Summary
우리는 hSOD1G93A 쥐 모델에서 근 위축성 측삭 경화증의 병태 생리학에 대한 연구를 위해 세포 내Ca 2+의 타임 랩스 비디오 이미징을 위해 쥐 피질에서 신경교 세포, 성상 세포 및 미세 아교 세포의 1 차 배양을 준비하는 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐의 피질에서 신경교 세포, 성상 세포 및 미세 아교 세포의 1 차 배양을 준비하는 방법과 쥐 hSOD1G93A 모델에서 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)의 병태 생리학을 연구 할 목적으로 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 먼저, 프로토콜은 출생 후 쥐 피질에서 성상 세포와 미세 아교 세포를 분리 및 배양하는 방법을 보여 주며, 성상 세포의 신경교 섬유 산성 단백질 (GFAP) 마커와 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (Iba1) 소교 세포 마커를 사용하여 면역 세포 화학에 의해 이러한 배양의 순도를 특성화하고 테스트하는 방법을 보여줍니다. 다음 단계에서는 배양 된 세포의 염료 로딩 (칼슘 민감성 Fluo 4-AM) 및 살아있는 세포에 대한 비디오 이미징 실험에서 Ca2+ 변화의 기록에 대한 방법을 설명합니다.
비디오 녹화의 예는 다음으로 구성됩니다 : (1) ALS 환자로부터 분리 된 면역 글로불린 G (IgG)에 급성으로 노출 된 배양 된 성상 세포의Ca 2+ 이미징 사례는 동일한 실험에서 입증 된 바와 같이 ATP에 대한 반응과 비교하여 특징적이고 특이적인 반응을 나타낸다. 예는 또한 비 형질 전환 대조군과 비교하여 hSOD1G93A 성상 세포에서 ALS IgG에 의해 유발되는 세포 내 칼슘 농도의 더 뚜렷한 일시적인 상승을 보여줍니다. (2) 소포체Ca2+ ATPase의 비경쟁적 억제제인 타프시가르긴(Thg)에 의한 칼슘 저장고갈 동안 배양된 성상세포의Ca2+ 이미징, 이어서 기록 용액에 칼슘을 첨가하여 유도된 저장 작동식 칼슘 진입, 이는 hSOD1G93A 및 비-형질전환 성상세포에서의Ca 2+ 저장 작업 간의 차이를 입증함; (3) 배양된 미세아교세포의 Ca2+ 영상화는 주로 ALS IgG에 대한 반응의 결여를 나타내는 반면, ATP 적용은Ca2+ 변화를 유도하였다. 이 논문은 또한 Ca2+ 염료 및 염료 로딩 기술의 올바른 농도를 선택하여 중요한 세포 밀도 및 배양 순도와 관련하여 가능한 주의 사항 및 주의 사항을 강조합니다.
Introduction
세포 배양 기술은 건강 및 질병 분야의 다양한 세포 신경 생리학 분야에서 수많은 발전을 가져 왔습니다. 특히, 실험실 동물의 신경 조직에서 갓 분리 된 1 차 세포 배양을 통해 실험자는 다양한 생화학 적 배지 및 생리 학적 설정에서 다양한 세포의 행동을 면밀히 연구 할 수 있습니다. Ca2+ 민감성 염료와 같은 다양한 형광 생리학적 지표를 타임랩스 비디오 현미경과 함께 사용하면 실시간으로 세포 생물물리학 및 생화학적 과정에 대한 더 나은 통찰력을 얻을 수 있습니다.
ALS는 상부 및 하부 운동 뉴런에 영향을 미치는 치명적인 신경 퇴행성 질환입니다1. 이 질병은 가족 유형의 복잡한 발병 기전을 가지고 있지만 대부분 산발적 인 형태 (사례의 90 %)2. 비세포 자율 메커니즘이 ALS 병태생리학에 기여한다는 것은 잘 알려져 있으며, 이는 주로 신경교 세포의 필수적인 역할 때문입니다3. ALS는 또한 염증의 체액 성 및 세포 성 요인의 침범과 함께 신경 염증성 질환으로 잘 특성화됩니다.
면역 글로불린 G는 ALS 및 기타 신경 퇴행성 질환에서 분자 마커로 널리 사용됩니다. 이 마커의 혈청 수준을 연구하면 질병 4,5,6에서 신경 염증의 존재와 단계를 나타낼 수 있지만 뇌척수액에 존재하면 혈액 뇌 장벽7의 위반을 나타낼 수 있습니다. IgGs는 또한 ALS 환자7의 척수 운동 뉴런에서 침착 된 것으로 확인되었습니다. 그럼에도 불구하고,이 접근법은 IgGs 수준과 질병의 단계 및 특성의 상관 관계에서 약간의 불일치를 보여 주었다6.
ALS 환자의 혈청에서 분리 된 IgG (ALS IgG)는 나이브 성상 세포8에서 칼슘 반응을 유도하고 뉴런에서 글루타메이트 방출을 유도 할 수 있으며, 이는 ALS 병리학9의 특징 인 흥분 독성 효과를 가리킨다. 그러나, hSOD1G93A ALS 래트 모델 (인간 SOD1 돌연변이 10의 다중 카피 함유)에 대한 연구는 배양된 신경교세포 11, 조직 12,13,14, 또는 살아있는 동물13에서 산화 스트레스의 다수의 마커를 보여주었다. ALS 래트 모델로부터 배양된 성상교세포가 비-형질전환 동료로부터의 성상아교세포보다 과산화물에 의해 유도된 산화 스트레스에 더 취약하다는 것은 주목할 만하다1.
배양 물의 소교 세포는 덜 명백한 방식으로 ALS IgG의 영향을받습니다. 즉, BV-2 소교세포 세포주는 단지 4/11 ALS IgG 환자 샘플15의 적용에 반응하여 산화 스트레스의 형광 마커로부터의 신호의 상승을 나타냈다. 미세아교세포는 많은 신경염증성 병리에 참여하여 ALS16,17의 비세포 자율 메커니즘에서 산화 스트레스와 후기 진행 단계를 추가하는 것으로 잘 알려져 있습니다. 그럼에도 불구하고, ALS IgGs를 사용한 데이터는 이들 세포가 ALS 염증의 이러한 체액성 인자에 대해 성상세포만큼 반응적이지 않을 수 있음을 나타내었다. ALS 쥐 모델의 1 차 성상 세포에 대한 여러 연구가 새끼뿐만 아니라 증상이있는 동물, 뇌 또는 척수18,19,20,21에서 수행되었습니다. 이것은 소교 세포 1 차 배양에도 해당되지만, 성상 세포보다 적고 대부분 배아 단계22,23,24의 뇌 영역에서 발생합니다.
우리는 주로 흥분 독성의 생리적 마커로서이 이온의 세포 내 과도 현상을 따르는 수단으로 배양 된 세포에 대한Ca2+의 타임 랩스 비디오 이미징을 사용합니다. 따라서 이러한 과도 현상 (진폭, 과도 상태에서의 영역, 상승 시간, 주파수)의 생물 물리학 적 특성화를 통해 연구원은 신경 퇴행의 다양한 세포 모델에서 실험적 진단 매개 변수를 얻을 수 있습니다. 따라서이 기술은 질병 바이오 마커로서 IgGs의 정량적 생리 학적 평가의 이점을 제공합니다. ALS의 유도에서 IgGs 및Ca2+의 역할에 관한 많은 문헌이 있다. 이들 연구의 대부분은 환자 IgG를 실험 동물25,26,27,28,29에 주입하여 ALS를 유도함으로써 수행되었으며, 이어서 세포 내Ca2+ 상승 및 IgG 침착을 나타내었다. 일련의 연구는 시험관 내 운동 시냅스에 대한 ALS IgG의 효과를 조사했습니다. 30,31,32. 위의 맥락에서 여기에 제시된 기술은 ALS의 비 세포 자율 메커니즘에서 중요한 역할을하는 신경교 세포에 초점을 맞추고 신경 염증의 체액 성 요인으로서 IgG에 대한 잠재적 인 흥분 독성 반응을 정량화합니다. 이 접근법은 다른 세포 배양 시스템 및 일반적인 염증의 세포 모델에서 전체 혈청, CSF 또는 사이토 카인과 같은 다른 체액 성 인자를 테스트하는 데 더 광범위하게 적용될 수 있습니다.
이 논문은 Sprague Dawley 쥐의 피질에서 신경교 세포, 성상 세포 및 미세 아교 세포의 1 차 배양을 준비하는 방법과 이러한 세포를 추가로 사용하여 환자 혈청 유래 IgG로 ALS 병태 생리학을 연구하는 방법을 설명합니다. 프로토콜은 배양된 세포의 염료 로딩(그림 1) 및 타임랩스 비디오 이미징 실험에서 Ca2+ 변화의 기록에 대해 자세히 설명되어 있습니다. 비디오 녹화의 예는 신경교 세포가 ATP와 비교하여 ALS IgG에 어떻게 반응하는지 보여줄 것이며, 후자는 퓨린성 막 수용체를 활성화합니다. hSOD1G93A ALS 래트 뇌로부터 분리된 성상세포가 비-형질전환 대조군과 비교하여 ALS IgG에 대해 더 뚜렷한Ca 2 + 반응과 어떻게 반응하는지, 그리고 이 과정을Ca2+ 저장 작업의 차이와 연관시키는 방법에 대한 예가 처음으로 도시되었다. 또한 ALS IgG로 심각하게 도전받는 소교 세포에서 칼슘 이미징의 예가 나와 있으며 세포 내 칼슘의 반응은 미미합니다.
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Protocol
모든 실험은 과학적 목적을위한 동물 보호에 관한 EU 지침과 베오그라드 대학교 생물학 학부 윤리위원회 (승인 번호 EK-BF-2016 / 08)의 허가를 받아 수행되었습니다. 환자 물질 (IgGs에 대한 혈청)에 관해서는 인간을 대상으로 한 실험을 위해 세계 의학 협회 윤리 강령 (헬싱키 선언)에 따라 정보에 입각 한 환자의 동의하에 일상적인 임상 검사를 위해 수집되었습니다. 이 프로토콜은 세르비아 임상 센터의 윤리위원회에서 승인되었습니다 (No. 850/6).
1. 1차 세포 배양 제제
- 뇌 조직 분리
알림: 얼음처럼 차가운 용액을 사용하여 얼음 위에서 격리를 수행해야 합니다.- 1차 신생아 세포 배양을 위해 1-3일령의 신생아 새끼를 사용하십시오33.
참고: 여기에 제시된 연구를 위해, Sprague Dawley hSOD1G93A 및 비-형질전환 쥐가 사용되었다. 유전형 분석을 위해, 쥐 꼬리는 나중에 DNA 추출 및 PCR에 사용되었다. - 강아지의 머리에 70 % 에탄올을 뿌리고 즉시 가위를 사용하여 빠르게 참수하십시오.
- 두개골을 노출시키기 위해 작은 각도의 가위로 피부를 자릅니다. 구멍 매그넘 에서 궤도쪽으로 절단하여 두개골을 엽니 다. 다음으로 수직 정중선 절단을하십시오. 두개골에서 뇌를 제거하고 인산염 완충 식염수 (PBS)가 들어있는 페트리 접시에 넣으십시오.
알림: 형질 전환 새끼와 비 형질 전환 강아지 사이의 교차 오염을 방지하기 위해 강아지 사이의 도구를 청소하십시오. 뇌의 나머지 부분에서 피질을 분리하는 것은 실체 현미경으로 수행해야합니다. - 집게의 끝을 사용하여 두 반구 사이의 연결을 찢습니다. 그런 다음 반구를 중앙에서 옆으로 부드럽게 밀어 구부러진 집게로 반구를 분리합니다.
- 수막을 직선 및 곡선 집게로 조심스럽게 찢어 제거하십시오.
- 구부러진 집게로 꼬집어 해마를 제거하십시오. 해마를 폐기하거나 다른 세포 배양 준비에 사용하십시오.
알림: 멸균 상태를 보장하기 위해 층류 후드 아래에서 추가 단계를 수행해야 합니다.
- 1차 신생아 세포 배양을 위해 1-3일령의 신생아 새끼를 사용하십시오33.
- 조직 균질화 및 해리
- 하나의 피질을 3mL의 차가운 PBS로 채워진 15mL 튜브로 옮깁니다. 1mL 팁으로 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 현탁액이 균질해질 때까지 10-15회 스트로크를 완료합니다.
알림: 이 과정에서 기포가 발생하지 않도록 매우 주의하십시오. - 500 ×g에서 5 분 동안 원 심 분리합니다. 상청액을 제거하고 1mL 팁으로 위아래로 피펫팅하여 3mL의 차가운 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 원심분리 단계를 반복합니다.
알림: 이 시점에서 사용된 모든 용액은 37°C로 예열해야 합니다. - 상청액을 버리고 10% 소 태아 혈청(FBS)과 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신)가 보충된 완전한 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) 2mL에 펠릿을 재현탁합니다. 균질액을 2mL 튜브로 옮깁니다.
- 균질 액을 21G 및 23G 바늘 (각각 3 회)에 통과시켜 단일 세포의 현탁액을 만듭니다.
알림: 이 과정에서 기포가 발생하지 않도록 매우 주의하십시오.
- 하나의 피질을 3mL의 차가운 PBS로 채워진 15mL 튜브로 옮깁니다. 1mL 팁으로 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 현탁액이 균질해질 때까지 10-15회 스트로크를 완료합니다.
- 하나의 피질에서 준비된 세포 현탁액을 60mL의 완전한 DMEM이 들어있는 직경 3mm의 페트리 접시 또는 T25 플라스크 (부착 세포의 성장을 위해 폴리펩티드 코팅으로 전처리 된 표면)에 붓습니다. 현탁액이 균일하게 분포되도록 페트리 접시를 가볍게 흔든다.
- 37°C에서 5%CO2/95% 공기의 가습된 분위기에서 배양기에서 세포를 성장시킨다.
- 분리 후 48시간 후에 배지를 교체하고 3일마다 배지를 교체하십시오.
- 성상 세포 성장을 촉진하려면 세포가 70 % -80 % 컨플루언시에 도달하면 예열 된 PBS로 씻어 느슨하게 부착 된 신경교 세포와 배지에서 FBS의 흔적을 제거합니다.
- 예열 된 트립신 용액 1mL (0.25 % 트립신, PBS에서 0.02 % EDTA, 멸균 여과)를 추가하여 성상 세포의 밑에있는 층을 트립신 화합니다.
- 접시를 37 ° C의 인큐베이터에 2-5 분 동안 놓습니다.
- 현미경으로 세포를 확인하십시오. 분리되기 시작하면 4mL의 완전한 DMEM을 추가합니다.
- 세포 현탁액을 수집하여 15mL 튜브로 옮깁니다. 500 ×g에서 5 분 동안 원 심 분리합니다.
- 상청액을 버리고 펠릿을 완전한 배지 1mL에 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오.
- 세포를 5mL의 새로운 완전한 DMEM에서 104 cells/cm2 의 밀도로 재플레이트합니다.
- 3 일마다 매체를 교체하십시오. 다른 신경교 세포 유형의 존재를 최소화하려면 성상 세포가 50 % 합류에 도달 한 후 각 배지를 교체하기 전에 완전한 DMEM으로 세포를 세척하십시오.
- 1mL 피펫으로 상청액 배지를 흡인하고 세포 층에 여러 번 부드럽게 분배합니다. 이 세척 단계에서 세포층의 전체 표면이 덮여 있는지 확인하십시오.
- 세포가 80 % 합류 (보통 14 일 후)에 도달하면 1.6 단계에서 설명한대로 트립신 화 및 성상 세포 수집을 반복합니다.
- 폴리 -L- 라이신 (50 μg / mL)으로 코팅 된 7mm 원형 유리 커버 슬립에 성상 세포 5 × 103 을 시드합니다. 48 시간 후에 실험에 사용하십시오.
- 미세아교세포를 촉진시키기 위해, 단계 1.7 후에, 신경교세포가 합류층(34)에 도달하도록 한다. 소교 세포가 성상 세포 층 위에 나타날 때 (10-15 일 후, 더 작고 타원형의 몸체와 더 짧은 과정으로 인식됨) 궤도 셰이커에서 페트리 접시를 220rpm에서 2 시간 동안 흔 듭니다.
- 소교세포 분산 및 파종
- 1mL 피펫 팁으로 상층액을 흡인하여 분리되고 느슨하게 부착된 세포를 가볍게 씻고 세포층에 여러 번 부드럽게 분주합니다. 이 세척 단계에서 세포층의 전체 표면을 덮고 분리된 세포로 배지를 수집하여 15mL 튜브로 옮깁니다.
- 500 ×g에서 5 분 동안 원 심 분리합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 1mL의 배지에 재현탁합니다.
- 세포 현탁액을 21 G 바늘에 통과시켜 단일 세포 현탁액을 수득한다.
참고: 대부분의 발표된 방법은 트립신 또는 파파인을 사용하여 조직을 해리합니다. 그러나 21G 바늘은 세포의 과소화를 방지하여 더 부드러운 해리를 허용하는 장점이 있습니다. - 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. poly-L-라이신(50μg/mL)으로 코팅된 7mm 원형 유리 커버슬립에 5 × 103 개의 소교세포를 시드합니다. 48 시간 후에 실험에 사용하십시오.
참고: 희소돌기아교세포 전구체 세포와 성상세포가 실험자의 경험에 따라 여전히 다양한 수로 존재할 수 있기 때문에 흔들어서 순수한 미세아교세포 배양을 얻는 것은 어렵습니다. 신경교 배양물에서 상이한 세포 집단의 존재를 추정하기 위해 사용된 면역세포화학 프로토콜은 다른 곳에서 기술되었다35.
2. 면역세포화학
- 커버슬립에 도말된 셀을 PBS로 2 x 1분 동안 헹굽니다.
- 실온(RT)에서 20분 동안 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정합니다.
- PBS에서 3 x 5 분 동안 세척하십시오.
- RT에서 10 분 동안 10 % 정상 당나귀 혈청 (NDS) / 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) / 0.1 % Triton X-100을 함유 한 차단 용액에서 45 분 동안 배양하십시오.
- 10mm 직경의 커버슬립당 50μL의 블로킹 용액을 추가합니다.
- 1차 항체를 1% NDS/1% BSA/0.1% TritonX-100으로 다음 희석하여 준비합니다: 마우스 항-GFAP 1:300, 염소 항-Iba1 1:500. 세포를 1차 항체와 함께 +4°C에서 밤새 배양합니다.
- PBS로 3 x 10분 동안 헹굽니다.
- 형광단과 접합된 2차 항체와 함께 인큐베이션한다: 당나귀 항-마우스 (여기 488 nm[1:200)) 또는 당나귀 항-염소 (647 nm[1:200)에서 여기). 어둠 속에서 RT에서 2 시간 동안 세포를 배양하십시오.
- PBS에서 7 x 5 분 동안 세척하십시오.
- 세포를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 1:4,000)과 함께 RT에서 10분 동안 배양합니다.
- PBS에서 5 x 5 분 동안 세척하십시오.
- 장착 솔루션을 사용하여 현미경 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다. 커버 슬립 당 한 방울을 사용하십시오.
참고: 항체 희석액은 생산자에 따라 다를 수 있습니다. 사용자는 실험을 위한 최적의 희석액을 결정해야 합니다.
3. 타임랩스 비디오 이미징
알림: 형광 염료가 포함 된 용액은 직사광선으로부터 보호해야합니다. 이미징 실험을 시작하기 전에 관류를 켤 때 유리 커버 슬립이 움직이지 않는지 확인하십시오.
- 용액 및 세포의 준비
- 이미징을 위한 세포외 용액(ECS)을 준비합니다: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal2, 2 mMMgCl2, 10 mM D-글루코스, 및 10 mM 헤페스. pH를 7.4로 조정하십시오. 삼투압이 280-300 mOsm / kg인지 확인하고 Ca없이 ECS를 준비하십시오 2+ : 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D- 포도당, 10 mM hepes 및 0.1 mM EGTA.
- 시험 용액을 준비하십시오 : ECS에 용해 된 100 μM ATP, Ca가없는 ECS에서 1 μM Thg 2+, ECS8에서 0.1 mg / mL ALS IgG.
- 커버슬립 하나를 ECS가 있는 접시에 옮겨 전체 DMEM을 씻어냅니다. 1 mM Fluo-4 AM 원액을 ECS로 희석하여 최종 농도인 5 μM Fluo-4AM이 되도록 염료 로딩 용액을 제조한다.
- 어두운 곳에서 RT에서 30분 동안 염료 로딩 용액에 셀이 있는 커버슬립을 놓습니다. ECS에서 세포를 20 분 동안 씻으십시오.
- 세포가 적절하게 로딩되지 않은 경우(즉, 기본 형광 수준이 노출 시간이 400ms 이상인 카메라 다이내믹 레인지의 5%<너무 낮은 경우) 로딩 시간을 37°C에서 최대 45분에서 1시간으로 늘립니다. 또는 ECS에서 희석하기 전에 DMSO에서 동일한 부피의 20%(w/v) 세제(플루로닉)와 Fluo-4 AM 스톡 용액을 혼합하여 최종 플루로닉 농도를 ~0.02%로 만듭니다.
참고: 본 연구의 실험예는 앞서 기술한바와 같이 ALS 환자의 혈청으로부터 분리된 인간 IgG 4,5,11로 수행하였다. 각 실험은 단일 환자의 IgG 샘플로 수행되었습니다.
- 비디오 이미징
참고: 이 프로토콜에서 비디오 이미징 시스템은 크세논 쇼트 아크 램프, 폴리크로메이터 시스템 및 물, 글리세린 및 오일 이멀젼 대물렌즈가 장착된 도립 에피형광 현미경과 결합되었습니다. 타임랩스 이미징은 디지털 카메라 시스템을 사용하여 수행되었습니다.- 시스템이 작동 온도에 도달할 수 있도록 실험 15분 전에 이미징 설정의 구성 요소를 켭니다.
- 커버슬립을 1mL의 작업 용액(ECS 또는 Ca2+가 없는 ECS)과 함께 기록실에 놓습니다.
- 올바른 이미징 프로토콜을 선택하려면 이미징 소프트웨어를 열고 수집 패널에서 여기 파장이 480nm, 다이크로익 미러가 505nm, 방출 파장이 535nm인 Fluo4-AM의 필터 쌍을 선택합니다.
- 실험 전반에 걸쳐 일관된 수의 세포를 갖도록 주의하면서 시야를 선택합니다. 신호가 포화되지 않도록 노출 시간과 감지기 게인을 적절하게 조정하십시오. 획득을 위한 의사 색상 모드를 선택합니다. 자세한 지침은 제조업체에서 제공한 설명서를 참조하십시오.
- 샘플링 속도를 1Hz(초당 1프레임)로 조정합니다.
- 기준선 결정을 위해 3-5분 동안 기저 수준의 형광을 획득함으로써 이미징을 시작한다(F0). 작업 솔루션의 일정한 흐름을 보장하십시오.
- 작업 용액의 흐름을 중지하고 원하는 시간 동안 테스트 용액으로 전환하십시오 (그림 2 및 그림 3의 예에서 시간 막대 참조). 각 시험 용액 사이에서 3-5 분 동안 작업 용액의 일정한 흐름으로 세포를 씻으십시오.
- 용액 상단에서 일정한 흡입을 배열하여 기록 챔버의 용액 부피를 ~1mL로 유지합니다( 그림 2E 참조).
참고: 이미징된 세포에 직접 처리를 적용하기 위해 유리 피펫(내경 0.8mm)으로 만든 맞춤형 전달 시스템을 핀치 밸브 및 전자 밸브 컨트롤러가 포함된 용액 교환 시스템과 결합된 45° 각도로 ~350μm 떨어진 ~1mm 떨어진 곳에 배치했습니다( 그림 2E 참조).
4. 데이터 분석
- 개별 셀에 해당하는 관심 영역(ROI)을 정의합니다.
- 신호 강도가 가장 높은 프레임을 선택하고(즉, ATP 적용에서) 응용 프로그램 다각형 도구를 사용하여 하나의 셀을 둘러쌉니다. 획득한 필드의 모든 셀에 대해 반복합니다. 서클 도구를 사용하여 백그라운드에서 5개의 ROI를 선택합니다.
- 단일 셀의 평균 신호 강도와 각 시간 프레임의 배경을 측정하려면 모든 ROI를 선택하고 ImageJ의 ROI Manager에서 다중 측정 명령을 사용하거나 상용 소프트웨어에서 동등한 명령을 사용합니다(재료 표 참조).
- ROI의 평균 신호 강도 값을 스프레드시트로 내보냅니다.
- 5개의 배경 ROI를 평균하고 동시에 획득한 프레임의 평균 ROI 강도에서 각 프레임의 평균 배경을 뺍니다.
- 획득된 데이터를 기준선 신호로 정규화하려면 방정식 (1)을 사용하십시오.
ΔF / F 0 = (F- F 0) / F0 (1)
여기서, F는 배경 감산 후의 각 시간 프레임의 신호 강도이고,F0 는 기준선 Fluo-4 형광이다.
참고: 이 연구에서는 맞춤형 코드가 사용되었습니다. - 칼슘 활성을 분석하려면 칼슘 피크의 진폭 (ΔF / F 0), 칼슘 과도 (ΔF / F 0 × s)의 통합 변화 (시간 적분, 반응 기록 아래 표면), 자극 시작에서 최대 칼슘 과도 (s)까지의 피크 경과 시간, 자극 시작에서 ΔF / F 0 값까지 경과 된 상승 시간 최대 진폭 (S)의 50 % -80 %, 절반 최대 진폭 (S)에서 과도 현상의 절반 너비 전체 너비, 반복적 인 경우 응답 주파수 (Hz)에 도달합니다.
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Representative Results
배양에서 다양한 신경교 세포 유형의 특성 분석
실험을 위해 성상 세포를 생산하는 데 보통 15-21 일이 걸리는 반면, 소교 세포는 자라는 데 10-15 일이 걸립니다. 배양물의 세포 순도를 평가하기 위해 면역염색을 수행하였다. 도 1 은 각각의 배양물에서 성상세포 마커 GFAP 및 미세아교세포 마커 Iba1의 이중 표지의 발현을 나타낸 것이다.
칼슘 영상은 건강한 성상 세포와 병든 성상 세포의 세포 생리학의 차이를 드러내는 것으로 알려져 있습니다. 이전에 야생형 성상 세포에서 ALS IgG가 세포 내 및 세포 외 풀을 세포질8로 동원하여 세포 Ca에 영향을 미친다는 것을 입증했습니다 2+. 다음 프로토콜은 hSOD1G93A의 칼슘 과도 상태와 환자의 ALS IgG 샘플에 급성으로 노출 된 비 형질 전환 배양 성상 세포 사이에 차이가 있는지 여부를 결정했습니다. Fluo4-AM이 로딩된 성상세포를 3분 동안 ECS로 관류시켜 안정한 기준선을 얻었다. 다음에, 100 μg/mL ALS IgG를 5분 동안 수조에 도포하였다. 성상 세포를 ECS로 세척 한 다음, 각 기록의 끝에 100 μM ATP를 적용하여 각 세포의 건강을 테스트하고 표준 자극에 대한 칼슘 반응을 관찰했습니다.
그림 2A, B의 대표적인 흔적은 hSOD1G93A 성상 세포가 비 형질 전환 성상 세포보다 일시적인 칼슘의 더 큰 진폭, 더 큰 전체 통합 변화 및 더 짧은 피크 시간으로 ALS IgG에 반응한다는 것을 보여줍니다. 그러나 여기서는 Fluo4-AM과 같은 단일 파장 Ca2+-프로브를 사용할 때 정량적 데이터를 해석할 때 주의해야 합니다(토론 섹션 참조). 또한, ALS IgG에 대한 반응의 형태는 ATP에 대한 반응과 구별 가능하다 (ATP에 대한 반응으로 의사 컬러 이미지에서 트레이스 및 세포 동시성에서 더 큰 진폭을 갖는 더 빠른 과도 현상에 주목하라, 그림 2A, B).
hSOD1G93A와 비 형질 전환 성상 세포 사이의 ALS IgG 및 ATP에 대한 칼슘 반응의 차이의 기원을 추가로 연구하기 위해 1 μM Thg를 사용하여 칼슘 이미징 중에 내부Ca 2+ 저장소를 조작하는 약리학 적 접근법을 사용했습니다. Thg는 소포체Ca2+ ATPase (SERCA)의 비 선택적 억제제이며, 세포 내Ca2+ 저장소를 거의 즉시 고갈시키고, 이는 수 분 동안 지속되는 칼슘 일시적 반응에 반영된다. 관찰된 현상에서 외부 Ca2+의 효과를 배제하기 위해,Ca2+를 박탈한 ECS를 실험 중에 사용하였다. 3분 동안 형광의 기저 수준을 기록한 후, 1 μM Thg를 2분 동안 중탕에 도포하였다. Thg-유도된 칼슘 고갈 후, 성상교세포를Ca2+를 함유하는 ECS로 관류시켜 저장소의 리필을 유도하고 모니터링하였다. 설명된 실험의 대표적인 흔적은 그림 2C, D에 나와 있습니다. 예상대로, hSOD1G93A 성상 세포는 저장 고갈에 의해 밝혀진 바와 같이 저장소에서 더 높은 수준의Ca 2+를 가졌으며,이 이온의 과부하를 나타냅니다. 유사한 메카니즘이 SOD1G93A 형질전환 마우스36으로부터의 배양된 성상세포에서 입증되었다.
배양에서 소교세포의 칼슘 이미징
Fluo-4 AM으로 표지된 미세아교세포의 타임랩스 영상화는 성상세포에 대해 기재된 것과 동일한 방식으로 수행하였다(도 3B). 미세아교세포를 2mMCa2+로 ECS와 3분 동안 관류시켜 안정한 기준선을 얻은 다음, 5분 동안 100μg/mL ALS IgG의 목욕 적용, ECS로 세척 및 100μM ATP로 자극하였다. 흥미롭게도, 성상 세포는 ALS IgG에 쉽게 반응하지만, 대다수의 소교 세포는 ALS IgG에 반응하지 않았다 (칼슘 과도 반응과 반응하는 단 하나의 소교 세포에 의해 예시 된 바와 같이; 도 3A의 예에서 적색 흔적). 그러나 그들은 항상 ATP에 반응하고 성상 세포와 유사한 방식으로 반응했습니다 (그림 3A). 또한 세포 추적 2 (도 3A)에서 자발적인Ca2+ 일시적 현상의 경우가 유도 된 반응으로 오인되어서는 안된다.
그림 1: 1차 배양의 성상세포와 미세아교세포. Iba1(녹색)로 염색된 배양물에서 GFAP(빨간색) 및 미세아교세포(오른쪽)를 사용하여 표지된 배양물에서 성상교세포(왼쪽)의 대표적인 공초점 이미지. 이중 표지(GFAP/Iba1)를 사용하여 배양 순도를 표시하였다. DAPI는 핵 (파란색)을 표지하는 데 사용되었습니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어 : GFAP = 신경교 섬유 산성 단백질; LBA1 = 이온화 칼슘-결합 어댑터 분자 1; DAPI = 4',6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 성상세포 병태생리학 연구에서 칼슘 영상 적용의 예. (A) hSOD1G93A 성상 세포를 5 분 동안 이미징하여 기준선 형광 ( '기준선')을 수집 한 다음 ALS IgG (0.1 mg / mL)를 5 분 동안 급성 적용 ( 'ALS IgG에 대한 반응') 및 100 μM ATP ( 'ATP에 대한 반응'). 상단 패널에는 의사 컬러 이미지가 표시됩니다 (형광 강도는 색상으로 구분되어 있으며, 여기서 검은 색은 매우 낮은 강도에 해당하고 흰색은 가장 높은 강도로 픽셀을 표시합니다. 색-강도 관계는 실험의 각 세그먼트에서 개별 세포의 형광 강도에 해당하는 B의 상단 패널 오른쪽에있는 색상 막대로 표시됩니다 ( '기준선', 'ALS IgG에 대한 반응' 및 'ATP에 대한 반응'). 회색 점선은 대표적인 칼슘 추적(주황색)에 대한 특정 시점의 의사 색상 이미지를 가리킵니다. 칼슘 흔적의 중간에있는 회색 상자는 ALS IgG의 5 분 적용을 표시합니다. 칼슘 흔적 아래의 검은 색 막대는 ATP의 적용을 표시합니다. (B) 비 형질 전환 성상 세포 (파란색 추적)를 제외하고 (A)와 동일합니다. (C) 칼슘이 없는 ECS에서 1μg/mL 타프시가르긴(미량 아래의 검은색 막대)으로 도전한 hSOD1G93A 성상세포에서 대표적인 칼슘 미량(주황색)을 이어서 2mM Ca2+('2mMCa2+', 미량 아래의 검은색 막대). (D) 비 형질 전환 성상 세포를 제외하고는 (C)에서와 동일합니다 (흔적은 파란색입니다). 진폭 스케일 = 100% ΔF/F0. 시간 척도 = 200초 스케일 바 = 50 μm. (E) 용액 교환의 맞춤형 모드와 생화학 작용제 적용을 위한 피펫 배치를 묘사하는 실험 설정의 계획. 약어 : ALS = 근 위축성 측삭 경화증; IgG = 면역 글로불린 G; Thg = 타프시가르진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 배양된 미세아교세포의 칼슘 이미징의 예. (A) 왼쪽: 배양된 미세아교세포의 명시야 이미지. 순수한 소교세포 배양을 얻는 것이 어렵기 때문에 성상교세포도 여기에 존재합니다(더 큰 편평한 다각형 세포, 화살촉으로 표시된 예 참조). ramified (작은 체세포, 두드러진 과정)와 아메보이드 미세 아교 세포 (각각 녹색 및 노란색 상자로 표시됨)가 모두 배양 물에 존재합니다. 가운데: 왼쪽에서 확대된 노란색 및 청록색 상자. 빨간색, 파란색 및 보라색 선은 시간 경과에 따른 평균 형광 강도가 추출되는 ROI를 표시합니다. 오른쪽: 중간 패널에 있는 세 개의 세포의 칼슘 흔적. 추적의 색상은 중간 패널의 ROI 색상과 일치합니다. 200초 동안 기준선 칼슘 형광('기준선 형광')을 이미징한 후, 세포를 5분 동안 ALS IgG(0.1mg/mL)의 급성 적용('ALS IgG에 대한 반응'), 이어서 100μM ATP('ATP에 대한 반응')에 노출시켰습니다. 칼슘 흔적의 중간에있는 회색 상자는 ALS IgG의 5 분 적용을 표시합니다. 칼슘 흔적 아래의 검은 색 막대는 ATP의 적용을 표시합니다. 소수의 세포를 나타내는 세포 1 (빨간색 흔적)만이 ALS IgG에 반응하는 반면 모든 세포는 ATP에 반응했습니다. (B) 의사 컬러 이미지는 기록의 각 세그먼트 ( '기준선', 'ALS IgG에 대한 반응'및 'ATP에 대한 반응')의 형광 강도를 나타내며, 여기서 주황색 점선은 대표적인 칼슘 트레이스 (A, 오른쪽 패널)의 특정 시점을 가리 킵니다. 녹색 및 주황색 상자는 아메보이드 미세아교세포를 표시합니다(A와 동일). 색상 강도 관계는 오른쪽의 색상 막대로 표시됩니다. 진폭 스케일 = 100% ΔF/F0. 시간 척도 = 100초 스케일 바 = 50 μm. 약어 : ALS = 근 위축성 측삭 경화증; IgG = 면역 글로불린 G; ROI = 관심 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 논문은 쥐 hSOD1G93A 모델에서 ALS와 같은 세포(patho)생리학의 다양한 측면을 연구하기 위한 빠르고 "예산에 맞는" 도구로서 일차 세포 배양 방법을 제시합니다. 따라서이 기술은 더 높은 수준의 조직 (즉, 조직 조각 또는 살아있는 동물)에서 외삽되고 추가로 조사 될 수있는 단일 세포 수준의 연구에 적합합니다. 그러나 기술로서의 세포 배양에는 몇 가지 주의 사항이 있습니다. 얼음 위에서 뇌 조직 분리 및 세포 해리를 수행하고 가능한 한 최단 시간에 이러한 단계와 후속 분리 및 준비 단계를 수행하는 것이 가장 중요합니다. 오염은 잘 멸균된 장비를 사용하고 층류 후드(37)에서 조직 해리를 수행하는데 특히 주의를 기울임으로써 극복될 수 있는 항상 존재하는 장애물이다. 세포의 정확한 밀도를 심는 것도 중요합니다. 파종된 세포의 수가 원하는 수보다 적으면 접시에서 세포 성장 및 번식을 지원하지 않습니다. 그러나 세포가 너무 조밀하면 성장 배지의 영양소에 대한 경쟁이 발생하여 더 많은 세포 사멸이 발생합니다. 이것이 적어도 시작 조직과 해리 부피의 올바른 관계에 관한 경험을 얻기 전에 파종하기 전에 해리 된 세포를 세는 것이 권장되는 이유입니다.
GFAP는 널리 사용되는 성상 세포 마커이며 종종 세포 배양 순도38,39를 평가하는 데 사용됩니다. 그러나 성상 세포 반응성을 연구 할 때 GFAP만으로는 충분하지 않습니다. Ki67 또는 기타 성상 세포 마커 (글루타민 합성 효소, 알 돌라 제 -C 또는 알데히드 탈수소 효소 -1)와 같은 증식 마커와 결합하는 것이 좋습니다 18,38. 이러한 기술은 순수한 신경교 세포 유형 배양을 생성하는 경향이 있지만 배양 세포 순도를 평가할 때는 주의를 기울여야 합니다. 이는 일반적으로 일부 희소돌기아교세포 전구체 또는 성상교세포(34)를 함유하는 소교세포 배양에 특히 중요하다. 소교 세포에 대한 특정 마커는 많은 관심을 끌고 있습니다. 가장 많이 사용되는 마커는 Iba1이지만 분화 수용체 (CD68, CD45) 및 프랙 토킨 수용체 (CX3CR1)와 같이 자주 사용되는 다른 마커도 다른 세포에서도 검출 될 수 있습니다 (자세한 내용은40 참조). 현재 미세아교세포에 대한 가장 특이적인 마커는 TMEM119와 퓨린성 수용체 P2Y1241이지만 최근 논문에서는 TMEM119 특이성42에 대한 우려가 제기되었습니다.
타임랩스 라이브 셀 이미징을 도입하면 Ca2+ 신호와 같은 세포 프로세스를 실시간으로 모니터링할 수 있는 이점이 있습니다. 또한, 상이한 화학적 작용제 (예를 들어, 여기에서 Thg)를 적용함으로써 세포 행동의 조절은 건강한 세포 또는 세포 질환 모델에서 활성화된 경로 및 신호 메신저의 설명을 위한 추가 정보를 제공한다 (여기에서 hSOD1G93A ALS 래트로부터 단리 및 배양됨). Fluo-4 AM과 같은 세포막 투과성 형광 염료로 작업할 때는 염료가 세포 내부를 채울 수 있는 정확한 농도와 배양 시간을 찾는 것이 중요합니다. 너무 오래 걸리면 세포를 37 ° C의 인큐베이터에 보관하여 염료 흡수를 늘릴 수 있습니다. 더 심한 경우에는 중성 세제(예: Pluronic F-127)를 로딩 용액에 사용할 수 있습니다. 또한 염료의 농도를 10 μM 이상으로 높여 위의 결과를 달성하는 것은 권장되지 않습니다. 실제로, 더 높은 농도에서, 염료는 Ca2+ 완충제로서 작용하여Ca2+ 신호 진폭을 감쇠시킬 수 있다.
또한 Fluo-4 및 유사한 단일 파장 염료 외에도 하나의 측정 및 하나의Ca2+ 둔감 기준 파장에서 방출되는Ca 2+ 감응 비율 측정 염료 (예 : Fura-2)가 존재한다는 점도 언급 할 가치가 있습니다. 따라서 이러한 측정은 셀의 고르지 않은 염료 분포로 인한 편향과 광학 경로의 변화에 민감하지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 단일 파장 염료를 사용하는 경우, 특히 Fluo-4와 같은 고 친화도 지표와 함께, 상대적 측정이 동일한 샘플 내에서 이루어지는 경우, 또는 실제Ca 2+ 농도 변화가 아닌 공정의 역학을 주로 따르는 경우에 바람직하다43. 그럼에도 불구하고 이러한 측정은Ca 2+ 농도 측면에서 정량적 데이터에 사용할 수 없으며 그림 2에 제시된 데이터의 진폭을 해석 할 때는주의가 필요합니다.
우리는 여기에서 살아있는 세포(배양에서 성상세포)에 대한 이 이미징 시설을 사용하는 것이 쥐 세포36에 대한 이전 결과에 따라 ALS 모델에서 방해받는 Ca 2+ 저장소의 보충 및 저장소에서 운영되는Ca 2+ 항목의 보충과 같은 병태생리학의 미묘한 세포 내 메커니즘을 나타낼 수 있는 방법을 입증했습니다. 이것은 여기에 제안 된 바와 같이 ALS IgG에 대한 hSOD1G93A 성상 세포의 더 높은 민감도를 설명 할 수 있으며, 이는 병리학의 진행을 강화시킬 수 있습니다. 이러한 실험에서 측정값을 비교하려면 시야에서 유사한 세포 밀도를 갖고 ROI(예: soma 대 프로세스)에 대해 동일한 셀 구획을 취하는 것이 좋습니다.
여기에 소교 세포가 성상 세포와 동일한 활력으로 ALS IgG에 반응하지 않는 예가 여기에 나타났습니다. 이것은 ALS IgG 처리15시 소교 세포주에서 과산화물의 희소 한 생성의 발견과 일치한다. 전체적으로,이 접근법은 ALS와 관련된 IgG에 대한 세포 특이 적 반응을 가리키며, 또한 미세 아교 세포 대 성상 아교 세포의 순수 세포 배양을 통해 실현 된 중요한 사실입니다. 신경병태생리학 모델로부터 유래된 신경교세포를 사용하거나 환자의 유도성 만능줄기세포로부터 유래된 신경교세포를 이용하여 ALS와 같은 중증 신경질환에서 생리학적 바이오마킹의 미래를 갖는다. 따라서 질병의 특정 상태의 지문으로서 미세Ca 2+ 신호 전달을 이해하거나 다른 흥분 독성 질환을 구별하는 것이 필수적입니다. 이러한 목적을 위해 기계 학습 절차를 개발하고 데이터 기록을 분류해야 합니다. 또한, 이들 세포는 배양물에서 성장하고, 신경염증의 다양한 체액성 인자(예를 들어, 혈청, IgG, CSF)에 대한 반응을 유발함으로써 신경퇴행성 질환의 진단 또는 환자 계층화에 사용되는 마이크로유체 장치에 시딩될 수 있다.
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Disclosures
저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 세르비아 공화국 교육 과학 기술 개발부 계약 번호 451-03-9/2021-14/ 200178, FENS - NENS 교육 및 훈련 클러스터 프로젝트 "신경염증의 신경교세포에 대한 삼자 과정" 및 EC H2020 MSCA RISE 보조금 #778405의 지원을 받았습니다. 면역조직화학 이미지를 제공해 주신 Marija Adžić와 Mina Perić, 논문 작성에 도움을 주신 Danijela Bataveljić에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | Sarstedt, Germany | 62 554 502 | |
| 2 mL tube | Sarstedt, Germany | 72.691 | |
| 21 G needle | Nipro, Japan | HN-2138-ET | |
| 23 G needle | Nipro, Japan | HN-2338-ET | |
| 5 mL syringe | Nipro, Japan | SY3-5SC-EC | |
| 6 mm circular glass coverslip | Menzel Glasser, Germany | 630-2113 | |
| 60 mm Petri dish | ThermoFisher Sientific, USA | 130181 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, Germany | A9062 | |
| AxioObserver A1 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Bovine serum albumine | Sigma-Aldrich, Germany | B6917 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 2110 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, Germany | 10236276001 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 158968 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich, Germany | D5648 | |
| Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21447 | |
| Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21202 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich, Germany | EDS-100G | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Germany | E4378 | |
| ”evolve”-EM 512 Digital Camera System | Photometrics, USA | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10500064 | |
| Fiji ImageJ Software | Open source under the GNU General Public Licence | ||
| FITC filter set | Chroma Technology Inc., USA | ||
| Fluo-4 AM | Molecular Probes, USA | F14201 | |
| Goat anti-Iba1 | Fujifilm Wako Chemicals, USA | 011-27991 | |
| HEPES | Biowest, France | P5455 | |
| HighSpeed Solution Exchange System | ALA Scientific Instruments, USA | ||
| Incubator | Memmert GmbH + Co. KG, Germany | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | M2393 | |
| Matlab software | Math Works, USA | ||
| Mouse anti-GFAP | Merck Millipore, USA | MAB360 | |
| Mowiol 40-88 | Sigma-Aldrich, Germany | 324590 | |
| Normal donkey serum | Sigma-Aldrich, Germany | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, Germany | 158127 | |
| Penicilin and Streptomycin | ThermoFisher Sientific, USA | 15140122 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich, Germany | P5899 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | P5405 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Carlo Erba Reagents, Spain | 471686 | |
| Shaker DELFIA PlateShake | PerkinElmer Life Sciencies, USA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Germany | S3817 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S5886 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Carl ROTH GmbH | X987.2 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich, Germany | P5280 | |
| Thapsigargine | Tocris Bioscience, UK | 1138 | |
| Triton X - 100 | Sigma-Aldrich, Germany | T8787 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich, Germany | T4799 | |
| Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520 | Wescor, ELITechGroup Inc., USA | ||
| ViiFluor Imaging System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiChrome Polychromator System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiView high performance setup | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| Xenon Short Arc lamp | Ushio, Japan |
References
- Kiernan, M. C., et al.
- Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Gleichman, A. J., Carmichael, S. T. Glia in neurodegeneration: Drivers of disease or along for the ride. Neurobiology of Disease. 142, 104957 (2022).
- Zhang, R., et al. Evidence for systemic immune system alterations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS). Journal of Neuroimmunology. 159 (1-2), 215-224 (2005).
- Saleh, I. A., et al. Evaluation of humoral immune response in adaptive immunity in ALS patients during disease progression. Journal of Neuroimmunology. 215 (1-2), 6 (2009).
- Wang, M., et al. Evaluation of Peripheral Immune Activation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Frontiers in Neurology. 12, 628710 (2021).
- Li, J. -Y., et al. Blood-brain barrier dysfunction and myelin basic protein in survival of amyotrophic lateral sclerosis with or without frontotemporal dementia. Neurological Sciences. 43 (5), 3201-3210 (2022).
- Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis affects cytosolic Ca2+ homeostasis in cultured rat astrocytes. Cell Calcium. 54 (1), 17-25 (2013).
- Andjus, P. R., Stevic-Marinkovic, Z., Cherubini, E. Immunoglobulins from motoneurone disease patients enhance glutamate release from rat hippocampal neurones in culture. Journal of Physiology. 504, 103-112 (1997).
- Howland, D. S., et al. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (3), 1604-1609 (2002).
- Dučić, T., Stamenković, S., Lai, B., Andjus, P., Lučić, V. Multimodal synchrotron radiation microscopy of intact astrocytes from the hSOD1 G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Analytical Chemistry. 91 (2), 1460-1471 (2019).
- Popović-Bijelić, A., et al. Iron-sulfur cluster damage by the superoxide radical in neural tissues of the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 96, 313-322 (2016).
- Stamenković, S., et al. In vivo EPR pharmacokinetic evaluation of the redox status and the blood brain barrier permeability in the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 108, 258-269 (2017).
- Stamenković, S., Dučić, T., Stamenković, V., Kranz, A., Andjus, P. R. Imaging of glial cell morphology, SOD1 distribution and elemental composition in the brainstem and hippocampus of the ALS hSOD1(G93A) rat. Neuroscience. 357, 37-55 (2017).
- Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from sera of amyotrophic lateral sclerosis patients induce oxidative stress and upregulation of antioxidative system in BV-2 microglial cell line. Frontiers in Immunology. 8, 1619 (2017).
- Boillée, S., Cleveland, D. W. Revisiting oxidative damage in ALS: microglia, Nox, and mutant SOD1. Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 474-478 (2008).
- Boillée, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Martínez-Palma, L., et al. Mitochondrial modulation by dichloroacetate reduces toxicity of aberrant glial cells and gliosis in the SOD1G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of American Society for Experimental Neurotherapeutics. 16 (1), 203-215 (2019).
- Díaz-Amarilla, P., et al. Phenotypically aberrant astrocytes that promote motoneuron damage in a model of inherited amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), 18126-18131 (2011).
- Barbosa, M., et al. Recovery of depleted miR-146a in ALS cortical astrocytes reverts cell aberrancies and prevents paracrine pathogenicity on microglia and motor neurons. Frontiers in Cell Developmental Biology. 9, 634355 (2021).
- Gomes, C., et al. Astrocyte regional diversity in ALS includes distinct aberrant phenotypes with common and causal pathological processes. Experimental Cell Research. 395 (2), 112209 (2020).
- Kovacs, M., et al. CD34 identifies a subset of proliferating microglial cells associated with degenerating motor neurons in ALS. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3880 (2019).
- Komiya, H., et al. Ablation of interleukin-19 improves motor function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Molecular Brain. 14 (1), 1-13 (2021).
- Trias, E., et al. Emergence of microglia bearing senescence markers during paralysis progression in a rat model of inherited ALS. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 1-14 (2019).
- Pullen, A. H., Demestre, M., Howard, R. S., Orrell, R. W. Passive transfer of purified IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis to mice results in degeneration of motor neurons accompanied by Ca2+ enhancement. Acta Neuropatholgica. 107 (1), 35-46 (2004).
- Obál, I., et al. Intraperitoneally administered IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis or from an immune-mediated goat model increase the levels of TNF-α, IL-10 in the spinal cord and serum of mice. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 121 (2016).
- Obál, I., et al. Experimental motor neuron disease induced in mice with long-term repeated intraperitoneal injections of serum from ALS patients. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2573 (2019).
- Mohamed, H. A., et al. Immunoglobulin Fc gamma receptor promotes immunoglobulin uptake, immunoglobulin-mediated calcium increase, and neurotransmitter release in motor neurons. Journal of Neuroscience Research. 69 (1), 110-116 (2002).
- Engelhardt, J. I., Siklos, L., Appel, S. H. Altered calcium homeostasis and ultrastructure in motoneurons of mice caused by passively transferred anti-motoneuronal IgG. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56 (1), 21-39 (1997).
- Pagani, M. R., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Calcium signaling pathways mediating synaptic potentiation triggered by amyotrophic lateral sclerosis IgG in motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2661-2672 (2006).
- Carter, J. R., Mynlieff, M. Amyotrophic lateral sclerosis patient IgG alters voltage dependence of Ca2+ channels in dissociated rat motoneurons. Neuroscience Letters. 353 (3), 221-225 (2003).
- Fratantoni, S. A., Weisz, G., Pardal, A. M., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Amyotrophic lateral sclerosis IgG-treated neuromuscular junctions develop sensitivity to L-type calcium channel blocker. Muscle & Nerve. 23 (4), 543-550 (2000).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Vay, S. U., et al. The impact of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) and voltage-gated potassium KCNQ/Kv7 channels on primary microglia function. Journl of Neuroinflammation. 17 (1), 100 (2020).
- Bijelić, D. D., et al. Central nervous system-infiltrated immune cells induce calcium increase in astrocytes via astroglial purinergic signaling. Journal of Neuroscience Research. 98 (11), 2317-2332 (2020).
- Kawamata, H., et al. Abnormal intracellular calcium signaling and SNARE-dependent exocytosis contributes to SOD1G93A astrocyte-mediated toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2331-2348 (2014).
- Nims, R. W., Price, P. J. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 53 (10), 872-879 (2017).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Adzic, M., et al. Extracellular ATP induces graded reactive response of astrocytes and strengthens their antioxidative defense in vitro. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1053-1066 (2017).
- Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 198 (2020).
- Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nature Neuroscince. 17 (1), 131-143 (2014).
- Vankriekelsvenne, E., et al. Transmembrane protein 119 is neither a specific nor a reliable marker for microglia. Glia. 70 (6), 1170-1190 (2022).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
