Batofenantropin Bazlı Kolorimetrik Tahlil Kullanılarak Doku Non-Heme Demir İçeriğinin Ölçülmesi
Summary
Burada, hayvan dokularındaki heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için, çoğu laboratuvarda kolayca uygulanabilen basit, köklü bir kolorimetrik test kullanılarak bir protokol sağlanmaktadır.
Abstract
Demir önemli bir mikro besindir. Hem aşırı demir yükü hem de eksikliği insanlar için oldukça zararlıdır ve doku demir seviyeleri ince bir şekilde düzenlenir. Demir yükü veya eksikliğinin deneysel hayvan modellerinin kullanılması, demir homeostazının sistemik ve hücresel düzenlenmesinde rol oynayan mekanizmaların bilgisini ilerletmek için etkili olmuştur. Hayvan dokularındaki toplam demir seviyelerinin ölçümü genellikle atomik absorpsiyon spektroskopisi veya heme olmayan demirin bir batofenantrolin reaktifi ile reaksiyonuna dayanan kolorimetrik bir tahlil ile gerçekleştirilir. Uzun yıllar boyunca, kolorimetrik tahlil, çok çeşitli hayvan dokularında heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için kullanılmıştır. Atomik absorpsiyon spektroskopisinden farklı olarak, kırmızı kan hücrelerinde bulunan hemoglobinden türetilen heme demirinin katkısını dışlar. Dahası, sofistike analitik beceriler veya çok pahalı ekipmanlar gerektirmez ve bu nedenle çoğu laboratuvarda kolayca uygulanabilir. Son olarak, kolorimetrik tahlil küvet bazlı olabilir veya daha yüksek numune verimi sağlayan bir mikroplaka formatına uyarlanabilir. Bu çalışma, aşırı demir yükü veya demir eksikliğinin çeşitli deneysel hayvan modellerinde doku demir seviyelerindeki değişikliklerin tespiti için uygun olan iyi kurulmuş bir protokol sunmaktadır.
Introduction
Demir, oksijen taşınması, enerji üretimi veya DNA sentezi gibi önemli biyolojik işlemlerde yer alan proteinlerin işlevi için gerekli olan temel bir mikro besindir. Önemli olarak, hem demir fazlalığı hem de demir eksikliği insan sağlığına oldukça zararlıdır ve doku demir seviyeleri ince bir şekilde düzenlenir. Anormal diyet demir emilimi, demir eksikliği olan diyetler, tekrarlanan kan transfüzyonları ve kronik inflamasyon, dünya çapında milyarlarca insanı etkileyen demir ile ilişkili bozuklukların yaygın nedenleridir1,2,3.
Aşırı demir yükü veya eksikliğinin deneysel hayvan modelleri, demir homeostazının sistemik ve hücresel regülasyonunda yer alan mekanizmalar hakkındaki bilgimizi ilerletmek için etkili olmuştur4. Son yirmi yılda kaydedilen önemli ilerlemelere rağmen, birçok kilit husus belirsizliğini korumaktadır. Önümüzdeki yıllarda, hayvan dokularındaki toplam demir seviyelerinin doğru ölçümü, demir biyolojisi alanındaki araştırmaları ilerletmek için kritik bir adım olmaya devam edecektir.
Çoğu laboratuvar, doku demirini atomik absorpsiyon spektroskopisi (AAS), endüktif olarak eşleşmiş plazma kütle spektrometresi (ICP-MS) veya heme olmayan demirin bir batofenantrolin reaktifi ile reaksiyonuna dayanan kolorimetrik bir tahlil ile ölçer. Sonuncusu, Torrance ve Bothwell tarafından 50 yıl önce tanımlanan orijinal yönteme dayanmaktadır5,6. Bu yöntemin bir varyasyonu daha sonra batofenantropin7’ye alternatif olarak ferrozin kullanılarak geliştirilmiş olsa da, ikincisi literatürde en çok atıfta bulunulan kromojenik reaktif olmaya devam etmektedir.
Tercih edilen yöntem genellikle mevcut uzmanlığa ve altyapıya bağlıdır. AAS ve ICP-MS daha hassas olsa da, kolorimetrik tahlil aşağıdaki önemli avantajları sunduğu için yaygın olarak kullanılmaya devam etmektedir: i) kırmızı kan hücrelerinde bulunan hemoglobinden elde edilen heme demirinin katkısını dışlar; ii) sofistike analitik beceriler veya çok pahalı ekipmanlar gerektirmez; ve iii) orijinal küvet bazlı tahlil, daha yüksek numune verimi sağlayan bir mikroplaka formatına uyarlanabilir. Bu çalışmada sunulan kolorimetrik yaklaşım, kemirgenlerden balıklara ve meyve sineklerine kadar çeşitli deneysel hayvan modellerinde aşırı demir yükü veya demir eksikliği olan doku non-heme demir seviyelerindeki değişiklikleri ölçmek için rutin olarak kullanılmaktadır. Burada, hayvan dokularındaki heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için, çoğu laboratuvarın uygulamayı kolay bulması gereken basit, iyi kurulmuş, kolorimetrik bir tahlil kullanılarak bir protokol sağlanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hayvan dokularındaki heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için, başlangıçta Torrance ve Bothwell tarafından tanımlanan batofenantrolin bazlı kolorimetrik tahlilin adaptasyonu kullanılarak bir protokol sağlanmıştır5,6. Yöntemin kritik adımları doku numunesi kurutma; protein denatürasyonu ve asit hidrolizi ile inorganik demir salınması; indirgeyici ajan tiyoglikolik asit varlığında ferrik (Fe3+) demirin demir durumuna (Fe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, UIDB/04293/2020 projesi kapsamında FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P. aracılığıyla Ulusal Fonlar tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. Anemia of inflammation. Blood. 133 (1), 40-50 (2019).
- Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).
- Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
- Torrence, J. D., Bothwell, T. H., Cook, J. D. Tissue iron stores. Methods in Haematology. , 104-109 (1980).
- Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
- Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
- Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297 (2010).
- Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. Iron Absorption in Drosophila melanogaster. Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).
- Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
- Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).
