert, der vom Wildlife Management Institute verwaltet wird (Grant SA 2021-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
| 250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
| Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
| Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
| Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
| FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
| Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
| Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
| Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
| Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
| Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton - Hot Pink - Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
| Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
| MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
| Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
| Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
| Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
| Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
| Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
| packing material Amount per deployable unit: as needed |
References
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