Summary
Hier beschrijven we een in vivo beeldvormingstechniek met behulp van optische coherentietomografie om de diagnose en kwantitatieve meting van retinopathie bij muizen te vergemakkelijken.
Abstract
Optische coherentietomografie (OCT) biedt een niet-invasieve methode voor de diagnose van retinopathie. De OCT-machine kan retinale crosssectiebeelden vastleggen waaruit de retinale dikte kan worden berekend. Hoewel OCT veel wordt gebruikt in de klinische praktijk, is de toepassing ervan in fundamenteel onderzoek niet zo gangbaar, vooral bij kleine dieren zoals muizen. Vanwege de kleine omvang van hun oogbollen is het een uitdaging om fundusbeeldvormingsonderzoeken uit te voeren bij muizen. Daarom is een gespecialiseerd retinaal beeldvormingssysteem vereist om OCT-beeldvorming bij kleine dieren mogelijk te maken. Dit artikel demonstreert een specifiek systeem voor kleine dieren voor LGO-onderzoeksprocedures en een gedetailleerde methode voor beeldanalyse. De resultaten van retinaal OCT-onderzoek van zeer low-density lipoproteïne receptor (Vldlr) knock-out muizen en C57BL / 6J muizen worden gepresenteerd. De OCT-beelden van C57BL / 6J-muizen toonden retinale lagen, terwijl die van Vldlr knock-out muizen subretinale neovascularisatie en retinale verdunning vertoonden. Kortom, OCT-onderzoek zou de niet-invasieve detectie en meting van retinopathie in muismodellen kunnen vergemakkelijken.
Introduction
Optische coherentietomografie (OCT) is een beeldvormingstechniek die in vivo hoge resolutie en crosssectieve beeldvorming kan bieden voor weefsel 1,2,3,4,5,6,7,8, vooral voor het niet-invasieve onderzoek in het netvlies 9,10,11,12 . Het kan ook worden gebruikt om enkele belangrijke biomarkers te kwantificeren, zoals retinale dikte en retinale zenuwvezellaagdikte. Het principe van OCT is optische coherentiereflectometrie, waarbij crosssectionale weefselinformatie wordt verkregen uit de samenhang van licht dat door een monster wordt gereflecteerd en via een computersysteem in een grafische of digitale vorm wordt omgezet7. OCT wordt veel gebruikt in oogheelkundige klinieken als een essentieel hulpmiddel voor diagnose, follow-up en management voor patiënten met retinale aandoeningen. Het kan ook inzicht geven in de pathogenese van netvliesaandoeningen.
Naast klinische toepassingen is OCT ook gebruikt in dierstudies. Hoewel pathologie de gouden standaard is voor morfologische karakterisering, heeft OCT het voordeel van niet-invasieve in vivo beeldvorming en longitudinale follow-up. Bovendien is aangetoond dat OCT goed gecorreleerd is met histopathologie in retinopathie diermodellen 11,13,14,15,16,17,18,19,20. De muis is het meest gebruikte dier in biomedische studies. De kleine oogbollen vormen echter een technische uitdaging voor het uitvoeren van OCT-beeldvorming bij muizen.
Vergeleken met de OCT die voor het eerst werd gebruikt voor retinale beeldvorming bij muizen 21,22, is OCT bij kleine dieren nu geoptimaliseerd met betrekking tot hardware- en softwaresystemen. Oct vermindert bijvoorbeeld, in combinatie met de tracker, de signaal-ruisverhouding aanzienlijk; Oct-softwaresysteemupgrades maken het mogelijk om automatisch meer retinale lagen te detecteren; en de geïntegreerde DLP-beamer helpt de bewegingsartefacten te verminderen.
Very-low-density lipoprotein receptor (Vldlr) is een transmembraaneiwit in endotheelcellen. Het wordt uitgedrukt op retinale vasculaire endotheelcellen, retinale pigmentepitheelcellen en rond het buitenste beperkende membraan23,24. Subretinale neovascularisatie is het fenotype van Vldlr knock-out muizen23. Daarom worden Vldlr knock-out muizen gebruikt om de pathogenese en potentiële therapie van subretinale neovascularisatie te onderzoeken. Dit artikel demonstreert de toepassing van OCT-beeldvorming om retinale laesies te detecteren bij Vldlr knock-out muizen, in de hoop een technische referentie te bieden voor retinopathie-onderzoek in modellen met kleine dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De operaties werden uitgevoerd naar aanleiding van de Verklaring over het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek van de Association for Research in Vision and Ophthalmology. Het experimentele ontwerp werd goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierethiek (Medisch-ethische commissie van JSIEC, EC 20171213(4)-P01). Twee maanden oude C57BL/6J muizen en Vldlr knock-out muizen werden gebruikt in deze studie. Er waren 7 muizen in elke groep, die allemaal vrouwelijk waren en 20 g tot 24 g wogen.
1. Experimentele omstandigheden
- Wijs de muizen toe aan twee groepen: een experimentele groep bestaande uit Vldlr knock-out muizen en een controlegroep bestaande uit C57BL/6J muizen.
- Voed de muizen conventioneel met voedsel en water.
- Voed de muizen op in het dierenlaboratorium onder stabiele omstandigheden van kamertemperatuur (22 °C), vochtigheid (50-60%), licht-donkercyclus (12 h-12 h) en kamerlichtintensiteit (350-400 lux).
- Bereid de experimentele apparatuur voor: optische coherentietomografie met confocale scanninglaser oftalmoscoop (cSLO) voor kleine dieren (figuur 1A).
- Bereid alle materialen voor die nodig zijn voor het experiment voor (figuur 1B) en weeg de muizen (figuur 1C).
2. Informatiedossiers
- Noteer de informatie: groep, code, geboortedatum, leeftijd, geslacht, gewicht en verdovingsdosering.
3. Instrument opstarten en testen
- Schakel de computer in en start de software op.
- Klik op de knop Testprogramma om het testprogramma te voltooien.
- Zet de thermostaat aan en verwarm deze voor op de temperatuur van 37 °C.
- Start de OCT-moduleprocedure na het testen van het programma.
- Maak een nieuw onderwerp aan en vul de muisinformatie in.
- Verwarm de elektrische deken voor en bedek deze met chirurgische handdoeken.
4. Anesthesie
- Gebruik gelyofiliseerd anestheticumpoeder met Tiletamine en Zolazepam om het verdovingsmengsel te bereiden.
OPMERKING: Volg de aanbevelingen van de lokale commissie voor dierethiek voor de keuze, dosering en route van anesthesietoediening. Verdoof het dier met een verdovingsmiddel dat gedurende ten minste 1 uur immobiliteit en verlies van pijnwaarneming zal veroorzaken, waarna het dier snel herstelt. Dosering moet gebaseerd zijn op de duur van de experimenteertijd, het gewicht van het dier en andere factoren. - Verdoof het dier met behulp van het bereide verdovingsmengsel. Zorg ervoor dat het dier warm blijft tijdens de hele procedure tot herstel.
5. Toepassing van mydriatische druppels
- Bereik handmatige bevestiging van de muis door het nekvel, laat de oogbol iets uitsteken en draai de muiskop met één oog naar boven gericht.
- Breng de mydriatische druppels aan om de pupillen te verwijden (figuur 2A).
- Controleer na 10 min op pupilverwijding.
6. Plaatsing van de muis
- Plaats een muis op een elektrisch dekenplatform.
- Bedek beide ogen met medische natriumhyaluronaatgel (figuur 2B).
- Schroef een 60 D dubbele bolvormige lens (vooraf ingestelde lens) op het cSLO-apparaat (figuur 1A-5, 6).
- Plaats een 100 D-contactlens op het hoornvlies van de muis met de holle zijde die de natriumhyaluronaatgel op het hoornvliesoppervlak raakt (figuur 2C, D en figuur 3A-II).
- Plaats de muis op het kleine, constante temperatuur dierenplatform en houd het oog 1-2 mm uit de buurt van de lens van het cSLO-apparaat (figuur 3A).
- Pas de hoek van de contactlens aan met een tang om de pupil in het midden van de lens te houden.
- Verfijn de aanpassingen aan het hoofd om het oog recht vooruit te laten kijken.
7. Confocale Scanning Laser Oftalmoscoop (cSLO)
- Klik op de oct-knop , kies de muismodule en start het cSLO-programma (figuur 4B).
- Selecteer de IR-modus (lichtbron: rood licht) en pas de parameter aan (bereik: 2047, figuur 4D).
- Selecteer het oog dat u wilt onderzoeken (rechteroog: figuur 4C-1; linkeroog: figuur 4C-2).
- Bedien de hendel en beweeg de vooraf ingestelde lens langzaam naar de contactlens.
- Pas de dioptriewaarde aan totdat de beeldvorming van de achterste pool duidelijk is (figuur 4E).
- Breng verdere aanpassingen aan om het beeld van de retinale achterste pool uit te lijnen en centreer deze op de oogzenuwkop.
8. Optische coherentietomografie (LGO)
- Start het OCT-programma (figuur 4G).
- Klik op de voortgangsbalk omhoog en omlaag totdat de OCT-afbeelding verschijnt (afbeelding 4H).
- Parameters aanpassen: Bereik Min (Figuur 4I) = 0-20, Bereik Max (Figuur 4J) = 40-60.
- Pas de vooraf ingestelde lensafstand en positierichting aan totdat een ideaal OCT-beeld is verkregen.
- Selecteer de scanpositie door de standaardregel in de cSLO (figuur 4M) te verplaatsen.
- Begin met scannen vanaf de oogzenuwkop.
- Verzamel afbeeldingen in dezelfde volgorde voor elk oog: horizontale lijn: oogzenuwkop → superieur → inferieur; verticale lijn: oogzenuwkop → nasale → temporale.
- Verzamel afbeeldingen uit vier richtingen.
- Klik op Gemiddelde om de cSLO- en OCT-afbeeldingssignalen te overlappen (figuur 4F en figuur 4O).
- Klik op de opnameknop om de SLO-OCT-afbeelding te verkrijgen (figuur 4P).
- Sla alle afbeeldingen op en exporteer ze (figuur 4Q, R).
9. Het einde van het experiment (na het LGO-onderzoek)
- Leg de muis op de elektrische deken om hem warm te houden totdat hij wakker wordt.
OPMERKING: De muis moet worden gecontroleerd totdat hij weer voldoende bewustzijn heeft om sternale lighouding te behouden. Postoperatieve blootstelling aan fel licht moet worden geminimaliseerd. - Verwijder de 100 D contactlens.
- Breng de levofloxacine ooggel aan om het hoornvlies te beschermen.
- Plaats de muis terug in de kooi nadat hij wakker is geworden.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de onderzochte muis niet wordt teruggebracht naar het gezelschap van andere muizen totdat deze volledig is hersteld. - Schakel de software uit en schakel de computer uit.
- Reinig de 100 D contactlens met water; droog de lens.
- Reinig en desinfecteer de omgeving.
10. Beeldanalyse
- Vergelijk de OCT-beelden van Vldlr knock-out muizen met die van C57BL/6J muizen.
- Observeer meerdere posities: verticale en horizontale scans die door de optische papilla gaan; superieure, inferieure, nasale en temporale scans; en abnormale reflectieplaatsscans.
- Observeer de dikte, vorm, gelaagdheid en abnormale reflectielaesies van het netvlies in elk beeld, evenals de glasvochtinterface van het netvlies en het glasachtig lichaam.
- Noteer de locaties, kenmerken en aantallen laesies.
11. Retinale stratificatie correctie
- Klik op Load Examination (Bekijk de OCT-interface ) (figuur 5A).
- Roep de OCT-afbeeldingen van een muis op vanuit een pop-upvenster.
- Afbeeldingen selecteren: OCT-afbeeldingen scannen door de optische papilla, horizontaal of verticaal.
- Dubbelklik op de afbeelding in de mediacontainer om deze op het scherm weer te geven (afbeelding 5C).
- Klik op Laagdetectie om de automatische gelaagdheid op het netvlies te voltooien (figuur 5D).
- Selecteer de scheidslijnen aan beide zijden van de laag die zijn voorbereid voor analyse (figuur 6D-10).
- Selecteer een afzonderlijke scheidingslijn (figuur 6B-6) en klik op Laag bewerken (figuur 6A-1) om de lijn te activeren wanneer een rode cirkel verschijnt (figuur 6B-7).
- Pas de afstand (figuur 6A-4, bijvoorbeeld 50) en het limietbereik (figuur 6A-5, bijvoorbeeld 50) aan.
- Wijzig de deellijn door de rode cirkel te verplaatsen (vergelijk de groene scheidingslijn in figuur 6B en figuur 6C; Figuur 6C toont het gewijzigde resultaat).
12. Retinale lamineerdikte
- Klik op de knop Markering meten (Afbeelding 6D-9).
- Selecteer de scheidslijn van de te analyseren laag (selecteer bijvoorbeeld in de buitenste nucleaire laag de4e en5e deellijn in de lijst) om de grens van de laag op de OCT-afbeelding weer te geven (figuur 6D-10).
- Selecteer Verbinden met laag (afbeelding 6D-11) en Verbonden blijven tijdens beweging (figuur 6D-12).
- Selecteer het gebied om de resultaten weer te geven (de geselecteerde kolom is gekleurd, Figuur 6D-13).
- Klik op de positie die moet worden geanalyseerd op de OCT-afbeelding om de meetlijn te laten verschijnen (loodrecht op de horizontale as en consistent met de kleur van het resulterende gebied) (figuur 6D-14).
- Klik op de volgende kolom voor de volgende meting en onthul de vorige gegevens (figuur 6E-15).
- Lees de Vert-waarde (dikte van de gemeten positie) in de rij Lengte in μm (weefsel) (figuur 6E, rode rechthoek).
- Klik op Delete Marker (Figuur 6E-16) en New Marker (Figuur 6E-17) om opnieuw te testen, zodat de resultaten de oorspronkelijke gegevens dekken (als hermeting nodig is).
- Druk op Scr afdrukken op het toetsenbord om schermafbeeldingen op te slaan of klik op Onderzoek opslaan om rechtstreeks op te slaan (Figuur 5H).
- Voer de gegevens in een spreadsheet of statistische software in voor statistische analyse.
13. Meting van de volledige dikte van het netvlies
- Selecteer regel 1 (ILM, binnenbegrenzingsmembraan, figuur 7B) en lijn 7 (OS-RPE, OS: buitenste fotoreceptorsegmenten; RPE: retinale pigmentepitheellaag, figuur 7C) in de lijst in de rechterbovenhoek.
OPMERKING: De volledige retinale dikte betekent de dikte van de retinale neurepitheliumlaag, het netvlies tussen ILM en OS-RPE op OCT). - Meet de retinale dikte aan beide zijden van de optische papilla met een specifiek interval.
- Bijvoorbeeld: van het verschijnen van de retinale structuur aan de rand van de optische papilla, meet 4 waarden met een afstand van 200 μm van de horizontale liniaal (figuur 7G, H).
- Noteer alle gemeten waarden in een spreadsheet.
- Gebruik meerdere t-tests (één per rij) om de gemeten waarden van elke overeenkomstige positie in beide groepen te vergelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dankzij de hoge resolutie scans van OCT kunnen de lagen van het netvlies van de muis worden waargenomen en kunnen abnormale reflecties en hun exacte locaties worden geïdentificeerd. De retinale OCT-beelden van Vldlr knock-out muizen en C57BL/6J muizen werden vergeleken in deze studie. De OCT-beelden van alle C57BL/6J-muizen toonden verschillende retinale lagen met verschillende reflectiviteit en de afbakening was duidelijk (figuur 8D). Daarentegen vertoonden alle Vldlr knock-out muizen abnormale, hyperreflecterende laesies op de OCT-beelden (figuur 8B).
Onvolledig glasvochtloslating (PVD) bij Vldlr knock-out muizen
De OCT-resultaten toonden enkele middelste reflecterende banden op de retinale oppervlakken van Vldlr knock-out muizen (figuur 8B, rode pijlen). Deze middelste reflecterende banden kleefden aan het netvliesvat (figuur 8B, groene pijl), wat overeenkomt met het cSLO-beeld (figuur 8A, groene pijl). Deze kenmerken komen overeen met de OCT-kenmerken van onvolledig glasvochtloslating.
Subretinale neovascularisatie bij Vldlr knock-out muizen
De resultaten toonden aan dat subretinale neovascularisatie twee ontwikkelingsmodi had in de Vldlr knock-out muizen.
Met betrokkenheid van de buitenste nucleaire laag
Een hyperreflecterende laesie, met een bottom-down driehoekige vorm op het OCT-beeld, verscheen op de subretinale ruimte en verspreidde zich naar de buitenste nucleaire laag. De laesie brak niet door de buitenste plexiforme laag (figuur 8B, witte pijl).
Het OCT-uiterlijk van dit type subretinale neovascularisatie was consistent met de pathologische bevindingen in figuur 9A. De pathologische sectie toonde aan dat neovascularisatie (figuur 9A, dikke groene pijl) door de RPE, fotoreceptor binnen/ buitenste segmenten (IS / OS) en het externe beperkende membraan (ELM) brak. Het drong de buitenste nucleaire laag (ONL) binnen, maar brak niet door de buitenste plexiforme laag (OPL).
Zonder betrokkenheid van de buitenste nucleaire laag
Een band van hyperreflectieve laesie verscheen op de OCT-afbeelding, die zich in de subretinale ruimte bevond (figuur 8B, gele pijl). De cSLO-afbeelding toonde de bijbehorende locatie (figuur 8A, gele pijl). De aanvullende scans van het netvlies rond deze locatie (figuur 8A, gele pijl) toonden dezelfde bevindingen.
In overeenstemming met de laesie (figuur 10A, dikke blauwe pijl) in de pathologische sectie, brak deze subretinale neovascularisatie niet door de ELM (figuur 10A, dunne gele pijl) maar betrof gedeeltelijk de fotoreceptor IS /OS.
Retinale dikte resultaten
De retinale dikte van het rechteroog van alle muizen werd verkregen door gebruik te maken van de automatische stratificatie- en diktemeetfunctie van OCT. De retinale dikte van Vldlr knock-out muizen (200,94 ± 14,64 μm) was significant lager dan die van C57BL/6J muizen (217,46 ± 10,21 μm, P < 0,001, t-test, 7 rechter ogen/groep). De vergelijking van de dikte van het netvlies in de vier richtingen (temporeel, nasaal, superieur en inferieur) van de achterste polaire tussen de twee groepen is weergegeven in figuur 11.
Figuur 1: Voorbereiding van proefmateriaal en dieren. (A) Apparatuur: 1. cSLO/OCT-apparaat voor retinale beeldvorming bij kleine dieren, 2. computer en monitor, 3. Klein, constant temperatuur dierenplatform, 4. thermostaat, 5. vooraf ingestelde lens, 6. installatie van de vooraf ingestelde lens. (B) Geneesmiddelen en kleine producten: I. povidon-jodium, II. microsyringe, III. oplossing van het anestheticummengsel, IV. timer, V. mydriatische oogdruppels, VI. tang, VII. medische natriumhyaluronaatgel, VIII. medisch wattenstaafje, IX. antibiotische oogzalf, X. 100 D contactlens (twee). (C) Gewichtsmeting op een digitale balans. Afkortingen: cSLO = confocale scanning laser oftalmoscoop; OCT = optische coherentietomografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbereiding vóór OCT-onderzoek van muizen. (A) Mydriasis oogdruppeltoepassing, (B) natriumhyaluronaatgelcoating op het hoornvlies, (C, D) plaatsing van een 100 D-contactlens, met concaaf oppervlak dat contact maakt met het hoornvlies. Afkorting: OCT = optische coherentie tomografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: OCT-onderzoeksprocedures. (A) Plaatsing van de muispositie, I. vooraf ingestelde lens, II. contactlens, III. Klein, constant temperatuur dierenplatform. B) Werking van de cSLO/OCT-machine, IV. bedieningshendel, V. kantelhendel, VI. cSLO-apparaat. Afkortingen: cSLO = confocale scanning laser oftalmoscoop; OCT = optische coherentietomografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: OCT-beeldvormingsproces. Een. Meetmodus , B. Start Laser van de IR-laser, C. oogselectie (C-1-OD; C-2-OS), D. bereik van IR-laser, E. de dioptrie, F. overlay van het cSLO-beeld, G. OCT scanning start/stop laserknop H. referentie van OCT-afbeelding, I. Bereik Min: 0-20, J. Bereik Max: 50-60, K. signaalintensiteit van het beeld, L. scanrichting (bijv. verticale scan), M. scanpositie geselecteerd door de groene referentielijn te verplaatsen (bijv. verticale scan door de optische papilla), N. real-time weergave van het OCT-beeld, O. overlay van het OCT-beeld, P. Shot: beeldacquisitie, Q. SLO-OCT-beelden die zijn verkregen, R. Save Examination: opslaan van het onderzoeksresultaat. Schaalstaven = 200 μm. Afkortingen: cSLO = confocale scanning laser oftalmoscoop; OCT = optische coherentietomografie; IR = infrarood; OD = rechteroog; OS = linkeroog. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Automatische retinale delaminatie-interface op OCT-systeem. A. Knop Belastingsonderzoek , B. Mediacontainer, met alle OCT-afbeeldingen, C. OCT-afbeelding die wordt geselecteerd voor analyse, D. Laagdetectieknop voor automatische retinale gelaagdheid, E. scheidingslijnlijst, F. automatische delaminatie op het netvlies, G. Laag bewerken knop voor gelaagde correctie, H. Onderzoek opslaan knop voor het opslaan van de resultaten. Schaalstaven = 200 μm. Afkorting: OCT = optische coherentie tomografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Gelaagde correctie (A-C) en diktemeting (D-E). (A) Gelaagde activeringsinterface voor bewerken: 1. Knop Laag bewerken , 2. lijst met scheidingslijnen (bijvoorbeeld alle regels selecteren), 3. geactiveerde scheidslijnen, 4. Aanpassing van de afstand, 5. Aanpassing van het limietbereik . (B) Activering van een scheidslijn (bv. lijn 3 in A), 6. lijn 3, de lijn tussen de binnenste plexiforme laag en de binnenste kernlaag, 7. een voorbeeld van een gelaagdheidsfout. (C) Wijziging van gelaagdheidsfouten, 8. de rode cirkel voor wijziging. (D) Een voorbeeld van retinale lamellaire diktemeting, 9. Meet Marker knop, 10. scheidslijnen van de buitenste kernlaag, 11. Maak verbinding met laag (de meting verbindt zich met de laag volgens de scheidslijnen), 12. Blijf verbonden op beweging (de meetpositie is waar de handmatige klik blijft), 13. de locatie van de resultatenweergave, 14. de meetlijn (loodrecht op de horizontale as). (E) Verkrijging van meetresultaten, 15. de meetresultaten (rode rechthoek: Vert-waarde is het dikteresultaat), 16. Verwijder marker knop voor het verwijderen van meetrecords, 17. Nieuwe Marker-knop voor hermeting (het nieuwe resultaat overschrijft de oorspronkelijke record). Schaalbalken = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Meting van de volledige retinale dikte. A. Meet markerknop , B. lijn 1 (ILM) en C. lijn 7 (OS-RPE) selectie voor het weergeven van de grenzen van het netvlies van volledige dikte, D. Verbinden met laagselectie , E. Blijf verbonden bij beweging selectie, F. liniaalbalk (verticale en horizontale liniaalbalken, beide 200 μm lang), G. meetlijnen op het netvlies (4 lijnen met 200 μm horizontale liniaallengte als afstand aan elke kant van de optische papilla), H. de meetresultaten (de resultaten worden gedifferentieerd door verschillende kleuren en komen overeen met de kleur van de meetlijnen op het netvlies), I. Gegevensextractie uit de Vert-waarde in de rij Lengte in μm (weefsel). Schaalstaven = 200 μm. Afkortingen: ILM = inner limiting membrane; OS-RPE = fotoreceptor buitenste segment van retinaal pigmentepitheel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Vergelijking van cSLO- en OCT-beelden van Vldlr knock-out en C57BL/6J muizen. cSLO (A) en OCT (B) beelden van Vldlr knock-out muizen vergeleken met de cSLO (C) en OCT (D) beelden van C57BL/6J muizen. Kenmerken van OCT bij Vldlr knock-out muizen (B): 1) Middelste reflecterende lijn (B, rode pijlen) op het binnenoppervlak van het netvlies met hechting aan het retinale vat (B, groene pijl). 2) Hyperreflectieve laesies, gelegen in de subretinale ruimte, met (B, witte pijl) of zonder (B, gele pijl) betrokkenheid van de buitenste nucleaire laag. De pijlen op de cSLO-afbeelding (A) vertegenwoordigen de locaties van de overeenkomstige kleurpijlen op OCT-afbeelding (B). Schaalstaven = 200 μm. Afkortingen: cSLO = confocale scanning laser oftalmoscoop; OCT = optische coherentietomografie; Vldlr = lipoproteïnereceptor met zeer lage dichtheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Modus 1: retinale paraffinesecties met hematoxyline-eosinekleuring in Vldlr knock-out en C57BL/6J muis. (A) Een voorbeeld van subretinale neovascularisatie die de buitenste nucleaire laag binnendringt (dikke groene pijl), gelegen in het middelste deel van het netvlies van een Vldlr knock-out muis. (B) Normale controle, het middelste deel van het netvlies van een C57BL/6J muis. Schaalstaven = 50 μm. Afkortingen: Vldlr = lipoproteïnereceptor met zeer lage dichtheid; ILM = binnenbegrenzingsmembraan; NFL = retinale zenuwvezellaag; GCL = retinale ganglioncellaag; IPL = binnenste plexiforme laag; INL = binnenste nucleaire laag; OPL = buitenste plexiforme laag; ONL = buitenste kernlaag; ELM = uitwendig beperkende membraan; IS = fotoreceptor binnenste segment; OS = fotoreceptor buitenste segment; RPE = retinale pigmentepitheellaag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Modus 2: retinale paraffinesecties met hematoxyline-eosinekleuring in Vldlr knockout en C57BL/6J muis. (A) Een voorbeeld van subretinale neovascularisatie zonder de betrokkenheid van de buitenste nucleaire laag (dikke blauwe pijl) en met intacte ELM (dunne gele pijl), gelegen in het middelste periferie retina in een Vldlr knockout muis. (B) Normale controle, het middelste periferie-netvlies van een C57BL/6J-muis. Schaalstaven = 50 μm. Afkortingen: VLDR = zeer lage dichtheid lipoproteïne receptor; ILM = binnenbegrenzingsmembraan; NFL = retinale zenuwvezellaag; GCL = retinale ganglioncellaag; IPL = binnenste plexiforme laag; INL = binnenste nucleaire laag; OPL = buitenste plexiforme laag; ONL = buitenste kernlaag; ELM = uitwendig beperkende membraan; IS = fotoreceptor binnenste segment; OS = buitenste fotoreceptorsegment; RPE = retinale pigmentepitheellaag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11: Vergelijking van de retinale dikte tussen C57BL/6J muizen en Vldlr knock-out muizen (alle gegevens van het rechteroog). (A) Retinale dikte (μm) door de oogzenuw papilla door OCT horizontale scanning. (B) Retinale dikte (μm) door de papilla van de oogzenuw door OCT verticale scanning. De horizontale coördinaat vertegenwoordigt de meetposities met een afstand van 200 μm.*: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P < 0,001. Afkortingen: T = Temporal; P = Optische papilla; N = Nasaal; S = Superieur; I = Inferieur; OCT = optische coherentietomografie; VLDR = lipoproteïnereceptor met zeer lage dichtheid; OD = rechteroog. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie werd OCT-beeldvorming met behulp van een retinaal beeldvormingssysteem voor kleine dieren toegepast om retinale veranderingen te evalueren bij Vldlr knock-out muizen, die onvolledige posterieure glasvochtloslating, subretinale neovascularisatie en dunner wordende retinale dikte vertonen. OCT is een niet-invasieve beeldvormingsmethode om de toestand van het netvlies in vivo te onderzoeken. De meeste OCT-apparaten zijn ontworpen voor menselijk oogonderzoek. De grootte van de hardware-apparatuur, de instelling van de brandpuntsafstand, de instelling van de systeemparameters en de positioneringsvereisten van de examinator zijn allemaal gebaseerd op het menselijk oog. Aanpassingen van de lens- en systeeminstellingen zijn vereist om kleine dieren te onderzoeken met mensspecifieke OCT-apparatuur. Dit artikel presenteert LGO-onderzoeksprocedures voor kleine dieren.
De brandpuntsafstand is anders tijdens het scannen van afbeeldingen van verschillende kleine dieren met verschillende groottes van oogbollen. Dit verschil in brandpuntsafstand is van cruciaal belang en moet worden opgelost om duidelijke en nauwkeurige fundusbeelden te verkrijgen. Een effectieve methode is het vervangen van de objectieflens door lenzen met verschillende krommingen. Vanwege zijn kleine oogbol heeft de muis een contactlens van 100 D voor het hoornvlies nodig naast de dubbelbollige 60 D preset lens van de OCT-apparatuur.
De OCT kan alleen lijnscans leveren die slechts een beperkt gebied van het netvlies bestrijken. Daarom is het essentieel om het protocol van OCT-scans te standaardiseren voor kwalitatieve en kwantitatieve vergelijking van OCT-bevindingen in verschillende groepen. Hier werden drie horizontale scans en drie verticale scans uitgevoerd. Deze machine biedt een real-time cSLO-beeld om de locatie van de OCT-scan te bewaken, zodat de positie van de scan nauwkeurig en gemakkelijk kan worden aangepast. Extra scans kunnen worden toegevoegd wanneer een abnormale reflectie wordt gevonden.
De parameters van beeldacquisitie moeten zorgvuldig worden aangepast. Hier wordt aanbevolen dat de Range Min 0-20 is en de Range Max 50-60 (Figuur 4I, J). Wanneer de parameters overgeschikt zijn, zou het signaalcontrast van het beeld worden verbeterd en wordt het gereflecteerde signaal van het netvlies met lage reflectie lager of zelfs zwart, en sommige morfologische informatie zal verloren gaan.
Hieronder volgen enkele tips om verslechtering van de beeldkwaliteit te voorkomen: 1. Plaats een contactlens voor de ogen onmiddellijk na de anesthesie om staar te voorkomen; 2. Zorg ervoor dat de vooraf ingestelde lens en contactlens schoon zijn; 3. Vermijd het binnendringen van haar tussen het hoornvlies en de contactlens; 4. Zorg ervoor dat de doppler, het contrast en de helderheid in de OCT-parameters op de juiste manier zijn ingesteld.
De OCT-beelden kunnen worden gebruikt om laesies kwalitatief te detecteren en kwantitatief statistieken zoals retinale dikte te meten. Hier wordt een methode voorgesteld om de retinale dikte op verschillende locaties te meten, en het gemiddelde kan worden berekend als de gemiddelde retinale dikte. Dit wordt bereikt door de automatische stratificatiefunctie van het LGO-systeem. Daarom kan ook de dikte van de retinale laminaties worden gemeten. De meetmethode is eenvoudig en nauwkeurig (figuur 6 en figuur 7). De resultaten toonden aan dat de retinale dikte lager was bij Vldlr knock-out muizen dan C57BL/6J muizen, in overeenstemming met de literatuur25. Het verschil in retinale dikte tussen de twee groepen kan duidelijk worden weergegeven door een grafiek die wordt gegenereerd uit de metingen op meerdere locaties (figuur 11). Vergelijkbare retinopathieanalyse en retinale diktemeetmethoden zijn ook gemeld in het muismodel26 van de ziekte van Stargardt. Het is echter vermeldenswaard dat de hyperreflectieve banden op het glasvochtinterface van het netvlies niet tot het netvliesweefsel behoren en tijdens stratificatie moeten worden verwijderd. Bovendien, als subretinale laesies het netvlies binnendringen, moet de diktemeting het binnengedrongen deel omvatten.
Dit retinale beeldvormingssysteem voor kleine dieren heeft enkele beperkingen. Hoewel het bijvoorbeeld duidelijke beelden van de achterste pool binnen 35° kan opleveren, is beeldacquisitie van het perifere netvlies nog steeds een uitdaging. Bovendien vormt cSLO een grijsschaalbeeld, dat niet zo goed is als een kleurenfundusbeeld om funduslaesies (pigmentatie, bloeding, exsudatie) te detecteren. Daarom zijn verdere verbeteringen nodig. Samenvattend kan OCT-onderzoek door de cSLO-machine de niet-invasieve detectie en meting van retinopathie in muismodellen vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen potentieel belangenconflict.
Acknowledgments
Projectbron: Natural Science Foundation van de provincie Guangdong (2018A0303130306). De auteurs willen het Ophthalmic Research Laboratory, Joint Shantou International Eye Center van Shantou University en de Chinese University of Hong Kong bedanken voor financiering en materialen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-Dpt contact lens | Volk Optical,Inc, Mentor, OH | Accessory belonging to the RETImap | |
| Double aspheric 60-Dpt glass lens | Volk Optical,Inc, Mentor, OH | Accessory belonging to the RETImap | |
| Electric heating blanket | POPOCOLA | CW-DRT-01 | 50 x 35 cm |
| Injection syringe (1 mL) | Kaile | 0.45 x 16RWLB | |
| Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel | EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD | 5 g: 0.015 g | |
| Medical sodium hyaluronate gel | Alcon | 16H01E | |
| Microliter syringes | Shanghai high pigeon industry and trade co., LTD | Q31/0113000236C001-2017 | 50 µL |
| Povidone iodine solution | Guangdong medihealth pharmaceutical Co.,LTD | 100 mL | |
| RETImap | ROLAND CONSULT | 19-99_50-2.1_1.2E | cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP |
| Small animal ear studs | OSMO POCKET OT110 | INS1005-1S | |
| Tropicamide Phenylephrine Eye Drops | Santen Pharmaceutical Co.,LTD | 5 mg/mL | |
| Xylazin | Sigma | X1251-5G | 5 g |
| Zoletil 50 | Virbac.S.A | 7FRPA | Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg |
References
- Frombach, J., et al. Serine protease-mediated cutaneous inflammation: characterization of an ex vivo skin model for the assessment of dexamethasone-loaded core multishell-nanocarriers. Pharmaceutics. 12 (9), 862 (2020).
- Osiac, E., Săftoiu, A., Gheonea, D. I., Mandrila, I., Angelescu, R. Optical coherence tomography and Doppler optical coherence tomography in the gastrointestinal tract. Journal of Gastroenterology. 17 (1), 15-20 (2011).
- Xiong, Y. Q., et al. Diagnostic accuracy of optical coherence tomography for bladder cancer: A systematic review and meta-analysis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 298-304 (2019).
- Andrews, P. M., et al. Optical coherence tomography of the aging kidney. & Clinical Transplantation. 14 (6), 617-622 (2016).
- Terashima, M., Kaneda, H., Suzuki, T. The role of optical coherence tomography in coronary intervention. The Korean Journal of Internal Medicine. 27 (1), 1-12 (2012).
- Avital, Y., Madar, A., Arnon, S., Koifman, E. Identification of coronary calcifications in optical coherence tomography imaging using deep learning. Scientific Reports. 11 (1), 11269 (2021).
- Huang, D., et al.
- Tsai, T. H., et al. Optical coherence tomography in gastroenterology: a review and future outlook. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-17 (2017).
- Chen, J., et al. Relationship between optical intensity on optical coherence tomography and retinal ischemia in branch retinal vein occlusion. Scientific Reports. 8 (1), 9626 (2018).
- Chen, X., et al. Quantitative analysis of retinal layer optical intensities on three-dimensional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54 (10), 6846-6851 (2013).
- Cruz-Herranz, A., et al. Monitoring retinal changes with optical coherence tomography predicts neuronal loss in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 203 (2019).
- Podoleanu, A. G.
- Augustin, M., et al. Optical coherence tomography findings in the retinas of SOD1 knockout mice. Translational Vision Science & Technology. 9 (4), 15 (2020).
- Berger, A., et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
- Burns, M. E., et al. New developments in murine imaging for assessing photoreceptor degeneration in vivo. Advances in Experimental Medicine & Biology. 854, 269-275 (2016).
- Jagodzinska, J., et al. Optical coherence tomography: imaging mouse retinal ganglion cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: Jove. (127), e55865 (2017).
- Kocaoglu, O. P., et al. Simultaneous fundus imaging and optical coherence tomography of the mouse retina. Investigative Opthalmology & Visual Science. 48 (3), 1283-1289 (2007).
- Tode, J., et al. Thermal stimulation of the retina reduces Bruch's membrane thickness in age related macular degeneration mouse models. Translational Vision Science & Technology. 7 (3), 2 (2018).
- Wang, R., Jiang, C., Ma, J., Young, M. J. Monitoring morphological changes in the retina of rhodopsin-/- mice with spectral domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3967-3972 (2012).
- Xie, Y., et al. A spectral-domain optical coherence tomographic analysis of Rdh5-/- mice retina. PLoS ONE. 15 (4), 0231220 (2020).
- Li, Q., et al. Noninvasive imaging by optical coherence tomography to monitor retinal degeneration in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42 (12), 2981-2989 (2001).
- Horio, N., et al. Progressive change of optical coherence tomography scans in retinal degeneration slow mice. Archives of Ophthalmology. 119 (9), 1329-1332 (2001).
- Hu, W., et al. Expression of VLDLR in the retina and evolution of subretinal neovascularization in the knockout mouse model's retinal angiomatous proliferation. Investigative Opthalmology & Visual Science. 49 (1), 407-415 (2008).
- Wyne, K. Expression of the VLDL receptor in endothelial cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (3), 407-415 (1996).
- Augustin, M., et al. In vivo characterization of spontaneous retinal neovascularization in the mouse eye by multifunctional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (5), 2054-2068 (2018).
- Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. The FASEB Journal. 34 (3), 3693-3714 (2020).
