Summary
Burada, hayvan dokularındaki heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için, çoğu laboratuvarda kolayca uygulanabilen basit, köklü bir kolorimetrik test kullanılarak bir protokol sağlanmaktadır.
Abstract
Demir önemli bir mikro besindir. Hem aşırı demir yükü hem de eksikliği insanlar için oldukça zararlıdır ve doku demir seviyeleri ince bir şekilde düzenlenir. Demir yükü veya eksikliğinin deneysel hayvan modellerinin kullanılması, demir homeostazının sistemik ve hücresel düzenlenmesinde rol oynayan mekanizmaların bilgisini ilerletmek için etkili olmuştur. Hayvan dokularındaki toplam demir seviyelerinin ölçümü genellikle atomik absorpsiyon spektroskopisi veya heme olmayan demirin bir batofenantrolin reaktifi ile reaksiyonuna dayanan kolorimetrik bir tahlil ile gerçekleştirilir. Uzun yıllar boyunca, kolorimetrik tahlil, çok çeşitli hayvan dokularında heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için kullanılmıştır. Atomik absorpsiyon spektroskopisinden farklı olarak, kırmızı kan hücrelerinde bulunan hemoglobinden türetilen heme demirinin katkısını dışlar. Dahası, sofistike analitik beceriler veya çok pahalı ekipmanlar gerektirmez ve bu nedenle çoğu laboratuvarda kolayca uygulanabilir. Son olarak, kolorimetrik tahlil küvet bazlı olabilir veya daha yüksek numune verimi sağlayan bir mikroplaka formatına uyarlanabilir. Bu çalışma, aşırı demir yükü veya demir eksikliğinin çeşitli deneysel hayvan modellerinde doku demir seviyelerindeki değişikliklerin tespiti için uygun olan iyi kurulmuş bir protokol sunmaktadır.
Introduction
Demir, oksijen taşınması, enerji üretimi veya DNA sentezi gibi önemli biyolojik işlemlerde yer alan proteinlerin işlevi için gerekli olan temel bir mikro besindir. Önemli olarak, hem demir fazlalığı hem de demir eksikliği insan sağlığına oldukça zararlıdır ve doku demir seviyeleri ince bir şekilde düzenlenir. Anormal diyet demir emilimi, demir eksikliği olan diyetler, tekrarlanan kan transfüzyonları ve kronik inflamasyon, dünya çapında milyarlarca insanı etkileyen demir ile ilişkili bozuklukların yaygın nedenleridir1,2,3.
Aşırı demir yükü veya eksikliğinin deneysel hayvan modelleri, demir homeostazının sistemik ve hücresel regülasyonunda yer alan mekanizmalar hakkındaki bilgimizi ilerletmek için etkili olmuştur4. Son yirmi yılda kaydedilen önemli ilerlemelere rağmen, birçok kilit husus belirsizliğini korumaktadır. Önümüzdeki yıllarda, hayvan dokularındaki toplam demir seviyelerinin doğru ölçümü, demir biyolojisi alanındaki araştırmaları ilerletmek için kritik bir adım olmaya devam edecektir.
Çoğu laboratuvar, doku demirini atomik absorpsiyon spektroskopisi (AAS), endüktif olarak eşleşmiş plazma kütle spektrometresi (ICP-MS) veya heme olmayan demirin bir batofenantrolin reaktifi ile reaksiyonuna dayanan kolorimetrik bir tahlil ile ölçer. Sonuncusu, Torrance ve Bothwell tarafından 50 yıl önce tanımlanan orijinal yönteme dayanmaktadır5,6. Bu yöntemin bir varyasyonu daha sonra batofenantropin7'ye alternatif olarak ferrozin kullanılarak geliştirilmiş olsa da, ikincisi literatürde en çok atıfta bulunulan kromojenik reaktif olmaya devam etmektedir.
Tercih edilen yöntem genellikle mevcut uzmanlığa ve altyapıya bağlıdır. AAS ve ICP-MS daha hassas olsa da, kolorimetrik tahlil aşağıdaki önemli avantajları sunduğu için yaygın olarak kullanılmaya devam etmektedir: i) kırmızı kan hücrelerinde bulunan hemoglobinden elde edilen heme demirinin katkısını dışlar; ii) sofistike analitik beceriler veya çok pahalı ekipmanlar gerektirmez; ve iii) orijinal küvet bazlı tahlil, daha yüksek numune verimi sağlayan bir mikroplaka formatına uyarlanabilir. Bu çalışmada sunulan kolorimetrik yaklaşım, kemirgenlerden balıklara ve meyve sineklerine kadar çeşitli deneysel hayvan modellerinde aşırı demir yükü veya demir eksikliği olan doku non-heme demir seviyelerindeki değişiklikleri ölçmek için rutin olarak kullanılmaktadır. Burada, hayvan dokularındaki heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için, çoğu laboratuvarın uygulamayı kolay bulması gereken basit, iyi kurulmuş, kolorimetrik bir tahlil kullanılarak bir protokol sağlanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL/6 fareler ticari olarak satın alındı ve C57BL/6 arka planındaki hepcidin-null (Hamp1−/-) fareler8 Sophie Vaulont'un (Institut Cochin, Fransa) nazik bir hediyesiydi. Hayvanlar, i3S hayvan tesisinde belirli patojensiz koşullar altında, sıcaklık ve ışık kontrollü bir ortamda, standart kemirgen chow ve suya serbest erişime sahip olarak barındırıldı. Avrupa levreği (Dicentrarchus labrax) ticari bir balık çiftliğinden satın alındı ve ICBAS hayvan tesisinde, sıcaklık ve ışık kontrollü bir ortamda barındırıldı ve günlük ad libitum'u standart levrek yemi ile besledi. Omurgalı hayvanları içeren tüm prosedürler i3S Hayvan Etik Komitesi ve ulusal otorite Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV) tarafından onaylanmıştır. Ticari reaktifler, ekipmanlar ve hayvanlar hakkındaki bilgiler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Çözelti hazırlama
NOT: Tüm reaktifleri ve çözeltileri demir içermeyen cam eşyalarla veya tek kullanımlık plastik eşyalarla işleyin ve hazırlayın. Demir kontaminasyonu riski nedeniyle metalik laboratuvar malzemelerinin (örneğin paslanmaz çelik spatulalar) herhangi bir reaktif veya çözelti ile temas etmesine izin vermeyin. Yeniden kullanılabilir cam eşyaların demir içermediğinden emin olun. Malzemeleri 30-60 dakika boyunca uygun laboratuvar deterjanı ile yıkayın, deiyonize suyla durulayın, deiyonize su ile 1:3 seyreltilmiş% 37'lik bir nitrik asit çözeltisinde gece boyunca bekletin, tekrar deiyonize suyla durulayın ve kurumaya bırakın.
- Asit karışımı: Bir cam şişede 82.2 mL% 37 hidroklorik aside 10 g trikloroasetik asit ekleyin, iyice çözün ve son hacmi deiyonize su ile 100 mL'ye ayarlayın. Kullanmadan önce çalkalayın. Alternatif olarak, doku sindirimi için sadece% 37 hidroklorik asit kullanın.
NOT: Çözelti, koyu kahverengi cam reaktif şişelerinde saklandığında en az 2 ay boyunca stabildir.
DİKKAT: Hidroklorik asit ve trikloroasetik asit aşındırıcıdır ve konsantre formlar toksik asidik buharları serbest bırakır. Asitleri kullanırken her zaman koruyucu giysiler, kimyasallara dayanıklı eldivenler ve kimyasal sıçrama gözlükleri kullanın. Onları solumaktan kaçının ve her zaman bir duman başlığının altındayken asitleri kullanın. - Doymuş sodyum asetat: Bir cam şişede 400 mL deiyonize suya 228 g susuz sodyum asetat ekleyin ve oda sıcaklığında gece boyunca çalkalayın. Çözeltinin dinlenmesine ve bir gün boyunca çökelmesine izin verin. Yağış olmazsa, az miktarda sodyum asetat eklemeye devam edin. Çözeltiyi bir cam şişede saklayın.
- Kromojen Reaktif: 1 mL kromojen reaktif hazırlamak için, 500 μL deiyonize suya ve 10 μL konsantre (% 100) tiyoglikolik aside 1 mg 4,7-difenil-1,10-fenantropin disülfonik asit disodyum tuzu ekleyin ve iyice çözün. Son hacmi deiyonize su ile 1 mL'ye kadar yapın.
NOT: Gerektiği kadar kromojen reaktif hazırlayın. Çözelti, ışıktan korunduğunda 1 ay boyunca kararlıdır. - Çalışma Kromojen Reaktifi (WCR): 5 hacim doymuş sodyum asetat ve 5 hacim deiyonize suya 1 hacim Kromojen Reaktifi ekleyin.
NOT: Bu çözelti kullanım gününde taze olarak hazırlanmalıdır. - Stok Demir Standart Çözeltisi: 20 mM'lik bir stok demir çözeltisi hazırlamak için, 5.480 μL% 37 hidroklorik asit içeren 250 mL hacimsel şişeye 111.5 mg karbonil demir tozu yerleştirin. Oda sıcaklığında gece boyunca çözünmeye bırakın (veya kaynar su banyosunda inkübe edin). Daha sonra, çözeltiyi deiyonize su ile 100 mL'lik son bir hacme kadar hazırlayın.
NOT: Standart çözelti, sıkıca kapatılmış bir kapta saklandığında süresiz olarak saklanabilir. - Çalışma Demiri Standart Çözeltisi (WISS): 500 μL deiyonize suya 13,5 μL% 37 hidroklorik asit ekleyin. Stok Demir Standart Çözeltisinden 10 μL ekleyin ve deiyonize su ile 1 mL'ye kadar son hacmi oluşturun (11.169 μg Fe / mL, 200 μM; AAS ile ölçülür).
NOT: Çalışma çözeltisi kullanım gününde taze olarak hazırlanmalıdır.
2. Numune kurutma
- Bir neşter bıçağı ile 10-100 mg ağırlığındaki bir doku örneğini kesin. Analitik/hassas terazide küçük bir parafilm parçası (Taze Ağırlık) üzerinde doğru şekilde tartın.
- Plastik cımbız kullanarak, doku parçasını 24 delikli bir plakaya (suyun buharlaşmasına izin vermek için kapaksız) yerleştirin ve 48 saat boyunca 65 ° C'de standart bir inkübatörde kurumasını bekleyin.
- Alternatif olarak, doku örneklerini kurutmak için bir laboratuvar mikrodalga sindirim fırını kullanın. Plastik cımbız kullanarak, tartılan doku parçasını demir içermeyen bir Teflon bardağa yerleştirin ve mikrodalgada kurutun. Çalışma parametrelerini cihazın kullanım kılavuzuna göre ayarlayın.
NOT: Referans olarak, spesifik çürütme fırını kullanılarak karaciğer numunelerinin kurutulması için çalışma parametreleri (bkz. Malzeme Tablosu) Tablo 1'de gösterilmiştir. - Plastik cımbız kullanarak, her kurumuş doku parçasını analitik/hassas bir terazinin içindeki küçük bir parafilm parçasının üzerine yerleştirin ve doğru şekilde tartın (Kuru Ağırlık).
3. Asidik sindirimi örnekleyin
- Plastik cımbız kullanarak, her kurutulmuş doku parçasını 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- 1 mL asit karışımı ekleyin ve mikrosantrifüj tüpünü kapatın. Dokunun ihmal edilmesi dışında, aynı şekilde bir asit boşluğu hazırlayın.
DİKKAT: Asit karışımı aşındırıcıdır ve toksik buharlar salgılar. Asit karışımını kullanırken koruyucu giysiler, kimyasallara dayanıklı eldivenler ve kimyasal sıçrama gözlükleri takın. Nefes almaktan kaçının ve her zaman bir duman başlığının altındayken kullanın. - Mikrosantrifüj tüplerini bir inkübatörde 20 saat boyunca 65 ° C'de inkübe ederek dokuları sindirin.
- Oda sıcaklığına soğuduktan sonra, şeffaf (sarı) asit ekstraktının (süpernatant) 500 μL'sini, plastik uçlarla donatılmış bir mikropipet kullanarak yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Net bir süpernatan elde etmek mümkün değilse, kısa bir santrifüjleme spini gerçekleştirin.
DİKKAT: Süpernatant oldukça asidiktir. Süper nantantları kullanırken koruyucu giysiler, kimyasallara dayanıklı eldivenler ve kimyasal sıçrama gözlükleri giyin. Her zaman bir duman başlığının altındayken onları kullanın.
NOT: Bu noktada, asit ekstraktları kolorimetrik tahlil için hemen kullanılabilir veya daha sonra kullanmak üzere -20 ° C'de dondurulabilir. Dondurulmuş numuneleri oda sıcaklığına tamamen çözün ve kullanmadan önce vorteksleyin.
4. Renk gelişimi
- Tablo 2'de belirtildiği gibi 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde veya daha yüksek verim için doğrudan düz tabanlı, 96 delikli, berrak, işlenmemiş polistiren mikroplakalara kromojen reaksiyonları hazırlayın. Tüm reaksiyonları (asit boşluğu, standart ve numune) en azından kopya halinde hazırlayın.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
5. Absorbans okuma
- Bir spektrofotometrede veya plaka okuyucuda 535 nm dalga boyundaki numune emiciliğini deiyonize su referansına karşı ölçün. Plakalar kapaksız veya kapaklı olarak okunabilir. Kapaklı kasada, absorbans okumasına olası paraziti önlemek için ölçüm öncesinde kapaktan asit buharlarının salınması nedeniyle oluşan yoğuşmaları giderin.
NOT: Deiyonize suya karşı okunan asit boşluğunun optik emilimi (referans) 0,015'ten az olmalıdır; standardın ve numunelerin optik absorbansı 0.100 ile 1.000 arasında olmalıdır. Çok yüksek veya çok düşük demir içeriğine sahip numuneler için, asit ekstraktı (süpernatant) ve diH2O hacimlerinin ayarlanması gerekebilir (Tablo 2): absorbans 1.0'dan büyükse, daha küçük bir numune (süpernatant) hacmi kullanın; absorbans 0.1'den düşük olduğunda, süpernatanın daha yüksek bir hacmini kullanın. Her numunenin doku demir içeriği hesaplanırken numune hacmi (Vsmp) dikkate alınır (bkz. adım 6).
6. Doku demir içeriğinin hesaplanması
- Aşağıdaki denklemle heme olmayan doku demir içeriğini hesaplayın:
Doku demiri (μg/g kuru doku) =
AT = test numunesinin emilmesi
AB = asit boşluğunun emilmesi
AS = standardın absorbansı
Fes = WISS'nin demir konsantrasyonu (μg Fe/mL)
W = kuru mendilin ağırlığı (g)
Vsmp = numune hacmi (Tablo 2'deki değişken Supernatant hacmi mL'ye dönüştürülür)
Vf = 65 ° C'de gece inkübasyonundan sonra asit karışımının son hacmi (mL cinsinden asit hacmine artı kuru doku hacmine karşılık gelir; numune ağırlıkları önemli ölçüde farklılık göstermiyorsa, sabit bir hacim ≈ 1 mL varsayalım)
Vstd = demir standart hacmi (Tablo 2'deki WISS hacmi mL'ye dönüştürülmüştür)
Vrv = nihai reaksiyon hacmi (Tablo 2'deki toplam hacim mL'ye dönüştürülür)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cuvette ile 96 kuyucuklu mikro plaka karşılaştırması
Doku heme olmayan demirin, orijinal olarak Torrance ve Bothwell tarafından tanımlanan bir batofenantropin reaktifi ile reaksiyona girerek ölçülmesi5,6, absorbans okuması için bir spektrofotometrenin kullanılmasına dayanır. Bu nedenle, kromojen reaksiyonunda kullanılan hacimler, normal bir spektrofotometre küvetinin boyutuyla uyumludur. Bu çalışma, kromojen reaksiyonlarının bir mikroplaka okuyucusunda absorbans ölçümü için doğrudan 96 delikli bir mikroplakada hazırlandığı, daha küçük reaktif hacimleri gerektiren ve daha yüksek verime izin veren bir yöntem adaptasyonunu açıklamaktadır.
Her iki yaklaşımın hassasiyetini karşılaştırmak için, başlangıçta çalışan demir standart çözeltisinin (WISS) seri seyreltilmesi hazırlandı ve kromojen reaksiyonları, Tablo 2'de belirtildiği gibi, 1.5 mL tüplerde veya 96 delikli plakalarda monte edildi. Absorbans, sırasıyla bir spektrofotometrede (küvetli) veya bir mikroplaka okuyucuda ölçüldü. İki yaklaşımla oluşturulan temsili standart eğriler Şekil 1A'da gösterilmiştir. Her iki durumda da, test edilen demir konsantrasyonları boyunca doğrusallık çok yüksekti (mikroplaka ve küvet için sırasıyla r2 = 0.9996 ve r2 = 0.9997).
Dikkate değer, 11.169 μg Fe / mL içeren bir WISS kullanıldı. Mevcut veriler, standardı hazırlamak için daha düşük demir konsantrasyonlarının kullanılabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, daha yüksek demir konsantrasyonlarına sahip bir WISS'nin kullanılması önerilmez, çünkü bu, spektrofotometrenin doğrusal dinamik algılama aralığını aşan absorbans değerlerine yol açabilir ve standart eğrilerin platoya çıkmasına neden olabilir.
Küvet ve mikroplaka bazlı testleri daha da karşılaştırmak için, toplam 55 fare dokusu örneğinde (karaciğer, dalak, kalp, akciğer, kemik iliği) heme olmayan demir içeriği ölçülmüştür. İki metodoloji arasında çok yüksek derecede korelasyon gözlenmiştir (r = 0.999, p < 0.0001), mikroplaka bazlı yöntemin orijinal küvet bazlı yönteme geçerli bir alternatif olduğunu göstermektedir (Şekil 1B).
Son olarak, fare dokularındaki heme olmayan demir seviyeleri, aynı dokulardan elde edilen numunelerin hidroklorik asit ve trikloroasetik asit karışımı (orijinal yöntem açıklamasına göre) veya tek başına hidroklorik asit karışımı ile asidik sindiriminden sonra mikroplaka bazlı yöntemle ölçülmüştür. Trikloroasetik asidin asit sindiriminden çıkarılabileceğini gösteren çok yüksek bir korelasyon gözlendi (r = 0.999, p < 0.0001, Şekil 1C).
Aşağıda yer alan temsili sonuçlar, 96 kuyucuklu plakalarda numune emiliminin ölçülmesiyle elde edilmiştir.
Genetik hemokromatozun fare modelinde doku non-heme demir seviyelerinin ölçülmesi
Batofenantropin bazlı kolorimetrik tahlil kullanılarak, yaygın olarak kullanılan fare suşu C57BL / 6'dan ve hepcidin nakavt (Hamp1-/-) farelerinden (C57BL / 6 genetik arka planında) çeşitli dokularda (karaciğer, dalak, kalp ve pankreas) heme olmayan demir içeriği belirlendi. Temsili demir seviyeleri Şekil 2'de gösterilmiştir. Hepcidin, demir metabolizmasının önemli bir düzenleyicisidir ve bozulması, şiddetli hepatik, pankreas ve kardiyak demir birikimi ve dalak demir tükenmesi ile hemokromatoz benzeri demir birikimi fenotipine yol açar8.
Deneysel demir modülasyonu sonrası levrek karaciğerinde heme olmayan demir seviyelerinin ölçümü
Batofenantropin bazlı kolorimetrik test kullanılarak, sağlıklı (kontrol), demir ile muamele edilmiş (intraperitoneal yolla uygulanan 2 mg demir dekstran) ve anemik (kaudal damarlardan alınan kanın% 2 v / w'si) Avrupa levreği (Dicentrarchus labrax) karaciğerinde heme olmayan demir seviyeleri belirlendi. Beklendiği gibi, hepatik demir seviyeleri demir ile tedavi edilen hayvanlarda büyük ölçüde artarken, anemi hepatik demir depolarında hafif bir azalmaya neden olmuştur (Şekil 3).
Tüm Drosophila melanogaster'de heme olmayan demir seviyelerinin ölçümü
Mevcut yöntem, küçük vücut kütleleri nedeniyle bireysel Drosophila sineklerinde heme olmayan demir seviyelerini ölçmek için uygun olmasa da (ortalama ağırlık erkekler ve dişiler için sırasıyla 0.6 mg ve 0.8 mg'dır)9, havuzlanmış sineklerle başarıyla kullanılabilir. Şekil 4 , vahşi tip Oregon-R veya Malvolio (Mvl) nakavtı olan 20 bütün erkek sinek grubu için temsili heme olmayan demir seviyelerini göstermektedir. Mvl, iki değerli metal taşıyıcı 1 (DMT1) adı verilen bir proteini kodlayan memeli SLC11A2 geninin homologudur ve genetik bozulması demir eksikliğine yol açar10. Beklendiği gibi, Mlv sinekleri, vahşi tipe kıyasla önemli ölçüde daha düşük bir vücut heme olmayan demir içeriği sundu.
| Güç 650W (%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| Basınç (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Süre (dk): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| Basınçta kalma süresi (TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| VANTİLATÖR: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tablo 1: Burada kullanılan mikrodalga sindirim fırınında karaciğer kurutma için çalışma parametreleri.
| WCR (μL) | Asit karışımı (μL) | Süpernatant (μL) | WISS (μL) | diH2O (μL) | Toplam hacim (μL) | ||
| 1,5 mL borular | Asit Boş | 1000 | 150 | 150 | 1300 | ||
| Standart | 1000 | 150 | 150 | 1300 | |||
| Örnek | 1000 | Değişken | Değişken | 1300 | |||
| 96 delikli mikro plaka | Asit Boş | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | ||
| Standart | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | |||
| Örnek | 150 | Değişken | Değişken | 195 |
Tablo 2: 1.5 mL tüplerde veya 96 delikli plakalarda kromojen reaksiyonlarının hazırlanması.
Şekil 1: Küvet veya 96 kuyucuklu mikroplaka bazlı kolorimetrik tahliller ile heme olmayan demirin belirlenmesi. (A) mikroplaka (açık kareler) ve küvet bazlı (açık üçgenler Δ) tahliller için standart eğriler
. (B) Karaciğer (katı daireler), dalak (açık 
daireler), kalp (katı üçgenler
), akciğer (yıldız işaretleri
) ve kemik iliği (elmaslar
) dahil olmak üzere 6 aylık erkek C57BL / 6 farelerinden alınan 55 doku örneğinde küvet bazlı ve mikroplaka bazlı heme olmayan demir seviyeleri arasındaki korelasyon. (C) Hidroklorik asit ve trikloroasetik asit (HCl + C2HCl3O2) veya tek başına hidroklorik asit (HCl) karışımı ile numunelerin asidik sindiriminden sonra 96 kuyucuklu mikroplaka bazlı tahlil ile ölçülen 6 aylık erkek farelerden (karaciğer, katı daireler; dalak, açık daireler) elde edilen dokuların bir alt kümesindeki heme olmayan demir seviyeleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Batofenantrolin bazlı kolorimetrik tahlil ile çeşitli dokularda belirlenen heme olmayan demir içeriği. Erkek C57BL / 6 vahşi tip farelerin (açık daireler ) ve erkek hepcidin eksikliği olan Hamp1-/- farelerin karaciğer, dalak, kalp ve pankreaslarındaki heme olmayan demir seviyeleri, 8 haftalıkken C57BL / 6 genetik arka planında (açık kareler ) batofenantrolin bazlı kolorimetrik tahlil ile ölçülmüştür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Deneysel demir modülasyonunu takiben genç dişi Avrupa levreklerinde hepatik heme olmayan demir seviyeleri. Aşırı demir yükü, 2 mg demir dekstranın intraperitoneal olarak uygulanmasıyla sağlanırken, anemi, kaudal damarlardan% 2 v / w kanın çekilmesiyle indüklendi. Karaciğerler demir tedavisi veya kan alımından 4 gün sonra toplandı. Kontrol hayvanları sağlıklı, tedavi edilmemiş levrekti. Non-heme demir düzeyleri batofenantrolin bazlı kolorimetrik tahlil ile ölçüldü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 1 aylık Drosophila'da heme olmayan demir seviyeleri, batofenantrolin bazlı kolorimetrik tahlil ile ölçülmüştür. Sonuçlar, (A) 20 sineğin her bir havuzundaki heme olmayan demir içeriğini veya (B) ortalama 0.64 mg / sinek ağırlığı göz önüne alındığında, her bir sineğin tahmini demir içeriğini göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hayvan dokularındaki heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için, başlangıçta Torrance ve Bothwell tarafından tanımlanan batofenantrolin bazlı kolorimetrik tahlilin adaptasyonu kullanılarak bir protokol sağlanmıştır5,6. Yöntemin kritik adımları doku numunesi kurutma; protein denatürasyonu ve asit hidrolizi ile inorganik demir salınması; indirgeyici ajan tiyoglikolik asit varlığında ferrik (Fe3+) demirin demir durumuna (Fe2+) indirgenmesi ve bir batofenantrolin reaktifi (kromojen reaksiyonu) ile reaksiyonu; elde edilen demir iyonu / batofenantropin pembe kompleksinin absorbans okuması; ve doku demir içeriğinin hesaplanması.
Mevcut çalışma, orijinal küvet tabanlı protokolün, tahlil hassasiyetinden ödün vermeden daha yüksek verim için 96 kuyu tabanlı bir formata nasıl uyarlanabileceğini göstermektedir. Özellikle, bu adaptasyon önemli ölçüde zaman tasarrufu sağlar, çünkü: 1) çok kanallı pipetler kullanılarak 96 delikli plakalarda aynı anda daha fazla sayıda kromojen reaksiyonu hazırlanabilir; ve 2) absorbans okumaları, bir plaka okuyucusunda spektrofotometre kullanıldığından çok daha hızlıdır. Mikroplaka bazlı tahlilin bir diğer önemli avantajı, reaktiflerle (özellikle batofenantrolin reaktifiyle) maliyetleri önemli ölçüde azaltan kromojen reaksiyon hacimlerinin ayarlanmasıdır. Tüm protokol 4 gün içinde tamamlanabilir. Numune kurutma (65 °C'de bir fırında gerçekleştirildiğinde 48 saate kadar sürebilir) ve asidik sindirim (20 saat boyunca gece boyunca uygun bir şekilde gerçekleştirilir) en çok zaman alan iki adımdır. Numune kurutma, çok çeşitli malzemelerin sindirilmesi, çözülmesi, hidrolize edilmesi veya kurutulmasında laboratuvar kullanımı için tasarlanmış bir mikrodalga çürütme fırını kullanılarak hızlandırılabilir. Çoğu doku örneğini 2,5 saatten daha kısa sürede kurutmak mümkün olduğundan, tüm protokolü sadece 2 gün içinde gerçekleştirebilirsiniz. Bununla birlikte, bir mikrodalganın kapasitesi, sığabileceği teflon bardak sayısıyla sınırlı olduğundan ve bardakların her kullanımdan sonra yıkanması ve dekontaminasyonuna ihtiyaç duyması nedeniyle, kullanıcılar çok sayıda numuneyi işlerken numuneleri 65 ° C'de 24 delikli plakalarda kurutmayı daha uygun bulabilirler. Dokuları kurutmak için gereken süre, 65 ° C'nin üzerindeki sıcaklıklar kullanılarak hala azaltılabilir; ancak erime riski nedeniyle plastik malzemeden kaçınılmalıdır.
Daha önce, Grundy ve ark.11 , numune kurutma adımı dahil edilmeden, tüm tahlilin 96 delikli plakalarda gerçekleştirildiği yöntemin bir uyarlamasını geliştirmişti. Bununla birlikte, kuru ağırlık yerine ıslak ağırlık kullanan dokulardaki metallerin ölçümü, hem taze hem de dondurulmuş doku numunelerinde hava ile kurutma yoluyla değişken ağırlık kaybından önemli ölçüde etkilenir12. Bu nedenle, demir içeriğinin doku kuru ağırlığına karşı normalleştirilmesi önerilir. Doku kurutması uygun bir seçenek değilse (örneğin, yağ dokusu), tahlilin numune toplandıktan hemen sonra yapılması önerilir, böylece taze ağırlığın doğru bir şekilde belirlenmesi depolama eserlerinden önemli ölçüde etkilenmez.
Asit çözeltisinin bileşimi de ele alındı. Orijinal protokole5,6 göre, dokular hidroklorik asit ve trikloroasetik asitten oluşan bir asit karışımı ile sindirilir. Bununla birlikte, mevcut çalışma, en azından karaciğer ve dalak örneklerini sindirmek için tek başına% 37 hidroklorik asidin eşit derecede verimli olduğunu göstermektedir.
Stok demir standart çözeltisi, ucuz ve oldukça saf bir demir tozu olan karbonil demir tozu kullanılarak hazırlanır. Burada açıklanan yaklaşımı takiben, daha sonra AAS tarafından belirlendiği gibi, 1.1169 mg Fe / mL (20 mM) içeren bir stok demir standart çözeltisi hazırlanmıştır. Diğer demir kaynakları (örneğin, demir sülfat, demir nitriyotoriasetat veya ticari standart çözeltiler), gerçek demir konsantrasyonunun belirlenmesi ve standart bir eğri gerçekleştirilerek analiz doğrusallığının doğrulanması koşuluyla, stok demir standart çözeltisini üretmek için kullanılabilir.
Mevcut yöntem kullanılarak, çeşitli hayvan dokularının heme olmayan demir içeriği başarıyla ölçülmüştür. Kemirgen dokuları (karaciğer, dalak, kalp ve pankreas), levrek karaciğeri ve tüm drosophila ile elde edilen temsili sonuçlar dahil edilmiştir. Yöntem, sofistike analitik araçlar veya pahalı altyapı gerektirmez ve bu nedenle çoğu laboratuvarda kolayca uygulanabilir. Özetle, burada açıklanan yöntem, demir homeostazı ve demir ile ilgili bozukluklar çalışmalarında, aşırı demir yükü veya eksikliğinin deneysel hayvan modellerini kullanan yaygın olarak uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, UIDB/04293/2020 projesi kapsamında FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P. aracılığıyla Ulusal Fonlar tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T.
- Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).
- Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
- Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. Methods in Haematology. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).
- Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
- Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
- Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297 (2010).
- Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F.
- Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
- Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).
