Summary
여기에서, 우리는 재석회화 물질의 분해에 관여하는 곰팡이 균주를 찾기 위해 토양 생물 다양성을 스크리닝하기위한 프로토콜을 제시합니다. 첫째, 휴믹산 또는 리그노셀룰로오스 상에서 성장할 수 있는 곰팡이 균주가 분리된다. 그들의 활성은 효소 분석과 탄화수소 및 플라스틱과 같은 오염 물질에 대해 테스트됩니다.
Abstract
환경 오염은 증가하는 문제이며, 생물 정화 과정에 관여하는 곰팡이를 확인하는 것은 필수적인 작업입니다. 토양은 미생물 생물의 놀라운 다양성을 보유하고 있으며 이러한 생물 정화 균류의 좋은 원천이 될 수 있습니다. 이 연구는 다른 선별 검사를 사용하여 생물 개선 잠재력을 가진 토양 균류를 찾는 것을 목표로합니다. 유일한 탄소원으로서 석회화 물질을 보충한 미네랄 배양 배지를 성장 시험으로 사용하였다. 첫째, 토양 희석액을 휴믹산 또는 리그노셀룰로스로 개질된 미네랄 배지로 페트리 접시에 도금하였다. 성장하는 곰팡이 콜로니를 분리하고 탄화수소 (페트롤라툼 및 사용 된 모터 오일)의 복잡한 혼합물과 다른 플라스틱 폴리머 (PET, PP, PS, PUR, PVC)의 분말과 같은 다른 기질에서 테스트했습니다. 정성적 효소 시험은 에스테라제, 락카제, 퍼옥시다제 및 프로테아제의 생산을 조사하기 위한 성장 시험과 관련되었다. 이 효소는 석회화 물질의 주요 분해 과정에 관여하며, 검사 된 곰팡이 균주에 의한 구성 분비는 생물 교정을 위해 악용 될 잠재력을 가질 수 있습니다. 100 개 이상의 균주를 분리하고 테스트했으며, 좋은 생물 개선 잠재력을 가진 몇 가지 분리 물이 발견되었습니다. 결론적으로, 설명 된 선별 시험은 토양에서 생물 정화 잠재력을 가진 곰팡이 균주를 확인하는 쉽고 저렴한 방법입니다. 또한, 최소한의 배양 배지에 다른 재생 물질을 추가함으로써 요구 사항에 따라 다른 오염 물질에 대한 선별 테스트를 조정할 수 있습니다.
Introduction
토양은 지구상의 삶의 기본 구성 요소이며 많은 생태계의 기초입니다. 토양의 미네랄, 유기물 및 미생물은 하나의 시스템으로 간주 될 수 있으며 밀접한 연관성과 상호 작용이 발생합니다. 이러한 화합물의 상호 작용은 육상 과정, 환경 품질 및 생태계 건강에 중요한 영향을 미칩니다1. 토양 오염은 전 세계적으로 심각한 환경 문제를 제기합니다. 살충제, 석유 제품, 플라스틱 및 기타 화학 물질과 같은 석회화 물질 및 독성 물질의 무차별적이고 장기적이며 과도한 적용은 토양 생태학에 심각한 영향을 미치며 결과적으로 토양 미생물을 변화시킬 수 있습니다. 토양의 미생물 공동체는 다른 생리 학적 상태의 광범위한 유기체로 구성되어 있으며 대부분은 박테리아와 곰팡이입니다. 토양의 많은 오염 물질은 중장기 안정성을 가지고 있으며, 그 지속성은 미생물이 재생 물질을 영양소로 활용할 수있게 해주는 적응 메커니즘의 개발로 이어질 수 있습니다 2,3. 따라서 이러한 미생물은 생물 치료 기술로 간주 될 수 있습니다.
생물 정화는 폐기물을 덜 독성 또는 무독성 화합물로 분해 또는 변형시키기 위해 미생물과 그 효소를 사용하여 오염의 영향을 완화하려고 시도합니다. 고세균, 박테리아, 조류 및 곰팡이의 다양한 종은이 생물 치료 능력을 가지고 있습니다4. 그들의 특별한 생분해 작용의 결과로, 곰팡이는 특히 생물 개선을위한 유망한 유기체입니다. 그들은 히팔 네트워크를 사용하여 다른 기질을 공격 할 수있어 다른 미생물보다 토양 매트릭스에 더 효율적으로 침투 할 수 있습니다. 또한, 오염 물질을 제거하기 어려운 접근 할 수없는 간극에 도달 할 수 있습니다5, 그리고 그들은 또한 낮은 수분 수준6에서 살아남을 수 있습니다. 또한, 곰팡이는 비특이적 효소의 다른 카세트를 합성하여 일반적으로 셀룰로오스, 리그닌 및 휴믹산과 같은 천연 석회화 물질을 분해합니다. 표적 기질이 결여된 것들은 탄화수소, 플라스틱 및 살충제 7,8,9,10과 같은 광범위한 재석회성 오염 물질의 분해에 관여할 수 있다. 따라서 많은 곰팡이 종들이 이미 생물 정화제로보고되었지만 석회화 오염 물질의 생물 정화 후보를 선택하기 위해 아직 연구되지 않은 종을 탐구하는 데 관심이 높아지고 있습니다. 생물 치료 특성을 갖는 것으로 이미 알려진 종은 phyla Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota 14,15 및 Mucoromycota에 속합니다. 예를 들어, 페니실륨 속 및 아스퍼질러스는 지방족 탄화수소 13, 상이한 플라스틱 중합체16,17,18, 중금속 19, 및 염료20의 분해에 관여하는 것으로 잘 알려져 있다. 마찬가지로, Phanerochaete chrysosporium 및 Trametes versicolor와 같은 basidiomycetes 진균에 대해 수행 된 연구는 방향족 탄화수소13 및 플라스틱21과 같은 석회화 물질의 산화에 관여하는 것으로 나타났습니다. 생분해 과정에 관여하는 진균의 또 다른 예는 zygomycetes Rhizopus spp., Mucor spp., 및 Cunninghamella spp.22,23이다. 특히, 커닝하멜라는 방향족 탄화수소를 산화시킬 수 있으며, 광범위한 이종 바이오틱스13에서 제품의 해독을 연구하기위한 모델 유기체로 간주됩니다.
에스테라제, 락카제, 퍼옥시다제 및 프로테아제와 같은 재석회화 물질(24,25)의 주요 분해 과정에 관여하는 몇몇 진균 효소가 있다. 락카제는 세포에서 생성되고 이어서 분비되는 구리 함유 산화제로서, 다양한 페놀성 및 방향족 화합물의 산화를 허용한다. 이들은 오르토 및 파라디페놀, 아미노기 함유 페놀, 리그닌, 및 아릴기 함유 디아민26을 분해할 수 있다. Peroxidases는 과산화수소를 매개체로 사용하여 리그닌 및 기타 방향족 화합물을 분해합니다. 많은 다른 퍼옥시다제가 있지만, 독성 물질을 분해할 가능성이 가장 큰 것은 리그닌 퍼옥시다제와 망간 퍼옥시다제27이다.
에스테라제 및 프로테아제는 세포 외 또는 외부 세포 효소의 그룹에 속하며, 이는 기원의 세포 외부에서 작용하지만 여전히 그들에 묶여 있습니다. 이 효소는 큰 반석회 분자를 더 작은 분자로 가수분해하는 촉매 작용을 할 수 있습니다. 기질 특이성이 낮기 때문에 이러한 효소는 섬유 염료, 펄프 및 제지 산업에서 방출되는 유출물 및 가죽 태닝, 석유 제품, 플라스틱 및 살충제28,29,30과 같은 다양한 오염 물질의 생물 정화에 중요한 역할을 할 수 있습니다.
생물매개성 진균 균주를 선택하기 위한 다수의 스크리닝 방법이 이미 발표되었다. 예를 들어, 짚계 한천 배지는 다환식 방향족 탄화수소(PAH) 분해에서 높은 전위를 갖는 백색부후균을 스크리닝하기 위해 사용되어 왔다(31); 썩어가는 나무의 작은 조각이 맥아 추출물 한천 (MEA) 위에 놓여져 나무 썩은 곰팡이(32)를 분리했습니다. 그러나 이미 제안 된 대부분의 방법은 관심있는 활성에 대해 매우 구체적인 곰팡이를 선택합니다. 이 연구는 더 넓은 범위의 행동으로 토양 균류를 선택하기위한 더 넓은 접근법을 제안합니다. 이 방법은 항생제와 혼합 된 휴믹산 또는 리그노 셀룰로오스로 수정 된 배지에 토양 샘플의 연속 희석을 초기 도금하여 이러한 천연 석회화 물질을 분해하는 능력을 가진 곰팡이를 선택합니다. 휴믹산과 리그노셀룰로오스는 사실 매우 복잡한 분자 구조를 가지고 있기 때문에 생분해에 매우 저항력이 강한 물질이며, 이를 통해 시험된 진균33,34의 분해 능력에 대한 우수한 지표가 될 수 있습니다. 그 후, 첫 번째 테스트에서 선택된 곰팡이는 바셀린, 중고 엔진 오일 및 플라스틱과 같은 특정 오염 물질을 분해 할 가능성이있는 사람들을 식별하기 위해 선별됩니다. 마지막으로, 재생 물질의 생분해 과정에 관여하는 효소를 생산할 수있는 곰팡이 균주를 검출하기 위해 정성적 효소 테스트가 수행됩니다. 이를 위해 프로테아제 및 에스테라제 테스트가 수행되고 갈산과 구아아콜은 락카제 및 기타 리그놀로지분해 효소 생산35,36의 지표로 사용됩니다. 이들 기질은 진균이 갈색의 형태로 산화시키는 능력과 리그노분해 능력37,38,39의 보유 사이에 강한 상관관계가 발견되었기 때문에 사용된다.
이러한 프로토콜을 통해 높은 분해 잠재력과 광범위한 작용 스펙트럼을 가진 곰팡이 균주를 토양 샘플에서 직접 분리 할 수 있습니다. 이러한 곰팡이 균주의 분리는 생물 치료 목적을위한 새로운 후보자를 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Protocol
1. 토양에서 석회화 물질을 분해 할 수있는 곰팡이 균주 선택
- 항생제 용액의 제조.
- 페니실린 (50 mg / L), 스트렙토 마이신 (40 mg / L), 클로르 테트라 사이클린 (40 mg / L), 네오 마이신 (100 mg / L) 및 클로람페니콜 (100 mg / L)을 탈이온수 250 mL에 넣으십시오.
- 항생제 용액에 클로람페니콜을 첨가하기 전에 ≥99% 에탄올 3 mL에 녹인다.
- 항생제 용액을 10분 동안 용액 내부에 자석 교반 막대를 가진 자석 교반기(열 없음)에 놓는다. 4°C에서 보관한다.
- 성장 배지의 제조.
- 상업용 휴믹산 1g, 부쉬넬-하스 국물(BH) 3.26g, 한천 15g을 탈이온수 1L에 넣고 121°C(휴믹산 한천)에서 20분 동안 오토클레이브한다.
- 휴믹산 한천을 층류 캐비닛 아래의 페트리 접시에 플레이트하십시오.
- 리그노셀룰로오스 4 g, BH 3.26 g, 및 한천 15 g을 탈이온수 1 L에 넣고 121°C에서 20분 동안 오토클레이브한다(리그노셀룰로오스 한천).
- 리그노셀룰로오스 한천을 층류 캐비닛 아래의 페트리 접시에 접시에 넣습니다.
- 층류 캐비닛 아래에서, 페트리 접시에서 배지가 응고된 후, 항생제 용액 1 mL를 0.2 μm 필터가 있는 멸균 주사기를 사용하여 준비된 플레이트 상에 옮기고 이를 멸균한다.
- 멸균 일회용 L 자형 세포 스프레더를 사용하여 항생제 용액을 플레이트 표면에 고르게 분배하고 층류 캐비닛 아래에서 공기 건조시킵니다.
- 맥아 추출액 20g과 한천 15g을 탈이온수 1L에 넣고 121°C에서 20분간 오토클레이브한다(맥아 추출물 한천 - MEA).
- MEA를 층류 캐비닛 아래의 페트리 접시에 플레이트하십시오.
- 토양 샘플링 및 토양 희석.
- 10cm 깊이에서 관심있는 토양을 샘플링하고 최상층에서 식물, 잔디 및 죽은 잎을 제거하고 멸균 폴리에틸렌 백에 넣으십시오.
- 실험실에 도착한 후 2mm 메쉬를 사용하여 토양을 체질하여 뿌리와 식물 파편을 제거하십시오.
- 하류 분석을 즉시 진행할 수 없는 경우, 체질된 토양 샘플을 4°C에서 보관한다.
- 층류 캐비닛에서 작업하면서 체질 된 토양 1g을 멸균 탈이온수 10mL (1 x 10-1 희석)가있는 멸균 15mL 튜브에 넣으십시오. 튜브를 수평으로 30분 동안 흔든다.
- 층류 캐비닛 아래에서, 현탁액이 침전되기 전에, 멸균 피펫으로 1 x 10-1 희석액 1 mL를 취하여 9 mL의 탈이온수 블랭크(1 x 10-2 희석)로 옮긴다. 그것을 철저히 소용돌이 치십시오.
- 현탁액이 침전되기 전에, 멸균 피펫으로 1 x 10-2 희석액 1 mL를 취하여 9 mL의 탈이온수 블랭크(1 x 10-3 희석)로 옮긴다. 그것을 철저히 소용돌이 치십시오.
- 선택적 매체에 토양 희석을 도금.
- 층류 캐비닛 아래에서 작업하면서 멸균 점이있는 마이크로 피펫을 사용하여 1 x 10-3 희석액 100 μL를 수집하고 휴믹 한천 페트리 접시로 옮깁니다. 적어도 4 ~ 5 개의 페트리 요리에 대해이 작업을 수행하십시오.
- 멸균 일회용 L자형 세포 스프레더를 사용하여 페트리 접시 표면에 희석액을 골고루 분배한다.
- 층류 캐비닛 아래에서 10-15 분 동안 공기 건조하십시오.
- 1.4.1.-1.4.3단계를 반복합니다. 리그노 셀룰로오스 페트리 접시를 사용하여.
- 어둠 속에서 25°C에서 최대 15일 동안 인큐베이션한다.
- 선택적 배지에서 성장 배지로 성장한 곰팡이 식민지의 분리.
- 준비 후 3 일부터 시작하여 최대 15 일 동안 곰팡이 식민지 성장에 대해 매일 준비된 선택적 배지 페트리 접시를 확인하십시오.
- 유사성에 대해 존재하는 모든 곰팡이 식민지를 확인하십시오. 필요한 경우 광학 현미경으로 관찰 할 슬라이드를 준비하십시오.
참고 : 목표는 가장 많은 수의 곰팡이 식민지를 분리하는 것이지만 동일한 곰팡이 균주를 다른 판에서 항상 분리하는 것을 피할 필요가 있으므로이 검사는 매우 중요합니다. 다른 매크로 및 미세 형태를 가진 식민지를 찾으십시오. - 층류 캐비닛 아래 또는 Bunsen 버너에서, 멸균 접종 바늘로 콜로니에서 균사체의 작은 부분을 부드럽게 제거하고 새로운 MEA 페트리 접시로 옮겨 선택된 각 곰팡이 균주를 분리하십시오.
참고 :이 단계에서는 원래 Petri 접시에 존재하는 다른 곰팡이 식민지에서 오염 될 위험이 높기 때문에 섬세하고 정확하게하는 것이 매우 중요합니다. 하나 이상의 진균 균주가 접종된 MEA 플레이트 상에서 성장하면, 단계 1.5.3을 반복한다. - 어둠 속에서 25°C에서 7일 동안 인큐베이션한다. 이들은 특정 반발성 물질에 대해 추가로 시험되는 진균 균주이다.
2. 반발성 물질에 대한 성장 시험
- 바셀린에 성장 테스트.
- 액체 BH 20mL(BH 3.26g/L) 20mL를 50mL 바이알에 넣고 121°C에서 20분 동안 오토클레이빙하여 멸균한다.
- 탈이온수 7mL를 15mL 유리 바이알에 옮기고 깨진 유리 커버슬립 조각을 각 바이알에 넣습니다.
- 121 °C에서 20 분 동안 오토 클레이빙하여 멸균하십시오.
- 층류 캐비닛 아래에서, 멸균 피펫을 사용하여 각 50 mL BH 바이알에 1 mL의 페트롤라툼을 첨가한다. 음성 대조군으로 BH 만 함유 한 바이알을 보관하십시오.
- 층류 캐비닛 아래에서, 멸균 바늘을 사용하여 선택된 진균 균주(단계 1.5.3에서 제조됨)를 갖는 MEA 플레이트로부터 배지 표면의 균사체를 제거하고 부러진 커버슬립이 있는 15 mL 유리 바이알로 옮긴다.
- 각 바이알을 와류 믹서에서 2 분 동안 교반하여 깨진 커버 슬립이 곰팡이 식민지의 큐브를 자르고 곰팡이 현탁액을 만듭니다.
- 각 페트롤라툼 바이알에 200 μL의 진균 현탁액을 접종한다. 각 곰팡이 균주에 대해 두 번의 반복실험을하십시오.
- 음성 대조군의 경우, 200 μL의 곰팡이 현탁액을 액체 BH 만있는 바이알에 넣으십시오. 또한, 배지의 오염을 확인하기 위해 곰팡이 접종없이 페트롤라툼으로 두 개의 바이알을 보관하십시오.
- 바이알을 어둠 속에서 25°C에서 인큐베이션하고, 접종으로부터 15일 및 30일 후에 이를 확인한다.
- 중고 엔진 오일에 대한 성장 테스트.
- BH 3.26 g과 한천 15 g을 탈이온수 1 L에 넣고 121°C(BHA)에서 20분 동안 오토클레이브한다.
- BHA를 층류 캐비닛 아래의 페트리 접시에 접시에 넣습니다.
- 응고되면 사용 된 엔진 오일 500μL를 BHA Petri 접시에 옮기고 멸균 일회용 L 자형 셀 스프레더를 사용하여 플레이트 표면에 고르게 분배하십시오.
- 사용된 각 BHA 플레이트에 각각의 진균 균주를 기관오일을 접종하고, 단계 1.5.3에서 제조된 플레이트로부터 균사체를 수집한다. 오염을 피하기 위해 Bunsen 버너 또는 층류 후드에서 작업하십시오. 각 곰팡이 균주에 대해 두 번의 반복실험을하십시오.
- 음성 대조군의 경우 페트리 접시에 BHA만 접종하십시오. 또한, 배지의 오염을 확인하기 위해 곰팡이 접종없이 사용 된 엔진 오일 BHA Petri 접시 몇 개를 보관하십시오.
- 페트리 접시를 어둠 속에서 25°C에서 인큐베이션하고, 접종으로부터 15일 및 30일 후에 이를 확인한다.
- 플라스틱에 대한 성장 테스트.
- 200 μL의 진균 현탁액(단계 2.1.5.-2.1.6)을 96-마이크로웰 플레이트 내로 옮긴다. 곰팡이 균주 - 플라스틱 조합의 세 가지 복제물을 만드십시오.
- 곰팡이 현탁액이있는 각 웰에 다른 종류의 플라스틱 분말 (폴리에틸렌 테레프탈레이트 - PET, 폴리 염화 비닐 - PVC, 고밀도 폴리에틸렌 - HDPE, 폴리스티렌 - PS, 폴리 우레탄 - PUR) 10mg을 첨가하십시오.
- 음성 대조군의 경우, 플라스틱 분말을 첨가하는 대신 살균 된 BH 용액 200 μL를 곰팡이 현탁액이있는 웰에 첨가하십시오. 또한, 각 유형의 플라스틱 분말에 대해 200 μL의 멸균 BH 용액과 10mg의 각 플라스틱 먼지로 웰을 채워 매체의 오염을 확인합니다.
- 마이크로웰 플레이트를 어둠 속에서 25°C에서 인큐베이션하고, 접종으로부터 15일 및 30일 후에 이를 확인한다.
3. 질적 효소 시험
- 질적 ligninolytic 효소 비색 시험.
- 감자 덱스트로스 국물(PD) 27g과 한천 15g을 탈이온수 1L에 넣고 121°C(PDA)에서 20분 동안 오토클레이브한다.
- 배지가 약간 식었지만 여전히 액체인 경우 층류 후드 아래에 갈산(5g/L)을 넣고 페트리 접시에 배지를 플레이트합니다.
- PDA+ 갈산 플레이트를 각각의 진균 균주에 접종하고, 단계 1.5.3에서 제조된 플레이트로부터 균사체를 수집한다. 오염을 피하기 위해 Bunsen 버너 또는 층류 후드에서 작업하십시오.
- 음성 대조군으로 PDA (갈산 없음) 만 함유 한 페트리 요리를 준비하고 곰팡이 균주 (각 곰팡이 균주마다 하나씩)와 PDA + 갈산과 곰팡이 접종이없는 페트리 접시 한 개를 접종하십시오.
- 페트리 접시를 어둠 속에서 25°C에서 배양하고 접종으로부터 7일 후에 이를 확인한다.
- 정성적 락케이스 비색 테스트.
- PD 27 g과 한천 15 g을 탈이온수 1 L에 넣고 121°C(PDA)에서 20분 동안 오토클레이브한다.
- 배지가 약간 식었지만 여전히 액체인 경우, 층류 후드 아래에 guaiacol (400 μL / L)을 넣고 페트리 접시에 접시에 넣으십시오.
- PDA+ guaiacol 플레이트를 각각의 진균 균주에 접종하고, 단계 1.5.3에서 제조된 플레이트로부터 균사체를 수집한다. Bunsen 버너 또는 층류 후드에서 작업하여 오염을 피하십시오.
- 음성 대조군으로 PDA (guaiacol 없음) 만 사용하여 페트리 요리를 준비하고 곰팡이 균주 (각 곰팡이 균주마다 하나씩)와 PDA + guaiacol 및 곰팡이 접종이없는 페트리 접시 하나를 접종하십시오.
- 페트리 접시를 어둠 속에서 25°C에서 배양하고 접종으로부터 7일 후에 이를 확인한다.
- 정성적 프로테아제 테스트.
- K2HPO4 (1 g/L), KH2PO4 (0.5 g/L),MgSO4·7H2O(0.5 g/L), MnCl2·4H2O (0.001 g/L),CuCl2·2H2O (1.4 x 10-5 g/L), ZnCl2 (1.1 x 10-5 g/L),CoCl2·6H2O(2 x 10-5 g/L), Na2MoO4·2H2O(1.3 x 10-5 g/L),FeCl3·6H2O(7.5 x 10-5 g/L) 및 젤라틴/펩톤 (0.02 g/L)을 탈이온수로 하였다.
- YES 배지를 10분 동안 매체 내부에 자석 교반 막대가 있는 자석 교반기(열 없음) 위에 놓습니다.
- 모든 염이 매질에 용해되었을 때, 용액 5 mL를 20 mL 멸균 유리 바이알로 옮기고 121°C에서 20분 동안 오토클레이브한다.
- 음성 대조군의 경우, 약 20 mL 멸균 유리 바이알을 BH 용액 5 mL와 함께 준비하고, 이를 121°C에서 20분 동안 오토클레이브한다.
- 층류 캐비닛 하에서, 각 균주에 대한 200μL의 진균 현탁액(단계 2.1.5.-2.1.6)을 YES 배지 멸균된 바이알로 옮긴다(진균 균주 당 적어도 2번의 반복실험을 만든다). 각각의 진균 균주에 대해, 동일한 진균 현탁액 200 μL를 BH 멸균된 바이알에 첨가하여 음성 대조군을 갖는다.
- 바이알을 어둠 속에서 25°C에서 21일 동안 인큐베이션하고 7일마다 확인한다.
- 질적 에스테라제 테스트.
- 펩톤 (10 g / L), NaCl (5 g / L), CaCl2 (0.1 g / L) 및 트윈 80 ~ 1 L의 탈이온수 10 mL를 첨가하여 트윈 80 배지를 준비하십시오.
- Tween 80 배지를 10분 동안 매체 내부에 자석 교반 막대를 사용하여 자기 교반기(열 없음) 위에 놓습니다.
- 모든 것이 배지 내부에서 녹으면 용액 5 mL를 20 mL 멸균 유리 바이알에 옮기고 121 °C에서 20 분 동안 오토클레이브하십시오.
- 음성 대조군의 경우, 약 20 mL 멸균 유리 바이알을 BH 용액 5 mL와 함께 준비하고, 이를 121°C에서 20분 동안 오토클레이브한다.
- 층류 캐비닛 하에서, 각 균주에 대한 200μL의 진균 현탁액(단계 2.1.5.-2.1.6)을 Tween 80 배지 멸균 바이알로 옮깁니다(진균 균주 당 적어도 2번의 반복실험을 수행). 각 진균 균주에 대해, 동일한 진균 현탁액 200 μL를 음성 대조군을 위한 BH 멸균된 바이알에 첨가한다.
- 바이알을 어둠 속에서 25°C에서 21일 동안 인큐베이션하고 7일마다 확인한다.
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Representative Results
선택적 배지 방법 (프로토콜의 섹션 1)은 토양의 풍부한 생물 다양성을 선별하고 높은 생물 정화 잠재력을 가진 곰팡이를 선택할 수있게했습니다. 휴믹산과 리그노셀룰로오스 배지로 100개 이상의 진균 균주를 분리하였다. 이 곰팡이는 많은 오염 물질과 유사한 화학 구조를 가진 천연 석회화 물질의 생분해에 관여하는 효소를 생산했습니다. 그러나, 선택적 배지로 분리된 진균 균주는 추가 스크리닝이 필요했다. 구체적으로, 선택적 시험은 휴믹산과 리그노셀룰로스를 분해할 수 있는 균주를 분리하고, 성장 시험은 특정 오염물질을 유일한 탄소원으로 사용할 수 있는 사람들을 위해 단리된 진균을 스크리닝하고, 정성적 효소 시험은 그들의 대사 활동을 기술하였다.
성장 테스트는 탄화수소 (석유 및 사용 된 엔진 오일)와 플라스틱 (PET, PVC, HDPE, PS, PUR)을 분해하는 곰팡이 능력에 중점을 두었습니다. 이들 물질 각각은 선택된 진균 균주에 대한 유일한 탄소원으로서 시험에서 사용되었다. 이들 물질을 이용하는 진균 능력은 첨가된 물질을 갖는 샘플과 단지 최소 배지(BH 또는 BHA, 시험에 의존함)를 갖는 대조군 샘플 사이의 콜로니 성장의 차이로서 평가되었다. 정성적 척도를 사용하여 대조군과의 성장 차이 부재(0)에서 낮음(+), 중간(++) 및 높음(+++) 수준의 성장 차이에 이르는 결과(그림 1)를 설명했습니다.
그림 1: 성장 테스트에서 곰팡이 균주의 성장 성공률. 바셀린, 중고 엔진 오일 및 플라스틱 분말 (폴리에틸렌 테레프탈레이트, PET; 폴리 염화 비닐, PVC; 고밀도 폴리에틸렌, HDPE; 폴리스티렌, PS; 폴리우레탄, PUR)에서 자랄 수있는 곰팡이 균주의 비율은 성공의 정도가 다른 유일한 탄소 공급원입니다 (성장 없음, 0; 낮은 성장, +; 중간 성장, ++; 높은 성장, +++). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
페트롤라툼 및 사용된 엔진 오일 테스트는 선택된 진균 균주의 탄화수소 생분해 가능성을 평가하였다. 장쇄 알칸 (>C25)의 혼합물 인 휘발유는 유일한 탄소 공급원으로 사용되었습니다. 이 물질을 이용하는 진균 능력은 BH+ 페트롤라툼을 갖는 바이알과 BH만을 갖는 대조군 바이알 사이의 콜로니 성장의 차이로서 평가되었다(도 2). 시험된 곰팡이 균주의 거의 75%가 페트롤라툼을 유일한 탄소원으로 사용할 수 있었으며, 균주의 21%가 최대 성장을 보였다(+++, 그림 1).
그림 2 : 유일한 탄소 공급원으로서의 석유 라툼의 질적 성장 규모 사진. 정성적 척도는 처리된 샘플과 BH 대조군 사이의 성장 차이에 기초한다. 그것은 성장 차이 (0), 낮은 (+), 중간 (++) 및 높은 (+++) 수준의 성장 차이가없는 것까지 다양합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
사용 된 엔진 오일은 탄화수소, 엔진 첨가제 및 금속의 복잡한 혼합물입니다. 복합 및 독성 탄화수소 블렌드를 탄소원으로서 활용하는 진균 능력을 평가하기 위해 성장 시험에 사용하였다. 다른 성장 시험과 마찬가지로, 성장은 플레이트에서의 진균 성장을 엔진 오일과 BHA만을 함유하는 대조군 플레이트에서의 성장을 비교함으로써 평가되었다(도 3). 성장 결과는 선택적 배지의 효능을 확인하였다 (프로토콜의 섹션 1). 실제로, 분리된 진균 균주의 거의 90%가 중고 엔진 오일에서 성장할 수 있었으며, 39%는 최대 성장을 보였다(+++, 그림 1).
그림 3 : 유일한 탄소 공급원으로 사용 된 엔진 오일의 질적 성장 규모 사진. 정성적 척도는 처리된 샘플과 BHA 대조군 사이의 성장 차이에 기초한다. 성장 차이 (0), 낮은 (+), 중간 (++) 및 높은 (+++) 수준의 성장 차이가없는 것까지 다양합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
플라스틱 분말에 대한 성장 테스트는 특정 플라스틱 폴리머를 주요 탄소 공급원으로 사용할 수있는 곰팡이 균주를 선택하는 데 사용되었습니다. 따라서, 이들 균주는 플라스틱 생물교정에 대한 높은 잠재력을 갖는다. 멀티웰 플레이트에서의 성장은 입체 현미경으로 관찰되었고, 성장의 부재 (0)에서 균사의 높은 생산 (+++)에 이르기까지 질적 척도를 사용하여 평가되었다. PUR은 성장을 보이는 곰팡이 균주의 비율이 가장 높은 플라스틱 분말이었으며 (92 %), 균주의 31 %가 최대 성장 (+++)을 보였습니다. 휴믹산 및 리그노셀룰로오스 배지에서 분리한 균주의 약 70%가 PS 분말에서 자랐으며, 그 중 거의 60%-65%가 HDPE, PVC 및 PET를 유일한 탄소원으로 사용할 수 있었다. 따라서 많은 비율의 곰팡이가 멀티 웰 플레이트의 다른 플라스틱 분말에서 자랄 수 있었지만 매우 적은 수의 곰팡이가 플라스틱의 높은 식민지화를 보였다. 실제로 균주의 10 %만이 PET와 HDPE에서 번성 할 수 있었고 13 %는 PS에서 번성 할 수있었습니다. 높은 곰팡이 성장이 정기적으로 관찰 된 유일한 플라스틱은 PUR이었으며, 곰팡이 균주의 약 30 %가 매우 풍부하게 자랄 수있었습니다.
재생 물질의 생분해 과정에 관여하는 효소를 생산할 수 있는 곰팡이 균주를 검출하기 위해 정성적 효소 시험이 수행되었다. Peroxidases 및 laccases는 갈산 및 guaiacol 테스트에서 배지의 아래쪽에 갈색 후광으로 생산되는 리그놀립 분해 효소입니다 (프로토콜의 단계 3.1. 및 단계 3.2). 두 시험 모두에서 색의 강도의 증가는 이러한 효소의 더 높은 생산을 나타냈다 (그림 4).
그림 4: 질적 리그노분해 효소의 질적 척도 사진. 질적 인 척도는 식민지 주변의 적색 / 갈색 후광의 생산을 기반으로합니다. 0 = 활동 없음, + = 일부 활동, ++ = 높은 활동, +++ 매우 높은 활동. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
시험된 진균의 약 60%가 리그노분해 효소를 생산할 수 있었으며, 이는 선택적 매질의 성공을 나타낸다. 또한, 분리된 진균 균주의 12%는 갈산 배지에서 콜로니 주위에 강렬한 다크 할로(+++)를 생성했으며, 17%는 구아아콜 배지(laccase)에서 그렇게 함으로써 이들 효소의 높은 진균 분비를 나타낸다(그림 5).
도 5: 정성적 효소 시험 동안 진균 균주에 의한 효소 활성의 비율. 상응하는 질적 효소 시험 중에 다양한 수준의 성공 (0 = 활성 없음, + = 활성, ++ = 높은 활성, + ++ 매우 높은 활성)을 가진 리그놀로지 분해 효소, 락카제, 프로테아제 및 에스테라제를 생산할 수있는 곰팡이 균주의 비율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
진균 활성을 분석하기 위해 사용된 또 다른 스크리닝 테스트는 프로테아제 시험이었고, 이는 YES 배지 바이알과 BH를 사용한 대조군 바이알 사이의 진균 성장의 차이에 기초하였다. 그러나, YES 배지에서 진균 균주의 대략 70%는 대조군과 유사한 성장을 나타내었고, 심지어 성장도 감소하였다. 곰팡이 균주는 최대 수준의 차이 (+++)에 도달하지 못했습니다. 이러한 결과는 이 시험이 프로테아제 활성에 대한 스크리닝에 부적합할 수 있음을 시사한다.
마지막으로, 에스테라제 활성은 Tween 80 배지에서 백색 침전물의 형성에 의해 평가되었다(도 5). 선택된 진균 균주의 거의 60%가 에스테라제 활성을 나타냈고, 13%는 높은 침전물 형성(+++)을 나타냈으며, 이는 13%의 균주가 그들의 생분해 잠재력을 면밀히 조사하기 위해 선택되어야 함을 시사한다(도 5).
모든 성장 및 효소 시험과 관련하여 가장 성공적인 균주 (즉, 적어도 하나의 테스트에서 +++를 얻은 균주)가 가장 흥미 롭습니다. 이 곰팡이 균주는 분해 물질을 유일한 탄소 공급원으로 효율적으로 사용하거나 석회화 물질의 생분해에 관여하는 높은 수준의 효소를 생산할 수있었습니다. 실제로, 시험된 115개의 진균 균주 중 39개는 탄화수소 공급원(페트롤라툼 또는 중고 엔진 오일)에서 번성(+++)할 수 있었고, 58개는 적어도 하나의 플라스틱 폴리머에서 높은 성장을 보였다. 32 개만이 수행 된 효소 시험 중 적어도 하나에서 매우 높은 효소 활성 (+++)을 보였다. 이러한 결과는 프로테아제 시험을 제외하고 보고된 모든 선별 시험의 높은 효능을 보여주며, 이는 어떠한 고성능의 균주도 선택하지 않았다.
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Discussion
토양의 풍부한 생물 다양성은 수많은 대사 능력을 가진 곰팡이의 풍부한 원천이며, 그 중 일부는 생물 개선을위한 잠재적 인 후보자가 될 수 있습니다. 선택적 배지 테스트 (프로토콜의 섹션 1)는 천연 복합 폴리머에서 성장할 수있는 곰팡이를 유일한 탄소 공급원으로 분리하기 쉽고 효과적인 방법입니다. 진균류는 리그노분해 효소인 락카제 및 퍼옥시다제(31)와 같은 세포외, 비특이적 가수분해효소 및 산화환원효소(30)를 생성할 수 있다. 이들 효소는 리그노셀룰로스 및 휴믹산뿐만 아니라 탄화수소, 방향족 화합물 및 염소화 유기 화합물(32)을 포함하는 많은 상이한 이종 바이오틱스를 분해할 수 있다.
설명 된 방법은 해석하기 쉽고 수행 비용이 저렴한 결과를 생성합니다. 이러한 특성을 통해 전문가가 아닌 사람이 사용할 수 있습니다. 그러나 불임 및 형태 학적 식별과 같은 특정 측면은 특별한주의가 필요합니다. 예를 들어, 토양 현탁액의 30분 교반(단계 1.3.4.)은 진균 포자 및 프로파굴레가 토양 미세조직으로부터 자유로워지고 용액 중에 현탁될 수 있도록 필요하다. 이런 식으로, 이러한 토양 현탁액의 희석액을 도금함으로써, 최대 수의 진균 균주를 분리할 수 있다. 곰팡이 균주의 거시적 및 현미경적 형태학적 확인은 균주를 구별하고 동일한 진균 균주를 여러 번 분리하는 것을 피하기 위해 중요하다. 또한, 미생물 오염의 불임성과 회피는 다른 활성 곰팡이 균주의 존재가 연구 된 식민지의 활동을 잘못 나타낼 수 있기 때문에 중요합니다.
선택적 테스트 후, 바셀린, 사용 된 엔진 오일 및 다른 플라스틱 폴리머와 같은 다양한 석회화 물질에 대해 일련의 성장 테스트가 수행되었습니다. 이 단계는 관심있는 석회화 물질에 따라 사용자 정의 할 수 있습니다. 중요한 단계는 선택된 물질을 BH 또는 BHA에 유일한 탄소원으로 첨가하고 첨가된 재석회화 물질 없이 대조군에 대하여 진균 성장을 확인하는 것이다.
플라스틱 및 탄화수소에 대한 성장 테스트의 목적은 곰팡이가 물질에 대한 성장을 질적으로 관찰함으로써 이러한 물질을 유일한 탄소 원으로 사용할 수 있는지 여부를 평가하는 것이 었습니다. 불행히도, 이들 물질의 극심한 석회화로 인해, 특히 비교적 짧은 시간 후에 기질의 중량의 실제 감소와 곰팡이 바이오매스의 중량의 증가를 정량화하는 것은 매우 어렵다. 곰팡이 균주가 이러한 선별 성장 테스트에서 매우 잘 수행된다면, 석회화 물질의 분해를 정량화하기위한 추가 연구가 수행되어야합니다.
사용 된 효소 테스트 (프로토콜의 섹션 3)는 효율적이고 빠르게 수행 할 수 있기 때문에 선택되었지만 질적 인 결과 만 산출합니다. 그들은 곰팡이 균주의 분해 가능성을 강조하지만 정확하게 정량화 할 수는 없습니다. 특정 관심 균주가 단리되는 경우, 대사 활성을 보다 정확하게 기술하기 위해 분광광도계 정량 효소 에세이와 같은 추가 시험이 수행될 수 있다. 차선의 효능을 보인 유일한 효소 시험은 YES 배지에서 성장할 수 있는 낮은 수의 균주를 가진 질적 프로테아제 시험이었다. 실제로, PUR에서 성장할 수 있는 균주의 높은 비율은 진균이 아미드 및 우레탄 결합을 깨뜨리는 데 관여하는 프로테아제를 생성하고, 에스테르 결합40을 표적으로 하는 에스테라제를 생성했음을 시사한다. 프로테아제 생성 진균의 거의 완전한 부재는 사용된 방법에 문제가 있었을 수 있음을 시사한다. 프로테아제 활성, 예를 들어 카제인 41, 탈지유(42) 또는 분유(43) 한천 플레이트 테스트와 같은 다른 시험이 채택될 수 있다. 갈산 검사는 리그노분해 효소의 생산을 검출하는 데 매우 유용한 것으로 판명되었지만, 불행하게도, 그것은 매우 구체적이지 않았고 생산된 ligninolytic 효소의 유형(과산화증 또는 락카제)을 구별할 수 없었다.
이 연구의 결과는 리그노 셀룰로오스 또는 휴믹산을 선택적 배지로 사용하면 생물 개선 잠재력을 가진 곰팡이 균주가 풍부한 토양 생물 다양성으로부터 분리 될 수 있음을 시사합니다. 실제로, 선택적 방법에 의해 분리 된 곰팡이 균주의 70 % 이상이 페트롤라툼 또는 사용 된 엔진 오일에서 자랄 수 있었고 60 %는 유일한 탄소 공급원으로서 다른 플라스틱 폴리머에서 자랄 수있었습니다. 또한, 질적 효소 테스트는 생분해 과정과 관련된 이러한 곰팡이의 대사 활성을 기술했습니다. 하나 이상의 테스트에서 +++ 활성을 나타내는 곰팡이 균주의 선택은 생물 요법에서 매우 활성인 곰팡이 균주를 찾을 가능성을 증가시키기 때문에 권장됩니다. 선별 시험으로 선택된 곰팡이 균주와 장기간 접촉 한 후 석회화 물질에 대한 가스 질량 크로마토그래피 (GC-MS)를 사용한 테스트는 물질 9,44의 실제 생분해를 보여주었습니다. 다른 생태계에서 이러한 간단한 선별 검사를 사용하면 다른 토양에서 곰팡이 생물 다양성을 조사 할 수 있습니다. 석회화 물질을 분해 할 수있는 곰팡이를 찾으면 생물 정화 잠재력을 가진 확인 된 균주의 수가 증가하고 환경 오염의 증가하는 문제를 해결하는 데 도움이됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 파비아 대학의 Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD)과 Solveig Tosi 교수가이 작업을위한 기회를 제공 한 것을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
References
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