Summary
Qui, presentiamo un protocollo semplice per il campionamento genetico non invasivo delle popolazioni di farfalle basato sulla raccolta sul campo dei detriti residui di uova. Può essere utilizzato per confermare l'identità della specie e quantificare la variazione genetica. Questo protocollo può essere facilmente adattato a gruppi più ampi per il coinvolgimento scientifico della comunità.
Abstract
Il declino globale degli insetti continua ad accelerare. Un campionamento genetico efficace è fondamentale per far progredire la comprensione di molti taxa e colmare le lacune di conoscenza esistenti. Questo protocollo rappresenta un metodo dimostrato per il campionamento non distruttivo di farfalle rare per la struttura genetica della popolazione o le analisi dei codici a barre del DNA. Utilizza il corion delle ovaie di farfalla tratteggiate per produrre una quantità e una qualità di DNA sufficientemente elevate per il sequenziamento genico di successo per confermare l'identità della specie e quantificare la variazione genetica. Può essere particolarmente utile quando altre tecniche di campionamento dei tessuti sono poco pratiche o non disponibili. Sebbene sviluppato per un lepidottero, potrebbe comunque essere facilmente adattato per l'uso con altre specie di insetti. È stato specificamente progettato con facilità d'uso come obiettivo per aiutare a massimizzare l'ampia implementazione da parte di individui di diversa esperienza e livelli di abilità, come scienziati della comunità, professionisti della conservazione e studenti, e per l'uso su vaste aree geografiche per facilitare un ampio campionamento della popolazione. I dati generati possono aiutare a informare le decisioni tassonomiche e di elencazione, le azioni di conservazione e gestione e migliorare la ricerca ecologica di base.
Introduction
Un campionamento genetico efficace della popolazione di taxa di insetti rari, in declino e / o elencati è spesso fondamentale per aiutare a informare le azioni di conservazione e gestione. I metodi di campionamento dei tessuti letali o dannosi sono abitualmente utilizzati per molte analisi genetiche. Tuttavia, questi metodi sono indesiderabili o non consentiti perché possono causare danni alle popolazioni esistenti vulnerabili o avere un impatto negativo sul comportamento e sulla forma fisica. Varie tecniche di campionamento non letali o non invasive che coinvolgono tessuti come gambe intere, tagli di antenne o ali, esuvie larvali o emolinfa da secrezioni difensive e altri prodotti, come il frassino, sono state adatte per la ricerca genetica sugli insetti 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . La fattibilità complessiva e l'applicabilità di queste varie tecniche di campionamento dei tessuti variano significativamente in base alla biologia, all'ecologia, al comportamento, alle dimensioni e alla rarità dell'organismo focale, della situazione e degli individui che raccolgono il materiale. Ad esempio, le gambe intere o i ritagli di appendici richiedono la cattura temporanea e un'attenta manipolazione di diversi individui di una fase di vita appropriata, in genere da parte di personale esperto. Allo stesso modo, le fonti di tessuto, come le esuvie larvali o le frass, sono probabilmente pratiche solo se gli organismi sono in cattività o temporaneamente trattenuti per un periodo adeguato.
Per le domande di ricerca poste a livello di popolazione, come quelle riguardanti la potenziale differenziazione tassonomica o la struttura genetica, è spesso richiesto il campionamento su una scala temporale o geografica più ampia (cioè regionale o continentale). Di conseguenza, alcune fonti di tessuto non invasive possono essere completamente impraticabili o per lo meno inefficienti da raccogliere in quantità. La raccolta di campioni su tali scale può inoltre essere logisticamente o finanziariamente impraticabile o proibitiva per i singoli ricercatori o anche per i team sul campo più piccoli. Mentre l'impegno diretto degli scienziati della comunità è stato sempre più adottato dalla comunità di ricerca per aiutare ad affrontare molte di queste sfide e accelerare la raccolta basata sui big data, l'adozione è stata limitata per gli studi che coinvolgono il campionamento non distruttivo, non invasivo o eDNA10,11,12.
Per aiutare a superare alcune di queste potenziali limitazioni, abbiamo dimostrato che il corion delle ovaie delle farfalle tratteggiate potrebbe produrre una quantità e una qualità di DNA sufficientemente elevate per il sequenziamento genico di successo per confermare l'identità della specie e quantificare la variazione genetica. Successivamente abbiamo testato vari protocolli di raccolta utilizzando questa tecnica13. Questo lavoro pilota è servito come base per ulteriori perfezionamenti metodologici. Questo documento descrive in dettaglio il risultante protocollo di raccolta sul campo rivisto semplice ma completo implementato per gli scienziati della comunità e altro personale non esperto. Questo protocollo fa parte di un'analisi della struttura della popolazione a livello di gamma della farfalla elfa ghiacciata (Callophrys irus) per aiutare a informare le future azioni di conservazione e una determinazione federale di una possibile inclusione ai sensi dell'Endangered Species Act degli Stati Uniti. Sebbene potenzialmente più laborioso di alcuni metodi non invasivi, la mancanza del necessario contatto con l'organismo e la facilità d'uso lo rendono un modello potenzialmente praticabile che può essere applicato ad altri programmi di ricerca genetica di popolazione mirati a una selezione di insetti comuni e quelli di interesse per la conservazione, che lasciano residui di detriti di uova da ninfe o larve appena schiuse. Il linguaggio protocollare qui presentato è stato specificamente sviluppato per le farfalle della famiglia Lycaenidae e per l'uso da parte di non esperti definiti qui come scienziati della comunità o altri individui (ad esempio, biologi di agenzia, stagisti) con esperienza entomologica limitata.
Protocol
1. Diffusione delle forniture agli scienziati della comunità
- Esamina attentamente e raccogli l'elenco completo delle forniture relative alla raccolta necessarie consultando la tabella completa dei materiali.
- Se la raccolta dei campioni avrà luogo in più sedi e/o da più individui/squadre, raccogliere e organizzare tutte le forniture necessarie in unità dispiegabili separate (Figura 1 e Figura 2).
- Trasportare forniture (unità dispiegabili) agli scienziati della comunità o ad altro personale responsabile della raccolta sul campo.
- Se il personale non è locale, imballare accuratamente le forniture (ciascuna unità dispiegabile) in una scatola di cartone separata con un'etichetta di spedizione completa e spedire.
NOTA: La spedizione rapida non è richiesta in questa fase.
2. Preparazione della collezione di scienziati della comunità
- Al ricevimento delle forniture di raccolta, compresa la scatola di raccolta, esaminare attentamente l'elenco di fornitura laminato e condurre un inventario completo. Avvisare il responsabile del progetto se mancano forniture.
- Preriempire provette da microcentrifuga da 1,5 mL con 180 μL di tampone di lisi, applicare etichette con un'etichetta identificativa univoca prestampata a ciascuna provetta per microcentrifuga e posizionare tutte le provette nella scatola di stoccaggio delle provette per microcentrifuga a 64 pozzetti. Fissare saldamente il coperchio dopo il caricamento.
NOTA: se non sono disponibili stampanti per etichette, applicare numeri ID univoci sul lato e sul coperchio di ciascun flaconcino utilizzando un marcatore a prova di etanolo. - Assicurarsi che tutte le apparecchiature digitali (ad esempio, smartphone o fotocamera) siano completamente cariche e che tutte le batterie di ricambio siano imballate.
- Riempire parzialmente un piccolo dispositivo di raffreddamento con ghiaccio per lo stoccaggio sul campo e il trasporto locale dei campioni raccolti.
- Imballare tutte le forniture di raccolta nella scatola di raccolta o in un contenitore robusto e resistente alle intemperie per un trasporto sicuro e uno stoccaggio consolidato.
- Rivedere il protocollo di raccolta dei campioni genetici non distruttivi in dettaglio prima di entrare in campo.
NOTA: utilizzare il protocollo illustrato laminato e condensato per ulteriori indicazioni sul campo (Figura supplementare S1 e Figura supplementare S2).
3. Raccolta di campioni sul campo
- All'arrivo sul campo, utilizzare una matita o una penna per tutte le stagioni per registrare sul taccuino da campo resistente alle intemperie l'ora del giorno, la data, il nome generale della proprietà (ad esempio, Apalachicola National Forest), il nome o la descrizione specifica della posizione del campo e la lettura GPS, se disponibile, e il nome completo e i ruoli di tutte le persone presenti.
- Individuare un habitat adatto con la presenza di specie di piante ospiti larvali specifiche per la farfalla bersaglio.
NOTA: prestare attenzione per evitare o ridurre al minimo l'impatto su habitat sensibili, popolazioni vegetali e fauna selvatica. Inoltre, assicurati di proteggere tutte le autorizzazioni e / o i permessi appropriati del proprietario terriero prima di accedere a un sito e agli eventi di raccolta di campioni. - Utilizzando uno smartphone o una fotocamera, scatta fotografie dettagliate di tutti i siti sul campo, i luoghi di raccolta dei campioni, le piante ospiti e qualsiasi altra informazione che possa essere rilevante per il progetto. Utilizzare smartphone o altre fotocamere che registrano le coordinate GPS.
NOTA: il geotagging delle foto deve essere abilitato su tutti gli smartphone. - Cerca in modo completo tutte le parti della pianta ospite larvale, come foglie, boccioli di fiori, fiori o frutti in via di sviluppo, noti per essere selezionati ovopositando (deposizione delle uova) farfalle femmine adulte per le uova schiuse. Per la maggior parte dei Lycaenidae, cerca uova bianche e schiuse con un buco distinto al centro simile a una ciambella da cui è emersa la larva neonata (Figura 3). Cerca le uova non schiuse che sono un po 'più scure di colore, spesso verdi o bluastre, e saranno completamente intatte senza un buco nel mezzo (Figura 4). Utilizzare una lente a mano o un altro dispositivo di ingrandimento per ispezionare attentamente ogni uovo.
- Una volta individuato un uovo schiuso, indossare guanti di nitrile su entrambe le mani.
- Usando una pinza pulita, sterile e appuntita, afferrare e estrarre delicatamente l'uovo schiuso dalla pianta ospite e metterlo direttamente in un tubo di microcentrifuga etichettato preriempito con tampone di lisi prelevato dalla scatola di stoccaggio a 64 pozzetti.
NOTA: Alcuni materiali di riporto di piante ospiti (di diametro inferiore a 15 mm) sono accettabili e normali durante la raccolta. - Raccogliere almeno un totale di 5 campioni per appezzamento/sito di pianta ospite (ciascuno contenente 1-20 uova schiuse), mirando a >50 uova totali in un luogo, se disponibile.
NOTA: Ciò contribuirà a garantire che almeno un po 'di tessuto venga raccolto in ogni pianta / patch campione e aumenterà le possibilità di rilevare il DNA (osservazione personale). - Dopo ogni raccolta di uova, pulire accuratamente le punte delle pinze immergendole in una fiala di etanolo al 95% o bagnando con etanolo al 95% da una bottiglia di spremitura o utilizzando salviette imbevute di alcol.
NOTA: Ciò contribuirà a ridurre al minimo il trascinamento tissutale tra gli eventi di campionamento. - Se disponibili, raccogliere diverse uova schiuse (1-20 uova) da più piante nello stesso cerotto ospite in un singolo tubo di microcentrifuga e chiudere saldamente il coperchio. Per le specie di farfalle che utilizzano specie ospiti erbacee o legnose più grandi, raccogliere più uova da posizioni diverse sulla stessa pianta se le macchie ospiti sono limitate.
NOTA: Le piante si trovano nella stessa zona ospite se le loro foglie si toccano. Se c'è una notevole separazione fisica tra piante o appezzamenti, questo dovrebbe essere considerato un campione diverso. Se si raccoglie un altro tipo di tessuto, come esuvie larvali o una singola gamba, posizionare solo una singola gamba, un frammento di gamba o un'esuvia larvale in una provetta di microcentrifuga (un campione per individuo). - Assicurarsi che tutto il materiale raccolto sia completamente immerso nel tampone di lisi all'interno di ogni provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Picchiettare il fondo del tubo in questione su una superficie dura per riimmergere eventuali campioni, se necessario.
- Pulire la pinza per asciugare con una salvietta da laboratorio usa e getta pulita.
NOTA: Un'attenta pulizia delle pinze è essenziale per evitare la contaminazione incrociata tra i campioni. - Quando si raccoglie un nuovo campione, scartare i guanti in nitrile usati e sostituirli con un paio pulito.
- In un quaderno da campo resistente alle intemperie, utilizzare una matita o una penna per tutte le stagioni per registrare l'etichetta identificativa univoca assegnata dalla provetta della microcentrifuga insieme al tipo di campione (ad esempio, uova, esuvie larvali o gamba), il numero approssimativo di uova schiuse e informazioni sulla raccolta come nomi del collezionista, data, posizione, specie di piante ospiti ed eventuali note aggiuntive (Figura 2).
- Riporre la provetta chiusa per microcentrifuga con il campione di detriti di uova nella scatola di stoccaggio della microcentrifuga a 64 pozzetti.
- Mantenere la scatola di stoccaggio della microcentrifuga a 64 pozzetti in un dispositivo di raffreddamento con ghiaccio mentre si è sul campo.
- Mantenere tutte le altre forniture di raccolta nella scatola di raccolta mentre si è sul campo per lo stoccaggio e il trasporto sicuri e consolidati tra i siti.
4. Quando la raccolta dei campi è completa
- Assicurarsi che tutte le provette di microcentrifuga contenenti campioni siano nella scatola di stoccaggio della microcentrifuga a 64 pozzetti in un dispositivo di raffreddamento con ghiaccio per il trasporto.
- Riporre tutte le forniture per la raccolta sul campo nella scatola di raccolta.
- Trasportare tutti i campioni in ufficio o in laboratorio e ricontrollare attentamente ogni provetta di microcentrifuga per assicurarsi che tutto il materiale del campione sia completamente immerso nel tampone di lisi.
- Mettere la scatola di stoccaggio della microcentrifuga da 64 pozzetti con i campioni in un congelatore fino alla spedizione o alla lavorazione.
NOTA: Un congelatore commerciale medio di -18 °C è accettabile per la conservazione a breve termine. - Valutare attentamente tutte le forniture nella cassetta degli attrezzi di raccolta e sostituirle secondo necessità.
NOTA: questo è particolarmente importante se sono pianificati più eventi di raccolta dei campi. - Conservare la scatola di raccolta in un luogo sicuro fino al prossimo evento di raccolta sul campo.
- Scarica tutte le immagini digitali e assicurati che venga eseguito il backup sicuro su un server o su un sistema di archiviazione basato su cloud.
- Scansiona o fotografa le pagine originali resistenti alle intemperie, le pagine del quaderno da campo o le schede tecniche sul campo contenenti i dati di raccolta fino a quando tutte le informazioni possono essere inserite in un foglio di calcolo o database del progetto.
5. Invio di campioni e dati
- Rimuovere tutte le scatole di stoccaggio della microcentrifuga a 64 pozzetti con campioni dal congelatore.
- Imballare con cura le scatole di stoccaggio della microcentrifuga da 64 pozzetti con i campioni e il taccuino da campo o le schede tecniche sul campo in una scatola di spedizione standard, allegare l'etichetta di spedizione fornita con il numero di conto del mittente originale e inviare tramite corriere espresso, durante la notte, consegna il giorno successivo al direttore del progetto.
- Inviare via e-mail il numero di tracciamento del pacco e una copia delle pagine del blocco appunti scansionate o delle schede tecniche sul campo al direttore del progetto.
6. Estrazione del DNA
- Una volta ricevute le scatole di stoccaggio della microcentrifuga a 64 pozzetti, conservarle a -20 °C per la conservazione del DNA nei campioni fino al momento dell'estrazione del DNA.
- In laboratorio, estrarre il DNA macinando il tessuto degli insetti conservato in tampone di lisi dopo lo scongelamento da -20 °C. Aggiungere 20 μL di proteinasi K e lasciare il campione in ammollo per una notte a 56 °C in un incubatore riscaldato per non più di 24 ore.
- Aggiungere i tamponi di pulizia e lavaggio appropriati, secondo la raccomandazione specifica del produttore13.
- Trasferire il campione sospeso nel tampone in una colonna di rotazione attaccata a un flaconcino di raccolta da 2 ml.
- Centrifugare a 6.021 × g per 60 s usando una centrifuga. Aggiungere i tamponi di lavaggio appropriati e girare verso il basso in modo appropriato.
- Rilasciare il DNA legato utilizzando un tampone di elusione (30 μL) e far girare il campione in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Conservare a -20 °C.
NOTA: Procedere al sequenziamento se la concentrazione di DNA supera 0,010 ng/ml. Vedere la Figura 5 per la concentrazione di DNA per tipo di tessuto.
7. Analisi dei dati delle sequenze di DNA
- Tagliare o modificare le chiamate di base di bassa qualità nelle sequenze risultanti.
- Sequenze di query su database pubblici per la conferma dell'identificazione delle specie.
- Allineare le sequenze tra loro per confrontare le differenze tra gli individui.
Representative Results
I materiali per raccogliere fino a 563 campioni sono stati inviati a otto scienziati della conservazione e della comunità provenienti da nove stati in tutta la gamma di specie nel Nord America orientale. I materiali sono stati inviati nell'arco di tre mesi nel corso del 2021 prima degli orari di punta dei voli locali. Ad oggi, abbiamo ricevuto un totale di 160 campioni di tessuto C. irus che sono stati raccolti (Tabella 1). Il DNA genomico è stato estratto seguendo un protocollo per questo tipo di campione dettagliato da Storer et al.14. Di questi 160 campioni, il DNA è stato estratto con successo da 88 con una concentrazione media di 1,67 ng / μL (SE ± 2,98) e la più alta resa di DNA è stata di 26,8 ng / μL. Le concentrazioni sono state quantificate utilizzando un kit di analisi ad alta sensibilità secondo le istruzioni del produttore con 2 μL di estratto.
Mentre il numero totale di campioni ricevuti è sostanzialmente inferiore a quello del numero totale complessivo di materiali distribuiti per la raccolta, questo è principalmente un artefatto di fornire una sovrabbondanza di materiali di raccolta al collezionista primario o al team leader per consentire loro di avere la massima flessibilità per includere più siti di raccolta e / o scienziati della comunità coinvolti, se lo si desidera. Inoltre, C. iris è un taxon raro e in declino rappresentato da popolazioni limitate e spesso relativamente piccole in tutto il suo areale esistente. Nonostante questo vincolo, il numero totale di campioni di tessuto ricevuti è notevole, soprattutto rispetto a quello che ci si aspetterebbe con un campionamento più tradizionale di singole farfalle adulte.
Figura 1: Singole unità dispiegabili di tutte le forniture necessarie in attesa di spedizione agli scienziati della comunità o ad altro personale responsabile della raccolta sul campo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Singola unità dispiegabile comprensiva di tutte le forniture, scatola di raccolta in plastica trasparente e etichetta del corriere espresso compilata in attesa della spedizione agli scienziati della comunità o ad altro personale responsabile della raccolta sul campo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Foto dell'uovo di farfalla elfa smerigliata (Callophrys irus) su lupino selvatico (Lupinus perennis) che mostra un foro distinto al centro da cui è emersa la larva neonata. Si noti che il colore generale dell'uovo tratteggiato è bianco. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Foto di uova di farfalla elfo smerigliata non schiuse (Callophrys irus) su lupino selvatico (Lupinus perennis). Si noti che le uova non schiuse mancano di un foro centrale evidente e che il loro colore generale è verde bluastro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Concentrazione di DNA per tipo di tessuto. Le linee mediane della scatola rappresentano la mediana, ogni casella estende l'IQR e i baffi della scatola sono 1,5 × IQR, con eventuali punti esterni che sono valori anomali. I campioni contenenti un singolo caso di uova avevano un solo caso di uova e i campioni contenenti più casi di uova avevano almeno due casi, con un numero di casi compreso tra 2 e 20 (media = 5,3) per campione. Abbreviazione: IQR = intervallo interquartile. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Stato | Custodia per uova | Custodie per uova | Frass | Gamba | Muta | Totale generale |
| Arkansas | 2 | 2 | ||||
| Florida | 3 | 10 | 7 | 22 | 42 | |
| Michigan | ||||||
| New Hampshire | 24 | 6 | 15 | 45 | ||
| New York | 30 | 30 | ||||
| Ohio | ||||||
| Wisconsin | 9 | 5 | 5 | 19 | ||
| Oklahoma | 16 | 6 | 22 | |||
| Totale generale | 36 | 21 | 16 | 65 | 22 | 160 |
Tabella 1: Numero e tipo di materiale tissutale raccolto per stato.
Figura supplementare S1: Prima pagina del protocollo fronte/retro, laminato, condensato e illustrato per l'uso sul campo. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2. Retropagina del protocollo bifacciale, laminato, condensato, illustrato per l'uso sul campo. Clicca qui per scaricare questo file.
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo sul campo per il campionamento non distruttivo di farfalle rare per la struttura genetica della popolazione o le analisi dei codici a barre del DNA. I vantaggi complessivi di questo protocollo sono specificamente progettati per aiutare a massimizzare l'ampia implementazione da parte di individui di diversa esperienza e livelli di abilità come scienziati della comunità, professionisti della conservazione e studenti. Questi includono costi complessivi relativamente bassi, forniture e attrezzature facili da acquisire, un metodo semplice e accessibile senza numerosi passaggi eccessivamente complessi e una facile implementazione su un'ampia area geografica. Si rivolge inoltre al materiale organico residuo che elimina la necessità di catturare o manipolare temporaneamente e, nel processo, potenzialmente danneggiare gli organismi viventi per acquisire campioni genetici. Inoltre, estende il periodo potenziale disponibile per la raccolta dei campioni oltre la fenologia tradizionale o la durata di vita di una particolare fase della vita, migliorando la flessibilità e l'opportunità complessiva di raccolta per aiutare a massimizzare il numero di campioni.
Mentre il taxon focale per questo sforzo era la farfalla elfica ghiacciata, uno specialista di habitat diffuso ma in declino, questo protocollo può essere applicato più ampiamente a molti altri insetti, compresi quelli di interesse per la conservazione. Allo stesso modo, mentre il protocollo mira alla raccolta di uova schiuse come fonte di materiale genetico, può essere facilmente adattato ad altri campioni potenzialmente più tradizionali (ad esempio, zampe, frammenti di ali, clip antennali) o persino a interi organismi. Tuttavia, questo aspetto è anche una potenziale limitazione del protocollo. Sebbene la stragrande maggioranza dei passaggi sia progettata per essere relativamente semplice e veloce da realizzare, la ricerca completa di macchie di piante ospiti larvali per le uova da schiusa, che individualmente hanno in genere un diametro di <1,0 mm, richiede tempo e lavoro. Tuttavia, un'attività di campionamento così estesa è particolarmente ideale per una rete più ampia di partecipanti come gli scienziati della comunità.
Come per altri progetti sul campo, un'attenta preparazione è essenziale. Ciò include la conduzione di un inventario completo delle forniture necessarie per garantire che non manchino articoli, che qualsiasi lavoro di preparazione richiesto sia stato completato e che siano ben organizzati, imballati in modo sicuro e pronti per la distribuzione sul campo. Inoltre, tutto il personale sul campo, in particolare quelli che conducono la raccolta dei tessuti, dovrebbero rivedere il protocollo di raccolta in dettaglio prima di qualsiasi evento di raccolta e rivolgere eventuali domande alle persone che supervisionano il progetto. Una volta sul campo, la parte del protocollo relativa alla raccolta dei campioni richiede una meticolosa attenzione ai dettagli. Ciò include la localizzazione e l'ispezione attenta di tutti gli ovuli per assicurarsi che siano schiusi e quindi appropriati per la raccolta, la pulizia accurata delle pinze, la sostituzione dei guanti per contribuire a ridurre il trascinamento di tessuto tra gli eventi di campionamento e la garanzia che i campioni di tessuto siano completamente immersi nel tampone di lisi all'interno di ogni provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Infine, è essenziale registrare dati accurati e dettagliati, che include il collegamento dell'etichetta identificativa univoca assegnata dalla provetta della microcentrifuga con il campione specifico prelevato e tutte le altre informazioni di raccolta pertinenti. Mentre questo passaggio è di routine nella ricerca scientifica, spesso deve essere accuratamente chiarito e rafforzato per un pubblico scientifico della comunità.
Qui, dimostriamo il potenziale sfruttamento degli scienziati della comunità per la raccolta di campioni non letali da specie piccole, rare e minacciate. Tuttavia, ci sono alcune potenziali limitazioni da tenere a mente quando si analizzano i dati genetici risultanti. Ad esempio, mentre il raggruppamento di campioni da un singolo cerotto aumenta le possibilità di recuperare abbastanza DNA per il rilevamento, introduce anche potenzialmente eterozigosi. Inoltre, poiché il protocollo prevede la raccolta del corion dagli ovai schiusi, solo le farfalle femminili, che rappresentano il DNA dei genitori, possono essere campionate all'interno di una popolazione. Tuttavia, poiché non erano disponibili dati genetici precedenti a livello di popolazione per C. irus, le conoscenze acquisite non possono che giovare alla conservazione e alla gestione delle specie. Ad esempio, mentre sarebbe necessario un disegno di studio approfondito e dettagliato e un'attenta selezione dei marcatori per valutare adeguatamente la struttura della popolazione, il protocollo di campionamento qui delineato e l'uso del codice a barre del DNA della subunità 1 (CO1) della citocromo c ossidasi potrebbero essere utilizzati per rilevare la presenza di taxa rari o in pericolo. Ulteriori discussioni sull'utilità e l'applicazione del sequenziamento del DNA dal campionamento non letale qui descritte sono dettagliate da Storer et. al.14.
Oltre all'obiettivo primario di raccogliere campioni per l'analisi genetica, il protocollo sottolinea anche che i partecipanti scattano fotografie digitali dettagliate di tutti i siti di campo, i luoghi di raccolta, le piante ospiti larvali presenti e qualsiasi altro elemento dell'habitat circostante che potrebbe essere rilevante. Tale documentazione aiuta a fornire una valutazione generale dell'habitat utile per illustrare le condizioni del sito esistenti come la fenologia delle piante, la densità delle risorse ospiti e la storia di gestione (ad esempio, il recente incendio prescritto). Tali informazioni sono particolarmente utili per i progetti in cui i campioni sul campo sono prelevati in un periodo di tempo più ampio per consentire confronti ambientali più dettagliati.
Infine, poiché il declino globale degli insetti continua ad accelerare, sono assolutamente necessari sforzi di valutazione e monitoraggio delle specie ampliati15,16. L'uso di un impegno partecipativo più diffuso da parte di scienziati della comunità, studenti (ad esempio, stagisti e borsisti del Fish and Wildlife Service degli Stati Uniti) e professionisti della conservazione offre opzioni sempre più praticabili per un'ampia raccolta di dati di molti tipi, compresi i campioni di DNA. Di conseguenza, i dati generati da questo protocollo hanno molti possibili usi. Questi includono aiutare a informare le azioni di conservazione (ad esempio, pianificazione, recupero e gestione), elencare le decisioni o le valutazioni dello stato delle specie e la ricerca ecologica, della popolazione e tassonomica.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare David Cuthrell, Amanda Dillon, Steve Fuller, Neil Gifford, Heidi Holman, Dean Jue, Sally Jue, Daniel Kennedy, Genevieve Kozak, Rebecca Longenecker, Maureen McClung, Matt Moran, Robin Niver, Brenda Smith, Hunter Trowbridge e Jessup Weichelt per l'aiuto con vari aspetti del progetto, tra cui logistica, coordinamento, permessi e / o raccolta di campioni. Questa ricerca è stata finanziata attraverso una sovvenzione del Fish and Wildlife Service degli Stati Uniti (Federal Award Identification Number F20AC00356) amministrato dal Wildlife Management Institute (grant SA 2021-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
| 250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
| Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
| Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
| Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
| FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
| Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
| Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
| Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
| Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
| Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton - Hot Pink - Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
| Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
| MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
| Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
| Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
| Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
| Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
| Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
| packing material Amount per deployable unit: as needed |
References
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