Summary
Burada, inatçı materyallerin parçalanmasında rol oynayan mantar suşlarını aramak için toprak biyoçeşitliliğini taramak için bir protokol sunuyoruz. İlk olarak, hümik asitler veya lignoselüloz üzerinde büyüyebilen mantar suşları izole edilir. Aktiviteleri daha sonra hem enzimatik testlerde hem de hidrokarbonlar ve plastikler gibi kirleticiler üzerinde test edilir.
Abstract
Çevre kirliliği giderek artan bir sorundur ve biyoremediasyon sürecinde yer alan mantarları tanımlamak önemli bir görevdir. Toprak, inanılmaz bir mikrobiyal yaşam çeşitliliğine ev sahipliği yapar ve bu biyoremediatif mantarların iyi bir kaynağı olabilir. Bu çalışma, farklı tarama testleri kullanarak biyoremediasyon potansiyeli olan toprak mantarlarını araştırmayı amaçlamaktadır. Tek karbon kaynağı olarak inatçı maddelerle desteklenen mineral kültür ortamları büyüme testleri olarak kullanılmıştır. İlk olarak, toprak seyreltmeleri Petri kaplarına hümik asitler veya lignoselüloz ile değiştirilmiş mineral ortam ile kaplandı. Büyüyen mantar kolonileri, hidrokarbonların karmaşık karışımları (petrolatum ve kullanılmış motor yağı) ve farklı plastik polimerlerin tozları (PET, PP, PS, PUR, PVC) gibi farklı substratlar üzerinde izole edildi ve test edildi. Kalitatif enzimatik testler, esterazların, lakkazların, peroksidazların ve proteazların üretimini araştırmak için büyüme testleri ile ilişkilendirilmiştir. Bu enzimler, inatçı materyalin ana bozunma süreçlerinde rol oynar ve incelenen mantar suşları tarafından yapısal sekresyonları, biyoremediasyon için kullanılma potansiyeline sahip olabilir. 100'den fazla suş izole edildi ve test edildi ve iyi biyoremediasyon potansiyeline sahip birkaç izolat bulundu. Sonuç olarak, tarif edilen tarama testleri, topraktan biyoremediasyon potansiyeli olan mantar suşlarını tanımlamak için kolay ve düşük maliyetli bir yöntemdir. Ek olarak, farklı kirleticiler için tarama testlerini, gereksinimlere göre, minimum kültür ortamına diğer inatçı maddeler ekleyerek uyarlamak mümkündür.
Introduction
Toprak, Dünya üzerindeki yaşamın temel bir bileşenidir ve birçok ekosistemin temelidir. Topraktaki mineraller, organik maddeler ve mikroorganizmalar, aralarında meydana gelen yakın ilişkiler ve etkileşimlerle tek bir sistem olarak düşünülebilir. Bu bileşiklerin etkileşimleri karasal süreçler, çevresel kalite ve ekosistem sağlığı üzerinde önemli bir etkiye sahiptir1. Toprak kirliliği dünya çapında ciddi çevre sorunları oluşturmaktadır. Pestisitler, petrol ürünleri, plastikler ve diğer kimyasallar gibi inatçı ve toksik maddelerin ayrım gözetmeksizin, uzun süreli ve aşırı uygulanmasının toprak ekolojisi üzerinde ciddi etkileri vardır ve sonuç olarak toprak mikrobiyotasını değiştirebilir. Topraklardaki mikrobiyal topluluklar, çoğunluğu bakteri ve mantar olmak üzere farklı fizyolojik durumlarda çok çeşitli organizmalardan oluşur. Topraklardaki kirleticilerin çoğu orta ila uzun vadeli stabiliteye sahiptir ve kalıcılıkları, mikroorganizmaların inatçı maddeleri besin maddesi olarak kullanmalarına izin veren uyarlanabilir mekanizmaların gelişmesine yol açabilir 2,3. Bu nedenle, bu mikroorganizmalar biyoremediasyon teknikleri için düşünülebilir.
Bioremediasyon, atıkların daha az toksik veya toksik olmayan bileşiklere parçalanması veya dönüştürülmesi için mikroorganizmaları ve enzimlerini kullanarak kirliliğin etkilerini azaltmaya çalışır. Çeşitli arke, bakteri, alg ve mantar türleri bu biyoremediasyon yeteneğinesahiptir 4. Özel biyodegradatif etkilerinin bir sonucu olarak, mantarlar özellikle biyoremediasyon için umut verici organizmalardır. Hifal ağlarını kullanarak farklı substratlara saldırabilirler, bu da toprak matrisine diğer mikroorganizmalardan daha verimli bir şekilde nüfuz etmelerini sağlar. Ek olarak, kirleticilerin çıkarılmasının zor olduğu erişilemez ara noktalara ulaşabilirler5 ve ayrıca düşük nem seviyelerinde hayatta kalabilirler6. Dahası, mantarlar genellikle selüloz, lignin ve hümik asitler gibi doğal inatçı maddeleri parçalamak için spesifik olmayan enzimlerin farklı kasetlerini sentezler. Hedef substrattan yoksun olanlar, hidrokarbonlar, plastikler ve pestisitler 7,8,9,10 gibi çok çeşitli inatçı kirleticilerin bozulmasına karışabilir. Bu nedenle, birçok mantar türü zaten biyoremediasyon ajanları olarak bildirilmiş olmasına rağmen, inatçı kirletici maddelerin biyoremediasyonu için adayları seçmek için henüz çalışılmamış türlerin araştırılmasına olan ilgi artmaktadır. Biyoremediasyon özelliklerine sahip olduğu bilinen türler, filum Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota 14,15 ve Mucoromycota'ya aittir. Örneğin, Penicillium ve Aspergillus cinslerinin, alifatik hidrokarbonların13, farklı plastik polimerlerin 16,17,18, ağır metallerin19 ve boyaların20'nin parçalanmasında rol oynadığı iyi bilinmektedir. Benzer şekilde, Phanerochaete chrysosporium ve Trametes versicolor gibi bazidiomycetes mantarları üzerinde yapılan çalışmalar, aromatik hidrokarbonlar13 ve plastikler21 gibi inatçı malzemelerin oksidasyonuna katılımlarını ortaya koymuştur. Biyodegradasyon işlemlerinde yer alan mantarların bir başka örneği de zygomycetes Rhizopus spp., Mucor spp. ve Cunninghamella spp.22,23'tür. Özellikle, Cunninghamella aromatik hidrokarbonları oksidaz edebilir ve çok çeşitli ksenobiyotiklerden ürünlerin detoksifikasyonunu incelemek için model bir organizma olarak kabul edilir13.
Esteraz, lakkaz, peroksidaz ve proteaz gibi inatçı materyallerin 24,25 ana degradatif süreçlerinde yer alan birkaç mantar enzimi vardır. Lakkazlar, hücrede üretilen ve daha sonra salgılanan, çeşitli fenolik ve aromatik bileşiklerin oksidasyonuna izin veren bakır içeren oksidazlardır. Orto ve para difenollerini, amino grubu içeren fenolleri, ligninleri ve aril grubu içeren diaminleri26 parçalayabilirler. Peroksidazlar, lignin ve diğer aromatik bileşikleri parçalamak için bir aracı olarak hidrojen peroksit kullanır. Birçok farklı peroksidaz vardır, ancak toksik maddeleri bozma potansiyeli en yüksek olanlar lignin peroksidaz ve manganez peroksidaz27'dir.
Ezarazlar ve proteazlar, menşe hücrelerinin dışında hareket eden, ancak yine de onlara bağlı olan hücre dışı veya ekto-hücresel enzimler grubuna aittir. Bu enzimler, büyük inatçı moleküllerin hidrolizini daha küçük olanlara katalize edebilir. Düşük substrat özgüllükleri nedeniyle, bu enzimler tekstil boyaları, kağıt hamuru ve kağıt endüstrilerinden salınan atık sular ve deri tabaklama, petrol ürünleri, plastikler ve pestisitler gibi çeşitli kirleticilerin biyoremediasyonunda önemli bir rol oynayabilir28,29,30.
Biyoremediatif mantar suşları için seçilecek bir dizi tarama yöntemi zaten yayınlanmıştır. Örneğin, polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH) bozunmasında yüksek potansiyele sahip beyaz çürük mantarları taramak için saman bazlı agar ortamı kullanılmıştır31; ve odun çürüyen mantarları izole etmek için malt özü agar (MEA) üzerine küçük çürüyen odun parçaları yerleştirilmiştir32. Bununla birlikte, daha önce önerilen yöntemlerin çoğu, ilgilendikleri aktivite için çok spesifik mantarlar seçmektedir. Bu araştırma, daha geniş bir etki alanına sahip toprak mantarlarını seçmek için daha geniş bir yaklaşım önermektedir. Yöntem, toprak örneklerinin seri seyreltmelerinin, bu doğal inatçı maddeleri bozma kabiliyetine sahip mantarları seçmek için antibiyotiklerle karıştırılmış hümik asitler veya lignoselüloz ile değiştirilmiş bir ortam üzerine ilk kaplanmasına dayanır. Hümik asitler ve lignoselüloz, aslında, çok karmaşık moleküler yapılara sahip oldukları için biyolojik bozunmaya karşı son derece dirençli maddelerdir ve bu, test edilen mantarların bozunma kabiliyetinin mükemmel göstergeleri olmalarını sağlar33,34. Daha sonra, ilk testlerde seçilen mantarlar, petrolatum, kullanılmış motor yağı ve plastikler gibi spesifik kirleticileri parçalama potansiyeline sahip olanları belirlemek için taranır. Son olarak, inatçı maddelerin biyolojik bozunma işlemlerinde yer alan enzimleri üretebilen mantar suşlarını tespit etmek için kalitatif enzimatik testler yapılır. Bu amaçla proteaz ve esteraz testleri yapılırken, lakkaz ve diğer lininolitik enzim üretiminin göstergeleri olarak gallik asit ve guaiakol kullanılmaktadır35,36. Bu substratlar kullanılır, çünkü mantarların onları kahverengi renkli formlarına oksitleme kabiliyeti ile lininolitik kabiliyete sahip olma arasında güçlü bir korelasyon bulunmuştur37,38,39.
Bu protokoller sayesinde, yüksek bozunma potansiyeline ve geniş bir etki spektrumuna sahip mantar suşlarını doğrudan toprak örneklerinden izole etmek mümkündür. Bu mantar suşlarının izolasyonu, biyoremediasyon amaçları için yeni adaylar bulmaya yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. İnatçı materyalleri topraktan parçalayabilen mantar suşlarının seçimi
- Antibiyotik çözeltisinin hazırlanması.
- Penisilin (50 mg / L), streptomisin (40 mg / L), klortetrasiklin (40 mg / L), neomisin (100 mg / L) ve kloramfenikol (100 mg / L) 250 mL deiyonize steril suya koyun.
- Antibiyotik çözeltisine kloramfenikol eklemeden önce, 3 mL% ≥99 etanol içinde çözün.
- Antibiyotik çözeltisini, çözeltinin içinde 10 dakika boyunca manyetik bir karıştırma çubuğu bulunan manyetik bir karıştırıcıya (ısı yok) yerleştirin. 4 °C'de saklayın.
- Büyüme ortamının hazırlanması.
- 1 g ticari hümik asit, 3.26 g Bushnell-Haas suyu (BH) ve 15 g agar'ı 1 L deiyonize suya koyun ve 121 ° C'de (hümik asit agar) 20 dakika boyunca otoklav yapın.
- Hümik asit agarını laminer bir akış dolabı altında Petri kaplarına yerleştirin.
- 1 L deiyonize suya 4 g lignoselüloz, 3.26 g BH ve 15 g agar koyun ve 121 ° C'de (lignoselüloz agar) 20 dakika boyunca otoklav yapın.
- Lignoselüloz agarını laminer bir akış dolabı altında Petri kaplarına tabaklayın.
- Laminer bir akış kabini altında, ortam Petri kaplarında katılaştıktan sonra, sterilize etmek için 0.2 μm filtreli steril bir şırınga kullanarak 1 mL antibiyotik çözeltisini hazırlanan plakalara aktarın.
- Steril tek kullanımlık L şeklinde bir hücre yayıcı kullanarak antibiyotik solüsyonunu plaka yüzeylerine eşit olarak dağıtın ve laminer akış kabininin altında hava ile kurumasını bekleyin.
- 1 L deiyonize suya 20 g malt özü suyu ve 15 g agar koyun ve 121 ° C'de 20 dakika boyunca otoklav yapın (malt özü agar - MEA).
- MEA'yı laminer bir akış kabini altında Petri kaplarına yerleştirin.
- Toprak örneklemesi ve toprak seyreltmeleri.
- İlgilenilen toprağı 10 cm derinlikte örnekleyin, bitkileri, çimleri ve ölü yaprakları üst tabakadan çıkarın ve steril polietilen torbalara koyun.
- Laboratuvara ulaştıktan sonra, 2 mm'lik bir ağ kullanarak toprağı eleyin, kökleri ve bitki kalıntılarını temizleyin.
- Aşağı akış analizine hemen devam etmek mümkün değilse, elenmiş toprak örneklerini 4 ° C'de saklayın.
- Laminer bir akış kabini altında çalışırken, elenmiş toprağın 1 g'ını, 10 mL steril deiyonize su (1 x 10-1 seyreltme) ile steril 15 mL'lik bir tüpe koyun. Tüpü 30 dakika yatay olarak çalkalayın.
- Laminer bir akış kabini altında, süspansiyon yerleşmeden önce, steril bir pipetle 1 x 10-1 seyreltmenin 1 mL'sini alın ve 9 mL'lik bir deiyonize su boşluğuna (1 x 10-2 seyreltme) aktarın. İyice vorteks.
- Süspansiyon yerleşmeden önce, steril bir pipetle 1 x 10-2 seyreltmenin 1 mL'sini alın ve 9 mL'lik bir deiyonize su boşluğuna (1 x 10-3 seyreltme) aktarın. İyice vorteks.
- Seçici ortam üzerinde toprak seyreltmelerinin kaplanması.
- Laminer bir akış kabini altında çalışırken, steril bir noktaya sahip bir mikropipet kullanarak 1 x 10-3 seyreltmenin 100 μL'sini toplayın ve bir hümik agar Petri kabına aktarın. Bunu en az 4 veya 5 Petri kabı için yapın.
- Steril tek kullanımlık L şeklinde hücre yayıcı kullanarak seyreltmeyi Petri kabı yüzeyine eşit olarak dağıtın.
- Laminer akış kabininin altında 10-15 dakika boyunca hava ile kurumaya bırakın.
- 1.4.1.-1.4.3 adımlarını yineleyin. lignoselüloz Petri yemekleri kullanarak.
- En fazla 15 gün boyunca karanlıkta 25 ° C'de inkübe edin.
- Seçici ortamdan büyüme ortamına kadar yetiştirilen mantar kolonilerinin izolasyonu.
- Hazırlıktan 3 gün sonra başlayarak, hazırlanan seçici ortam Petri kaplarını maksimum 15 gün boyunca herhangi bir mantar kolonisi büyümesi için günlük olarak kontrol edin.
- Benzerlikler için mevcut tüm mantar kolonilerini kontrol edin. Gerekirse, ışık mikroskobu altında gözlemlenecek bir slayt hazırlayın.
NOT: Amaç, en fazla sayıda mantar kolonisini izole etmektir, ancak aynı mantar suşunu her zaman farklı plakalardan izole etmekten kaçınmak gerekir, bu nedenle bu kontrol çok önemlidir. Farklı makro ve mikromorfolojiye sahip kolonileri arayın. - Bir laminer akış dolabı altında veya bir Bunsen brülöründe, seçilen her mantar suşunu, steril bir aşılama iğnesi ile koloniden miselyumun küçük bir kısmını nazikçe çıkararak ve yeni bir MEA Petri kabına aktararak izole edin.
NOT: Bu aşamada, hassas ve hassas olmak çok önemlidir, çünkü orijinal Petri kabında bulunan diğer mantar kolonilerinden kaynaklanan kontaminasyon riski yüksektir. Aşılanmış MEA plakasında birden fazla mantar suşu büyürse, Adım 1.5.3'ü tekrarlayın. - 7 gün boyunca karanlıkta 25 ° C'de inkübe edin. Bunlar, spesifik inatçı maddeler üzerinde daha fazla test edilecek mantar suşlarıdır.
2. İnatçı maddeler üzerinde büyüme testleri
- Petrolatum üzerinde büyüme testi.
- 20 mL sıvı BH'yi (3,26 g/L BH) 50 mL şişelere aktarın ve 20 dakika boyunca 121 °C'de otoklavlayarak sterilize edin.
- 7 mL deiyonize suyu 15 mL cam şişelere aktarın ve her şişeye bazı kırık cam örtü parçaları ekleyin.
- 20 dakika boyunca 121 ° C'de otoklavlama yaparak sterilize edin.
- Laminer akış kabininin altında, steril bir pipet kullanarak her 50 mL BH şişesine 1 mL petrolatum ekleyin. Bazı şişeleri negatif kontrol olarak sadece BH ile saklayın.
- Laminer akış kabininin altında, steril bir iğne kullanarak seçilen mantar suşları (Adım 1.5.3'te hazırlanan) ile ortamın yüzeyindeki miselyumu MEA plakalarından çıkarın ve kırık kapaklarla 15 mL cam şişelere aktarın.
- Her şişeyi bir vorteks karıştırıcı üzerinde 2 dakika boyunca çalkalayın, kırık örtülerin mantar kolonisinin küpünü kesmesine izin vererek mantar süspansiyonu yapın.
- Her petrolatum şişesini 200 μL mantar süspansiyonu ile aşılayın. Her mantar suşu için iki kopya yapın.
- Negatif kontrol için, sadece sıvı BH içeren şişelere 200 μL mantar süspansiyonu koyun. Ayrıca, ortamdaki kontaminasyonu kontrol etmek için herhangi bir mantar aşılaması olmadan petrolatumlu birkaç şişe bulundurun.
- Şişeleri karanlıkta 25 ° C'de inkübe edin ve inokülumdan 15 gün ve 30 gün sonra kontrol edin.
- Kullanılmış motor yağı üzerinde büyüme testi.
- 1 L deiyonize suya 3.26 g BH ve 15 g agar koyun ve 121 ° C'de (BHA) 20 dakika boyunca otoklav yapın.
- BHA'yı laminer bir akış dolabı altında Petri kaplarına yerleştirin.
- Katılaştığında, 500 μL kullanılmış motor yağını BHA Petri tabaklarına aktarın ve steril tek kullanımlık L şeklinde bir hücre yayıcı kullanarak plaka yüzeylerine eşit olarak dağıtın.
- Kullanılmış her motor yağı BHA plakasını her mantar suşu ile aşılayın ve miselyumu Adım 1.5.3'te hazırlanan plakalardan toplayın. Kirlenmeyi önlemek için bir Bunsen brülöründe veya laminer akış davlumbazının altında çalışın. Her mantar suşu için iki kopya yapın.
- Negatif kontrol için, Petri yemeklerini yalnızca BHA ile aşılayın. Ayrıca, ortamdaki kontaminasyonu kontrol etmek için herhangi bir mantar aşılaması olmadan birkaç kullanılmış motor yağı BHA Petri kabı bulundurun.
- Petri bulaşıklarını karanlıkta 25 ° C'de inkübe edin ve inokülumdan 15 gün ve 30 gün sonra kontrol edin.
- Plastikler üzerinde büyüme testi.
- 200 μL mantar süspansiyonunu (Adım 2.1.5.-2.1.6.) 96 mikrovelli bir plakaya aktarın. Mantar suşu-plastik kombinasyonunun üç kopyasını yapın.
- Mantar süspansiyonlu her bir oyuğa, 10 mg farklı türde plastik toz ekleyin (polietilen tereftalat - PET, polivinil klorür - PVC, yüksek yoğunluklu polietilen - HDPE, polistiren - PS, poliüretan - PUR).
- Negatif kontrol için, plastik tozu eklemek yerine, mantar süspansiyonu ile kuyucuğa 200 μL sterilize BH çözeltisi ekleyin. Ayrıca, her plastik toz türü için, ortamın kirlenip kirlenmediğini kontrol etmek için bir kuyuyu 200 μL sterilize BH çözeltisi ve her plastik tozdan 10 mg ile doldurun.
- Mikrowell plakalarını karanlıkta 25 ° C'de inkübe edin ve inokülumdan 15 gün ve 30 gün sonra kontrol edin.
3. Kalitatif enzimatik testler
- Kalitatif ligninolitik enzimlerin kolorimetrik testi.
- 1 L deiyonize suya 27 g patates dekstroz suyu (PD) ve 15 g agar koyun ve 121 ° C'de (PDA) 20 dakika boyunca otoklav yapın.
- Ortam biraz soğuduğunda ancak hala sıvı olduğunda, laminer bir akış başlığının altına gallik asit (5 g / L) ekleyin ve ortamı Petri kaplarına tabaklayın.
- PDA + gallik asit plakalarını her mantar suşu ile aşılayın, miselyumu Adım 1.5.3'te hazırlanan plakalardan toplayın. Kirlenmeyi önlemek için bir Bunsen brülöründe veya laminer akış davlumbazının altında çalışın.
- Negatif kontroller olarak, Petri yemeklerini sadece PDA (gallik asit olmadan) ile hazırlayın ve bunları mantar suşları (her mantar suşu için bir tane) ve ayrıca PDA + gallik asit içeren ve mantar aşılaması olmayan bir Petri kabı ile aşılayın.
- Petri bulaşıklarını karanlıkta 25 ° C'de inkübe edin ve inokülumdan 7 gün sonra kontrol edin.
- Kalitatif lakslar kolorimetrik test.
- 1 L deiyonize suya 27 g PD ve 15 g agar koyun ve 121 ° C'de (PDA) 20 dakika boyunca otoklav yapın.
- Ortam biraz soğuduğunda ancak hala sıvı olduğunda, laminer bir akış başlığının altına guaiacol (400 μL / L) ekleyin ve Petri kaplarına tabaklayın.
- PDA + guaiacol plakalarını her mantar suşu ile aşılayın, miselyumu Adım 1.5.3'te hazırlanan plakalardan toplayın. Herhangi bir kontaminasyonu önlemek için bir Bunsen brülöründe veya laminer akış davlumbazının altında çalışın.
- Negatif kontroller olarak, Petri yemeklerini sadece PDA ile hazırlayın (guaiacol yok) Ve bunları mantar suşlarıyla (her mantar suşu için bir tane) ve ayrıca PDA + guaiacol ile bir Petri kabı ile aşılayın ve mantar aşılaması yok.
- Petri bulaşıklarını karanlıkta 25 ° C'de inkübe edin ve inokülumdan 7 gün sonra kontrol edin.
- Kalitatif proteaz testi.
- K 2 HPO 4 (1 g/L), KH 2 PO 4 (0,5 g/L), MgSO4·7H 2 O (0,5 g/L), MnCl 2·4H 2 O (0,001 g/L), CuCl 2·2H 2 O (1,4 x 10-5 g/L), ZnCl 2 (1,1 x 10-5 g/L), CoCl 2·6H 2 O (2x 10-5 g/L), Deiyonize suya Na 2 MoO4·2H2 O (1.3 x 10-5 g/L), FeCl3·6H2O(7.5 x 10-5 g/L) ve jelatin/pepton (0.02 g/L).
- EVET ortamını, ortamın içinde 10 dakika boyunca manyetik bir karıştırma çubuğu bulunan manyetik bir karıştırıcıya (ısı yok) yerleştirin.
- Tüm tuzlar ortama çözündüğünde, çözeltinin 5 mL'sini 20 mL steril cam şişelere aktarın ve 121 ° C'de 20 dakika boyunca otoklav yapın.
- Negatif kontrol için, 5 mL BH çözeltisi içeren yaklaşık 20 mL steril cam şişeler hazırlayın ve bunları 121 ° C'de 20 dakika boyunca otoklav yapın.
- Bir laminer akış kabini altında, her bir suş için 200 μL mantar süspansiyonunu (Adım 2.1.5.-2.1.6.) EVET orta sterilize şişelere aktarın (mantar suşu başına en az 2 kopya yapın). Her mantar suşu için, negatif bir kontrole sahip olmak için BH sterilize şişelere aynı mantar süspansiyonundan 200 μL ekleyin.
- Şişeleri 21 gün boyunca karanlıkta 25 ° C'de inkübe edin ve her 7 günde bir kontrol edin.
- Kalitatif esterazlar testi.
- Pepton (10 g / L), NaCl (5 g / L), CaCl2 (0.1 g / L) ve 10 mL Tween 80 ila 1 L deiyonize su ekleyerek Ara 80 ortamını hazırlayın.
- Aradaki 80 ortamını, ortamın içinde 10 dakika boyunca manyetik bir karıştırma çubuğu bulunan manyetik bir karıştırıcıya (ısı yok) yerleştirin.
- Her şey ortamın içinde eritildiğinde, çözeltinin 5 mL'sini 20 mL steril cam şişelere aktarın ve 121 ° C'de 20 dakika boyunca otoklav yapın.
- Negatif kontrol için, 5 mL BH çözeltisi içeren yaklaşık 20 mL steril cam şişeler hazırlayın ve bunları 121 ° C'de 20 dakika boyunca otoklav yapın.
- Bir laminer akış kabini altında, her bir suş için 200 μL mantar süspansiyonunu (Adım 2.1.5.-2.1.6.) Aradaki 80 orta sterilize şişeye aktarın (mantar suşu başına en az 2 kopya yapın). Her mantar suşu için, negatif kontrol için BH sterilize şişelerine aynı mantar süspansiyonundan 200 μL ekleyin.
- Şişeleri 21 gün boyunca karanlıkta 25 ° C'de inkübe edin ve her 7 günde bir kontrol edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seçici medya yöntemleri (protokolün 1. Bölümü), toprağın zengin biyolojik çeşitliliğinin taranmasına ve biyoremediasyon potansiyeli yüksek mantarların seçilmesine izin verdi. Hümik asit ve lignoselüloz ortamı ile 100'den fazla mantar suşu izole edildi. Bu mantarlar, birçok kirleticiye benzeyen kimyasal bir yapıya sahip olan doğal inatçı malzemelerin biyolojik parçalanmasında rol oynayan enzimler üretti. Bununla birlikte, seçici medya ile izole edilen mantar suşlarının daha fazla taranması gerekiyordu. Spesifik olarak, seçici testler hümik asitleri ve lignoselülozu bozabilen suşları izole etti, büyüme testleri, izole edilmiş mantarları tek karbon kaynağı olarak belirli bir kirletici kullanabilenler için taradı ve kalitatif enzimatik testler metabolik aktivitelerini tanımladı.
Büyüme testleri, hidrokarbonları (petrolatum ve kullanılmış motor yağı) ve plastikleri (PET, PVC, HDPE, PS, PUR) bozmak için mantar kabiliyetine odaklanmıştır. Bu maddelerin her biri, seçilen mantar suşları için tek karbon kaynağı olarak bir testte kullanılmıştır. Bu maddelerden yararlanma mantar yeteneği, eklenen maddeye sahip örnekler ile sadece minimum ortama sahip kontrol örnekleri (teste bağlı olarak BH veya BHA) arasındaki koloni büyümesindeki fark olarak değerlendirildi. Sonuçları tanımlamak için nitel bir ölçek kullanılmıştır (Şekil 1), kontrol ile büyüme farkının yokluğundan (0) düşük (+), orta (++) ve büyümedeki yüksek (+++) fark seviyelerine kadar.
Şekil 1: Büyüme testlerinde mantar suşlarının büyüme başarı oranı. Petrolatum, kullanılmış motor yağı ve plastik tozlarda (polietilen tereftalat, PET; polivinil klorür, PVC; yüksek yoğunluklu polietilen, HDPE; polistiren, PS; poliüretan, PUR) farklı başarı derecelerine sahip tek karbon kaynağı olarak büyüyebilen mantar suşlarının yüzdesi (büyüme yok, 0; düşük büyüme, +; orta büyüme, ++; yüksek büyüme, +++). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Petrolatum ve kullanılmış motor yağı testleri, seçilen mantar suşlarının hidrokarbon biyobozunma potansiyelini değerlendirdi. Uzun zincirli alkanların (>C25) bir karışımı olan petrolatum, tek karbon kaynağı olarak kullanılmıştır. Bu maddeden yararlanma mantar yeteneği, BH + petrolatum içeren şişeler ile sadece BH'li kontrol şişeleri arasındaki koloni büyümesindeki fark olarak değerlendirildi (Şekil 2). Test edilen mantar suşlarının neredeyse% 75'i tek karbon kaynağı olarak petrolatum kullanabildi ve suşların% 21'i maksimum büyüme (+++, Şekil 1) sergiledi.
Şekil 2: Tek karbon kaynağı olarak petrolatum üzerindeki nitel büyüme ölçeğinin resimleri. Kalitatif ölçek, tedavi edilen numuneler ile BH kontrolü arasındaki büyüme farkına dayanmaktadır. Büyüme farkının yokluğundan (0), düşük (+), orta (++) ve yüksek (+++) büyüme farkı seviyelerine kadar değişir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Kullanılmış motor yağı, hidrokarbonların, motor katkı maddelerinin ve metallerin karmaşık bir karışımıdır. Büyüme testlerinde, karmaşık ve toksik bir hidrokarbon karışımını karbon kaynağı olarak kullanma mantar yeteneğini değerlendirmek için kullanılmıştır. Diğer büyüme testleri gibi, büyüme de plakalardaki mantar büyümesi ile motor yağı ile sadece BHA içeren kontrol plakalarındaki büyüme karşılaştırılarak değerlendirilmiştir (Şekil 3). Büyüme sonuçları seçici ortamın etkinliğini doğruladı (protokolün 1. Bölümü). Gerçekten de, izole mantar suşlarının neredeyse% 90'ı kullanılmış motor yağında büyüyebildi,% 39'u maksimum büyüme (+++, Şekil 1) gösterdi.
Şekil 3: Tek karbon kaynağı olarak kullanılmış motor yağındaki nitel büyüme ölçeğinin resimleri. Kalitatif ölçek, tedavi edilen numuneler ile BHA kontrolü arasındaki büyüme farkına dayanmaktadır. Büyüme farkının yokluğundan (0), düşük (+), orta (++) ve yüksek (+++) büyüme farkı seviyelerine kadar değişir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Plastik tozlar üzerindeki büyüme testleri, birincil karbon kaynağı olarak belirli plastik polimerleri kullanabilecek mantar suşlarını seçmek için kullanıldı; Bu nedenle, bu suşlar plastik biyoremediasyon için yüksek bir potansiyele sahiptir. Çok kuyulu plakalardaki büyüme stereomikroskop ile gözlendi ve büyüme yokluğundan (0) yüksek hifa üretimine (+++) kadar değişen nitel bir ölçek kullanılarak değerlendirildi. PUR, mantar suşlarının en yüksek yüzdesine sahip olan plastik tozdu (% 92), suşların% 31'i maksimum büyüme (+++) gösterdi. Hümik asit ve lignoselüloz ortamından izole edilen suşların yaklaşık% 70'i PS tozu üzerinde büyürken, neredeyse% 60-65'i HDPE, PVC ve PET'i tek karbon kaynağı olarak kullanabildi. Bu nedenle, mantarların büyük bir yüzdesi, çok kuyulu plakalardaki farklı plastik tozlar üzerinde büyüyebildi, ancak bunların çok düşük bir kısmı plastiklerin yüksek kolonizasyonunu gösterdi. Gerçekten de, suşların sadece% 10'u PET ve HDPE üzerinde gelişebildi ve% 13'ü PS üzerinde gelişebildi. Yüksek mantar büyümesinin düzenli olarak gözlendiği tek plastik, mantar suşlarının yaklaşık% 30'unun çok bol miktarda büyümeyi başardığı PUR idi.
İnatçı maddelerin biyolojik bozunma süreçlerinde yer alan enzimleri üretebilen mantar suşlarını tespit etmek için kalitatif enzimatik testler yapıldı. Peroksidazlar ve lakkazlar, gallik asit ve guaiakol testlerinde (protokolün Adım 3.1. ve Adım 3.2.) ortamının alt tarafındaki kahverengimsi bir halo ile üretimi belirtilen linyonolitik enzimlerdir. Her iki testte de, rengin yoğunluğundaki artış, bu enzimlerin daha yüksek bir üretimini göstermiştir (Şekil 4).
Şekil 4: Kalitatif linolitik enzimlerin kalitatif ölçeğinin resimleri. Kalitatif ölçek, koloni çevresinde kırmızı / kahverengimsi bir halenin üretilmesine dayanmaktadır. 0 = etkinlik yok, + = bazı etkinlikler, ++ = yüksek etkinlik, +++ çok yüksek etkinlik. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Test edilen mantarların yaklaşık% 60'ı, seçici ortamın başarısını gösteren linyonolitik enzimler üretebildi. Ayrıca, izole mantar suşlarının% 12'si gallik asit ortamında koloni etrafında (+++) yoğun bir koyu halo üretti,% 17'si guaiacol ortamında (lakkazlar) bunu yaptı ve bu enzimlerin yüksek mantar sekresyonunu gösterdi (Şekil 5).
Şekil 5: Kalitatif enzimatik testler sırasında mantar suşlarına göre enzim aktivitesi oranı. Karşılık gelen kalitatif enzimatik testleri sırasında farklı başarı seviyelerine sahip ligninolitik enzimler, lakkazlar, proteazlar ve esterazlar üretebilen mantar suşlarının yüzdesi (0 = aktivite yok, + = aktivite, ++ yüksek aktivite, +++ çok yüksek aktivite). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Mantar aktivitesini analiz etmek için kullanılan bir diğer tarama testi, EVET orta boy şişeleri ile BH'li kontrol şişeleri arasındaki mantar büyümesindeki farka dayanan proteaz testiydi. Bununla birlikte, EVET ortamındaki mantar suşlarının yaklaşık% 70'i, kontrollere benzer bir büyüme gösterdi ve hatta büyümeyi azalttı. Hiçbir mantar suşu maksimum fark seviyesine (+++) ulaşmadı. Bu sonuçlar, bu testin proteaz aktivitesinin taranması için uygun olmayabileceğini düşündürmektedir.
Son olarak, esterazların aktivitesi Tween 80 ortamında beyaz bir çökelti oluşumu ile değerlendirildi (Şekil 5). Seçilen mantar suşlarının neredeyse% 60'ı esteraz aktivitesi gösterdi ve% 13'ü çökeltinin (+++) yüksek bir oluşumunu gösterdi, bu da% 13'teki suşların biyolojik bozunma potansiyellerini incelemek için seçilmesi gerektiğini düşündürmektedir (Şekil 5).
Tüm büyüme ve enzimatik testlerle ilgili olarak, en başarılı suşlar (yani, en az bir testte +++ elde edenler) en ilginç olanlardı. Bu mantar suşları, inatçı maddeleri tek karbon kaynağı olarak verimli bir şekilde kullanabildiler veya inatçı maddelerin biyolojik olarak parçalanmasında rol oynayan yüksek düzeyde enzimler ürettiler. Gerçekten de, test edilen 115 mantar suşundan 39'u hidrokarbon kaynakları (petrolatum veya kullanılmış motor yağı) üzerinde (+++) gelişebildi ve 58'i en az bir plastik polimer üzerinde yüksek büyüme gösterdi. Sadece 32'si, yapılan enzimatik testlerden en az birinde çok yüksek enzimatik aktivite (+++) göstermiştir. Bu sonuçlar, herhangi bir yüksek performanslı suşu seçmeyen proteaz testi dışında, bildirilen tüm tarama testlerinin yüksek etkinliğini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Toprağın zengin biyolojik çeşitliliği, bazıları biyoremediasyon için potansiyel adaylar olabilecek çok sayıda metabolik yeteneğe sahip bol miktarda mantar kaynağıdır. Seçici ortam testleri (protokolün 1. Bölümü), tek karbon kaynağı olarak doğal kompleks polimerler üzerinde büyüyebilen mantarları izole etmek için gerçekleştirilmesi kolay ve etkili yöntemlerdir. Mantarlar, ligninolitik enzimler lakkazlar ve peroksidazlar31 gibi hücre dışı, spesifik olmayan hidrolazlar ve oksidoredüktazlar30 üretebilir. Bu enzimler lignoselüloz ve hümik asitleri bozabilir, aynı zamanda hidrokarbonlar, aromatik bileşikler ve klorlu organik bileşikler dahil olmak üzere birçok farklı ksenobiyotik32.
Açıklanan yöntemler, yorumlanması kolay ve gerçekleştirilmesi düşük maliyetli sonuçlar üretir. Bu özellikler, uzman olmayanlar tarafından kullanılmalarına izin verir. Bununla birlikte, sterilite ve morfolojik tanımlama gibi bazı hususlar özel dikkat gerektirir. Örneğin, toprak süspansiyonunun 30 dakikalık ajitasyonu (Adım 1.3.4.), mantar sporlarının ve propagüllerin toprak mikroyapısından serbest bırakılması ve çözelti içinde askıya alınabilmesi için gereklidir. Bu şekilde, bu toprak süspansiyonunun seyreltmelerini kaplayarak, maksimum mantar suşu sayısını izole etmek mümkündür. Mantar suşlarının makro ve mikroskobik morfolojik tanımlanması, suşlar arasında ayrım yapmak ve aynı mantar suşunun birden çok kez izole edilmesini önlemek için önemlidir. Dahası, sterilite ve mikrobiyal kontaminasyonlardan kaçınmak çok önemlidir, çünkü diğer aktif mantar suşlarının varlığı, çalışılan kolonilerin aktivitesini yanlış temsil edebilir.
Seçici testlerden sonra, petrolatum, kullanılmış motor yağı ve farklı plastik polimerler gibi farklı inatçı maddeler üzerinde bir dizi büyüme testi yapıldı. Bu aşama, ilgilenilen inatçı maddelere göre özelleştirilebilir. Önemli adım, seçilen maddeyi BH veya BHA'ya tek karbon kaynağı olarak eklemek ve mantar büyümesini, ilave inatçı madde olmadan bir kontrole karşı kontrol etmektir.
Plastik ve hidrokarbonlar üzerindeki büyüme testlerinin amacı, mantarın malzeme üzerindeki büyümesini niteliksel olarak gözlemleyerek bu maddeleri tek karbon kaynağı olarak kullanıp kullanamayacağını değerlendirmekti. Ne yazık ki, bu malzemelerin aşırı inatçılığı nedeniyle, substratın ağırlığındaki gerçek düşüşü ve mantar biyokütlesinin ağırlığındaki artışı, özellikle nispeten kısa bir süre sonra ölçmek çok zordur. Bir mantar suşu bu tarama büyüme testlerinde çok iyi performans gösterirse, inatçı maddenin bozulmasını ölçmek için daha ileri çalışmalar yapılmalıdır.
Kullanılan enzimatik testler (protokolün 3. Bölümü), verimli ve hızlı performans gösterdikleri için seçilmiştir, ancak yalnızca nitel sonuçlar üretirler. Bir mantar suşunun bozulma potansiyelini vurgularlar, ancak tam olarak ölçemezler. Özellikle ilgi çekici bir suş izole edilirse, metabolik aktiviteyi daha kesin bir şekilde tanımlamak için spektrofotometrik kantitatif enzim denemeleri gibi daha ileri testler yapılabilir. Suboptimal etkinlik gösteren tek enzimatik test, EVET ortamında büyüyebilen düşük sayıda suş ile kalitatif proteaz testiydi. Gerçekten de, PUR'da büyüyebilen suşların yüksek yüzdesi, mantarların amid ve üretan bağlarının kırılmasında rol oynayan proteazlar ürettiğini, ester bağlarını hedef alan ester bağlarını hedef alan ester40. Proteaz üreten mantarların neredeyse tamamen yokluğu, kullanılan yöntemde bir sorun olabileceğini düşündürmektedir. Proteaz aktivitesi için kazein41, yağsız süt42 veya süt tozu43 agar plakası testleri gibi diğer testler de kabul edilebilir. Gallik asit testinin linyonolitik enzimlerin üretimini tespit etmek için çok yararlı olduğu kanıtlandı, ancak ne yazık ki, çok spesifik değildi ve üretilen lininolitik enzimin tipini (peroksidazlar veya lakkazlar) ayırt edemedi.
Bu çalışmanın sonuçları, seçici ortam olarak lignoselüloz veya hümik asitlerin kullanılmasının, biyoremediasyon potansiyeline sahip mantar suşlarının zengin toprak biyoçeşitliliğinden izole edilmesine izin verdiğini göstermektedir. Gerçekten de, seçici yöntemlerle izole edilen mantar suşlarının% 70'inden fazlası petrolatum veya kullanılmış motor yağı üzerinde büyüyebildi ve% 60'ı tek karbon kaynağı olarak farklı plastik polimerlerde büyüyebildi. Ayrıca, kalitatif enzimatik testler, bu mantarların biyolojik bozunma süreçlerine bağlı metabolik aktivitesini tanımlamıştır. Bir veya daha fazla testte +++ aktivitesi gösteren mantar suşlarının seçimi önerilir, çünkü biyoremediasyonda çok aktif olan bir mantar suşu bulma şansını arttırır. Tarama testlerimizle seçilen mantar suşları ile uzun süreli temastan sonra inatçı maddeler üzerinde gaz kütle-kromatografisi (GC-MS) kullanılarak yapılan testler, materyallerin gerçek biyolojik bozunmasını göstermiştir 9,44. Bu basit tarama testlerinin farklı ekosistemlerde kullanılması, farklı topraklardaki mantar biyoçeşitliliğinin araştırılmasına izin verecektir. İnatçı materyalleri bozabilecek mantarların araştırılması, biyoremediasyon potansiyeline sahip tanımlanmış suşların sayısını artıracak ve büyüyen çevre kirliliği sorununun üstesinden gelmeye yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Pavia Üniversitesi'nden Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) ve Profesör Solveig Tosi'ye bu çalışma için fırsat sağladıkları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
References
- Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
- Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S. Key fungal degradation patterns, enzymes and their applications for the removal of aliphatic hydrocarbons in polluted soils: A review. International Biodeterioration and Biodegradation. 147, (2020).
- Asemoloye, M. D., Ahmad, R., Jonathan, S. G. Synergistic action of rhizospheric fungi with Megathyrsus maximus root speeds up hydrocarbon degradation kinetics in oil polluted soil. Chemosphere. 187, 1-10 (2017).
- Abatenh, E., Gizaw, B., Tsegaye, Z., Wassie, M. The role of microorganisms in bioremediation - A review. Open Journal of Environmental Biology. 2, 038-046 (2017).
- Dix, N. J., Webster, J. Fungal Ecology. , Chapman & Hall. Cambridge, UK. (1995).
- Magan, N. Fungi in extreme environment. Environmental and Microbial Relationships. The Mycota. Esser, K., Lemke, P. A. 4, Springer. Berlin, Heidelberg. 99-114 (2007).
- Aranda, E. Promising approaches towards biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons with Ascomycota fungi. Current Opinion in Biotechnology. 38, 1-8 (2016).
- Hasan, I. F., AI-Jawhari, Role of Filamentous Fungi to Remove Petroleum Hydrocarbons from the Environment. Microbial Action on Hydrocarbons. Kumar, V., Kumar, M., Prasad, R. , Springer. Singapore. (2018).
- Daccò, C., et al. Trichoderma: evaluation of its degrading abilities for the bioremediation of hydrocarbon complex mixtures. Applied Sciences. 10 (9), 3152 (2020).
- Alarcón, A., Davies, F. T., Autenrieth, R. L., Zuberer, D. A. Arbuscular mycorrhiza and petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation of petroleum-contaminated soil. International Journal of Phytoremediation. 10, 251-263 (2008).
- Mancera-López, M. E., et al. Bioremediation of an aged hydro-carbon-contaminated soil by a combined system of biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi. International Biodeterioration and Biodegradation. 61, (2008).
- Hatami, E., Abbaspour, A., Dorostkar, V. Phytoremediation of a petroleum-polluted soil by native plant species in Lorestan Province, Iran. Environmental Science and Pollution Research. 26, 24323-24330 (2019).
- Prenafeta-Boldú, F. X., De Hoog, G. S., Summerbell, R. C. Fungal communities in hydrocarbon degradation. Microbial Communities Utilizing Hydrocarbons and Lipids: Members, Metagenomics and Ecophysiology. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , Springer. Cham. 1-36 (2018).
- Gu, J., Ford, T., Mitton, D., Mitchell, R. Microbiological degradation of polymeric materials. Uhlig's Corrosion Handbook. , John Wiley and Sons. 421-438 (2011).
- Tuomela, M., Hatakka, A. Oxidative fungal enzymes for bioremediation. Comprehensive Biotechnology: Environmental and Related Biotechnologies. 6, Elsevier. 224-239 (2019).
- DSouza, G. C., et al. Fungal biodegradation of low-density polyethylene using consortium of Aspergillus species under controlled conditions. Heliyon. 7 (5), 07008 (2021).
- El-Sayed, M. T., Rabie, G. H., Hamed, E. A. Biodegradation of low-density polyethylene (LDPE) using the mixed culture of Aspergillus carbonarius and A. fumigates. Environment, Development, and Sustainability. 23 (10), 14556-14584 (2021).
- Sepperumal, U., Markandan, M., Palraja, I. Micromorphological and chemical changes during biodegradation of polyethylene terephthalate (PET) by Penicillium sp. Journal of Microbiology and Biotechnology Research. 3 (4), 47-53 (2013).
- Leitão, A. L. Potential of Penicillium species in the bioremediation field. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6 (4), 1393-1417 (2009).
- Chen, S. H., Ting, A. S. Y. Biosorption and biodegradation potential of triphenylmethane dyes by newly discovered Penicillium simplicissimum isolated from indoor wastewater sample. International Biodeterioration & Biodegradation. 103, 1-7 (2015).
- Orhan, Y., Buyukgungor, H. Enhancement of biodegradability of disposable polyethylene in controlled biological soil. International Biodeterioration and Biodegradation. 45, 49-55 (2000).
- Deshmukh, R., Khardenavis, A. A., Purohit, H. J. Diverse metabolic capacities of fungi for bioremediation. Indian journal of microbiology. 56 (3), 247-264 (2016).
- Viswanath, B., Rajesh, B., Janardhan, A., Kumar, A. P., Narasimha, G. Fungal laccases and their applications in bioremediation. Enzyme research. 2014, 163242 (2014).
- Ali, M., Husain, Q., Ishqi, H. M. Fungal peroxidases mediated bioremediation of industrial pollutants. Fungal Bioremediation. , CRC Press. Boca Raton. (2019).
- Nousiainen, P., Kontro, J., Manner, H., Hatakka, A., Sipilä, J. Phenolic mediators enhance the manganese peroxidase catalyzed oxidation of recalcitrant lignin model compounds and synthetic lignin. Fungal Genetics and Biology. 72, 137-149 (2014).
- Srivastava, S., Kumar, M. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): A sustainable approach. Sustainable Green Technologies for Environmental Management. , Springer. Singapore. (2019).
- Wei, R., Zimmermann, W. Microbial enzymes for the recycling of recalcitrant petroleum-based plastics: how far are we. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1308-1322 (2017).
- Matsubara, M., Lynch, J. M., De Leij, F. A. A. M. A simple screening procedure for selecting fungi with potential for use in the bioremediation of contaminated land. Enzyme and Microbial Technology. 39 (7), 1365-1372 (2006).
- Mann, J., et al. Screening and selection of fungi for bioremediation of olive mill wastewater. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (3), 567-571 (2010).
- Andlar, M., Rezić, T., Marđetko, N., Kracher, D., Ludwig, R., Šantek, B. Lignocellulose degradation: an overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18, 768-778 (2018).
- Goméz-Toribio, V., García-Martín, A. B., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Guillén, F. Induction of extracellular hydroxyl radical production by white-rot fungi through quinone redox cycling. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3944-3953 (2009).
- Belcarz, A., Ginalska, G., Kornillowicz-Kowalska, T. Extracellular enzyme activities of Bjerkandera adusta R59 soil strain, capable of daunomycin and humic acids degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 68 (5), 686-694 (2005).
- Stevenson, F. J. Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2nd ed. , Wiley. New York. (1995).
- Andlar, M., et al. Lignocellulose degradation: An overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18 (11), 768-778 (2018).
- Lee, H., et al. Biotechnological procedures to select white rot fungi for the degradation of PAHs. Journal of Microbiological Methods. 97 (1), 56-62 (2014).
- Batista-García, R. A., et al. Simple screening protocol for identification of potential mycoremediation tools for the elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons and phenols from hyperalkalophile industrial effluents. Journal of Environmental Management. 198, 1-11 (2017).
- Shleev, S. V., et al. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie. 86 (9-10), (2004).
- Kiiskinen, L. L., Rättö, M., Kruus, K. Screening for novel laccase-producing microbes. Journal of Applied Microbiology. 97, (2004).
- Kumar, V. V., Rapheal, V. S. Induction and purification by three-phase partitioning of aryl alcohol oxidase (AAO) from Pleurotus ostreatus. Applied Biochemistry and Biotechnology. , 163 (2011).
- Loredo-Treviño, A., Gutiérrez-Sánchez, G., Rodríguez-Herrera, R., Aguilar, C. N. Microbial enzymes involved in polyurethane biodegradation: a review. Journal of Polymers and the Environment. 20 (1), 258-265 (2012).
- Garriga, M., et al. Technological and sensorial evaluation of Lactobacillus strains as starter cultures in fermented sausages. International Journal of Food Microbiology. 32 (1-2), 173-183 (1996).
- Zerdani, I., Faid, M., Malki, A. Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp. In microcco. African Journal of Biotechnology. 3 (1), 67-70 (2004).
- Nygren, C. M., Edqvist, J., Elfstrand, M., Heller, G., Taylor, A. F. Detection of extracellular protease activity in different species and genera of ectomycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 17 (3), 241-248 (2007).
- Asemoloye, M. D., et al. Hydrocarbon degradation and enzyme activities of Aspergillus oryzae and Mucor irregularis isolated from Nigerian crude oil-polluted sites. Microorganisms. 8 (12), 1912 (2020).
