Summary
Denne protokollen presenterer en detaljert oppsummering av strategier for å inokulere planterøtter med jordbårne mikrober. Eksemplifisert for sopp Verticillium longisporum og Verticillium dahliae, er tre forskjellige rotinfeksjonssystemer beskrevet. Potensielle anvendelser og mulige nedstrømsanalyser fremheves, og fordeler eller ulemper diskuteres for hvert system.
Abstract
Rhizosfæren har et svært komplekst mikrobielt samfunn der planterøtter stadig utfordres. Røttene er i nær kontakt med et bredt spekter av mikroorganismer, men studier på jordbårne interaksjoner ligger fortsatt bak de som utføres på overjordiske organer. Selv om noen inokulasjonsstrategier for å infisere modellplanter med modellrotpatogener er beskrevet i litteraturen, er det fortsatt vanskelig å få en omfattende metodisk oversikt. For å løse dette problemet beskrives tre forskjellige rotinokulasjonssystemer nettopp som kan brukes for å få innsikt i biologien til rotmikrobeinteraksjoner. For illustrasjon ble Verticillium arter (nemlig V. longisporum og V. dahliae) ansatt som rotinvaderende modellpatogener. Metodene kan imidlertid enkelt tilpasses andre rotkoloniserende mikrober - både patogene og fordelaktige. Ved å kolonisere planten xylem, viser vaskulære jordbårne sopp som Verticillium spp. en unik livsstil. Etter rotinvasjon sprer de seg via xylem-fartøyene akropetalt, når skytingen og fremkaller sykdomssymptomer. Tre representative plantearter ble valgt som modellverter: Arabidopsis thaliana, økonomisk viktig oljefrø voldtekt (Brassica napus) og tomat (Solanum lycopersicum). Trinnvise protokoller er gitt. Representative resultater av patogenisitetsanalyser, transkripsjonsanalyser av markørgener og uavhengige bekreftelser fra reporterkonstruksjoner vises. Videre diskuteres fordelene og ulempene ved hvert inokulasjonssystem grundig. Disse velprøvde protokollene kan bidra til å gi tilnærminger til forskningsspørsmål om rotmikrobeinteraksjoner. Å vite hvordan planter takler mikrober i jorda er avgjørende for å utvikle nye strategier for å forbedre landbruket.
Introduction
Naturlige jordarter er bebodd av et forbløffende antall mikrober som kan være nøytrale, skadelige eller gunstige for planter1. Mange plantepatogener er jordbårne, omgir røttene og angriper det underjordiske organet. Disse mikroorganismer tilhører et bredt utvalg av clades: sopp, oomycetes, bakterier, nematoder, insekter og noen virus 1,2. Når miljøforholdene favoriserer infeksjon, vil mottakelige planter bli syke og avlingene avtar. Effektene av klimaendringer, som global oppvarming og ekstremvær, vil øke andelen jordbårne plantepatogener3. Derfor vil det bli stadig viktigere å studere disse destruktive mikrober og deres innvirkning på mat og fôrproduksjon, men også på naturlige økosystemer. I tillegg er det mikrobielle gjensidige i jorda som tett samhandler med røtter og fremmer plantevekst, utvikling og immunitet. Når de konfronteres med patogener, kan planter aktivt rekruttere spesifikke motstandere i rhizosfæren som kan støtte vertsoverlevelse ved å undertrykke patogener 4,5,6,7. Imidlertid er mekanistiske detaljer og veier involvert i gunstige rotmikrobeinteraksjoner ofte fortsatt ukjente6.
Det er derfor viktig å utvide den generelle forståelsen av rotmikrobeinteraksjoner. Pålitelige metoder for å inokulere røtter med jordbårne mikroorganismer er nødvendige for å utføre modellstudier og overføre funnene til landbruksapplikasjoner. Gunstige interaksjoner i jorda studeres for eksempel med Serendipita indica (tidligere kjent som Piriformospora indica), nitrogenfiksing Rhizobium spp., eller mycorrhizal sopp, mens kjente jordbårne plantepatogener inkluderer Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp., og Verticillium spp.1. De to sistnevnte er soppgena som er globalt distribuert og forårsaker vaskulære sykdommer2. Verticillium spp. (Ascomycota) kan infisere hundrevis av plantearter - i stor grad dikotyledoner, inkludert urteaktige årlige, treaktige stauder og mange avlingsplanter 2,8. Hyphae av Verticillium kommer inn i roten og vokser både intercellulært og intracellulært mot den sentrale sylinderen for å kolonisere xylemfartøyene 2,9. I disse karene forblir soppen for det meste av livssyklusen. Siden xylem sap er næringsfattig og bærer planteforsvarsforbindelser, må soppen tilpasse seg dette unike miljøet. Dette oppnås ved sekresjon av koloniseringsrelaterte proteiner som gjør at patogenet kan overleve i verten10,11. Etter å ha nådd rotvaskulaturen, kan soppen spre seg i xylemkarene akropetalt til løvet, noe som fører til systemisk kolonisering av verten 9,12. På dette tidspunktet påvirkes anlegget negativt i vekst 9,10,13. For eksempel oppstår stunting og gule blader, samt for tidlig senescence 13,14,15,16.
Et medlem av dette slaget er Verticillium longisporum, som er svært tilpasset messing verter, som den agronomisk viktige oljefrø voldtekt, blomkål, og modellplanten Arabidopsis thaliana12. Flere studier kombinerte V. longisporum og A. thaliana for å få omfattende innsikt i jordbårne vaskulære sykdommer og de resulterende rotforsvarsresponsene 13,15,16,17. Enkel følsomhetstesting kan realiseres ved hjelp av V. longisporum / A. thaliana modellsystem og veletablerte genetiske ressurser er tilgjengelige for begge organismer. Nært relatert til V. longisporum er patogenet Verticillium dahliae. Selv om både sopparter utfører en lignende vaskulær livsstil og invasjonsprosess, er deres forplantningseffektivitet fra røtter til blader og de fremkalte sykdomssymptomene i A. thaliana forskjellige: mens V. longisporum vanligvis induserer tidlig senescence, resulterer V. dahliae infeksjon i vanning18. Nylig presenterte et metodisk sammendrag forskjellige rotinokulasjonsstrategier for å infisere A. thaliana med V. longisporum eller V. dahliae, som bistår i planlegging av eksperimentelle oppsett19. I felten forårsaker V. longisporum av og til betydelig skade i oljefrø voldtektsproduksjon12, mens V. dahliae har et svært bredt vertsområde som består av flere dyrkede arter, for eksempel vinranker, potet og tomat8. Dette gjør begge patogener økonomisk interessante modeller å studere.
Dermed bruker følgende protokoller både V. longisporum og V. dahliae som modellrotpatogener for å eksemplifisere mulige tilnærminger for rotinokulasjoner. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), oljefrø voldtekt (Brassica napus) og tomat (Solanum lycopersicum) ble valgt som modell verter. Detaljerte beskrivelser av metodene finner du i teksten nedenfor og den tilhørende videoen. Fordeler og ulemper for hvert inokulasjonssystem diskuteres. Samlet kan denne protokollsamlingen bidra til å identifisere en passende metode for spesifikke forskningsspørsmål i sammenheng med rotmikrobeinteraksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Medier for soppkulturer og planteokkulasjonssystemer
- Flytende potet dextrose buljong (PDB): Forbered 21 g/l PDB i ultrarent vann i en varmestabil kolbe.
- Flytende Czapek Dextrose Broth (CDB): Forbered 42 g/L CDB i ultrarent vann i en varmestabil kolbe.
- Medium for Petri parabolen inokuleringssystem: Forbered en varmestabil kolbe med 1,5 g /L Murashige og Skoog medium (MS) og 8 g/l agar i ultrarent vann.
MERK: Unngå sukker i dette mediet, da det vil føre til overdreven soppvekst etter inokulering. - Medium for det plastkoppbaserte inokulasjonssystemet: Forbered en varmestabil kolbe med 4,4 g/l MS, 0,2 g/L MgSO4, 1 g/L KNO3, 0,5 g/L 2-(N-morpholino)etanesulfonsyre (MES) og 6,0 g/l agar i ultrarent vann og juster pH til 5,7 med 5 M KOH.
MERK: Unngå sukker i dette mediet, da det vil føre til overdreven soppvekst etter inokulering. - 1/4 MS medium: Klargjør 1,2 g/l MS i ultrarent vann.
- Bruk autoklaven til å sterilisere alle løsningene ovenfor. Legg glassflaskene i kurven, lukk lokket og steriliser i 15 min ved 121 °C og 98,9 kPa.
2. Sterilisering av overflaten av plantefrø
MERK: Bruk protokollen nedenfor alltid til å sterilisere overflaten av frø fra Arabidopsis, oljefrø voldtekt og tomat før såing.
- Overfør frøene til et 2 ml reaksjonsrør. Plasser røret i en ekssiccator med en intern kapasitet på 5,8 L.
- Generer klorgass i ekssiccatoren ved å tilsette 6 ml 33% saltsyre (HCl) i 100 ml 12% vandig natriumhypokloritt (NaClO).
- Lukk straks lokket på ekssiccatoren og inkuber frøene i 3 timer i gassen.
3. Forbereder inokulum med Verticillium sporer (aseksuell avledet conidia)
MERK: Dyrk V. dahliae (stamme JR2) på samme måte som V. longisporum (stamme Vl43)17,18,19. Forsikre deg om at alt utstyr og medier er bakteriefrie og at alle trinn utføres i en laminær strømningshette for å holde inoculum axenic.
- Fyll 150 ml flytende PDB (trinn 1.1) i en 500 ml chicanery kolbe og supplere mediet med 500 mg / L cefotaxime.
- Tilsett Verticillium conida fra glyserol-lager lagring til PDB-mediet. Lukk kolben med en steril skumstopper.
- Inkuber kulturen i 7-10 dager i en mørk boks ved romtemperatur (RT) under kontinuerlig, horisontal risting (roterende shaker; 60 rpm). Dette resulterer i små, hvite mycelia sfærer.
- Fjern og kast PDB-supernatanten forsiktig. Det meste av mycelia bør forbli i kolben.
- Tilsett 100 ml flytende CDB (trinn 1.2) på mycelia i chicanery kolbe og supplere mediet med 500 mg / L cefotaxime.
- Inkuber ytterligere 4-5 dager i en mørk boks på RT under kontinuerlig, horisontal risting (roterende shaker, 60 rpm) for å indusere sporulering. Supernatanten blir gulgrå når conidia slippes ut.
- Filtrer en del (5-10 ml) av den konidiaholdige væsken gjennom et filterpapir (partikkelretensjonsnivå på 8-12 μm) i et sterilt 50 ml oppsamlingsrør. Dette skiller sporer fra mycelia.
- Bestem sporekonsentrasjonen ved hjelp av et celletellingskammer og et mikroskop. Fortynn med bakteriefritt 1/4 MS-medium i ultrarent vann til sporekonsentrasjonene nedenfor er oppnådd.
MERK: Under mikroskopet er conidia fra V. longisporum for det meste langtegnet og 7,1-8,8 μm i størrelse, mens V. dahliae conidia er kortere (3,5-5,5 μm) og ganske sfærisk20. - Bruk disse nyhøste conidia som inoculum. Sørg for å utføre forsøkene alltid med nyhøst conidia og ikke med frosne lagre, da frysing reduserer antall levedyktige sporer19 betydelig.
- For langtidslagring, frys sporene som høykonsentrert sporoppløsning (ca. 1 x 108 sporer/ml) i 25% glyserol ved -80 °C (kan lagres opptil 1 år). For de neste eksperimentene, bruk disse glyserollagrene til å inokulere PDB-mediet i trinn 3.2.
4. Et sterilt in vitro inokulasjonssystem basert på Petri-retter
MERK: For Petri-tallerkensystemet17 må du sørge for at alt utstyr og medier er bakteriefrie og at alle trinnene utføres i en laminær strømningshette.
- Etter autoklavering, hell mediet (se trinn 1.3) i Petri-retter.
- Etter herding av mediet, pakk Petri-rettene i en steril plastpose og oppbevar dem opp-ned over natten i kjøleskapet (4-10 °C). Et kjølt medium bidrar til å forhindre glidning av mediet i de neste trinnene.
- Klipp ut og fjern en infeksjonskanal og den øvre tredjedelen av det størknede mediet med en skalpell (figur 1A). Unngå å få væske eller luft under agarmediet mens du skjærer; Ellers vil mediet gli og lukke infeksjonskanalen.
- Fordel 50-100 overflatesteriliserte Arabidopsis frø med en steril pipettespiss på den kuttede øvre overflaten. Sett frøene i vinkelen der den kuttede agaroverflaten kommer i kontakt med veggen av Petri-parabolen slik at røttene kan vokse mellom mediet og Petri-parabolveggen. Dette vil lette inokulasjonen senere.
- Lukk Petri-rettene og forsegle dem med luftgjennomtrengelig tape for å tillate gassutveksling.
- Etter stratifisering i 2 dager i mørket ved 4 °C, plasser platene vertikalt i et egnet stativ og vokse plantene ved 22 °C ± 1 °C under langdagsforhold (16 t lys / 8 t mørke) i et vekstkammer.
- Når flertallet av røttene når infeksjonskanalen (ca. 9-11-dagers gamle frøplanter), legg platene horisontalt, åpne dem og tilsett 500 μL nyhøst Verticillium-conidia med en konsentrasjon på 4 x 105 sporer / ml direkte inn i infeksjonskanalen, og sørg for at væsken er jevnt fordelt i kanalen.
- På samme måte forbereder du kontrollplater ved å legge til 500 μL av en mock-løsning i stedet for sporer (bakteriefri 1/4 MS-medium).
- Inkuber platene horisontalt i et par minutter til væsken har gjennomvåt seg og ikke kan lekke ut når platene settes opp vertikalt igjen. Lukk deretter lokket og forsegle platene med luftgjennomtrengelig tape.
- Inkuber platene vertikalt i vekstkammeret. Eventuelt, dekk rotdelene med svarte papirbokser for å mørke røtter og jordbåren sopp (se19).
- Utfør analysene på de foretrukne tidspunktene etter inokulering avhengig av problemstillingen (se figurlegendene for de nøyaktige tidspunktene som brukes her). Nedenfor følger noen forslag.
- Klipp bladene fra røttene og høst begge separat. Ta agarstrimlene ut av Petri-rettene for å få enkel tilgang til røttene og trekk dem forsiktig ut av agaren ved hjelp av tang. Frys alt plantemateriale umiddelbart i flytende nitrogen.
- Grind prøvene i flytende nitrogen. Trekk ut totalt DNA fra 100 mg bladmateriale for å bestemme via en kvantitativ PCR (qPCR) mengden sopp-DNA i forhold til plante-DNA (se19).
- Grind prøvene i flytende nitrogen. Ta 100 mg plantemateriale og trekk ut totalt RNA. Gjennomføre kvantitativ omvendt transkripsjon PCR (qRT-PCR) for å bestemme uttrykket av plantegener (eller soppgener) under angrep (se19).
- Fjern forsiktig røttene fra agaren og unngå skade og undersøk dem under det fluorescerende mikroskopet.
- Bestemme induksjon av markørgener i plantereporterlinjer (f.eks. luciferase, β-glukuronidase eller fluorescerende reportere 17,19,21).
- Visualiser soppforplantning ved roten ved hjelp av soppreporterlinjer (f.eks. V. longisporum som vanligvis uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein, Vl-sGFP9) eller ved fargingsteknikker (f.eks. gjennom 5-bromo-4-kloro-3-indoksyl-N-acetyl-beta-d-glukosaminid (X-beta-D-Glc-Nac)18).
- Klipp bladene fra røttene og høst begge separat. Ta agarstrimlene ut av Petri-rettene for å få enkel tilgang til røttene og trekk dem forsiktig ut av agaren ved hjelp av tang. Frys alt plantemateriale umiddelbart i flytende nitrogen.
5. Et sterilt in vitro inokulasjonssystem organisert med plastkopper
MERK: Som nevnt i den første beskrivelsen av denne teknikken19, må du sørge for at alt utstyr og medier er bakteriefrie og at alle trinnene utføres i en laminær strømningshette.
- Bruk gjennomsiktige plastkopper med et totalt volum på 500 ml og steriliser dem i et 70% -75% etanolbad i minst 20 minutter. Tørk koppene i laminær strømningshette.
- Hell det autoklavede mediet (se trinn 1.4) i plastkoppene. Eventuelt, tilsett cefotaxime (endelig konsentrasjon på 50 mg / L) til det autoklavede mediet for å forhindre bakterielle forurensninger. Bruk 150 ml medium per kopp for eksperimenter med Arabidopsis eller mer medium (250-300 ml per kopp) for eksperimenter med større plantearter (oljefrø voldtekt, tomat).
- Legg et plastlag (sterilisert før ved å inkubere i 70%-75% etanol i 20 min) på mediet før det størkner (figur 1B).
MERK: Dette plastlaget inneholder fire prefabrikkerte hull i hjørnene for plassering av overflatesteriliserte frø. Dette gjør at frøene får tilgang til mediet. Senere forhindrer dette separasjonslaget bladene i å berøre det soppholdige mediet, slik at mikroberene ikke kan angripe bladene direkte og må ta rotveien. Et annet hull er i midten, noe som gjør det mulig å kutte infeksjonskanalen. - Når mediet har størknet, kutt agaren med en skalpell gjennom det prefabrikkerte senterhullet til en dybde på ca 1,5 cm. Fjern kuttet agar for å lage en infeksjonskanal der soppsporene kan legges til senere.
- Skrap agarmediet litt med en pipettespiss i de fire mindre hullene for å avbryte den størkne huden (dette gjør at frøene kan suge opp vann fra det vannfulle agarmediet). Plasser frøene med en pipettespiss i de mindre hullene.
- Lukk plastkoppen med en ekstra, invertert plastkopp og tetning med luftgjennomtrengelig tape. Båndet må tillate gassutveksling.
- Etter stratifisering i 3 dager i mørket ved 4 °C, inkuber koppsystemene under 12 timers lys / 12 timers mørke (Arabidopsis, oljefrø voldtekt) eller 16 h lys / 8 t mørke forhold (tomat) i vekstkamre ved en konstant temperatur på 22 °C og 60 % fuktighet.
- Følg den anbefalte alderen av planter for inokulering: 21 dager for Arabidopsis; 5-7 dager for oljefrø voldtekt; 12 dager for tomat.
- Inokuler plantleter med Verticillium ved å tilsette 1 ml konidiaoppløsning (anbefalt konsentrasjon: 4 x 105 sporer/ml) i infeksjonskanalen. For å forberede kontrollprøver, tilsett 1 ml mock-løsning uten sporer (bakteriefri 1/4 MS-medium) i kanalen.
- Utfør analysene på de foretrukne tidspunktene etter inokulering avhengig av problemstillingen (se figurlegendene for de nøyaktige tidspunktene som brukes her). Nedenfor følger noen forslag.
- Ta bilder av plantene med et digitalt kamera ovenfra og hold avstanden den samme for hvert bilde. Kvantifisere bladområdet (f.eks. med ImageJ22 eller BlattFlaeche17,19; bruk lengden på koppene til å sette skalaen) og sammenlign infiserte og kontrollgrupper. Kategorisere utviklingen av sykdomssymptomer (f.eks. mindre, mer gulaktige eller nekrotiske blader).
MERK: Hvis det er noen stilker på Arabidopsis, fjern dem for å få bedre bilder av rosettene. - Fjern røttene og definer biomassen (frisk vekt) av skudd fra infiserte og kontrollprøver ved å veie. Bestem den relative friske vekten19.
- Samle prøvene for molekylære analyser som følger.
- Arabidopsis: Fjern stilkene hvis det er noen. Klipp rosettene ved foten fra røttene. Sørg for å utelukke alt rotmateriale fra prøven og høste hele rosetter. Kombiner 4-5 rosetter fra forskjellige planter i en prøve og frys bladmaterialet i flytende nitrogen.
- Trekk røttene forsiktig ut av mediet med tang, trykk og dab dem med et papirhåndkle for å fjerne agarrester, og kombiner 4-5 røtter fra forskjellige planter i en prøve. Frys umiddelbart i flytende nitrogen.
- Oljefrø voldtekt/tomat: Klipp stammesegmenter fra hypokotyletylen (f.eks. 1 cm i lengde; ta alltid samme stammeregion). Kombiner materiale fra 4-5 planter i hver prøve og frys i flytende nitrogen.
- Grind prøvene i flytende nitrogen. Trekk ut totalt DNA fra 100 mg av bladet eller stammematerialet for å bestemme via qPCR mengden sopp-DNA i forhold til plante-DNA (se19).
- Grind prøvene i flytende nitrogen, ta 100 mg plantemateriale og trekk ut totalt RNA. Utfør qRT-PCR for å bestemme uttrykket av plantegener (eller soppgener) ved angrep (se19).
- Ta bilder av plantene med et digitalt kamera ovenfra og hold avstanden den samme for hvert bilde. Kvantifisere bladområdet (f.eks. med ImageJ22 eller BlattFlaeche17,19; bruk lengden på koppene til å sette skalaen) og sammenlign infiserte og kontrollgrupper. Kategorisere utviklingen av sykdomssymptomer (f.eks. mindre, mer gulaktige eller nekrotiske blader).
6. Et jordbasert inokulasjonssystem i potter
- Bland jord og sand grundig i et volumtrisk forhold på 3:1 (jord:sand) for å lette vaskingen av substratet av røttene. Hell blandingen i en autoklavpose. Hvis blandingen er for tørr, tilsett en passende mengde vann og bland den inn i substratet. Damp ved 80 °C i 20 minutter i en autoklav for å minimere mikrobielle forurensninger.
MERK: Unngå oppvarming til over 80 °C, da dette kan påvirke organiske jordnæringsstoffer. - Fyll potter med jord-sandblandingen og overfør dem til skuffer. Tilsett vann i skuffene ca 1/3 høyden på en gryte, slik at jord-sandblandingen blir grundig gjennomvåt med vann. I tillegg vannsprøyt substratet med en sprøyteflaske for å sikre våte startforhold.
- Så 3-4 frø i hver gryte (figur 1C) som sikrer at frøene har nok avstand til hverandre. Hold dem i 3 dager i mørke ved 4 °C for stratifisering for å synkronisere spiring.
MERK: Fordyrk et overskudd av planter, noe som muliggjør et utvalg av planter av lignende størrelse for inokulasjonsforsøkene og reduserer avvik på grunn av individuelle forskjeller. - La plantene vokse under lange dagers forhold (16 t lys / 8 t mørke; konstant temperatur på 22 °C; 60% fuktighet) med vanlig vanning.
- Følg den anbefalte alderen på planter for inokulering: 21 dager for Arabidopsis, 7 dager for oljefrø voldtekt og 10 dager for tomat. Velg planter av lignende størrelse for å utføre "root dip inokulering"15,17,23,24. Ta jorda ut av pottene og utgrav røttene forsiktig.
- Vask forsiktig bare røttene i en vannbeholder og hold rosettene ute av vannet. Inkuber de vaskede røttene i 60 min i en Petri-tallerken som inneholder Verticillium-sporeoppløsningen (anbefalt konsentrasjon: 2 x 106 sporer / ml). For den ikke-infiserte kontrollgruppen, inkuber røttene i 60 min i spotteløsningen uten sporer (bakteriefri 1/4 MS-medium).
- Forbered nye potter med fuktig, dampsterilisert jord (80 °C i 20 min) uten sand. Bruk en pipettespiss til å lage ett hull i midten av jorda i hver gryte.
- Plasser røttene direkte i hullet (overfør bare en plante per pott). Etter å ha satt inn røttene, sørg for å fylle hullene forsiktig med jord. Unngå å trykke på jorda, ellers kan repotting forårsake stresssymptomer som lilla blader.
- Dyrk infiserte og kontrollgrupper under lange dagers forhold (16 t lys / 8 t mørke; en konstant temperatur på 22 °C; 60 % fuktighet) med vanlig vanning.
- Utfør analysene på de foretrukne tidspunktene etter inokulering avhengig av problemstillingen (se figurlegendene for de nøyaktige tidspunktene som brukes her). Nedenfor følger noen forslag.
- Ta bilder av plantene med et digitalt kamera ovenfra, og hold avstanden den samme for hvert bilde. Kvantifisere bladområdet (f.eks. med ImageJ22 eller BlattFlaeche17,19; bruk diameteren på pottene for å stille inn skalaen) og sammenlign infiserte og kontrollgrupper. Kategoriser utviklingen av sykdomssymptomer (f.eks. mindre, mer gulaktige eller nekrotiske blader)13.
MERK: Fjerning av stammer av Arabidopsis letter å ta bilder av rosettene. - Fjern røttene og definer biomassen (frisk vekt) av skudd fra infiserte og kontrollprøver ved å veie. Bestem den relative friske vekten19.
- Alternativt kan du måle plantehøyden eller kategorisere soppvekst fra stamsegmenter for å evaluere sykdomsgrad13.
- Samle prøver for molekylære analyser som følger.
- Arabidopsis: Fjern stilkene. Klipp rosettene ved rotkronen. Kombiner 4-5 rosetter fra forskjellige planter i en prøve. Frys bladmaterialet i flytende nitrogen.
MERK: Når det gjelder røtter, er det vanskelig å rengjøre dem tilstrekkelig fra jorda uten å omprogrammere genuttrykk gjennom vask. - Oljefrø voldtekt/tomat: Klipp stammesegmenter fra hypokotyletylen (f.eks. 1 cm i lengde; ta alltid samme stammeregion). Kombiner materiale fra 4-5 planter i en prøve og frys det i flytende nitrogen.
- Grind prøvene i flytende nitrogen. Trekk ut totalt DNA fra 100 mg blad- eller stammemateriale for å bestemme via qPCR mengden sopp-DNA i forhold til plante-DNA (se19).
- Grind prøvene i flytende nitrogen, ta 100 mg plantemateriale og trekk ut totalt RNA. Utfør qRT-PCR for å bestemme uttrykket av plantegener (eller soppgener) ved angrep (se19).
- Ta bilder av plantene med et digitalt kamera ovenfra, og hold avstanden den samme for hvert bilde. Kvantifisere bladområdet (f.eks. med ImageJ22 eller BlattFlaeche17,19; bruk diameteren på pottene for å stille inn skalaen) og sammenlign infiserte og kontrollgrupper. Kategoriser utviklingen av sykdomssymptomer (f.eks. mindre, mer gulaktige eller nekrotiske blader)13.
7. Analysere dataene
- Beregn gjennomsnittet og standardavviket (± SD) basert på de biologiske replikeringene.
- Beregn de relative verdiene ved å dele alle resultatene fra den infiserte gruppen på resultatet av kontrollen. Vis gjennomsnittet som for eksempel "i forhold til spott" eller "i forhold til wild-type".
- Bestemme statistisk signifikans mellom grupper.
Figur 1: Sammenstilling av de tre inokulasjonssystemene og individuelle trinn i protokollene. Disse tallene illustrerer systemene med modellanlegget Arabidopsis thaliana. For andre plantearter må tidspunktet justeres. Oransje bokser fremhever, for hvilke påfølgende analyser anbefales mest med det respektive systemet. (A) For inokuleringssystemet i Petri retter17, hell mediet og la det størkne. Oppbevar platene i kjøleskapet over natten. Klipp deretter og fjern den øvre tredjedelen samt infeksjonskanalen (IC) med en skalpell (hvite områder i illustrasjonen ble fjernet fra agaren, mens blåaktige områder representerer agaren). Plasser frøene på den kuttede overflaten og lukk Petri-rettene. Etter stratifisering, plasser platene vertikalt og la plantene vokse. Når de fleste røttene har nådd infeksjonskanalen, legg til sporløsningen med en pipette direkte inn i kanalen. Kontroller at løsningen er jevnt fordelt. Lukk Petri-rettene og inkuber dem vertikalt i et vekstkammer. Tilnærminger som kan følge er ekspresjonell analyse med kvantitativ omvendt transkripsjon PCR (qRT-PCR), mikroskopi med reporterlinjer og kvantifisering av mikrobielt DNA. (B) For inokuleringssystemet i plastkopper19, hell mediet og overfør det separerte plastlaget med de prefabrikkerte hullene (fire små hull i hjørnene for å plassere frøene og ett stort hull i midten for infeksjonskanalen). La mediet størkne. Klipp og fjern agarmediet i senterhullet med en skalpell for å oppnå infeksjonskanalen (IC). Riper mediet i de mindre hullene og overfør frøene. Lukk koppen med en invertert kopp og forsegle med luftgjennomtrengelig tape (symbolisert i gult). La plantene vokse. For inokulering, legg til sporoppløsningen med en pipette direkte inn i infeksjonskanalen. Lukk systemet og fortsett dyrking i vekstkammeret. Tilnærminger som kan følge er ekspresjonell analyse med qRT-PCR, kvantifisering av mikrobielt DNA og bestemmelse av frisk vekt, bladområde eller andre sykdomsegenskaper. (C) "Root dip inokulering"15,17,23,24: For det jordbaserte inokulasjonssystemet, fyll potter med jord: sandblanding. Overfør frøene og la plantene vokse. Utgrav planter av lignende størrelse og vask røttene i vann. Plasser de vaskede røttene i en Petri-tallerken som holder løsningen med sporene. Etter inkubasjon, sett inn enkeltplanter i potter med jord. Tilnærminger som kan følge er ekspresjonell analyse i blader med qRT-PCR, kvantifisering av mikrobielt DNA og bestemmelse av frisk vekt, bladområde eller andre sykdomsegenskaper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter protokollen ble plantene dyrket og inokulert med V. longisporum (stamme Vl4325) eller V. dahliae (isolere JR218). Ulike scenarier ble utformet for å bevise effektiviteten og fremheve noen evner i de gitte protokollene. Representative resultater vises.
Ekspresjonell induksjon av gener involvert i den antimikrobielle indol-glukosinolat (IG) biosyntesen er en pålitelig indikator for evaluering av en Verticillium-infeksjon 17,19,26. I Arabidopsis, MYB51 (MYB domene protein 51; AT1G18570) koder en transkripsjonsfaktor involvert i aktivering av gener som er nødvendige for IG biosyntese27. MYB51 kan tjene som et markørgen som indikerer vellykket angrep da det konsekvent induseres i røtter av V. longisporum26 eller andre jordbårne sopp som Phytophthora parasitica26 og Fusarium oxysporum21. To dager etter inokulering (2 dpi) i det Petri parabolske systemet ble induksjon av MYB51 visualisert i røtter av arabidopsis. Reporterplantelinjen PromMYB51::YFP21 avslørte en promotoraktivering og en qRT-PCR-analyse bekreftet en betydelig transkripsjonsinduksjon av dette genet (figur 2A-B). Slike eksperimenter tar sikte på å bestemme uttrykksendringer i røtter under infeksjon.
Fordi Verticillium-artene som brukes i denne studien utfører en vaskulær livsstil og sprer seg fra roten til skytingen via xylem-karene, kan mengden sopp-DNA bestemmes i blader som en parameter for graden av soppforplantning. Arabidopsis ble rotinokulert i in vitro-systemet i plastkopper og rosettene ble høstet 12 dager senere. Sammenlignet med bakgrunnsverdien som er påvist i spottekontrollen, er det funnet betydelige mengder sopp-DNA i blader fra infiserte planter (figur 2C). Dette viser at infeksjonen har utviklet seg med hell. For videre undersøkelser kan mengden sopp-DNA kvantifiseres i forskjellige plantegenotyper for å få innsikt i rotforsvarsresponser. I tillegg ble røtter samlet på dette tidspunktet for å teste induksjonen av markørgenet via qRT-PCR. MYB51 transkripsjonsoverflod ble betydelig beriket (figur 2D). Dette illustrerer at mottakelighetstester og ekspresjonsanalyser lett kan utføres parallelt med koppsystemet, noe som understreker den store fordelen med denne prosedyren.
For å inkludere bevis på at andre modellplantearter også kan innføres, ble oljefrø voldtekt smittet med V. longisporum og tomat med V. dahliae i systemet i plastkopper. På dag 12 etter inokulering ved røttene ble mengden sopp-DNA kvantifisert i stammesegmenter kuttet ved bunnen av plantene (figur 2E-F). Sopp-DNA var påviselig i begge plantearter som indikerer forplantning av patogenene i planten. Igjen kunne forskjellige plantegenotyper testes for å få kunnskap om forsvarsmekanismer.
Hvis rotkoloniserende mikrobe av interesse ikke sprer seg fra røtter til blader, er det ikke mulig å kvantifisere mengden mikrobielt DNA i blader som en parameter for sykdoms alvorlighetsgrad. Et annet alternativ for å måle alvorlighetsgraden av sykdommen er vurdering og ekstrapolering av symptomer hos verten. For å eksemplifisere dette ble Arabidopsis rotdipp inokulert med V. dahliae i det jordbaserte systemet og det grønne bladområdet ble evaluert (figur 2G-H). Mens rosettene av mock-behandlede planter så sunne og grønne ut, hadde patogeninfiserte planter redusert bladstørrelse og gulaktige eller til og med nekrotiske blader. På denne måten kan følsomheten til forskjellige plantegenotyper analyseres og bekreftes, for eksempel ved å kvantifisere den friske vekten.
Figur 2: Representative resultater oppnådd ved å følge protokollene. (A,B) Arabidopsis røtter ble inokulert med V. longisporum i Petri parabolen systemet. Reporterlinjen PromMYB51::YFP21 avslørte en sterk aktivering av MYB51-promotoren i infiserte røtter sammenlignet med spottkontrollen (mikroskopi ved 2 dpi; skala bar: 50 μm). Transkripsjonell induksjon av MYB51 i wildtype (WT)-røtter ble ytterligere bekreftet med qRT-PCR-analyse (2 dpi). Verdier av infiserte prøver gis i forhold til spotteprøver (satt til 1) (n = 5; ± SD). (C) Systemisk kolonisering gjennom V. longisporum: Etter å ha inokulert Arabidopsis røtter i koppsystemet, ble den relative mengden sopp-DNA bestemt i blader av kvantitativ PCR (qPCR; 12 dpi). Verdier av infiserte prøver gis i forhold til bakgrunnsnivå i spotteprøver (satt til 1) (n = 3; ± SD). (D) V. longisporum infiserte og mock-behandlede røtter ble høstet fra koppsystemet og qRT-PCR-analyse ble utført. Verdier av infiserte prøver gis i forhold til spotteprøver (satt til 1) (n = 3; ± SD). MYB51 ble funnet å være transkripsjonelt indusert (12 dpi). (E) Oljefrø voldtekt ble inokulert i koppsystemet med V. longisporum og den relative mengden sopp-DNA ble kvantifisert gjennom qPCR i stammesegmenter (12 dpi). Verdier av infiserte prøver gis i forhold til bakgrunnsnivå i spotteprøver (satt til 1) (n = 3; ± SD). (F) Tomat ble inokulert i koppsystemet med V. dahliae og den relative mengden sopp-DNA ble kvantifisert gjennom qPCR i stammesegmenter (12 dpi). Verdier av infiserte prøver gis i forhold til bakgrunnsnivå i mock-prøver (satt til 1) (n = 5; ± SD). (G,H) Arabidopsis ble rotdipp inokulert med V. dahliae i det jordbaserte systemet og representative bilder av infiserte og mock-behandlede planter er vist (21 dpi). Det grønne bladområdet ble undersøkt. I forhold til mock (satt til 1), hadde infiserte planter mindre grønt bladområde (n = 5; ± SD). (B-F,H) For primerpar se19; statistikk: student 's t-test i forhold til mock, * p≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grunn av de enorme utbyttetapene forårsaket av jordbårne fytopatogene1, er det nødvendig med en forbedring av oppdrettsstrategier eller avlingsvarianter. Den begrensede innsikten i patogenesen av jordbårne sykdommer hindrer utviklingen av mer resistente planter. Underliggende patomekanismer må utforskes, som det kreves en robust metodisk plattform for. Rapporterte inokulasjonsprosedyrer har vist at multifaktorielle hendelser i rotmikrobeinteraksjoner kan dissekeres godt ved å kombinere forskjellige systemer19. Protokollene beskrevet ovenfor er ment å gi en rutinemessig arbeidsflyt for både eksperter og forskere som er nye på dette feltet. Håndteringen er enkel, tillater uavhengig replikering, og det nødvendige tekniske utstyret finnes i standard plantevitenskapelige laboratorier.
Tidlige verticilliuminfeksjonshendelser (timer etter inokulering til 6 dpi) kan undersøkes i Petri-parabolen, sene hendelser (>21 dpi) i det jordbaserte systemet, og i koppsystemet timelig i mellom (4 til 21 dpi). Etter å ha lagt sporene til infeksjonskanalen til Petri-parabolen, er de i direkte kontakt med røttene. Dette gjør det mulig å undersøke tidlige forsvarssvar. Som eksemplifisert med MYB51-induksjonen, kan ekspresjonelle endringer lett studeres med genreporterkonstruksjoner, qRT-PCR eller til og med genom-brede "-omics" tilnærminger17,26. Sammenlignet med de to andre infeksjonssystemene er forsvarsresponsene kraftigere i Petri-rettene. På grunn av sin lille størrelse i Petri-rettene, blir planteplantene raskt overgrodd av soppen, og intensiteten av forsvarsresponsene kan være ganske unaturlig i slike analyser19. Ekspresjonelle endringer kan også studeres i røtter av plastkoppsystemet som fører til resultater som kan sammenlignes med Petri-parabolsystemet, men med lavere induksjonsverdier for markørgener. I det eksperimentelle oppsettet i kopper er inokulumet ikke i umiddelbar kontakt med røttene, sporene må spire, og patogenet må vokse gjennom mediet mot røttene. Progresjon av infeksjon er langsommere sammenlignet med Petri parabolen systemet og derfor nærmere naturlige forhold. Når det gjelder røtter, har det jordbaserte systemet heller en ulempe, fordi de må fjernes tilstrekkelig fra jorda for analyse uten å omprogrammere genuttrykk ved vask. Dermed er det mer komplisert å studere ekspresjonelle endringer i røtter i jord. Det er imidlertid mulig å teste i blader om rotinfestasjonen utløser svar der.
I både in vitro inokulasjonssystemer (Petri-retter og plastkopper) kan eksterne forurensninger forhindres så lenge hvert trinn utføres under laminær strømningshette med sterilt utstyr. Dermed kan bilaterale interaksjoner undersøkes uforstyrret. Omvendt er det jordbaserte systemet bare "semi-sterilt" da plantene ikke er hermetisk isolert i vekstkammeret. Likevel kan det betraktes som den som er nærmest naturlige forhold når planter vokser i jord. Imidlertid er røtter skadet i det jordbaserte systemet på grunn av up-rooting, som gir mikrobiell tilgang til vevet. Selv om dette kan være litt kunstig, kan dette etterligne naturlige forhold som skader røtter, for eksempel nematodefôring28.
Petri-parabolen er godt egnet til å visualisere dynamikken i patogenspredning ved hjelp av fluorescerende merkede stammer (f.eks. V. longisporumstamme Vl-sGFP9). Rotfenotyper som følge av kolonisering er godt observerbare. På den annen side er kvantifisering av sykdomssymptomer ved blader / skudd i Petri-retter neppe mulig, da systemet er ganske lite. Dessuten er det kanskje ikke nok plass til plantearter som er større enn Arabidopsis. Alternativt etablerte Behrens et al.29 et infeksjonssystem på plater egnet for oljefrø voldtekt, hvor en børste dyppes i en spore suspensjon og brukes til å distribuere inoculum langs røtter som vokser på agar. For å vurdere symptomer er kopp- og jordbaserte systemer absolutt å foretrekke. Her kan utviklingen av symptomer (f.eks. redusert bladområde, tap i frisk vekt, redusert plantehøyde, omfanget av nekrotisk vev) evalueres ved blader/skudd. Undersøkelse av større plantearter, som oljefrøvoldtekt og tomat, er ikke noe problem i kopp- og jordbaserte systemer som vist i de representative resultatene. Hvis den jordbårne mikroben som undersøkes sprer seg fra rot til skyte, kan patogenspesifikt DNA forsterkes i forhold til plante-DNA i skyte/bladvev. Dette kan tjene som en markør for å gjennomføre patogenisitetstester med forskjellige plantegenotyper13,19 og er en fordel når du bruker vaskulære patogener som Verticillium som modell. Omvendt kan forskjellige genotyper av patogener brukes til å identifisere virulensgener som er nødvendige for vellykket kolonisering.
I alle tilfeller avhenger den beste timingen for analyser av genotype, plantearter og mikrobe. Det mest kritiske trinnet er å definere det beste tidspunktet for hvert forskningsspørsmål gjennom foreløpig testing. Videre, når du bruker andre mikrober enn Verticillium, bør tilstrekkelige konsentrasjoner for inokulasjon i utgangspunktet bli funnet ut.
Foruten mulighetene som allerede er nevnt, tilbyr koppsystemet potensialet til å utvide det for screening av agrokjemikalier som kan brukes til å begrense kolonisering med spesifikke parasittiske mikrober. Effekten av biocidkjemikalier på plantemikrobiell kolonisering kan testes ved å legge til den putative antimikrobielle forbindelsen direkte i agarmediet før (eller under) inokulering og overvåking av symptomutvikling hos verten. Dette kan lette gjennomføringen av screeninger for å akselerere oppdagelsen av nye behandlinger mot jordbårne sykdommer.
Selv om flere medlemmer av jordmikrobiomet er patogene, er de aller fleste nøytrale eller til og med gunstige for plantevekst1. Det er mulighet for å bruke protokollene til å inokulere planter med gunstige mikroorganismer. Tidligere ble S. indica sporer lagt til i Petri parabolen systemet for å undersøke de påfølgende svarene i røtter26. Dette utvider spekteret av de forklarte infeksjonssystemene for å studere ikke bare patogene, men også gunstige interaksjoner.
Siden det er kjent at mikrober i rhizosfæren påvirker hverandre6, kan dette simuleres ved en parallell inokulasjon med forskjellige mikrobielle arter (eller behandling av plantene først med en og senere med en annen). Dette muliggjør ko-, trippel- eller til og med flerkulturelle modeller. En mer avansert utvidelse til tilstrekkelige syntetiske samfunn (SynComs, samlinger av mikroorganismer) kan tenkes, da dette bidrar til å forstå påvirkningene av komplekse mikrobielle komposisjoner30.
Oppsummert tillater inokulasjonssystemene flere kombinasjoner for senere analyser og støtter en rekke bruksområder. Denne samlingen av metoder er bredt anvendelig for ulike rotkoloniserende mikrober (både gunstige og patogene) og tilbyr en robust plattform for å analysere rotmikrobeinteraksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner Tim Iven og Jaqueline Komorek for tidligere arbeid med disse metodene, gruppen Wolfgang Dröge-Laser (Institutt for farmasøytisk biologi, Universitetet i Würzburg, Tyskland) for å levere utstyret og ressursene som trengs for dette arbeidet, og Wolfgang Dröge-Laser samt Philipp Kreisz (begge Universitetet i Würzburg) for kritisk korrekturlesing av manuskriptet. Denne studien ble støttet av "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG, DR273/15-1,2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | all systems described require Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software to determine leaf areas |
| Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer flask with four baffles |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth medium | Duchefa | C1714 | |
| Digital camera | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine gas |
| Fluorescence Microscope | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiumsulfate-Heptahydrate |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size ØxH: 92 × 16 mm |
| Plastic cups (500 mL, transparent) | Pro-pac, salad boxx | 5070 | size: 108 × 81 × 102 mm |
| Pleated cellulose filter | Hartenstein | FF12 | particle retention level 8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Potato Dextrose Broth medium | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Reaction tubes 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Rotary (orbital) shaker | Edmund Bühler | SM 30 C control | |
| Sand (bird sand) | Pet Bistro, Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q purified water) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
References
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science. 4, 97 (2013).
- Delgado-Baquerizo, M., et al. The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale. Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).
- Berendsen, R. L., et al. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).
- Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
- Liu, H., et al. Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens. New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).
- Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity. Microorganisms. 9 (9), 1988 (2021).
- Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).
- Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
- Floerl, S., et al. Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biology. 8, 129 (2008).
- Leonard, M., et al. Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments. Frontiers in Microbiology. 11, 1876 (2020).
- Depotter, J. R. L., et al. Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts. Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).
- Fröschel, C., et al. A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).
- Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus. Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).
- Ralhan, A., et al. The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots. Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).
- Reusche, M., et al. Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).
- Iven, T., et al. Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).
- Reusche, M., et al. Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).
- Fröschel, C. In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen. Plant Methods. 17 (1), 57 (2021).
- Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape. Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).
- Poncini, L., et al. In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer. PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Fradin, E. F., et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).
- Singh, S., et al. The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).
- Zeise, K., von Tiedemann, A. Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum. Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).
- Fröschel, C., et al. Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes. Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).
- Gigolashvili, T., et al. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).
- Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).
- Behrens, F. H., et al. Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus). Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).
- Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).
