Summary
Aqui, apresentamos um protocolo de triagem da biodiversidade do solo para procurar cepas fúngicas envolvidas na degradação de materiais recalcitrantes. Primeiro, as cepas fúngicas capazes de crescer em ácidos húlicos ou lignocelulose são isoladas. Sua atividade é então testada tanto em ensaios enzimáticos quanto em poluentes como hidrocarbonetos e plásticos.
Abstract
A poluição ambiental é um problema crescente, e identificar fungos envolvidos no processo de bioremediação é uma tarefa essencial. O solo abriga uma incrível diversidade de vida microbiana e pode ser uma boa fonte desses fungos bioremediativos. Este trabalho tem como objetivo buscar fungos do solo com potencial de bioremediação utilizando diferentes testes de triagem. A mídia de cultura mineral complementada com substâncias recalcitrantes como única fonte de carbono foi usada como teste de crescimento. Primeiro, as diluições do solo foram banhadas em placas de Petri com meio mineral alterado com ácidos húlicos ou lignocelulose. As colônias fúngicas em crescimento foram isoladas e testadas em diferentes substratos, como misturas complexas de hidrocarbonetos (petrolatum e óleo de motor usado) e pós de diferentes polímeros plásticos (PET, PP, PS, PUR, PVC). Testes enzimáticos qualitativos estiveram associados aos testes de crescimento para investigar a produção de esterases, laccases, peroxidases e proteases. Essas enzimas estão envolvidas nos principais processos de degradação do material recalcitrante, e sua secreção constitutiva pelas cepas fúngicas examinadas poderia ter o potencial de ser explorada para a bioremediação. Mais de 100 cepas foram isoladas e testadas, e vários isolados com bom potencial de bioremediação foram encontrados. Em conclusão, os testes de triagem descritos são um método fácil e de baixo custo para identificar cepas fúngicas com potencial de bioremediação do solo. Além disso, é possível adequar os testes de triagem para diferentes poluentes, de acordo com as exigências, adicionando outras substâncias recalcitrantes aos meios de cultura mínimos.
Introduction
O solo é um componente fundamental da vida na Terra e é a base de muitos ecossistemas. Os minerais, matéria orgânica e microrganismos no solo podem ser considerados como um sistema, com associações próximas e interações ocorrendo entre eles. As interações desses compostos têm um impacto importante nos processos terrestres, na qualidade ambiental e na saúde do ecossistema1. A poluição do solo apresenta sérios problemas ambientais em todo o mundo. A aplicação indiscriminada, a longo prazo e excessiva de substâncias recalcitrantes e tóxicas, como pesticidas, produtos petrolíferos, plásticos e outros produtos químicos, tem efeitos sérios na ecologia do solo e, como resultado, pode alterar a microbiota do solo. As comunidades microbianas nos solos são compostas por uma ampla gama de organismos em diferentes estados fisiológicos, sendo a maioria bactérias e fungos. Muitos dos contaminantes nos solos têm estabilidade de médio a longo prazo, e sua persistência pode levar ao desenvolvimento de mecanismos adaptativos que permitem aos microrganismos utilizar substâncias recalcitrantes como nutrientes 2,3. Esses microrganismos podem, portanto, ser considerados para técnicas de bioremediação.
A bioremediação tenta mitigar os efeitos da poluição usando microrganismos e suas enzimas para a degradação ou transformação de resíduos em compostos menos tóxicos ou não tóxicos. Várias espécies de arqueias, bactérias, algas e fungos possuem essa capacidade de bioremediação4. Como resultado de suas ações biodegradativas particulares, os fungos são especialmente organismos promissores para a bioremediação. Eles podem atacar diferentes substratos usando sua rede hignótica, permitindo-lhes penetrar a matriz do solo de forma mais eficiente do que outros microrganismos. Além disso, eles podem alcançar interstícios inacessíveis onde contaminantes são difíceis de remover5, e também podem sobreviver a baixos níveis de umidade6. Além disso, os fungos sintetizam diferentes fitas de enzimas inespecíficas, geralmente para degradar substâncias recalcitrantes naturais como celulose, lignina e ácidos húricos. Aqueles que não possuem o substrato alvo podem estar envolvidos na degradação de uma ampla gama de poluentes recalcitrantes, como hidrocarbonetos, plásticos e pesticidas 7,8,9,10. Portanto, embora muitas espécies fúngicas já tenham sido relatadas como agentes de bioremediação, há um interesse crescente em explorar espécies que ainda não foram estudadas para selecionar candidatos para a bioremediação de substâncias contaminantes recalcitrantes. As espécies já conhecidas por terem propriedades de bioremediação pertencem ao filo Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota14,15 e Mucoromycota. Por exemplo, os gêneros Penicillium e Aspergillus são bem conhecidos por estarem envolvidos na degradação dos hidrocarbonetos alifáticos13, diferentes polímeros plásticos 16,17,18, metais pesados19 e corantes20. Da mesma forma, estudos realizados em fungos basidiomycetes, como Phanerochaete chrysosporium e Trametes versicolor, revelaram seu envolvimento na oxidação de materiais recalcitrantes como hidrocarbonetos aromáticos13 e plásticos21. Outro exemplo de fungos envolvidos nos processos de biodegradação são os zigomycetes Rhizopus spp., Mucor spp., e Cunninghamella spp.22,23. Em particular, Cunninghamella é capaz de oxidase hidrocarbonetos aromáticos e é considerado um organismo modelo para estudar a desintoxicação de produtos de uma ampla gama de xenobióticos13.
Existem várias enzimas fúngicas envolvidas nos principais processos degradativos de materiais recalcitrantes24,25, como esterase, laccase, peroxidase e protease. Laccases são oxidações contendo cobre produzidas na célula e posteriormente secretadas, que permitem a oxidação de uma variedade de compostos fenólicos e aromáticos. Eles podem degradar ortos e para difenóis, os fenóis que contêm grupo amino, lignina e as diaminas contendo o grupo aryl26. Peroxidases usam peróxido de hidrogênio como mediador para degradar a lignina e outros compostos aromáticos. Existem muitas peroxidases diferentes, mas as que têm maior potencial para degradar substâncias tóxicas são a lignina peroxidase e a peroxidase de manganês27.
Esterases e proteases pertencem ao grupo de enzimas extra ou ecto-celular, que agem fora de suas células de origem, mas ainda estão ligadas a elas. Essas enzimas podem catalisar a hidrólise de grandes moléculas recalcitrantes em moléculas menores. Devido à sua baixa especificidade de substrato, essas enzimas podem desempenhar um papel fundamental na bioremediação de diversos poluentes, como corantes têxteis, efluentes liberados das indústrias de celulose e papel e bronzeamento de couro, produtos petrolíferos, plásticos e pesticidas 28,29,30.
Uma série de métodos de triagem para selecionar para cepas fúngicas bioremediativas já foram publicados. Por exemplo, o meio ágar à base de palha tem sido usado para triagem para fungos de podridão branca com alto potencial na degradação aromática policíclica (PAH)31; e pequenos pedaços de madeira podre foram colocados no ágar extrato de malte (MEA) para isolar fungos apodrecidos de madeira32. No entanto, a maioria dos métodos já propostos seleciona fungos muito específicos para sua atividade de interesse. Esta pesquisa propõe uma abordagem mais ampla para a seleção de fungos do solo com uma gama mais ampla de ação. O método baseia-se no revestimento inicial de diluições seriais de amostras de solo em um meio alterado com ácidos húlicos ou lignocelulose misturado com antibióticos para selecionar fungos com a capacidade de degradar essas substâncias recalcitrantes naturais. Os ácidos húricos e a lignocelulose, na verdade, são substâncias extremamente resistentes à biodegradação, pois possuem estruturas moleculares muito complexas, o que permite que sejam excelentes indicadores da capacidade degradante dos fungos testados33,34. Posteriormente, os fungos selecionados nos primeiros testes são examinados para identificar aqueles com potencial para degradar poluentes específicos, como petrolatum, óleo de motor usado e plásticos. Finalmente, são realizados testes enzimáticos qualitativos para detectar cepas fúngicas capazes de produzir enzimas envolvidas nos processos de biodegradação de substâncias recalcitrantes. Para isso, são realizados testes de protease e esterase, enquanto o ácido gálico e o guaiacol são utilizados como indicadores de laccase e outras produções ligninolíticas35,36. Esses substratos são usados porque uma forte correlação foi encontrada entre a capacidade dos fungos de oxidar-os à sua forma de cor marrom e a posse da capacidade ligninolítica 37,38,39.
Através desses protocolos, é possível isolar cepas fúngicas com alto potencial degradante e um amplo espectro de ação diretamente das amostras do solo. O isolamento dessas cepas fúngicas poderia ajudar a encontrar novos candidatos para fins de bioremediação.
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Protocol
1. Seleção de cepas fúngicas capazes de degradar materiais recalcitrantes do solo
- Preparação de solução antibiótica.
- Coloque penicilina (50 mg/L), estreptomicina (40 mg/L), clorofitracíclina (40 mg/L), neomicina (100 mg/L) e clorofifenicol (100 mg/L) em 250 mL de água estéril desionizada.
- Antes de adicionar clororamfenicol à solução antibiótica, dissolva-o em 3 mL de ≥99% de etanol.
- Coloque a solução de antibióticos em um agitador magnético (sem calor) com uma barra de agitação magnética dentro da solução por 10 minutos. Armazene a 4 °C.
- Preparação da mídia de crescimento.
- Coloque 1 g de ácido húlico comercial, 3,26 g de caldo Bushnell-Haas (BH), e 15 g de ágar em 1 L de água desionizada e autoclave-o por 20 min a 121 °C (ágar ácido húrico).
- Coloque o ágar ácido húlico nas placas de Petri sob um armário de fluxo laminar.
- Coloque 4 g de lignocelulose, 3,26 g de BH, e 15 g de ágar em 1 L de água desionizada e autoclave-o por 20 min a 121 °C (lignocellulose agar).
- Prato o ágar lignocellulose em pratos Petri sob um armário de fluxo laminar.
- Sob um gabinete de fluxo laminar, depois que a mídia se solidificar nas placas de Petri, transfira 1 mL da solução antibiótica para as placas preparadas usando uma seringa estéril com um filtro de 0,2 μm para esterilizá-la.
- Distribua a solução de antibiótico uniformemente nas superfícies da placa usando um espalhador de células em forma de L descartável e deixe-a secar no ar sob o armário de fluxo laminar.
- Coloque 20 g de caldo extrato de malte e 15 g de ágar em 1 L de água deionizada e autoclave-o por 20 min a 121 °C (ágar extrato de malte - MEA).
- Coloque o MEA em pratos petri sob um armário de fluxo laminar.
- Amostragem de solo e diluições do solo.
- Prove o solo de interesse a uma profundidade de 10 cm, removendo quaisquer plantas, grama e folhas mortas da camada superior, e coloque-o em sacos de polietileno estéreis.
- Depois de chegar ao laboratório, peneirar o solo usando uma malha de 2 mm, removendo quaisquer raízes e detritos vegetais.
- Se não for possível prosseguir com a análise a jusante imediatamente, armazene as amostras de solo peneiradas a 4 °C.
- Trabalhando sob um gabinete de fluxo laminar, coloque 1 g do solo peneirado em um tubo estéril de 15 mL com 10 mL de água deionizada estéril (1 x 10-1 diluição). Agite o tubo horizontalmente por 30 minutos.
- Sob um gabinete de fluxo laminar, antes que a suspensão se instale, pegue 1 mL da diluição 1 x 10-1 com uma pipeta estéril e transfira-a para um 9 mL de água deionizada em branco (1 x 10-2 diluição). Vórtice completamente.
- Antes que a suspensão se instale, pegue 1 mL da diluição 1 x 10-2 com uma pipeta estéril e transfira para um 9 mL de água em branco deionizado (diluição de 1 x 10-3 ). Vórtice completamente.
- Emplacando diluições do solo em mídia seletiva.
- Trabalhando sob um gabinete de fluxo laminar, colete 100 μL da diluição 1 x 10-3 usando uma micropipette com um ponto estéril e transfira-o para uma placa de ágar petri úmida. Faça isso por pelo menos 4 ou 5 pratos de Petri.
- Distribua a diluição uniformemente na superfície da placa de Petri usando um espalhador de células em forma de L descartável estéril.
- Deixe-o seco por 10-15 min sob o armário de fluxo laminar.
- Repetição passos 1.4.1.-1.4.3. usando pratos lignocellulose Petri.
- Incubar a 25 °C no escuro por uma máxima de 15 dias.
- Isolamento de colônias fúngicas cultivadas da mídia seletiva à mídia de crescimento.
- A partir de 3 dias após a preparação, verifique as placas de petri de mídia seletiva preparadas diariamente para qualquer crescimento de colônia fúngica por um máximo de 15 dias.
- Verifique todas as colônias fúngicas presentes para semelhanças. Se necessário, prepare um slide a ser observado sob um microscópio leve.
NOTA: O objetivo é isolar o maior número de colônias fúngicas, mas é necessário evitar sempre isolar a mesma cepa fúngica de diferentes placas, por isso este cheque é muito importante. Procure colônias com diferentes macro e micromorfologia. - Sob um gabinete de fluxo laminar ou em um queimador Bunsen, isole cada cepa fúngica escolhida removendo suavemente uma pequena parte do micélio da colônia com uma agulha de inoculação estéril e transferindo-a para uma nova placa DED.
NOTA: Nesta fase, é muito importante ser delicado e preciso, pois há um alto risco de contaminação das outras colônias fúngicas presentes na placa de Petri original. Se mais de uma cepa fúngica crescer na placa MEA inoculada, repita o passo 1.5.3. - Incubar a 25 °C no escuro por 7 dias. Estas são as cepas fúngicas a serem testadas mais adiante em substâncias recalcitrantes específicas.
2. Testes de crescimento em substâncias recalcitrantes
- Teste de crescimento em petrolatum.
- Transfira 20 mL de BH líquido (3,26 g/L de BH) em frascos de 50 mL e esterilize-os autoclaving a 121 °C por 20 min.
- Transfira 7 mL de água deionizada em frascos de vidro de 15 mL e adicione alguns pedaços de tampas de vidro quebradas em cada frasco.
- Esterilizá-los autoclaving a 121 °C por 20 min.
- Sob o gabinete de fluxo laminar, adicione 1 mL de petrolatum a cada frasco BH de 50 mL usando uma pipeta estéril. Mantenha alguns frascos com apenas BH como controle negativo.
- Sob o gabinete de fluxo laminar, remova o micélio na superfície do meio das placas MEA com as cepas fúngicas escolhidas (preparadas na Etapa 1.5.3.) usando uma agulha estéril e transfira-a para frascos de vidro de 15 mL com as tampas quebradas.
- Agitar cada frasco em uma batedeira de vórtice por 2 minutos, permitindo que as tampas quebradas cortem o cubo da colônia fúngica, fazendo uma suspensão fúngica.
- Inocular cada frasco de petrolatum com 200 μL de suspensão fúngica. Faça duas réplicas para cada cepa fúngica.
- Para o controle negativo, coloque 200 μL de suspensão fúngica em frascos apenas líquidos BH. Além disso, mantenha um par de frascos com petrolato sem qualquer inoculação fúngica para verificar se há contaminação no meio.
- Incubar os frascos a 25 °C no escuro e verificar após 15 dias e 30 dias a partir do inóculo.
- Teste de crescimento em óleo de motor usado.
- Coloque 3,26 g de BH e 15 g de ágar em 1 L de água deionizada e autoclave-o por 20 min a 121 °C (BHA).
- Coloque a BHA em pratos de Petri sob um armário de fluxo laminar.
- Quando tiver solidificado, transfira 500 μL de óleo de motor usado para as placas BHA Petri e distribua-o uniformemente nas superfícies da placa usando um espalhador de células descartável estéril em forma de L.
- Inocular cada placa BHA de óleo de motor usado com cada cepa fúngica, coletando o micélio das placas preparadas na Etapa 1.5.3. Trabalhe em um queimador Bunsen ou sob um capô de fluxo laminar para evitar contaminação. Faça duas réplicas para cada cepa fúngica.
- Para o controle negativo, inocular as placas de Petri apenas com BHA. Além disso, mantenha um par de pratos BHA Petri de óleo de motor usado sem qualquer inoculação fúngica para verificar se há contaminação no meio.
- Incubar as placas de Petri a 25 °C no escuro e verificar após 15 dias e 30 dias a partir do inóculo.
- Teste de crescimento em plásticos.
- Transfira 200 μL de suspensão fúngica (Etapas 2.1.5.-2.1.6.) em uma placa de 96 microwell. Faça três réplicas da combinação fúngica de plástico de tensão.
- Para cada poço com a suspensão fúngica, adicione 10 mg de um tipo diferente de pó plástico (polietileno tereftalato - PET, cloreto de polivinil - PVC, polietileno de alta densidade - HDPE, poliestireno - PS, poliuretano - PUR).
- Para o controle negativo, em vez de adicionar o pó plástico, adicione 200 μL de solução BH esterilizada ao poço com a suspensão fúngica. Além disso, para cada tipo de pó plástico, encha um poço com 200 μL de solução bh esterilizada e 10 mg de cada pó plástico para verificar se há contaminação do meio.
- Incubar as placas de microwell a 25 °C no escuro e verificar-as após 15 dias e 30 dias a partir do inóculo.
3. Testes enzimáticos qualitativos
- Enzimas ligninolíticas qualitativas testam colorimétricos.
- Coloque 27 g de caldo de dextrose de batata (PD) e 15 g de ágar em 1 L de água desionizada e autoclave-o por 20 min a 121 °C (PDA).
- Quando o meio tiver esfriado um pouco, mas ainda estiver líquido, adicione ácido gálico (5 g/L) sob um capô de fluxo laminar e coloque o meio em pratos de Petri.
- Inocular as placas de PDA + ácido gálico com cada cepa fúngica, coletando o micélio das placas preparadas na Etapa 1.5.3. Trabalhe em um queimador Bunsen ou sob um capô de fluxo laminar para evitar contaminação.
- Como controles negativos, prepare pratos de Petri com apenas PDA (sem ácido gálico) e inocula-os com as cepas fúngicas (uma para cada cepa fúngica), bem como uma placa de Petri com PDA + ácido gálico e sem inoculação fúngica.
- Incubar as placas de Petri a 25 °C no escuro e verificar após 7 dias do inóculo.
- Teste colorimétrico de laccases qualitativas.
- Coloque 27 g de PD e 15 g de ágar em 1 L de água desionizada e autoclave-o por 20 min a 121 °C (PDA).
- Quando o meio esfriar um pouco, mas ainda estiver líquido, adicione guaiacol (400 μL/L) sob um capô de fluxo laminar e emplaque-o em pratos de Petri.
- Inocular as placas PDA + guaiacol com cada cepa fúngica, coletando o micélio das placas preparadas no Passo 1.5.3. Trabalhe em um queimador Bunsen ou sob um capô de fluxo laminar para evitar qualquer contaminação.
- Como controles negativos, prepare pratos de Petri com apenas PDA (sem guaiacol) e inocula-os com as cepas fúngicas (uma para cada cepa fúngica), bem como uma placa de Petri com PDA + guaiacol e sem inoculação fúngica.
- Incubar as placas de Petri a 25 °C no escuro e verificar após 7 dias do inóculo.
- Teste de proteases qualitativas.
- Prepare o meio YES adicionando K2HPO4 (1 g/L) , KH2PO4 (0,5 g/L), MgSO4·7H2O (0,5 g/L), MnCl2·4H2O (0,001 g/L), CuCl2·2H2O (1.4 x 10-5 g/L), ZnCl2 (1.1 x 10-5 g/L), CoCl2·6H2O (2 x 10-5 g/L), Na2MoO4·2H2O (1,3 x 10-5 g/L), FeCl3·6H2O (7,5 x 10-5 g/L) e gelatina/peptone (0,02 g/L) à água desionizada.
- Coloque o meio SIM em um agitador magnético (sem calor) com uma barra de agitação magnética dentro do meio por 10 minutos.
- Quando todos os sais tiverem dissolvido no meio, transfira 5 mL da solução em frascos de vidro estéreis de 20 mL e autoclave-os por 20 min a 121 °C.
- Para o controle negativo, prepare cerca de 20 mL de frascos de vidro estéreis com solução de 5 mL de BH e autoclave-os por 20 min a 121 °C.
- Sob um gabinete de fluxo laminar, transfira 200 μL de suspensão fúngica (Etapas 2.1.5.-2.1.6.) para cada cepa para os frascos médios esterilizados YES (faça pelo menos 2 réplicas por cepa fúngica). Para cada cepa fúngica, adicione 200 μL da mesma suspensão fúngica aos frascos esterilizados de BH para ter um controle negativo.
- Incubar os frascos a 25 °C no escuro por 21 dias e verificar a cada 7 dias.
- Teste de esterases qualitativas.
- Prepare o meio Tween 80 adicionando peptone (10 g/L), NaCl (5 g/L), CaCl2 (0,1 g/L) e 10 mL de Tween 80 a 1 L de água desionizada.
- Coloque o meio Tween 80 em um agitador magnético (sem calor) com uma barra de agitação magnética dentro do meio por 10 minutos.
- Quando tudo estiver derretido dentro do meio, transfira 5 mL da solução em frascos de vidro estéreis de 20 mL e autoclave-os por 20 min a 121 °C.
- Para o controle negativo, prepare cerca de 20 mL de frascos de vidro estéreis com solução de 5 mL de BH e autoclave-os por 20 min a 121 °C.
- Sob um gabinete de fluxo laminar, transfira 200 μL de suspensão fúngica (Etapas 2.1.5.-2.1.6.) para cada cepa para os frascos médios esterilizados Tween 80 (faça pelo menos 2 réplicas por cepa fúngica). Para cada cepa fúngica, adicione 200 μL da mesma suspensão fúngica aos frascos esterilizados de BH para controle negativo.
- Incubar os frascos a 25 °C no escuro por 21 dias e verificar a cada 7 dias.
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Representative Results
Os métodos de mídia seletiva (Seção 1 do protocolo) permitiram a triagem da rica biodiversidade do solo e os fungos com alto potencial de bioremediação. Com o ácido húlico e a mídia lignocelulose, mais de 100 cepas fúngicas foram isoladas. Esses fungos produziram enzimas envolvidas na biodegradação de materiais recalcitrantes naturais, que possuem uma estrutura química semelhante a muitos poluentes. No entanto, as cepas fúngicas isoladas com as mídias seletivas precisavam de uma triagem adicional. Especificamente, os testes seletivos isolaram as cepas capazes de degradar ácidos húlicos e lignocelulose, os testes de crescimento examinaram os fungos isolados para aqueles capazes de usar um poluente específico como sua única fonte de carbono, e os testes enzimáticos qualitativos descreveram suas atividades metabólicas.
Os testes de crescimento foram focados na capacidade fúngica de degradar hidrocarbonetos (petrolatum e óleo de motor usado) e plásticos (PET, PVC, HDPE, PS, PUR). Cada uma dessas substâncias foi utilizada em um teste como única fonte de carbono para as cepas fúngicas selecionadas. A capacidade fúngica de explorar essas substâncias foi avaliada como a diferença no crescimento das colônias entre as amostras com a substância adicionada e as amostras de controle com apenas meio mínimo (BH ou BHA, dependendo do teste). Foi utilizada uma escala qualitativa para descrever os resultados (Figura 1), que vão desde a ausência de diferença de crescimento com os níveis de controle (0) a baixo (+), médio (++) e alto (+++) de diferença de crescimento.
Figura 1: Taxa de sucesso de crescimento das cepas fúngicas nos testes de crescimento. A porcentagem de cepas fúngicas capazes de crescer em óleo de gasolina, óleo de motor usado e pós plásticos (polietileno tereftalato, PET; cloreto de polivinil, PVC; polietileno de alta densidade, HDPE; poliestireno, PS; poliuretano, PUR) como sua única fonte de carbono com diferentes graus de sucesso (sem crescimento, 0; baixo crescimento, +; crescimento médio, ++; alto crescimento, +++ Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Os testes de óleo de motor e a gasolina e o uso avaliaram o potencial de biodegradação de hidrocarbonetos das cepas fúngicas selecionadas. O petrolato, uma mistura de alcanos de cadeia longa (>C25), foi usado como única fonte de carbono. A capacidade fúngica de explorar essa substância foi avaliada como a diferença no crescimento das colônias entre frascos com BH + petrolatum e frascos de controle com apenas BH (Figura 2). Quase 75% das cepas fúngicas testadas foram capazes de usar o petrolatum como sua única fonte de carbono, e 21% das cepas apresentaram crescimento máximo (+++, Figura 1).
Figura 2: Imagens da escala qualitativa de crescimento do petrolatum como a única fonte de carbono. A escala qualitativa baseia-se na diferença de crescimento entre as amostras tratadas e o controle de BH. Varia da ausência de diferença de crescimento (0), a baixo (+), médio (++) e altos (+++) níveis de diferença de crescimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O óleo do motor usado é uma mistura complexa de hidrocarbonetos, aditivos do motor e metais. Foi utilizado nos testes de crescimento para avaliar a capacidade fúngica de utilizar uma mistura complexa e tóxica de hidrocarbonetos como fonte de carbono. Como nos outros testes de crescimento, o crescimento foi avaliado comparando-se o crescimento fúngico em placas com o óleo do motor com o crescimento nas placas de controle contendo apenas BHA (Figura 3). Os resultados de crescimento confirmaram a eficácia da mídia seletiva (Seção 1 do protocolo). De fato, quase 90% das cepas fúngicas isoladas foram capazes de crescer com óleo de motor usado, com 39% mostrando crescimento máximo (+++, Figura 1).
Figura 3: Imagens da escala qualitativa de crescimento do óleo do motor usado como única fonte de carbono. A escala qualitativa baseia-se na diferença de crescimento entre as amostras tratadas e o controle da BHA. Varia de ausência de diferença de crescimento (0), a baixo (+), médio (++) e altos (+++) níveis de diferença de crescimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Testes de crescimento em pós plásticos foram usados para selecionar as cepas fúngicas que poderiam usar polímeros plásticos específicos como sua principal fonte de carbono; portanto, essas cepas têm um alto potencial para a bioremediação plástica. O crescimento das placas multiwell foi observado pelo estereoscópio e avaliado por uma escala qualitativa, que vai desde a ausência de crescimento (0) até a alta produção de hifa (+++). Pur foi o pó plástico que apresentou o maior percentual de cepas fúngicas apresentando crescimento (92%), com 31% das cepas mostrando crescimento máximo (+++). Aproximadamente 70% das cepas isoladas de ácido húlico e mídia lignocelulose cresceram em pó PS, enquanto quase 60%-65% delas foram capazes de usar HDPE, PVC e PET como sua única fonte de carbono. Portanto, uma grande porcentagem de fungos foram capazes de crescer nos diferentes pós plásticos em placas multiwell, mas um número muito baixo deles mostrou alta colonização de plásticos. De fato, apenas 10% das cepas foram capazes de prosperar em PET e HDPE, e 13% foram capazes de prosperar em PS. O único plástico onde o alto crescimento fúngico era regularmente observado foi o PUR, no qual aproximadamente 30% das cepas fúngicas conseguiram crescer muito abundantemente.
Foram realizados testes enzimáticos qualitativos para detectar cepas fúngicas que podem produzir enzimas envolvidas nos processos de biodegradação de substâncias recalcitrantes. Peroxidases e laccases são enzimas ligninolíticas cuja produção é indicada por um halo acastônico na parte inferior do meio em testes de ácido gálico e guaiacol (Passo 3.1. e Passo 3.2. do protocolo). Em ambos os testes, o aumento da intensidade da cor indicou maior produção dessas enzimas (Figura 4).
Figura 4: Imagens da escala qualitativa de enzimas ligninolíticas qualitativas. A escala qualitativa é baseada na produção de um halo vermelho/acastúldo ao redor da colônia. 0 = sem atividade, + = alguma atividade, ++ = alta atividade, +++ atividade muito alta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Aproximadamente 60% dos fungos testados foram capazes de produzir enzimas ligninolíticas, indicando o sucesso da mídia seletiva. Além disso, 12% das cepas fúngicas isoladas produziram um intenso halo escuro ao redor da colônia (+++) em meio ácido gálico, com 17% fazendo isso no meio guaiacol (laccases), indicando alta secreção fúngica dessas enzimas (Figura 5).
Figura 5: Taxa de atividade enzimática por cepas fúngicas durante testes enzimáticos qualitativos. A porcentagem de cepas fúngicas capazes de produzir enzimas ligninolytic, laccases, proteases e esterases com diferentes níveis de sucesso (0 = sem atividade, + = atividade, ++ = alta atividade, +++ atividade muito alta) durante seus testes enzimáticos qualitativos correspondentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Outro teste de triagem utilizado para análise da atividade fúngica foi o teste de proteases, que foi baseado na diferença de crescimento fúngico entre frascos médios SIM e frascos de controle com BH. No entanto, aproximadamente 70% das cepas fúngicas no meio YES apresentaram crescimento semelhante aos controles, ou mesmo diminuição do crescimento. Nenhuma cepa fúngica atingiu o nível máximo de diferença (+++). Esses resultados sugerem que este teste pode ser inadequado para a triagem para atividade de protease.
Por fim, a atividade de esterases foi avaliada pela formação de um precipitado branco em Tween 80 médio (Figura 5). Quase 60% das cepas fúngicas selecionadas apresentaram atividade esterase, e 13% apresentaram alta formação do precipitado (+++), sugerindo que as cepas nos 13% devem ser selecionadas para examinar seu potencial de biodegradação (Figura 5).
Em relação a todos os testes de crescimento e enzimáticos, as cepas mais bem sucedidas (ou seja, aquelas que obtiveram +++ em pelo menos um teste) foram as mais interessantes. Essas cepas fúngicas foram capazes de usar eficientemente substâncias recalcitrantes como sua única fonte de carbono, ou produziram um alto nível de enzimas envolvidas na biodegradação de substâncias recalcitrantes. De fato, 39 das 115 cepas fúngicas testadas foram capazes de prosperar (+++) em fontes de hidrocarbonetos (petrolatum ou óleo de motor usado), e 58 tiveram alto crescimento em pelo menos um polímero plástico. Apenas 32 apresentaram atividade enzimática muito alta (+++) em pelo menos um dos testes enzimáticos realizados. Esses resultados mostram a alta eficácia de todos os testes de triagem relatados, além do teste proteases, que não selecionou nenhuma cepa de alto desempenho.
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Discussion
A rica biodiversidade do solo é uma fonte abundante de fungos que possuem inúmeras habilidades metabólicas, algumas das quais podem ser potenciais candidatas à bioremediação. Testes de mídia seletiva (Seção 1 do protocolo) são métodos fáceis de executar e eficazes para isolar fungos capazes de crescer em polímeros complexos naturais como sua única fonte de carbono. Fungos podem produzir hidrolases extracelulares, não específicas e oxidoreductases30 , como as enzimas ligninolíticas laccases e peroxidases31. Essas enzimas podem degradar lignocelulose e ácidos húlicos, mas também muitos xenobióticos diferentes, incluindo hidrocarbonetos, compostos aromáticos e compostos orgânicos clorados32.
Os métodos descritos produzem resultados fáceis de interpretar e são de baixo custo para serem realizados. Essas características permitem que sejam utilizadas por não especialistas. No entanto, certos aspectos, como esterilidade e identificação morfológica, requerem atenção especial. Por exemplo, a agitação de 30 minutos da suspensão do solo (Etapa 1.3.4.) é necessária para que os esporos fúngicos e propagules sejam liberados da microestrutura do solo e possam ser suspensos na solução. Desta forma, ao emplacar diluições desta suspensão do solo, é possível isolar o número máximo de cepas fúngicas. A identificação morfológica macro e microscópica das cepas fúngicas é importante para diferenciar entre cepas e evitar isolar a mesma cepa fúngica várias vezes. Além disso, a esterilidade e a prevenção de contaminações microbianas são cruciais porque a presença de outras cepas fúngicas ativas poderia deturpar a atividade das colônias estudadas.
Após os testes seletivos, uma série de testes de crescimento foram realizados em diferentes substâncias recalcitrantes, como o petrolatum, óleo do motor usado e diferentes polímeros plásticos. Esta etapa pode ser personalizada de acordo com as substâncias recalcitrantes de interesse. O passo importante é adicionar a substância selecionada a BH ou BHA como única fonte de carbono e verificar o crescimento fúngico contra um controle sem a substância recalcitrante adicionada.
O objetivo dos testes de crescimento em plásticos e hidrocarbonetos foi avaliar se o fungo poderia usar essas substâncias como sua única fonte de carbono, observando qualitativamente seu crescimento no material. Infelizmente, devido à extrema recalcitrância desses materiais, é muito difícil quantificar a diminuição real do peso do substrato e o aumento do peso da biomassa fúngica, especialmente depois de um período relativamente curto de tempo. Se uma cepa fúngica se sair muito bem nesses testes de crescimento de triagem, novos estudos devem ser realizados para quantificar a degradação da substância recalcitrante.
Os testes enzimáticos utilizados (Seção 3 do protocolo) foram escolhidos por se mostrarem eficientes e rápidos de realizar, mas produzem apenas resultados qualitativos. Eles destacam o potencial de degradação de uma cepa fúngica, mas não podem quantificá-la com precisão. Se uma tensão de interesse particular for isolada, novos testes, como ensaios quantitativos quantitativos enzimómetros espectrofotmétricos, poderiam ser realizados para descrever a atividade metabólica com mais precisão. O único teste enzimático que mostrou eficácia subótima foi o teste de proteases qualitativas, com um baixo número de cepas capazes de crescer no meio YES. De fato, a alta porcentagem de cepas capazes de crescer no PUR sugere que os fungos produziram proteases envolvidas na quebra das ligações de amida e uretano, com esterase visando as ligações éster40. A ausência quase completa de fungos produtores de protease sugere que pode ter havido um problema no método utilizado. Outros testes poderiam ser adotados para atividade de protease, como casein41, leite desnatado42 ou leite em pó43 testes de placas de ágar. O teste de ácido gálico mostrou-se muito útil para detectar a produção de enzimas ligninolíticas, mas, infelizmente, não foi muito específico e não conseguiu distinguir o tipo de enzima ligninolítica produzida (seja peroxidases ou laccases).
Os resultados deste trabalho sugerem que o uso de ácidos lignocelulose ou húlico como mídia seletiva permite que cepas fúngicas com potencial de bioremediação sejam isoladas da rica biodiversidade do solo. De fato, mais de 70% das cepas fúngicas isoladas pelos métodos seletivos foram capazes de crescer em óleo de motor a gasolina ou usado, e 60% foram capazes de crescer em diferentes polímeros plásticos como única fonte de carbono. Além disso, os testes qualitativos enzimáticos descreveram a atividade metabólica desses fungos ligada aos processos de biodegradação. A seleção de cepas fúngicas que mostram +++ atividade em um ou mais testes é recomendada porque aumenta as chances de encontrar uma cepa fúngica que é muito ativa na bioremediação. Testes utilizando cromatografia de massa gasosa (GC-MS) nas substâncias recalcitrantes após contato prolongado com as cepas fúngicas selecionadas com nossos testes de triagem mostraram biodegradação real dos materiais 9,44. O uso desses simples testes de triagem em diferentes ecossistemas permitirá a investigação da biodiversidade fúngica em diferentes solos. A busca por fungos que possam degradar materiais recalcitrantes aumentará o número de cepas identificadas que têm potencial para a bioremediação e ajudarão a enfrentar o crescente problema da poluição ambiental.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Reconhecemos a Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) da Universidade de Pavia e o Professor Solveig Tosi por proporcionarem a oportunidade para este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
References
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