Summary
Qui, descriviamo la produzione su larga scala di sferoidi stromali / cellule staminali (ASC) di derivazione adiposa utilizzando un sistema di pipettaggio automatizzato per seminare la sospensione cellulare, garantendo così l'omogeneità delle dimensioni e della forma dello sferoide. Questi sferoidi ASC possono essere utilizzati come elementi costitutivi per approcci di bioprinting 3D.
Abstract
Le cellule stromali/staminali di derivazione adiposa (ASC) sono una sottopopolazione di cellule presenti nella frazione vascolare stromale del tessuto adiposo sottocutaneo umano riconosciuta come fonte classica di cellule stromali/staminali mesenchimali. Molti studi sono stati pubblicati con ASC per approcci di ingegneria tissutale basati su scaffold, che hanno esplorato principalmente il comportamento di queste cellule dopo la loro semina su scaffold bioattivi. Tuttavia, stanno emergendo approcci senza impalcature per ingegnerizzare i tessuti in vitro e in vivo, principalmente utilizzando sferoidi, per superare i limiti degli approcci basati su scaffold.
Gli sferoidi sono microtessuti 3D formati dal processo di auto-assemblaggio. Possono imitare meglio l'architettura e il microambiente dei tessuti nativi, principalmente a causa dell'ingrandimento delle interazioni cellula-cellula e cellula-cellula-matrice extracellulare. Recentemente, gli sferoidi vengono esplorati principalmente come modelli di malattia, studi di screening farmacologico e elementi costitutivi per la bioprinting 3D. Tuttavia, per gli approcci di bioprinting 3D, sono necessari numerosi sferoidi, omogenei per dimensioni e forma, per biofabbricare modelli complessi di tessuti e organi. Inoltre, quando gli sferoidi vengono prodotti automaticamente, ci sono poche possibilità di contaminazione microbiologica, aumentando la riproducibilità del metodo.
La produzione su larga scala di sferoidi è considerata il primo passo obbligatorio per lo sviluppo di una linea di biofabbricazione, che continua nel processo di bioprinting 3D e termina nella piena maturazione del costrutto tissutale nei bioreattori. Tuttavia, il numero di studi che hanno esplorato la produzione di sferoidi ASC su larga scala sono ancora scarsi, insieme al numero di studi che hanno utilizzato gli sferoidi ASC come elementi costitutivi per la bioprinting 3D. Pertanto, questo articolo mira a mostrare la produzione su larga scala di sferoidi ASC utilizzando una tecnica di idrogel microstampato non adesiva che diffonde sferoidi ASC come elementi costitutivi per approcci di bioprinting 3D.
Introduction
Gli sferoidi sono considerati un approccio privo di impalcature nell'ingegneria tissutale. Gli ASC sono in grado di formare sferoidi dal processo di auto-assemblaggio. La microarchitettura 3D dello sferoide aumenta il potenziale rigenerativo delle ASC, compresa la capacità di differenziazione in più lignaggi 1,2,3. Questo gruppo di ricerca ha lavorato con sferoidi ASC per l'ingegneria della cartilagine e del tessuto osseo 4,5,6. Ancora più importante, gli sferoidi sono considerati elementi costitutivi nella biofabbricazione di tessuti e organi, principalmente a causa della loro capacità di fusione.
L'uso di sferoidi per la formazione dei tessuti dipende da tre punti principali: (1) lo sviluppo di metodi robotici standardizzati e scalabili per la loro biofabbricazione7, (2) la fenotipizzazione sistematica degli sferoidi tissutali8, (3) lo sviluppo di metodi per l'assemblaggio di tessuti 3D9. Questi sferoidi possono essere formati con diversi tipi di cellule e ottenuti attraverso vari metodi, tra cui hanging drop, reaggregazione, microfluidica e micromole 8,9,10. Ognuno di questi metodi presenta vantaggi e svantaggi legati all'omogeneità delle dimensioni e della forma degli sferoidi, al recupero degli sferoidi dopo la formazione, al numero di sferoidi prodotti, all'automazione del processo, all'intensità del lavoro e ai costi11.
Nel metodo micromold, le cellule vengono erogate e depositate sul fondo del micromold a causa della gravità. L'idrogel non adesivo non consente alle cellule di aderire al fondo e le interazioni cellula-cellula portano alla formazione di un singolo sferoide per recessione 8,12. Questo metodo di biofabbricazione genera sferoidi di dimensioni omogenee e controllate, può essere robotizzato per la produzione su larga scala in modo efficiente in termini di tempo con il minimo sforzo e ha buoni fattori critici in termini di economicità nella progettazione di una biofabbricazione di tessuto sferoide 7,8. Questo metodo può essere applicato per formare sferoidi di qualsiasi lignaggio cellulare per preparare un nuovo tipo di tessuto con caratteristiche prevedibili, ottimali e controllabili8.
La biofabbricazione è definita come "la generazione automatizzata di prodotti biologicamente funzionali con organizzazione strutturale ..."13. Pertanto, la produzione automatizzata di sferoidi è considerata il primo passo obbligatorio per lo sviluppo di una linea di biofabbricazione, che continua nel processo di bioprinting 3D e termina nella piena maturazione del tessuto biostampato mediante fusione sferoide. In questo studio, per migliorare la scalabilità della biofabbricazione sferoide ASC, utilizziamo un sistema di pipettaggio automatizzato per seminare la sospensione cellulare, garantendo così l'omogeneità delle dimensioni e della forma dello sferoide. Questo documento mostra che è stato possibile produrre un gran numero (migliaia) di sferoidi necessari per gli approcci di bioprinting 3D per biofabbricare modelli di tessuto più complessi.
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Protocol
Gli ASC utilizzati in questo studio erano precedentemente isolati da donatori umani sani e crioconservati come descritto14 secondo il Comitato etico di ricerca dell'Ospedale Universitario Clementino Fraga Filho, Università Federale di Rio de Janeiro, Brasile (25818719.4.0000.5257). Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e le attrezzature utilizzate in questo studio.
1. Tripsinizzazione del monostrato ASC al passaggio tre
- Aprire la coltura tissutale di 175 cm2 matraccio contenente il monostrato di ASC all'80% di confluenza ed eliminare il surnatante.
- Aggiungere 7 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, 0,01 M) e lavare il monostrato due volte. Quindi, scartare il liquido.
- Aggiungere 5 ml di tripsina allo 0,125% con 0,78 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Quindi, incubare per 5 minuti a 37 °C.
- Aggiungere 10 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) a basso contenuto di glucosio con siero bovino fetale al 10% (FBS) alla coltura tissutale di 175 cm2 e mescolare bene la sospensione cellulare con una pipetta sorologica da 10 mL.
- Raccogliere la sospensione cellulare con una pipetta sierologica da 10 mL e trasferirla in un tubo centrifuga da 50 mL. Successivamente, centrifugare a 400 × g per 5 minuti per ottenere il pellet di ASC. Risospesso il pellet cellulare utilizzando DMEM LOW contenente il 10% di FBS.
- Eseguire un conteggio delle celle mediante esclusione del tripano.
- Dopo il conteggio, prendi un totale di 1 × 106 ASC in un tubo centrifugo separato da 15 ml per seminare le 81 recessioni microstampate con idrogel non aderente (un totale di 10.000 cellule / mL seminate qui). Per seminare 256 recessioni di idrogel microstampato non aderente, prendere un totale di 5 × 105 ASC in un tubo centrifugo (un totale di 2.500 cellule / mL seminati qui).
2. Fabbricazione di idrogel di agarosio non aderente microstampato
- Preparare 50 ml di una soluzione sterile di agarosio ultrapuro al 2% in NaCl allo 0,9% in acqua ultrapura. Autoclave della soluzione per 30 min a 121 °C.
- Aggiungere 500 μL di soluzione sterile di agarosio ultrapuro al 2% al centro di uno stampo in silicone contenente 81 o 256 recessi circolari.
- Dopo 40 minuti, sformare l'agarosio ultrapuro dallo stampo in silicone e metterlo in un pozzetto di una piastra di plastica a 12 pozzetti.
- Aggiungere 2 ml di DMEM LOW nel pozzo con l'agarosio microstampato e incubare in un incubatore a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5% per almeno 12 ore prima di seminare le ASC.
3. Biofabbricazione di sferoidi ASC mediante il sistema di pipettaggio automatizzato
- Verificare quanto segue:
- Controllare se il flusso laminare è attivo e il flusso d'aria dell'armadio funziona correttamente.
- Verificare se l'apparecchiatura è collegata alla tensione corretta.
- Verificare se il tablet è collegato all'apparecchiatura.
- Verificare se l'altezza del vetro di protezione dell'armadio è alla stessa altezza della marcatura del sensore dell'apparecchiatura.
- Premere il pulsante On/Off sul lato sinistro dell'apparecchiatura e attendere l'avvio del tablet e dell'apparecchiatura.
- Posizionare le scatole di punta, il rack per i tubi della centrifuga e la piastra contenente l'idrogel di agarosio microstampato nello spazio di lavoro dell'apparecchiatura.
- Sul tablet con il software aperto, fare prima clic su Labware Editor.
- Imposta un tavolo da lavoro virtuale e scegli le posizioni delle pipette, delle scatole di punta, del rack per i tubi di plastica e delle piastre.
NOTA: il tavolo di lavoro virtuale deve rappresentare le posizioni fisiche degli accessori nell'apparecchiatura. - Fare clic sul pulsante Passa a produrre per includere i parametri (vedere il passaggio 3.10) e i comandi che l'apparecchiatura eseguirà durante l'esperimento. Attendere che una barra degli strumenti e un elenco di prodotti si aprano nel software.
- Inizialmente, per indicare i comandi, includere il numero di campioni da pipettare e trascinarlo nell'elenco di produzione.
NOTA: Il numero di campioni è il numero di tubi di centrifuga in plastica contenenti la sospensione ASC da seminare al centro dei microstampi. - Dopo aver inserito il numero di campioni, fare clic sul pulsante di comando Sample Transfer sul software per trasferire la sospensione ASC nei pozzetti della piastra a 12 pozzetti, contenente i micromolghi, e trascinarla nell'elenco dei prodotti.
- Fare clic su Proprietà per impostare le posizioni iniziale e finale per l'apparecchiatura per trasferire il campione.
- Attendere che il software torni alla pagina Tabella di lavoro . Fare clic sul pulsante Opzioni per impostare i parametri per il seeding automatico degli ASC: i) Velocità di aspirazione di 15,4 s-1; ii) Velocità di erogazione di 1 s-1; iii) Ritardo di soffiaggio di 0 ms; iv) Velocità di soffiaggio di 15,4 s-1; v) Corsa iniziale del 100%. Selezionare Acqua come tipo di liquido standard.
- Impostare i parametri per miscelare gli ASC per ottenere una sospensione omogenea: i) Numero di Cicli di 5; ii) Velocità di 6,5 s-1; iii) Volume di 300 μL.
- Dopo aver impostato i parametri, aggiungere il tempo di 40 minuti all'elenco dei prodotti.
NOTA: questo tempo è necessario attendere che la sospensione ASC decantare nella parte inferiore del microstampo. - Nell'elenco dei prodotti, includere l'opzione Trasferimento reagente per trasferire il terreno di coltura sferoide ai corrispondenti pozzetti della piastra.
- Ripetere i passaggi 3.9-3.11 per impostare le configurazioni di posizione e parametri per trasferire il terreno di coltura sferoide.
- Fare clic sul pulsante con un simbolo di controllo sulla barra superiore del software per assicurarsi che non vi siano errori di programmazione.
- Fare clic sul pulsante Riproduci (con il simbolo di un triangolo) nella barra superiore del software per avviare il programma.
- Lascia che l'apparecchiatura si avvii, come programmato, e attendi che emetta un suono, indicando che è finita.
- Raccogliere la piastra a 12 pozzetti e incubarla in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per almeno 18 ore affinché gli sferoidi siano completamente formati e compatti.
- Raccogliere manualmente gli sferoidi dopo 1, 3 e 7 giorni di coltura per l'analisi. Lavare manualmente il mezzo con una micropipetta per liberare gli sferoidi dall'idrogel di agarosio non aderente microstampato.
- Dopo 5 minuti, controllare al microscopio per determinare se gli sferoidi sono completamente rilasciati dall'idrogel di agarosio non aderente microstampato.
- Raccogliere manualmente gli sferoidi utilizzando una micropipetta e trasferirli in un tubo centrifugo da 15 ml.
- Lavare gli sferoidi almeno due volte con 0,01 M PBS. Valutare la fattibilità ed eseguire analisi biomeccaniche sui campioni sferoidi freschi. Per l'analisi morfologica (istologia), incubare i campioni di sferoidi in paraformaldeide al 4% in PBS per almeno 18 ore a 2-8 °C.
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Representative Results
Il sistema di pipette automatiche può seminare la sospensione della cella ASC in 12 pozzetti di una piastra a 12 pozzetti in 15 minuti. L'utilizzo dell'idrogel non aderente 81 microstampato produrrà 972 sferoidi alla fine del protocollo. L'utilizzo di 256 idrogel non aderenti microstampato produrrà 3.072 sferoidi alla fine del protocollo. Gli sferoidi ASC sono stati analizzati per l'omogeneità delle loro dimensioni e forma. Gli sferoidi ASC dei microstidi con 81 recessioni hanno mostrato un diametro omogeneo durante il periodo di coltura in contrasto con gli sferoidi ASC dei microstridi con 256 recessioni (Figura 1C, D). Il rapporto tra i diametri più piccoli e più grandi (sfericità) era vicino a 1 negli sferoidi ASC da micromole con 81 e 256 recessioni (Figura 1E, F). I risultati delle analisi di vitalità, morfologia e forza (Figura 2) forniscono prove del successo della produzione su larga scala di sferoidi ASC.
Figura 1: Gli sferoidi ASC hanno mostrato una riproducibilità ad alto diametro. Micrografie ottiche rappresentative di sferoidi ASC da idrogel non adesivi microstampati con (A) 81 recessioni circolari e (B) 256 recessioni circolari. (C,D) Diametro sferoidale a 1, 3 e 7 giorni da cinque idrogel non adesivi microstampati con 81 e 256 recessioni circolari, rispettivamente. (E,F) Rapporto tra i diametri più piccoli e più grandi da idrogel non adesivi microstampati con 81 e 256 recessioni circolari, rispettivamente. Per misurare i diametri più piccoli e più grandi degli sferoidi, le immagini sono state acquisite settimanalmente utilizzando un microscopio ottico dotato di una fotocamera digitale. Larghezza e lunghezza sono state misurate utilizzando il software ImageJ. Un rapporto di diametro di ciascun sferoide è stato ottenuto dividendo la larghezza per la lunghezza (sfericità sferoide). Un totale di 85 sferoidi sono stati misurati da idrogel microstampati e non adesivi con 81 recessioni circolari e un totale di 160 sferoidi sono stati misurati da idrogel microstampati e non adesivi con 256 recessioni circolari. I dati sono espressi come deviazione media ± standard. Gli asterischi indicano valori di P ottenuti da ANOVA non parametrici e non accoppiati seguiti da confronti multipli (**P < 0,001; ****P < 0,0001). Barre di scala = 100 μm. Abbreviazione: ASC = cellule staminali/stromali del tessuto adiposo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Gli sferoidi ASC hanno mostrato un'elevata vitalità cellulare. (A) Micrografie a fluorescenza del saggio di vitalità degli sferoidi ASC al giorno 7 da idrogel microstampati e non adesivi con 256 recessioni circolari. Le cellule vive e morte sono osservate rispettivamente in verde e rosso. Il controllo della morte è mostrato nell'inserto. (B) Sezione di uno sferoide ASC colorato con ematossilina ed eosina da idrogel microstampati e non adesivi con 81 recessioni circolari. I campioni di sferoidi fissi sono stati incorporati nella paraffina e i campioni sono stati tagliati in sezioni di spessore di 5 μm utilizzando un microtomo. (C) Forza di resistenza alla compressione misurata in μN di sferoidi ASC al giorno 7. I dati sono stati raccolti da cinque sferoidi ed espressi come deviazione media ± standard, secondo la metodologia precedentemente descritta5. Gli asterischi indicano il valore di P ottenuto da ANOVA bidirezionale, non parametrico e non accoppiato, seguito da confronti multipli. Barre di scala = 50 μm. Abbreviazione: ASC = cellule staminali/stromali del tessuto adiposo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo documento presenta la generazione su larga scala di sferoidi ASC utilizzando un sistema di pipette automatizzato. Il passaggio critico del protocollo è quello di impostare con precisione il software per garantire il corretto volume di sospensione della cella, la velocità e la distanza per il pipettaggio. I parametri descritti nel protocollo sono stati determinati dopo una serie di prove per ottimizzare l'erogazione della sospensione cellulare ASC nei pozzetti di piastre a 12 pozzetti contenenti gli idrogel microstampati e non aderenti. L'ottimizzazione è stata valutata misurando il diametro e la sfericità degli sferoidi. L'area e l'altezza degli idrogel non aderenti microstampati sono state utilizzate per calcolare la velocità ideale per erogare la sospensione cellulare. Se la sospensione cellulare viene seminata dall'apparecchiatura a una velocità di erogazione diversa, ciò influenzerà direttamente la formazione degli sferoidi. Quindi, questi sono parametri cruciali da ottimizzare dopo le prove con l'apparecchiatura. Questo protocollo presenta alcune limitazioni. Solo la semina delle ASC nell'idrogel non aderente nel microstampe può essere automatizzata, seguita dall'aggiunta del terreno di coltura cellulare. Le caratteristiche del sistema sono limitate dalla versione dell'apparecchiatura e del software. Tuttavia, il vantaggio principale di questo approccio riproducibile è quello di produrre fino a 3.072 sferoidi ASC - omogenei per dimensioni e forma e vitali - con rischi minori di errori umani o contaminazione. Il gran numero di sferoidi ASC biofabbricati può essere caricato direttamente in un bioprinter 3D per produrre modelli di tessuto più complessi.
In generale, è ampiamente noto che il pipettaggio accurato e automatizzato svolge un ruolo centrale nell'automazione della coltura cellulare. I sistemi automatizzati di coltura cellulare consentono la produzione su larga scala e aumentano l'accuratezza tecnica, la riproducibilità e l'efficienza del processo15. Pertanto, i sistemi automatizzati possono facilitare la produzione su larga scala, che è comune e vantaggiosa per gli ambienti industriali16,17. Tuttavia, ci sono pochi studi che descrivono lo sviluppo di protocolli per automatizzare i sistemi di coltura cellulare 3D 7,18,19,20,21.
Mehesz e collaboratori7 e Meseguer-Ripolles e colleghi21 hanno usato un protocollo simile per biofabbricare gli sferoidi ASC. Nello studio di Mehesz et al.7, gli autori hanno utilizzato lo stesso sistema di pipettaggio automatizzato. Tuttavia, il loro protocollo ha prodotto solo 96 sferoidi, mentre il protocollo sviluppato nel presente lavoro è stato in grado di produrre fino a 3.072 sferoidi ASC contemporaneamente, omogenei per dimensioni e forma. Meseguer-Ripolles et al.21 hanno anche utilizzato un sistema di pipettaggio automatizzato per produrre fino a 73 sferoidi epatici. Un altro approccio in discussione per fabbricare sferoidi su larga scala al giorno d'oggi è tramite dispositivi di microfluidica. Tuttavia, gli articoli pubblicati finora hanno esplorato la tecnologia per sviluppare dispositivi migliori in grado di produrre gli sferoidi piuttosto che aumentare la scala per la fabbricazione di sferoidi 7,20.
Un altro metodo che può essere utilizzato per fabbricare un numero elevato di sferoidi è l'uso di fiaschi spinner. Tuttavia, un problema principale per quanto riguarda questa tecnica è la difficoltà nel controllare le dimensioni e la forma degli sferoidi22,23. Inoltre, il bioprinting 3D è già stato applicato agli sferoidi biofabbricati su larga scala. Nello studio di Daly e Kelly19, gli autori hanno utilizzato una tecnica a getto d'inchiostro per produrre un gran numero di sferoidi in microcamere di policaprolattone. Gli sferoidi erano vitali e omogenei per dimensioni e forma.
L'applicazione principale del protocollo descritto in questo lavoro è quella di biofabbricare gli sferoidi ASC su larga scala necessari per il bioprinting 3D. Come discusso da Mironov e collaboratori24, migliaia di sferoidi saranno necessari per biofabbricare tessuti complessi e modelli di organi. Il metodo automatizzato descritto in questo protocollo consentirà la fabbricazione di un gran numero di sferoidi ASC che possono essere caricati direttamente nel bioprinter 3D. È anche possibile differenziare questi sferoidi in un percorso mesodermico desiderato per ingegnerizzare i tessuti muscoloscheletrici. De Moor e collaboratori25 hanno sviluppato un metodo ad alta produttività per fabbricare un gran numero di sferoidi vascolarizzati per future applicazioni di bioprinting 3D.
L'apparecchiatura può essere modificata per migliorare il protocollo. Versioni più recenti dell'apparecchiatura consentono l'uso di un numero maggiore di piastre, che potrebbero aumentare il numero di sferoidi ASC prodotti. Questa stessa versione recente consente l'impilamento accurato delle piastre, e questo fornirebbe anche una migliore efficienza del protocollo. In conclusione, abbiamo mostrato con successo un protocollo che consente la biofabbricazione fino a 3.072 sferoidi ASC omogenei per dimensioni e forma in 15 minuti, e che questo è considerato il primo passo per costruire una linea di biofabbricazione per applicazioni di ingegneria tissutale.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo l'Istituto Nazionale di Metrologia, Qualità e Tecnologia (INMETRO, RJ, Brasile) per l'utilizzo delle loro strutture. Questo studio è stato parzialmente sostenuto dalla Fondazione Carlos Chagas Filho per il sostegno alla ricerca dello Stato di Rio de Janeiro (Faperj) (Codice finanziario: E26/202.682/2018 e E-26/010.001771/2019), dal Consiglio nazionale per lo sviluppo scientifico e tecnologico (CNPq) (codice finanziario: 307460/2019-3) e dall'Ufficio di ricerca navale (ONR) (codice finanziario: N62909-21-1-2091). Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal National Center of Science and Technology on Regenerative Medicine-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
References
- Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
- Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
- Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
- Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
- Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).
- Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
- Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).
- Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).
- Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
- Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).
- Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
- Doulgkeroglou, M. -K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
- Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).
- Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
- Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).
- Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).
- Lee, G. -H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).
- Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
- De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
