Summary
Les cybrides transmissibles sont des cellules hybrides obtenues en fusionnant des cellules appauvries en ADN mitochondrial (ADNmt) (cellules rho0 ) avec des cytoplastes (cellules énucléées) dérivées de patients atteints de troubles mitochondriaux. Ils permettent de déterminer l’origine nucléaire ou mitochondriale de la maladie, d’évaluer l’activité biochimique et de confirmer le rôle pathogénétique des variantes liées à l’ADNmt.
Abstract
La carence en complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale qui effectuent la phosphorylation oxydative (OXPHOS) est le marqueur biochimique des troubles mitochondriaux humains. D’un point de vue génétique, l’OXPHOS représente un exemple unique car il résulte de la complémentarité de deux systèmes génétiques distincts : l’ADN nucléaire (ADNn) et l’ADN mitochondrial (ADNmt). Par conséquent, les défauts OXPHOS peuvent être dus à des mutations affectant les gènes codés nucléaires et mitochondriaux.
Les travaux révolutionnaires de King et Attardi, publiés en 1989, ont montré que les lignées cellulaires humaines appauvries en ADNmt (nommées rho0) pouvaient être repeuplées par des mitochondries exogènes pour obtenir les soi-disant « cybrides transmitochondrials ». Grâce à ces cybrides contenant des mitochondries dérivées de patients atteints de troubles mitochondriaux (MD) et des noyaux de cellules rho0 , il est possible de vérifier si un défaut est lié à l’ADNmt ou à l’ADNn. Ces cybrides sont également un outil puissant pour valider la pathogénicité d’une mutation et étudier son impact au niveau biochimique. Cet article présente un protocole détaillé décrivant la génération, la sélection et la caractérisation des cybrides.
Introduction
Les troubles mitochondriaux (MD) sont un groupe de syndromes multisystémiques causés par une altération des fonctions mitochondriales due à des mutations de l’ADN nucléaire (ADNn) ou mitochondrial (ADNmt)1. Elles font partie des maladies métaboliques héréditaires les plus courantes, avec une prévalence de 1:5 000. Les maladies associées à l’ADNmt suivent les règles de la génétique mitochondriale : héritage maternel, hétéroplasmie et effet de seuil, et ségrégation mitotique2. L’ADNmt humain est un cercle d’ADN double brin de 16,6 kb, qui contient une courte région de contrôle avec des séquences nécessaires à la réplication et à la transcription, 13 gènes codant pour les protéines (toutes les sous-unités de la chaîne respiratoire), 22 ARNt et 2 gènes d’ARNr3.
Chez les individus en bonne santé, il existe un seul génotype d’ADNmt (homoplasmie), tandis que plus d’un génotype coexiste (hétéroplasmie) dans des conditions pathologiques. Les mutations hétéroplasmiques délétères doivent franchir un seuil critique pour perturber OXPHOS et provoquer des maladies pouvant affecter n’importe quel organe à tout âgede 4 ans. La double génétique d’OXPHOS dicte l’hérédité : autosomique récessive ou dominante et liée à l’X pour les mutations de l’ADNn, maternelle pour les mutations de l’ADNmt, plus des cas sporadiques à la fois pour l’ADNmt et l’ADNmt.
Au début de l’ère de la médecine mitochondriale, une expérience historique de King et Attardi5 a établi la base pour comprendre l’origine d’une mutation responsable d’un MD en créant des cellules hybrides contenant des noyaux de lignées cellulaires tumorales dans lesquelles l’ADNmt était entièrement épuisé (cellules rho0) et les mitochondries de patients atteints de DM. Les techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) n’étaient pas disponibles à cette époque, et il n’était pas facile de déterminer si une mutation était présente dans le génome nucléaire ou mitochondrial. La méthode, décrite en 1989, a ensuite été utilisée par plusieurs chercheurs travaillant dans le domaine de la médecine mitochondriale 6,7,8,9; un protocole détaillé a été récemment publié10, mais aucune vidéo n’a encore été réalisée. Pourquoi un tel protocole devrait-il être pertinent de nos jours alors que NGS pourrait identifier précisément et rapidement où se trouve une mutation? La réponse est que la génération de cybrides est toujours le protocole de pointe pour comprendre le rôle pathogène de toute nouvelle mutation de l’ADNmt, corréler le pourcentage d’hétéroplasmie avec la gravité de la maladie et effectuer une investigation biochimique dans un système nucléaire homogène dans lequel la contribution du fond nucléaire autochtone du patient est absente11, 12,13.
Ce protocole décrit comment obtenir des cytoplastes à partir de fibroblastes confluents dérivés de patients cultivés dans des boîtes de Petri de 35 mm. La centrifugation des plats en présence de cytochalasine B permet l’isolement des cytoplastes énucléés, qui sont ensuite fusionnés avec des cellules rho0 en présence de polyéthylène glycol (PEG). Les cybrides résultantes sont ensuite cultivées en milieu sélectif jusqu’à l’apparition de clones. La section des résultats représentatifs montre un exemple de caractérisation moléculaire des cybrides résultantes pour prouver que l’ADNmt est identique à celui des fibroblastes des patients donneurs et que l’ADNn est identique à l’ADN nucléaire de la lignée cellulaire tumorale rho0 .
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Protocol
REMARQUE: L’utilisation de fibroblastes humains peut nécessiter une approbation éthique. Les fibroblastes utilisés dans cette étude ont été dérivés de patients atteints de DM et stockés dans la biobanque institutionnelle conformément aux exigences éthiques. Un consentement éclairé a été fourni pour l’utilisation des cellules. Effectuer toutes les procédures de culture cellulaire sous une armoire à flux laminaire stérile à température ambiante (RT, 22-25 °C). Utilisez des solutions filtrées stériles adaptées à la culture cellulaire et aux équipements stériles. Cultiver toutes les lignées cellulaires dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO2. Des tests de mycoplasmes doivent être effectués chaque semaine pour s’assurer que les cultures sont exemptes de mycoplasmes. Les cellules 143BTK- rho0 peuvent être générées comme décrit précédemment5.
1. Culture de cellules
- Avant de commencer toute procédure, vérifier la présence de la mutation dans les fibroblastes dérivés de patients MD et quantifier le pourcentage d’hétéroplasmie ou d’homoplasmie par polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP) et / ou des analyses de séquençage d’ADNmt entier14.
- Ensemencez des fibroblastes dans quatre boîtes de Petri de 35 mm, contenant chacune 2 mL de milieu de culture complet (tableau 1). Laissez les cellules croître jusqu’à 80% de confluent (48 h).
- Cultiver 143BTK- rho0 cellules dans 8 mL de milieu de culture supplémenté (tableau 1) dans une boîte de Petri de 100 mm.
- Maintenir les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
- Vérifier l’absence d’ADNmt dans les cellules rho0 par des techniques de séquençage14.
2. Énucléation des fibroblastes
- Stériliser quatre bouteilles de 250 mL adaptées à la centrifugeuse par stérilisation autoclave à 121 °C pendant un cycle de 20 minutes. Séchez-les dans un four de laboratoire ou à RT.
- Préchauffer la centrifugeuse à 37 °C.
- Lavez deux fois les plats de 35 mm contenant les fibroblastes, en utilisant 2 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans (sans) calcium ni magnésium.
- Nettoyez la surface extérieure de la vaisselle avec 70% d’éthanol et attendez que l’alcool s’évapore.
- Retirez les couvercles de la vaisselle et les bouchons à vis des bouteilles. Placez chaque plat, sans le couvercle, à l’envers au fond de chaque bouteille de centrifugeuse de 250 ml.
- Ajouter lentement 32 mL de milieu d’énucléation à chaque bouteille (tableau 1), ce qui permet au milieu d’entrer dans le plat et d’entrer en contact avec les cellules. Retirez toutes les bulles de la vaisselle à l’aide d’une longue pipette Pasteur en verre, en recourbant la pointe dans une flamme Bunsen.
REMARQUE: Il est important d’enlever les bulles pour permettre au milieu d’entrer dans le plat et d’entrer en contact avec les cellules. - Fermez chaque bouteille avec le bouchon à vis et transférez-les à la centrifugeuse.
- Centrifugeuse pendant 20 min à 37 °C et 8 000 × g, accélération max, décélération lente. Faites attention à équilibrer la centrifugeuse : contrebalancez chaque bouteille. Si nécessaire, ajustez le poids en ajoutant un volume approprié de milieu d’énucléation.
- Pendant la centrifugation, utilisez le vide ou une pipette sérologique de 10 mL pour aspirer et jeter le milieu des plaques de culture 143BTK-rho 0 et les laver deux fois en utilisant 4 mL de 1x PBS sans calcium et magnésium.
- Ajouter 2 mL de trypsine pour recouvrir complètement la monocouche cellulaire.
- Placez les plats dans un incubateur à 37 °C pendant environ 2 min.
- Retirez les plats de l’incubateur, observez le détachement cellulaire à l’aide d’un microscope inversé pour les cellules vivantes (objectifs 4x ou 10x) et inhibez l’activité enzymatique en ajoutant 2 mL de milieu de culture supplémenté.
- Aspirer les 4 mL de la suspension cellulaire dans le plat avec une pipette de 10 mL et la transférer dans un tube conique de 15 mL.
- Comptez les cellules à l’aide d’une chambre hémocytométrique Burker ou d’un compteur automatisé.
- À la fin de la centrifugation (étape 2.8), aspirez le fluide des bouteilles et jetez-le.
- Retirez la vaisselle en inversant les bouteilles sur une gaze stérile préalablement pulvérisée avec 70% d’éthanol. Nettoyez la surface extérieure de la vaisselle et de leurs couvercles avec 70% d’éthanol. Attendez que l’alcool s’évapore, puis fermez la vaisselle.
- Avant de continuer, vérifiez la formation de cytoplastes (fantômes) à l’aide d’un microscope inversé pour les cellules vivantes (objectif 4x ou 10x). Recherchez des fibroblastes extrêmement allongés en raison de l’extrusion de leurs noyaux induite par la cytochalasine B.
- À chaque plat de 35 mm, ajouter 1 × 106 de 143BTK- rho0 cellules remises en suspension dans 2 mL de milieu de culture 143BTK- rho0 complété par 5% de sérum fœtal bovin (FBS).
- Laissez la vaisselle pendant 3 h dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5% de CO2 et laissez les cellules 143BTK-rho0 se déposer sur les fantômes. Ne pas déranger la vaisselle.
3. Fusion des fibroblastes énucléés avec des cellules rho 0
- Après 3 h d’incubation, aspirer et jeter le milieu des plats.
- Lavez les cellules adhérentes deux fois avec 2 mL de glucose élevé DMEM (Modified Eagle Medium) de Dulbecco sans sérum ou avec un milieu essentiel minimum (MEM).
- Aspirer et jeter le milieu.
- Ajouter 500 μL de solution de PEG (voir le tableau des matériaux) aux cellules et incuber pendant exactement 1 min.
- Aspirer et jeter la solution peg.
- Lavez les cellules trois fois en utilisant 2 mL de DMEM à glucose élevé sans sérum ou avec MEM.
- Ajouter 2 mL de milieu de fusion (tableau 1) et incuber toute la nuit dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
4. Sélection et expansion de Cybride
- Après une incubation d’une nuit, retirez les plaques de l’incubateur, trypsinisez les cellules comme décrit ci-dessus (étapes 2.9-2.13) et transférez le contenu de chaque plat de 35 mm dans un plat de 100 mm.
- Ajouter 8 mL de milieu de sélection (tableau 1) et placer les plaques dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
- Changez le milieu tous les 2-3 jours.
- Attendez environ 10 à 15 jours de sélection jusqu’à ce que des colonies de cellules apparaissent.
- Congelez l’une des quatre boîtes de Pétri en collectant tous les clones et en générant une culture « massive » comme sauvegarde des cybrides, qui peut éventuellement être reclonée et utilisée pour des recherches plus approfondies.
- Trypsiniser les cellules dans les boîtes de culture restantes, compter et ensemencer dans une ou plusieurs boîtes de Petri à 50-100 cellules / boîte dans le milieu de culture supplémenté (tableau 1) jusqu’à ce que des clones apparaissent. Laissez-les grandir pendant quelques jours.
- Abattez les cellules restantes par centrifugation à 1 200 × g pendant 3 min à TA et jetez le surnageant.
- Extraire l’ADN de la pastille (voir la Table des matériaux).
- Effectuer le génotypage par nombre variable d’analyses répétées en tandem (VNTR), comme indiqué précédemment15.
- Ramassez les clones de la boîte de Pétri avec des cylindres de clonage ou une pointe de pipette, à l’aide d’un stéréomicroscope pour éviter la mise en commun de différents clones, et transférez-les dans une plaque de 96 puits, chaque puits contenant 200 μL de milieu de culture supplémenté (tableau 1).
- Développez chaque clone jusqu’à ce qu’il y ait suffisamment de cellules pour congeler et extraire l’ADN.
- Vérifiez le pourcentage de mutation de chaque clone par RFLP ou d’autres méthodes de séquençage. Idéalement, essayez d’obtenir à la fois des clones avec de l’ADNmt de type sauvage (mutation à 0%) et des clones avec des pourcentages de mutation différents, les deux s’ajoutant à l’ADNmt mutant homoplasmique (mutation à 100%). Voir la Figure 1 pour un diagramme schématique du protocole de génération cybride.
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Representative Results
La génération de cybrides nécessite 3 jours de travail en laboratoire plus une période de sélection (~ 2 semaines) et 1-2 semaines supplémentaires pour la croissance des clones. Les étapes critiques sont la qualité des cytoplastes et la période de sélection. La morphologie des cybrides ressemble à celle des cellules donneuses rho0. L’attribution de l’ADNmt et de l’ADNn corrects dans les cybrides est obligatoire pour confirmer l’identité des cellules. Un exemple est donné à la figure 2. Dans ce cas, nous avons généré des cybrides à partir de fibroblastes dérivés d’un patient porteur de l’hétéroplasmique m.3243A>G, l’une des mutations d’ADNmt les plus courantes associées à la myopathie mitochondriale, à l’encéphalopathie, à l’acidose lactique et aux épisodes de type ACCIDENT VASCULAIRE CÉRÉBRAL (MELAS). L’analyse de la VNTR a montré que l’ADNn cybride est identique à celui des cellules rho0 (Figure 2A), confirmant le remplacement de l’ADNn du patient par le génome 143B. Les analyses RFLP et/ou de séquençage peuvent être utilisées pour évaluer la présence de la mutation de l’ADNmt et le pourcentage d’hétéroplasmie (Figure 2B,C).
Figure 1 : Diagramme schématique du protocole de génération de cybrides. Les fibroblastes dérivés du patient sont traités avec de la cytochalasine B et centrifugés pour obtenir des cytoplastes (cellules énucléées). La fusion cytoplasmique des cytoplastes et des cellules appauvries en ADNmt (143BTk- rho0) permet la génération de cybrides qui peuvent être isolés après sélection dans le milieu approprié. La collecte et l’amplification de clones uniques donnent différents pourcentages d’hétéroplasmie, qui en théorie peuvent varier de 100% de type sauvage à 100% muté. Abréviation : ADNmt = ADN mitochondrial. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Caractérisation moléculaire des cybrides. (A) L’analyse des microsatellites Apo-B montre que l’ADNn extrait des cybrides générés est identique à l’ADN nucléaire de la lignée cellulaire rho0. (B) Cartes de restriction HaeIII du produit PCR couvrant les espèces m.3243A>G associées au MELAS, utilisées pour quantifier la quantité de WT) et les espèces d’ADNmt Mut. (C) Résultats représentatifs de l’analyse RFLP montrant des niveaux d’hétéroplasmie m.3243A>G chez différents clones cybrides (c1, c2, c3). Abréviations : M = marqueur ; bp = paires de bases; WT = type sauvage; Mut = mutant; RFLP = polymorphisme de longueur de fragment de restriction; MELAS = myopathie mitochondriale, encéphalopathie, acidose lactique et épisodes ressemblant à des accidents vasculaires cérébraux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Composition des médias | |
| Milieu de culture complet | Conc. final. |
| DMEM High Glucose (sans L-Glutamine W/Pyruvate de sodium) | [1:1] |
| FetalClone III (produit de sérum bovin) | 10% |
| Pyruvate de sodium 100 mM | 1 mM |
| Pénicilline-Streptomycine (solution 100x) | 1% |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | 2 mM |
| Milieu de culture complété | Conc. final. |
| DMEM High Glucose (sans L-Glutamine W/Pyruvate de sodium) | [1:1] |
| FetalClone III (produit de sérum bovin) | 10% |
| Pyruvate de sodium 100 mM | 1 mM |
| Pénicilline-Streptomycine (solution 100x) | 1% |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | 4 mM |
| Uridine | 50 μg/mL |
| Milieu d’énucléation | Conc. final. |
| DMEM High Glucose (sans L-Glutamine W/Pyruvate de sodium) | [1:1] |
| FetalClone III (produit de sérum bovin) | 5% |
| Pyruvate de sodium 100 mM | 1 mM |
| Pénicilline-Streptomycine (solution 100x) | 1% |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | 2 mM |
| Cytochalasine B de Drechslera dematioidea | 10 μg/mL |
| Milieu de fusion | Conc. final. |
| DMEM High Glucose (sans L-Glutamine W/Pyruvate de sodium) | [1:1] |
| FetalClone III (produit de sérum bovin) | 5% |
| Pyruvate de sodium 100 mM | 1 mM |
| Pénicilline-Streptomycine (solution 100x) | 1% |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | 2 mM |
| Support de sélection | Conc. final. |
| DMEM High Glucose (sans L-Glutamine W/Pyruvate de sodium) | [1:1] |
| FBS dialyzé | 5% |
| Pyruvate de sodium 100 mM | 1 mM |
| Pénicilline-Streptomycine (solution 100x) | 1% |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | 2 mM |
| 5-Bromo-2'-Désoxyuridine | 100 μg/mL |
Tableau 1 : Détails des supports utilisés pour la génération de cybrides.
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Discussion
L’ADNmt a un taux de mutation très élevé par rapport à l’ADNn en raison de l’absence d’histones protectrices et de son emplacement à proximité de la chaîne respiratoire, ce qui expose la molécule à des effets oxydatifs dommageables qui ne sont pas efficacement contrecarrés par les systèmes de réparation16. Les premières mutations pathogènes de l’ADNmt ont été identifiées en 198817,18, et depuis lors, un grand nombre de mutations ont été décrites. La technologie NGS est une approche pertinente pour dépister l’ensemble du génome mitochondrial et identifier facilement les variantes14. Cependant, l’évaluation du rôle pathogène d’une mutation de l’ADNmt jamais décrite peut être difficile et repose toujours sur des méthodes « à l’ancienne » telles que la génération de cellules cybrides décrites dans ce protocole 11,12,13. La génération cybride décrite ici récapitule les méthodes originales décrites par King et Attardi5. Cependant, d’autres protocoles contiennent des modifications mineures principalement liées aux systèmes d’énucléation cellulaire10. Dans d’autres cas, l’énucléation n’est pas nécessaire, par exemple, lorsque le matériel biologique dérivé du patient est constitué de plaquettes, qui ne contiennent pas de noyau19.
Les cybrides transmissibles possèdent plusieurs caractéristiques importantes, ce qui en fait un outil de recherche pertinent même lorsque les technologies moléculaires à haut débit peuvent profiler l’ADN et l’ARN au niveau d’une seule cellule. Dans des travaux pionniers, les cybrides ont été utilisés pour établir ou confirmer l’origine génétique de troubles cliniquement et biochimiquement définis comme des troubles mitochondriaux 6,7,8,9,20. En effet, le système permet exclusivement l’étude de la contribution de la mutation de l’ADNmt sans l’influence des gènes nucléaires de la bande pro et dans un fond nucléaire homogène des cellules rho0.
En outre, une corrélation quantitative génotype-phénotype peut être réalisée, grâce à l’isolement de différents clones cybrides portant différents pourcentages des mutations. Les différents clones ont été sélectionnés à l’aide d’un milieu de sélection (tableau 1) complété par un FBS dialysé et ne contenant pas d’uridine et de pyruvate, permettant la croissance de cellules rho0 fusionnées avec des cytoplastes uniquement. Ainsi, les cellules rho0 qui n’avaient pas fusionné ou avaient fusionné avec des fibroblastes intacts (cellules bi- ou polynucléées), ainsi que tous les fibroblastes intacts non énucléés résiduels, sont éliminés. En effet, les cellules rho0 sont complètement appauvries en ADNmt par une exposition à long terme à de faibles concentrations de bromure d’éthidium, un puissant inhibiteur de la gamma-polymérasemitochondriale 21.
Dépourvues d’une chaîne respiratoire fonctionnelle, les cellules rho0 dépendent exclusivement de la glycolyse pour leurs besoins énergétiques et deviennent dépendantes du pyruvate. De plus, les cellules rho0 sont devenues auxotrophes pour les pyrimidines (l’uridine est un précurseur de la pyrimidine) en raison de la carence en dihydroorotate déshydrogénase, une enzyme fonctionnant dans les mitochondries et impliquée dans la biosynthèse de la pyrimidine. Alors que les cellules rho0 sont dérivées de cellules déficientes en thymidine kinase (TK-) de l’ostéosarcome humain 143B, les fibroblastes, les cytoplastes et les hybrides polynucléés sont TK +. Par conséquent, les cellules TK+ sont éliminées en raison de l’exposition à la 5-bromo-2'-désoxyuridine. En fait, cet analogue de l’uridine est reconnu par les savoirs traditionnels catalysant la phosphorylation de la désoxythymidine, qui est ensuite utilisée dans la biosynthèse de l’ADN. Ce processus entraîne des mutations létales provoquant la mort cellulaire. Un autre avantage des cybrides est la possibilité de les congeler et/ou de les réutiliser pendant de longues périodes de culture sans altération. De plus, comme les cellules tumorales, leur taux de croissance élevé réduit la durée de l’étude expérimentale.
La condition moléculaire préalable pour rendre ce système utile et fiable est de vérifier la contribution génétique correcte de l’ADN nucléaire et mitochondrial et la quantité d’ADNmt dans les cybrides repeuplés. De nos jours, cela peut être facilement réalisé en utilisant des techniques NGS permettant l’analyse de l’ensemble de la molécule d’ADNmt pour définir les haplogroupes et en vérifiant en permanence la présence de toute autre variante pathogène indésirable en plus de la variante étudiée. Dans le cas de conditions hétéroplasmiques, l’isolement de clones avec des charges de mutation différentes, allant idéalement de 0% à 100%, peut être utilisé pour corréler le pourcentage de mutation avec la gravité de la déficience mitochondriale.
Les pièges possibles cachés dans ces procédures de génération de cybrides sont liés à l’origine tumorale des cellules rho0 utilisées comme donneurs nucléaires. Ces cellules sont aneuploïdes, et il n’est pas clair comment cela pourrait éventuellement affecter les fonctions mitochondriales et la traduction et l’assemblage des différentes sous-unités de la chaîne respiratoire codées par l’ADN nucléaire et mitochondrial, respectivement. Généralement, il serait conseillé de générer des cybrides en utilisant des cellules rho0 d’origines différentes et de vérifier que les clones obtenus présentent des phénotypes comparables. Une autre limitation est que les cellules tumorales sont principalement glycolytiques tandis que les troubles mitochondriaux dépendent massivement de l’OXPHOS. Par conséquent, l’impact d’un noyau glycolytique (cellules rho0 ) sur les conséquences d’une mutation de l’ADNmt doit être soigneusement établi.
Malgré les limitations ci-dessus, la génération de cybrides a révolutionné le domaine de la médecine mitochondriale et est toujours utilisée pour établir le rôle pathogène de nouvelles mutations de l’ADNmt. De plus, la technologie cybride est utilisée pour étudier la contribution mitochondriale à différentes maladies, allant des troubles neurodégénératifs courants tels que la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer et la maladie de Huntington 22,23,24,25,26, au cancer et au traitement anticancéreux 27,28.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été réalisée au Centre d’étude des maladies pédiatriques mitochondriales (http://www.mitopedia.org), financé par la Fondation Mariani. VT est membre du Réseau européen de référence pour les maladies neuromusculaires rares (ERN EURO-NMD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva - HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
References
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