Summary
Aqui, descrevemos a produção em larga escala de esferoides esferoides de células-tronco derivados de adiposos (ASC) usando um sistema automatizado de pipetização para semear a suspensão celular, garantindo assim a homogeneidade do tamanho e forma de spheroid. Estes esferoides ASC podem ser usados como blocos de construção para abordagens de bioimpressão 3D.
Abstract
Células-tronco/estromenas derivadas de adiposos (ASCs) são uma subpopulação de células encontradas na fração vascular estromada do tecido adiposo subcutâneo humano reconhecido como uma fonte clássica de células mesenquimais estromicas/tronco. Muitos estudos foram publicados com ASCs para abordagens de engenharia de tecidos baseadas em andaimes, que exploraram principalmente o comportamento dessas células após sua semeadura em andaimes bioativos. No entanto, abordagens livres de andaimes estão surgindo para projetar tecidos in vitro e in vivo, principalmente usando esferoides, para superar as limitações das abordagens baseadas em andaimes.
Os spheróides são microtissues 3D formados pelo processo de auto-montagem. Eles podem imitar melhor a arquitetura e o microambiente dos tecidos nativos, principalmente devido à ampliação das interações de matriz celular-célula e célula-extracelular. Recentemente, os esferoides estão sendo explorados principalmente como modelos de doenças, estudos de rastreamento de medicamentos e blocos de construção para bioimpressão 3D. No entanto, para abordagens de bioimpressão 3D, numerosos esferoides, homogêneos em tamanho e forma, são necessários para biofabricar tecidos complexos e modelos de órgãos. Além disso, quando os esferoides são produzidos automaticamente, há pouca chance de contaminação microbiológica, aumentando a reprodutibilidade do método.
A produção em larga escala de esferoides é considerada o primeiro passo obrigatório para o desenvolvimento de uma linha de biofabricação, que continua no processo de bioimpressão 3D e termina na maturação total do tecido construído em bioreatores. No entanto, o número de estudos que exploraram a produção de spheroid ASC em larga escala ainda são escassos, juntamente com o número de estudos que usaram esferoides ASC como blocos de construção para bioimpressão 3D. Portanto, este artigo tem como objetivo mostrar a produção em larga escala de esferoides ASC usando uma técnica de hidrogel micromoldado não adesivo que espalha os esferoides ASC como blocos de construção para abordagens de bioimpressão 3D.
Introduction
Os spheróides são considerados uma abordagem livre de andaimes na engenharia de tecidos. AsCs são capazes de formar esferoides pelo processo de auto-montagem. A microarquitetura 3D do spheroid aumenta o potencial regenerativo das ASCs, incluindo a capacidade de diferenciação em várias linhagens 1,2,3. Este grupo de pesquisa tem trabalhado com esferoides ASC para engenharia de cartilagem e tecido ósseo 4,5,6. Mais importante, os esferoides são considerados blocos de construção na biofabricação de tecidos e órgãos, principalmente devido à sua capacidade de fusão.
O uso de esferoides para formação de tecidos depende de três pontos principais: (1) o desenvolvimento de métodos robóticos padronizados e escaláveis para sua biofabricação7, (2) o fenotipagem sistemática dos esferoides teciduais8, (3) o desenvolvimento de métodos para a montagem de tecidos 3D9. Esses esferoides podem ser formados com diferentes tipos de células e obtidos através de vários métodos, incluindo queda de suspensão, reagregação, microfluidos e micromedes 8,9,10. Cada um desses métodos possui vantagens e desvantagens relacionadas à homogeneidade de tamanho e forma dos esferoides, recuperação dos esferoides após a formação, número de esferoides produzidos, automação de processos, intensidade de mão-de-obra e custos11.
No método micromold, as células são dispensadas e depositadas na parte inferior do micromold por causa da gravidade. O hidrogel não adesivo não permite que as células aderam ao fundo, e interações célula-célula levam à formação de uma única recessão por perifóide 8,12. Este método de biofabricação gera esferoides de tamanho homogêneo e controlado, pode ser robotizado para produção em larga escala de forma eficiente com esforço mínimo, e tem bons fatores críticos de custo-efetividade no projeto de uma biofabricação de tecido spheroid 7,8. Este método pode ser aplicado para formar esferoides de qualquer linhagem celular para preparar um novo tipo de tecido com características previsíveis, ótimas e controláveis8.
A biofabização é definida como "a geração automatizada de produtos biologicamente funcionais com organização estrutural..."13. Portanto, a produção automatizada de esferoides é considerada o primeiro passo obrigatório para o desenvolvimento de uma linha de biofabricação, que continua no processo de bioimpressão 3D e termina na maturação total do tecido bioimpresso pela fusão esferoide. Neste estudo, para melhorar a escalabilidade da biofabricação esferoide ASC, utilizamos um sistema automatizado de pipetização para semear a suspensão celular, garantindo assim a homogeneidade do tamanho e forma de spheroid. Este artigo mostra que foi possível produzir um grande número (milhares) de esferoides necessários para abordagens de bioimpressão 3D para biofabricar modelos de tecidos mais complexos.
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Protocol
Os ASCs utilizados neste estudo foram previamente isolados de doadores humanos saudáveis e criopreservados conforme descrito14 segundo o Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro( 25818719.4.0000.5257). Consulte Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e equipamentos utilizados neste estudo.
1. Trypsinização da monocamada ASC na passagem três
- Abra a cultura tecidual 175 cm2 frasco contendo a monocamadas de ASCs a 80% de confluência e descarte o supernatante.
- Adicione 7 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS, 0,01 M) e lave a monocamada duas vezes. Em seguida, descarte o líquido.
- Adicione 5 mL de 0,125% de trippsina com ácido 0,78 mM etilenodiaminetetraacético (EDTA). Em seguida, incubar por 5 min a 37 °C.
- Adicione 10 mL de baixa glicose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) com 10% de soro bovino fetal (FBS) à cultura tecidual 175 cm2 frasco e misture bem a suspensão celular com uma pipeta sorológica de 10 mL.
- Colde a suspensão celular com uma pipeta sorológica de 10 mL e transfira-a para um tubo de centrífuga de 50 mL. Em seguida, centrífuga a 400 × g por 5 min para obter a pelota de ASCs. Resuspende a pelota de célula usando DMEM LOW contendo 10% de FBS.
- Realize uma contagem de células por exclusão de tripano.
- Após a contagem, pegue um total de 1 × 106 ASCs em um tubo de centrífuga separado de 15 mL para semear as 81 recessões micromoed com hidrogel não aderente (um total de 10.000 células/mL semeadas aqui). Para semear 256 recessões de hidrogel micromoedido não aderente, leve um total de 5 × 105 ASCs em um tubo de centrífuga (um total de 2.500 células/mL semeadas aqui).
2. Fabricação de hidrogel agarose não aderente micromoeda
- Prepare 50 mL de uma solução estéril de 2% de agarose ultrapure em 0,9% NaCl em água ultrauso. Autoclave a solução por 30 min a 121 °C.
- Adicione 500 μL de solução de agarose ultrapure de 2% estéril no centro de um molde de silicone contendo 81 ou 256 recessos circulares.
- Depois de 40 min, desenforme a agarose ultrapure do molde de silicone e colocá-lo em um poço de uma placa de plástico de 12 poços.
- Adicione 2 mL de DMEM LOW no poço com a ágarose micromoldada e incubar em uma incubadora a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5% por pelo menos 12 h antes de semear os ASCs.
3. Biofabricação de spheróides ASC usando o sistema automatizado de pipetização
- Confira a seguir:
- Verifique se o fluxo laminar está ligado e o fluxo de ar do gabinete está funcionando corretamente.
- Verifique se o equipamento está conectado à tensão correta.
- Verifique se o tablet está conectado ao equipamento.
- Verifique se a altura do vidro de proteção do armário está na mesma altura que a marcação do sensor do equipamento.
- Pressione o botão Ligar/Desligar no lado esquerdo do equipamento e aguarde o tablet e o equipamento para iniciar.
- Posicione as caixas de ponta, o rack para tubos de centrífugas e a placa contendo o hidrogel de agarose micromoldado no espaço de trabalho do equipamento.
- No tablet com o software aberto, primeiro clique no Labware Editor.
- Configure uma mesa de trabalho virtual e escolha as posições das pipetas, caixas de ponta, o rack para os tubos de plástico e as placas.
NOTA: A mesa de trabalho virtual deve representar as posições físicas dos acessórios no equipamento. - Clique no botão Switch to Produce para incluir os parâmetros (ver passo 3.10) e comandos que o equipamento realizará durante todo o experimento. Aguarde uma barra de ferramentas e uma Lista de Produtos para abrir no software.
- Inicialmente, para indicar os comandos, inclua o número de amostras a serem pipetadas e arraste-as para a Lista de Produtos.
NOTA: O número de amostras é o número de tubos de centrífugas plásticas contendo a suspensão ASC a ser semeada no centro dos micromedes. - Depois de inserir o número de amostras, clique no botão de comando Transferência de amostra no software para transferir a suspensão ASC para os poços da placa de 12 poços, contendo os micromedes, e arraste-a para a Lista de Produtos.
- Clique em Propriedades para configurar as posições de início e extremidade para o equipamento transferir a amostra.
- Aguarde que o software retorne à página Tabela de Trabalho . Clique no botão Opções para configurar os parâmetros para semeadura automatizada das ASCs: i) Velocidade de aspiração de 15,4 s-1; ii) Dispensar velocidade de 1 s-1; iii) Blow Delay de 0 ms; iv) Velocidade de estouro de 15,4 s-1; v) Curso inicial de 100%.. Selecione Água como o tipo líquido padrão.
- Configurar os parâmetros para misturar as ASCs para obter uma suspensão homogênea: i) Número de Ciclos de 5; ii) Velocidade de 6,5 s-1; iii) Volume de 300 μL.
- Após a configuração dos parâmetros, adicione o tempo de 40 minutos à Lista de Produtos.
NOTA: Este tempo é necessário para esperar que a suspensão asc decante na parte inferior do micromold. - Na Lista de Produtos, inclua a opção Transferência de Reagente para transferir o meio de cultura esferoide para os poços correspondentes da placa.
- Repita as etapas 3.9-3.11 para configurar as configurações de posição e parâmetro para transferir o meio de cultura esferoide.
- Clique no botão com um símbolo de verificação na barra superior do software para garantir que não haja erro de programação.
- Clique no botão Reproduzir (com um símbolo de triângulo) na barra superior do software para iniciar o programa.
- Que o equipamento comece, como programado, e aguarde que ele faça um som, indicando que ele terminou.
- Colete a placa de 12 poços e incuba-a em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO2 por pelo menos 18 h para que os esferoides sejam completamente formados e compactos.
- Colher manualmente os esferoides após 1, 3 e 7 dias de cultura para análise. Lave manualmente o meio com uma micropipette para liberar os esferoides do hidrogel agarose microolded não-aderente.
- Após 5 min, verifique sob o microscópio para determinar se os esferoides estão completamente liberados do hidrogel agarose micromolded não-aderente.
- Colete os esferoides manualmente usando uma micropipette e transfira-os para um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Lave os esferoides pelo menos duas vezes com 0,01 M PBS. Avalie a viabilidade e realize análises biomecânicas nas amostras de esferoide frescos. Para análise de morfologia (histologia), incubar as amostras de esferoides em 4% de paraformaldeído em PBS por pelo menos 18 h a 2-8 °C.
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Representative Results
O sistema de pipeta automática pode semear a suspensão da célula ASC em 12 poços de uma placa de 12 poços em 15 minutos. Usando o hidrogel não aderente de 81 micromoldados produzirá 972 esferoides no final do protocolo. O uso do hidrogel não aderente de 256 micromoldados produzirá 3.072 esferoides no final do protocolo. Os spheróides ASC foram analisados para a homogeneidade de seu tamanho e forma. Os esferoides ASC de micromedes com 81 recessões apresentaram diâmetro homogêneo durante o período de cultura em contraste com os esferoides ASC de micromedes com 256 recessões (Figura 1C,D). A razão entre os menores e maiores diâmetros (esfericidade) foi próxima de 1 em esferoides ASC de micromedes com 81 e 256 recessões (Figura 1E,F). Os resultados das análises de viabilidade, morfologia e força (Figura 2) fornecem evidências para a produção bem-sucedida e em larga escala de esferoides ASC.
Figura 1: Os esferoides ASC apresentaram reprodutibilidade de alto diâmetro. Micrografos ópticos representativos de esferoides ASC de hidrogéis micromoldados não adesivos com (A) 81 recessões circulares e (B) 256 recessões circulares. (C,D) Diâmetro esferoide em 1, 3 e 7 dias a partir de cinco hidrogéis micromolded não adesivos com 81 e 256 recessões circulares, respectivamente. (E,F) Razão dos menores e maiores diâmetros de hidrogéis micromoldados não adesivos com 81 e 256 recessões circulares, respectivamente. Para medir os menores e maiores diâmetros dos esferoides, as imagens foram adquiridas semanalmente usando um microscópio óptico equipado com uma câmera digital. Largura e comprimento foram medidos usando o software ImageJ. Uma razão de diâmetro de cada esferoide foi obtida dividindo largura por comprimento (esfericidade esferoide). Um total de 85 esferoides foram medidos a partir de hidrogéis micromoldados e não adesivos com 81 recessões circulares, e um total de 160 esferoides foram medidos a partir de hidrogéis micromedados e não adesivos com 256 recessões circulares. Os dados são expressos como ± desvio padrão. Os asteriscos indicam valores de P obtidos pela ANOVA não paramétrica e não foi seguida por múltiplas comparações (**P < 0,001; ****P < 0,0001). Barras de escala = 100 μm. Abreviação: ASC = tecido adiposo/células estromicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Os esferoides ASC apresentaram alta viabilidade celular. (A) Micrografos de fluorescência de ensaio de viabilidade de esferoides ASC no dia 7 de hidrogéis micromoldados e não adesivos com 256 recessões circulares. Células vivas e mortas são observadas em verde e vermelho, respectivamente. O controle da morte é mostrado no início. (B) Seção de um esferoide ASC manchado por hematoxilina e eosina de hidrogéis micromoedos e não adesivos com 81 recessões circulares. As amostras de esferoides fixos foram incorporadas em parafina, e as amostras foram cortadas em seções de espessura de 5 μm usando um microtome. (C) Força de resistência compressiva medida em μN de esferoides ASC no dia 7. Os dados foram coletados de cinco esferoides e expressos como ± desvio padrão médio, conforme metodologia descrita anteriormente5. Os asteriscos indicam o valor de P obtido por ANOVA bidirecional, não paramétrico e não remunerado, seguido de múltiplas comparações. Barras de escala = 50 μm. Abreviação: ASC = tecido adiposo/células estromicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo apresenta a geração em larga escala de esferoides ASC usando um sistema automatizado de pipetas. O passo crítico do protocolo é configurar precisamente o software para garantir o volume correto de suspensão, velocidade e distância da célula para a tubulação. Os parâmetros descritos no protocolo foram determinados após uma série de ensaios para otimizar a dispensa da suspensão da célula ASC nos poços de placas de 12 poços contendo os hidrogéis micromoedos e não aderentes. A otimização foi avaliada medindo o diâmetro e a esferofericidade dos esferoides. A área e a altura dos hidrogéis não aderentes micromoedos foram utilizados para calcular a velocidade ideal para dispensar a suspensão celular. Se a suspensão da célula for semeada pelo equipamento a uma velocidade de distribuição diferente, isso afetará diretamente a formação dos esferoides. Portanto, estes são parâmetros cruciais para serem otimizados após testes com o equipamento. Este protocolo tem algumas limitações. Somente a semeadura dos ASCs no hidrogel não aderente no micromold pode ser automatizada, seguida pela adição do meio de cultura celular. As características do sistema são limitadas pela versão do equipamento e do software. No entanto, a principal vantagem dessa abordagem reprodutível é produzir até 3.072 esferoides ASC homogêneos em tamanho e forma e viáveis com pequenos riscos de erros humanos ou contaminação. O grande número de esferoides ASC biofabricados pode ser carregado diretamente em uma bioimpressora 3D para produzir modelos de tecido mais complexos.
Em geral, é amplamente conhecido que a pipetação precisa e automatizada desempenha um papel central na automação da cultura celular. Sistemas automatizados de cultura celular permitem a produção em larga escala e aumentam a precisão técnica, a reprodutibilidade e a eficiência do processo15. Portanto, sistemas automatizados podem facilitar a produção em larga escala, o que é comum e benéfico para ambientes industriais16,17. No entanto, há poucos estudos descrevendo o desenvolvimento de protocolos para automatizar sistemas de cultura celular 3D 7,18,19,20,21.
Mehesz e os colaboradores7 e Meseguer-Ripolles e seus colegas21 usaram um protocolo semelhante para biofabricar os esferoides ASC. No estudo de Mehesz et al.7, os autores utilizaram o mesmo sistema automatizado de pipetização. No entanto, seu protocolo produziu apenas 96 esferoides, enquanto o protocolo desenvolvido no presente trabalho foi capaz de produzir até 3.072 esferoides ASC ao mesmo tempo, homogêneos em tamanho e forma. Meseguer-Ripolles et al.21 também usaram um sistema automatizado de pipetização para produzir até 73 esferoides hepáticos. Outra abordagem que está sendo discutida para fabricar esferoides em larga escala hoje em dia é através de dispositivos microfluidos. No entanto, os artigos publicados até agora exploraram a tecnologia para desenvolver melhores dispositivos que possam produzir os esferoides em vez de aumentar a escala para a fabricação de esferoides 7,20.
Outro método que pode ser usado para fabricar um alto número de esferoides é usando frascos rotadores. No entanto, uma questão principal em relação a essa técnica é a dificuldade em controlar o tamanho e a forma dos esferoides22,23. Além disso, a bioimpressão 3D também já foi aplicada aos esferoides biofabricados em larga escala. No estudo de Daly e Kelly19, os autores utilizaram uma técnica de jato de tinta para produzir um grande número de esferoides em microchambers de policaprolactona. Os esferoides eram viáveis e homogêneos em tamanho e forma.
A principal aplicação do protocolo descrito neste trabalho é biofabricar os esferoides ASC em larga escala necessários para a bioimpressão 3D. Como discutido por Mironov e colaboradores24, milhares de esferoides serão necessários para biofabricar tecidos complexos e modelos de órgãos. O método automatizado descrito neste protocolo permitirá a fabricação de um grande número de esferoides ASC que podem ser carregados diretamente na bioimpressora 3D. Também é possível diferenciar esses esferoides a um caminho mesodérmico desejado para projetar tecidos musculoesqueléticos. De Moor e colaboradores25 desenvolveram um método de alta produtividade para fabricar um grande número de esferoides de tamanho vascular para futuras aplicações de bioimpressão 3D.
O equipamento pode ser modificado para melhorar o protocolo. Versões mais recentes do equipamento permitem o uso de um número maior de placas, o que poderia aumentar o número de esferoides ASC produzidos. Esta mesma versão recente permite o empilhamento preciso das placas, e isso também proporcionaria uma melhor eficiência do protocolo. Em conclusão, mostramos com sucesso um protocolo que permite a biofabricação de até 3.072 esferoides ASC homogêneos em tamanho e forma em 15 min, e que este é considerado o primeiro passo para construir uma linha de biofabricação para aplicações de Engenharia de Tecidos.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos ao Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO, RJ) pelo uso de suas instalações. Este estudo foi parcialmente apoiado pela Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (Faperj) (Código financeiro: E26/202.682/2018 e E-26/010.001771/2019, o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (código financeiro: 307460/2019-3) e o Escritório de Pesquisa Naval (ONR) (código financeiro: N62909-21-1-2091). Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo Centro Nacional de Ciência e Tecnologia em Medicina Regenerativa-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
References
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