Summary
禽胚胎的脉络膜尿囊膜（CAM）是各个研究领域非常有用和适用的工具。一种特殊的日本鹌鹑CAM卵外模型适用于光动力处理研究。
Abstract
禽胚胎的脉络膜尿囊膜（CAM）是一种薄的胚胎外膜，作为主要的呼吸器官。其特性使其成为研究血管生成、肿瘤生长、药物输送系统或光动力诊断 （PDD） 和光动力疗法 （PDT） 的出色 体内 实验模型。同时，该模型解决了用合适的替代品替换实验动物的要求。 卵外 培养胚胎允许轻松的物质应用、访问、监测和记录。最常用的是小鸡凸轮;但是，本文介绍了日本鹌鹑CAM作为低成本和高通量模型的优势。另一个优点是胚胎发育较短，允许更高的实验周转率。本文探讨了鹌鹑CAM对癌症和微生物感染的PDD和PDT的适用性。作为示例，描述了使用光敏剂金丝桃素与脂蛋白或纳米颗粒组合作为递送系统。确定了白光图像的损伤评分和紫光（405 nm）下CAM组织荧光强度的变化，并分析了组织学切片。鹌鹑CAM清楚地显示了PDT对脉管系统和组织的影响。此外，还可以观察到毛细血管出血、血栓形成、小血管溶解和大血管出血等变化。日本鹌鹑CAM是一种很有前途的光动力诊断和治疗研究的 体内 模型，可用于肿瘤血管生成研究以及抗血管和抗菌治疗。
Introduction
鸡绒毛膜尿囊膜（CAM）模型是众所周知的，并广泛用于各个研究领域。它是一个血管丰富的胚胎外器官，提供气体交换和矿物质运输1。由于该膜的透明度和可及性，可以实时观察单个血管及其结构变化2。尽管有这些优点，但雏鸡CAM也有一些限制（例如，更大的繁殖设施，鸡蛋生产和饲料消耗），可以通过使用其他鸟类来避免。在该协议中，描述了使用日本鹌鹑（Coturnix japonica）胚胎的替代卵外CAM模型。由于其体积小，它允许使用比鸡CAM更多的实验个体。此外，鹌鹑胚胎较短的16天胚胎发育是另一个优势。鹌鹑CAM上的第一个较大的血管出现在胚胎日（ED）7。这可以直接与雏鸡胚胎发育（4-35 阶段）进行比较;然而，发育的后期阶段不再具有可比性，并且鹌鹑胚胎需要更少的时间3.令人感兴趣的是类似于鸡CAMs的微血管分支的定期发生4，5，6。快速的性成熟，高产蛋量和低成本育种是支持使用这种实验模型7的其他例子。
禽CAM模型通常用于光动力疗法（PDT）研究8。PDT用于治疗几种形式的癌症（局部小肿瘤）和其他非肿瘤疾病。其原理是将荧光药物，光敏剂（PS）输送到受损组织，并用适当波长的光激活。研究中使用的一种前瞻性PS是金丝桃素，最初从药用植物圣约翰草（金丝桃连翘）中分离出来9。这种化合物的强光敏作用是基于其光化学和光物理特性。其特征在于400-600nm范围内的多个荧光激发峰，其诱导约600nm处的荧光发射。金丝桃素在光谱带内的最大吸收值在540-590nm范围内，荧光最大值在590-640nm范围内9。为了达到这些光敏效果，在局部给药10后，金丝桃素被波长为405nm的激光激发。在光的存在下，金丝桃素可表现出杀病毒，抗增殖和细胞毒性作用11，而没有全身毒性，并且迅速从生物体中释放。金丝桃素是一种亲脂性物质，可形成不溶于水的非荧光聚集体，这就是为什么几种类型的纳米载体，例如聚合物纳米颗粒12，13或高密度和低密度脂蛋白（HDL，LDL）14，15，用于帮助其递送和渗透到细胞中。由于CAM是一种天然免疫缺陷系统，肿瘤细胞可以直接植入膜表面。该模型也非常适合根据定义的分数16，17 记录 PDT 诱导的血管损伤程度。与PDT相比，强度较低的光可用于光动力诊断（PDD）。在紫罗兰激发LED光下监测组织也会导致光敏剂18，19，20的光活化，从而导致荧光的发射，但它不能提供足够的能量来启动PDT反应并损害细胞。它使其成为肿瘤可视化和诊断或监测所用PSs的药代动力学的良好工具14，15。
本文介绍了存活率超过 80% 的卵 外 鹌鹑 CAM 测定的制备方法。这种 卵外 培养物成功地应用于大量的实验中。
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Protocol
该研究是按照机构指南进行的。所有设备和试剂必须用70%乙醇或紫外线高压灭菌或灭菌。
1. 种蛋孵化
- 在开始孵化之前，将受精鹌鹑蛋储存在10-15°C最多4-5天。仅使用干净且未损坏的鸡蛋。
- 将种蛋在强制通风孵化器中孵化~53-54小时。在关闭种蛋旋转的情况下，在50%-60%的湿度和37.5°C的孵化温度下水平产卵。
2. 卵外 培养物制备
注意：初始孵化后，种蛋适合开始 卵外 培养。
- 用 70% 乙醇消毒鸡蛋表面，不要旋转鸡蛋。
- 在无菌层流柜中，使用小型无菌手术剪刀打开蛋壳并将内容物转移到 6 孔培养板中。如果做得好，胚胎将躺在未损坏的蛋黄上。每个鸡蛋后，用70%乙醇消毒剪刀。
- 向 6 孔板的间隙中加入大约 5 mL 的无菌水，因为湿度对于防止 CAM 变干至关重要。
- 将胚胎放入培养箱中直至进一步实验，同时保持37°C的温度和80%-90%的湿度。
- 当 CAM 完全显影（从 ED7 开始）时，沿着小毛细管在 CAM 表面上放置一个无菌硅胶环（直径 6 mm，厚度约 1.5 mm）。放置戒指时避免使用主要血管。
注意：环定义了工作区，有助于标记物质应用的位置，并防止液体内容物泄漏。 - 根据国家法律终止胚胎培养。
- 重要的是，在工作期间戴上手套或用70%乙醇消毒双手。用真空吸引器吸出未正确倾斜的胚胎或未受精卵。
图1： 离卵 培养物制备。 （A） 储存和孵化的日本鹌鹑蛋。（B）用乙醇对蛋表面进行消毒。（C）蛋壳用剪刀剪开。（D）将鸡蛋的内容物倒入井中。（E）适当准备的3天大的胚胎，并具有发育中的CAM脉管系统。（F）储存在培养箱中的培养板。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：6 孔培养板，顶部放置胚胎和硅胶环。 请点击此处查看此图的大图。
3.肿瘤细胞接种
注意：所有程序都需要使用无菌层流柜。
- 根据各自的培养方案在烧瓶中培养不同类型的贴壁细胞。
- 从烧瓶中取出旧培养基，并用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞层以去除培养基的痕量。
- 胰蛋白酶消化后，通过加入培养基抑制胰蛋白酶并将细胞收获到离心管中。离心细胞并将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中。计数细胞并以所需浓度将其重悬于细胞培养基中。
注意：也可以使用例如悬挂滴法21来生产3D细胞培养物，即球状体。
- 将 1 x 105-1 x 106 个肿瘤细胞或 5-15 个球体（每个 CAM）植入 30 μL 细胞培养基溶液中，植入 CAM 顶部的硅胶环中。
注意：体积取决于所用硅胶环的尺寸。如果使用直径较大的硅胶环，则需要更大的体积来覆盖整个区域。根据细胞类型或不同类型的实验，可以使用不同的细胞浓度。有时，CAM的精细刮削用于改善嵌入细胞的粘附。 - 将带有接种细胞的CAM返回培养箱（37°C和80%-90%湿度）。
图3：用肿瘤接种CAM 。 （A）用移液管抽吸球体，以及（B）植入CAM表面。 请点击此处查看此图的大图。
4.光敏剂的应用
- 金丝桃素的应用
- 在昏暗的灯光下，通过将金丝桃素溶解在100%二甲基亚砜（DMSO）中来制备2 mM金丝桃素储备溶液。在用无菌PBS或盐水溶液进行实验前不久准备79μM金丝桃素的工作溶液。确保所有溶液中DMSO的最终浓度始终低于0.2%，这不会影响胚胎的发育。
- 在无菌条件下，将适量的金丝桃素溶液涂在硅胶环上。30 μL 的体积足以填充直径为 6 mm 的环。
- 将胚胎保存在37°C和80%-90%湿度的培养箱中。水溶液中的金丝桃素在组织中单构化后具有光活性，在CAM上施用约3小时后。
- 金丝桃素与低密度脂蛋白、高密度脂蛋白或纳米颗粒作为运输系统的应用
注意：这些转运系统用于改善金丝桃素对细胞和细胞结构的渗透。- 由于光敏性，请在昏暗的灯光下执行所有步骤，包括溶液的制备，并将溶液储存在黑暗中。
- 根据参考文献15，通过在PBS中混合适当体积的脂蛋白和金丝桃素储备溶液来制备金丝桃素-LDL和金丝桃素-HDL制剂。LDL或HDL与金丝桃素的浓度为20：115。
- 根据参考文献12，13通过活阳离子开环聚合合成聚合物纳米颗粒。用PBS调节聚合物纳米颗粒中金丝桃素的浓度至10μM12，13。
5. PDD 和 PDT
- 进行PDD
- 在无菌条件下，在CAM表面上应用光敏剂（金丝桃素，加载金丝桃素的聚合物纳米颗粒或带有脂蛋白载体的金丝桃素），有或没有肿瘤细胞（ED 7-9）。
- 使用紫色激发光（405nm波长的定制圆形LED灯）照亮CAM，并在金丝桃素给药后0，1，3，5，24和48小时的时间间隔内用数码相机记录CAM组织和肿瘤细胞中金丝桃素的荧光。
- 如果研究需要白光下的CAM图像，请在金丝索霉素给药前和实验结束时，在组织固定前不久记录CAM，因为光会影响金丝桃素的光活化。
- 使用图像处理和分析程序（例如，ImageJ22）评估荧光强度。
- 将 RGB 图像通道拆分为单独的红色、绿色和蓝色图像。以 8 位形式分析红色强度图像。评估环内区域的红色强度，并将其近似为金丝桃素荧光。在金丝桃素给药后（即从0小时，给药后立即到48小时）以不同的时间间隔获得整个图像配置文件图（使用ImageJ的配置文件图插件）。
- 进行PDT
- 在金丝桃素应用后至少3小时进行PDT。
- 将光纤放在CAM表面上方，以使激光覆盖硅胶环内的整个区域。
- 用405nm激光以285mW/ cm 2的通量率进行体内照射（1-2分钟）。
- 在光动力处理前后（24小时和48小时）使用白光和405nm荧光记录CAM。
- 从白光下拍摄的图像中检测PDT后24小时和48小时的光损伤。通过半定量评分16：1评估血管损伤 - 无破坏;2 - 部分关闭毛细管（直径≤10μm），不破坏中等或更大（直径≥50μm）和较小的血管（直径10-50μm）;3 - 部分关闭毛细血管消失的较小血管;4 - 较大血管部分关闭，较小血管和毛细血管消失;和 5 - 总光血栓形成，大部分血管消失。
图 4：用激光处理 CAM。 这张照片仅用于说明目的。对于 PDD 或 PDT，房间必须是黑暗的。 请点击此处查看此图的大图。
6. 准备 CAM 以进行进一步评估
- 石蜡包埋
- 将CAM组织固定在PBS中含有4%多聚甲醛（PFA）的培养板中至少2小时，最多过夜。
- 取出PFA，小心地从CAM上切出硅胶环内的一部分组织。
- 立即使升序酒精系列中的CAM组织脱水，如下所示。将CAM组织置于70%乙醇中3分钟，伊红溶液2分钟（以便组织更容易在石蜡块中定位），96%乙醇3 x 5分钟（始终在新培养皿中），100%乙醇5分钟和二甲苯2 x 10分钟。
- 使用刮刀或细刷子，尽快将样品转移到培养皿（59°C）中溶解的石蜡中。24小时后，将组织置于组织学模具中，用石蜡包埋培养基填充，使其在冰箱中固化。从包埋介质上切下凝固的CAM，将其在托盘中旋转90°，再次用包埋介质填充，然后使其凝固。
- 在切片机上准备5-10μm切片进行组织病理学分析，以确定PDT诱导的损伤。
- 用于组织学的冷冻CAM切片的制备
注意：对于包括组织学在内的某些方法，在低温恒温器切片机上制备的冷冻切片更合适。请按照以下步骤准备冻结的 CAM 部分。- 小心地将天然或 4% 多聚甲醛固定的 CAM 安装在载玻片上。
- 用最佳切割温度化合物（OCT）将嵌入模具填充成两半，并在液氮或干冰和乙醇的混合物中冷冻。
- 冷冻后，小心地倾斜CAM并将其从载玻片滑到冷冻的OCT介质的顶部。再次放入模具中，用OCT介质覆盖，并按照步骤6.2.2冷冻。
- 鹌鹑CAM的分形分析
注意：PDT引起的脉管系统变化可以通过计算分形维数系数19来评估。- 在层流柜中，将CAM溢在培养板中，该培养板具有4%多聚甲醛和2%戊二醛在PBS中的预热（37°C）固定溶液。
- 48小时后取出固定溶液。用微型剪刀和细刷小心地将CAM与胚胎分开，然后在PBS中清洗。
- 将洗好的 CAM 安装在载玻片上，让它慢慢干燥。
- 使用数码相机和透射仪作为均匀白光源拍摄载玻片。
- 使用 ImageJ 软件处理数字图像22.对于分析，从具有远端动脉分支的区域中选择一个正方形区域（512 × 512 像素）。按照参考文献31中描述的程序对图像进行二值化和骨架化，并计算分形维数系数（Df）。
- CAM组织的分子分析
- 对于分子分析，仔细分离天然CAM，在液氮中冷冻，并储存在-80°C。
- 根据 RNA 分离23、逆转录为 cDNA 和定量 PCR24 的标准方案确定基因表达。
图 5：用于分形分析的 CAM 组织。 PDT 后，将 CAM 固定、安装在载玻片上并干燥以进行分形分析。照片是使用透射仪在白光下拍摄的。 请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
在白光下，CAM表面肿瘤的定位是困难的。用于PDD的光敏剂（此处为金丝桃素）有望被肿瘤选择性吸收，并有助于可视化肿瘤。添加金丝桃素和使用荧光灯（例如，405nm）可以很好地显示肿瘤（鳞状细胞癌TE1）的位置（图6A）。组织学分析显示重要的肿瘤细胞侵入健康组织。异常鳞状细胞的同心结构，通常在鳞状细胞癌组织（角蛋白珍珠）中描述，是可见的（图6B）。肿瘤的生长伴随着水肿和膜增厚。
图 6：在 CAM 表面上生长的鳞状细胞癌 TE1 肿瘤 。 （A）使用白光（左）和405 nm LED光（右）并添加金丝桃素拍摄的图像。肿瘤生长的程度可以更好地可视化和定义。（B）肿瘤的横截面生长在CAM表面，CAM组织中有转移（M，角蛋白珍珠）。 请点击此处查看此图的大图。
在PDT中使用光敏剂和长时间暴露在高强度聚焦光下组织。这种治疗会影响CAM脉管系统，导致血栓形成，较大血管闭合，较小血管和毛细血管消失（图7）。应用处理的区域（硅胶环内部）受到影响，并且环内和周围区域的血管密度存在明显差异。
图 7：PDT 后 24 小时 CAM 脉管系统变化的示例。 激光处理导致大多数毛细血管消失，比较硅胶环中治疗区域内外的血管密度。 请点击此处查看此图的大图。
PDT中使用的激光在没有光敏剂存在的情况下不会造成任何损害（图8，中线，“仅照射”），与未经任何处理的对照相当（图8，顶线，“对照”）。图像的底线显示了由聚集的金丝桃素10的单构化引起的金丝桃素荧光随时间的变化。用金丝桃素孵育3小时后施用PDT，2小时后已经有明显的变化。治疗后24小时拍摄的白光图像显示脉管系统受到广泛损害。
图 8：金丝桃素给药和激光照射 （PDT） 后荧光强度和 CAM 脉管系统密度的变化。 使用405nm光和白光在0，1，3，5和24小时拍摄图像。图像的顶行对应于不处理的对照。图像的中间线仅对应于激光照射（即，没有金丝桃素）;激光照射（2分钟，405nm激光，通量率285mW / cm2）在金丝桃素给药后3小时施用。图像的底线对应于金丝桃素和激光照射（PDT）的处理;用金丝桃素孵育3小时后应用激光照射。图像清楚地显示了CAM脉管系统的损伤。 请点击此处查看此图的大图。
PDT对CAM组织结构产生负面影响。组织学分析（图9）显示，未经处理的对照CAM具有相对均匀的厚度;然而，PDT处理导致CAM变得更薄，更脆弱。
图9：对照和PDT处理的CAM组织的组织学分析 。 （A）未经处理的对照CAM的横截面。凸轮的厚度相对均匀。（B）PDT处理后CAM的横截面。与对照组相比，CAM 更薄、更脆弱。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
为了成功的 卵外 培养，遵循上述协议很重要。此外，如果鸡蛋打开得不够小心或在培养过程中湿度不足，蛋黄袋会粘在壳上并经常破裂。在鸡蛋孵化约60小时时开始卵 外 培养可确保胚胎的高存活率，因为它们已经足够大，可以在处理中存活下来。在后期发育阶段，CAM变薄并粘附在蛋壳上，导致膜破裂。
从孵化第7天开始，胚胎对搅拌的敏感性降低;CAM区几乎覆盖了油井的整个表面，并准备进行进一步的实验。尽管死亡胚胎可能代表感染的风险，但至少在半无菌条件下使用正确的工作方法，它们不会影响6孔板中活着的其他胚胎。目前实验中鹌鹑卵外胚的存活率约为80%，比鸡卵外实验中的存活率相对较好25，26，27。
在目前的实验中，使用硅胶环来分隔工作空间。到目前为止，没有证据表明环本身对CAM组织的发育，生长或血管生成有任何影响28。Kohli等人在鸡CAM模型中测试了不同结构和成分的生物材料的使用，并且在除硅胶以外的所有测试支架 中都观察到血管，其中没有观察到血管渗入其中29。只有不小心处理环才会导致CAM出血并降低胚胎的存活率。
由于其特性，该CAM模型代表了实验动物（如小鼠，大鼠或兔子）的可行，经济上有利的替代方案，特别是用于观察PDT30期间的脉管系统变化。它还适用于监测组织学水平的基因表达变化和组织变化24。这种天然免疫缺陷模型具有丰富且易于查看的血管网络，可以实时可视化测定13，31。
鹌鹑蛋壳易于打开， 卵外 栽培简单，需要较少的储存空间30.鹌鹑胚胎的发育时间很短，可以进行高周转率的实验。然而，这种快速发展在需要更多时间（例如，对于肿瘤发展和生长）的实验中可能是一个缺点，因为实验窗口最长为7天。使用鹌鹑的其他缺点之一是胚胎的更脆弱的体质及其对污染的敏感性。鹌鹑CAM的小尺寸限制了几种实验物质的应用10。
白光图像可以很好地显示更大且定义明确的肿瘤，但荧光成像对于疾病检测是一种非常有吸引力的工具，特别是对于非常小的肿瘤或肿瘤细胞簇32，可能用于可视化病变的边缘。在肿瘤区域观察到更高的光敏剂积累，因此光动力诊断在早期定位或手术切除期间非常有用。滤光片也用于正确获取图像32;然而，在本案中，这些照片是在没有特殊滤镜的情况下拍摄的。这种成像（无阻断系统）的使用例如用于膀胱肿瘤和神经胶质瘤的内窥镜检查和PDD，因此具有合适的临床应用。
尽管存在一些缺点，但日本鹌鹑CAM测定是新型药物测试和开发新的生物光子技术以及光动力诊断和治疗的绝佳工具。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了VEGA 2/0042/21和APVV 20-0129的支持。V. Huntošová的贡献是项目实施的结果：现代医学跨学科研究的开放科学社区（缩写：OPENMED），ITMS2014+：313011V455，由ERDF资助的运营计划综合基础设施支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
| CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
| digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
| diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
| eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| incubator Bios Midi | Bios Sedl any, Czech Republic |
Forced draught incubator for initial incubation | |
| incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
| Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
| LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
| macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
| microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
| microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
| scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
| software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
| stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
| stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |
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