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Biology

सेल्फिंग कैनोरहाब्डिटिस नेमाटोड्स के पारिस्थितिक सर्वेक्षण करने के लिए एक अत्यधिक स्केलेबल दृष्टिकोण

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63486
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

Summary

इस प्रोटोकॉल का उपयोग बड़े पैमाने पर पारिस्थितिक सर्वेक्षण करने के लिए किया जा सकता है जो केनोरहाबिडिटिस नेमाटोड को स्व-करने के लिए किया जाता है। इस विधि का प्राथमिक लाभ प्रकृति से एकत्र किए गए नेमाटोड से जुड़े पारिस्थितिक और आणविक डेटा का कुशल संगठन और विश्लेषण है।

Abstract

Caenorhabditis elegans जीव विज्ञान में प्रमुख मॉडल जीवों में से एक है, लेकिन हाल ही में शोधकर्ताओं ने इसकी प्राकृतिक पारिस्थितिकी पर ध्यान केंद्रित किया है। अपने प्राकृतिक संदर्भ में C. elegans के बारे में जानकारी की सापेक्ष sparsity प्रकृति में छोटे सूत्रकृमि की पहचान में शामिल चुनौतियों से आता है। इन चुनौतियों के बावजूद, C. elegans की पारिस्थितिकी पर बढ़ते ध्यान ने प्रयोगशाला के बाहर अपने जीवन के बारे में नई जानकारी का खजाना पैदा किया है। प्रकृति में सी एलिगन्स के लिए गहन खोज ने कई नई केनोरहाबिडिटिस प्रजातियों की खोज में योगदान दिया है और पता चला है कि कॉन्जेनेरिक नेमाटोड अक्सर जंगली में सहवास करते हैं, जहां वे सड़ने वाले पौधों की सामग्री से जुड़े माइक्रोबियल खिलने पर फ़ीड करते हैं। नई प्रजातियों की पहचान से यह भी पता चला है कि पुरुषों की एंड्रोडियोसियस संभोग प्रणाली और स्व-निषेचन उभयलिंगी केनोरहैब्डिटिस के भीतर तीन बार स्वतंत्र रूप से विकसित हुई है। अन्य दो स्व-स्वयं प्रजातियां, C. briggsae और C. tropicalis, C. elegans के प्रयोगात्मक लाभों को साझा करती हैं और आत्म-निषेचन सहित महत्वपूर्ण लक्षणों के यांत्रिक आधार में तुलनात्मक अध्ययन को सक्षम करती हैं। इन प्रगति के बावजूद, इन महत्वपूर्ण प्रजातियों की पारिस्थितिकी और प्राकृतिक विविधता के बारे में बहुत कुछ सीखा जाना बाकी है। उदाहरण के लिए, हमारे पास अभी भी उनके कई जीनों के लिए कार्यात्मक जानकारी की कमी है, जो केवल उनकी प्राकृतिक पारिस्थितिकी की समझ के माध्यम से प्राप्त की जा सकती है। केनोरहाबिडिटिस नेमाटोड को स्व-करने के पारिस्थितिक अनुसंधान की सुविधा के लिए, हमने जंगली से नेमाटोड एकत्र करने के लिए एक अत्यधिक स्केलेबल विधि विकसित की। हमारी विधि मोबाइल डेटा संग्रह प्लेटफार्मों, क्लाउड-आधारित डेटाबेस और आर सॉफ़्टवेयर वातावरण का उपयोग जंगली से नेमाटोड एकत्र करने की शोधकर्ताओं की क्षमता को बढ़ाने के लिए करती है, संबंधित पारिस्थितिक डेटा रिकॉर्ड करती है, और आणविक बारकोड का उपयोग करके जंगली नेमाटोड की पहचान करती है।

Introduction

पिछले दो दशकों ने केनोरहाबिडिटिस नेमाटोड की पारिस्थितिकी में रुचि में वृद्धि की है। इन अध्ययनों से, हम जानते हैं कि मुक्त रहने वाली केनोरहाबडाइटिस प्रजातियों को समशीतोष्ण और उष्णकटिबंधीय दोनों क्षेत्रों में अल्पकालिक सूक्ष्म-आवासों से अलग किया जा सकता है, जहां वे विघटित पौधों की सामग्री से जुड़े माइक्रोबियल खिलने पर फ़ीड करते हैं, कभी-कभी सिम्पेट्री 1,2,3,4,5,6,7,8 में . हमने यह भी सीखा है कि जीनस में तीन बार स्व-निषेचन का अभिसरण विकास हुआ है, और सेल्फिंग सी ब्रिग्स, सी एलिगन्स और सी। इन selfers के बीच, C. elegans पृथ्वी पर सबसे व्यापक रूप से अध्ययन किए गए जानवरों में से एक है और इसका उपयोग शोधकर्ताओं द्वारा जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण प्रगति करने के लिए किया गया है। महत्वपूर्ण रूप से, अन्य स्व-केनोरहाबडिटिस प्रजातियां सी एलिगन्स के कई प्रयोगात्मक लाभों को साझा करती हैं और जीनस में तुलनात्मक अध्ययन को तेजी से आगे बढ़ा रही हैं। हालांकि, जंगली में इन नेमाटोड की गुप्त प्रकृति उनकी पारिस्थितिकी और प्राकृतिक विविधता का अध्ययन करना मुश्किल बनाती है, जो उनके जीन के जैविक कार्यों और उन तरीकों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है जिनमें विकास ने प्रजातियों के बीच आनुवंशिक विविधता को आकार दिया है10,11।

जंगली में केनोरहाबिडिटिस नेमाटोड को स्व-करने की पारिस्थितिकी का अध्ययन करने के लिए सबसे बड़ी चुनौती उनका छोटा आकार है; वयस्क नेमाटोड अक्सर लंबाई में 1 मिमी या उससे कम होते हैं। इस चुनौती की आवश्यकता है कि शोधकर्ता जंगली से सब्सट्रेट का नमूना लेते हैं और जंगली में जानवरों का निरीक्षण करने की क्षमता के बिना प्रयोगशाला में सब्सट्रेट से ब्याज के नेमाटोड को अलग करने का प्रयास करते हैं। क्योंकि यहां तक कि प्रशिक्षित विशेषज्ञों को माइक्रोस्कोप के तहत अन्य मुक्त-जीवित नेमाटोड से केनोरहाबडिटिस नेमाटोड को भेदभाव करना मुश्किल लगता है, नेमाटोड को आमतौर पर सब्सट्रेट से हटा दिया जाता है, अलग किया जाता है, और स्थापित आणविक बारकोड 3,12,13,14 का उपयोग करके अनुक्रम पहचान द्वारा पहचाने जाने से पहले फैलाने के लिए छोड़ दिया जाता है। . इस तरह से प्रत्येक सूत्रकृमि को संसाधित करने के लिए आवश्यक समय और प्रयास एक संगठनात्मक चुनौती पेश करते हैं, क्योंकि शोधकर्ताओं को प्रयोगशाला में अलग-थलग किए गए प्रत्येक सूत्रकृमि की पहचान का पता लगाने में सक्षम होना चाहिए सटीक सब्सट्रेट और क्षेत्र में नमूना किए गए संबंधित पारिस्थितिक डेटा पर वापस। यहां, हम क्षेत्र से केनोरहाबडिटिस नेमाटोड को कुशलतापूर्वक इकट्ठा करने और पहचानने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया का वर्णन करते हैं और इन आइसोलेट्स को उच्च पैमाने पर उनके संबंधित स्थानिक और पारिस्थितिक डेटा के साथ ईमानदारी से जोड़ते हैं।

यह संग्रह विधि मोबाइल डेटा संग्रह प्लेटफ़ॉर्म, क्लाउड-आधारित डेटाबेस और R सॉफ़्टवेयर वातावरण का उपयोग करके पारिस्थितिक सर्वेक्षणों के पैमाने और सटीकता को बढ़ाती है। फुलक्रम एक अनुकूलन योग्य डेटा-संग्रह मंच है जो अधिकांश मोबाइल उपकरणों के साथ काम करता है और उपयोगकर्ताओं को स्थान-आधारित डेटा (https://www.fulcrumapp.com) को इकट्ठा करने और व्यवस्थित करने के लिए कस्टम एप्लिकेशन बनाने की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल क्षेत्र से स्थानिक रूप से स्पष्ट पारिस्थितिक डेटा को व्यवस्थित करने और प्रयोगशाला में अलग किए गए नेमाटोड की पहचान के साथ उन डेटा को सटीक रूप से जोड़ने के लिए अनुकूलित डेटा-संग्रह अनुप्रयोगों का उपयोग करने के तरीके पर विस्तृत निर्देश प्रदान करता है। प्रोटोकॉल यह भी बताता है कि स्थापित आणविक बारकोड का उपयोग करके सेल्फिंग कैनोरहाब्डिटिस नेमाटोड को कुशलतापूर्वक कैसे पहचाना जाए। इन तरीकों से डेटा को बस संसाधित किया जा सकता है और प्राकृतिक Caenorhabditis आबादी की पारिस्थितिकी और आनुवंशिक विविधता का पता लगाने के लिए साथ आर सॉफ्टवेयर पैकेज easyFulcrum15 के साथ reproducibly।

Protocol

1. संग्रह की तैयारी

  1. Caenorhabditis सूत्रकृमि का सर्वेक्षण करने के लिए एक स्थान की पहचान करें।
    नोट: अधिकांश समशीतोष्ण क्षेत्रों में, C. elegans और C. briggsae को कृषि क्षेत्रों या ग्रामीण और शहरी उद्यानों जैसे मानव-संबद्ध आवासों से आसानी से अलग किया जा सकता है। उपोष्णकटिबंधीय और उष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में, C. briggsae, C. elegans, और C. tropicalis सभी ऊपर सूचीबद्ध मानव-संबद्ध आवासों में पाए जा सकते हैं, कभी-कभी एक दूसरे के करीब निकटता में। हालांकि, सी elegans उष्णकटिबंधीय आवासों में अन्य प्रजातियों की तुलना में कूलर, शुष्क आवास पसंद करते हैं7,8. प्रत्येक प्रजाति को जंगली आवासों से भी अलग किया जा सकता है जो मनुष्यों से जुड़े नहीं हैं, लेकिन इन आवासों को कम बार नमूना दिया जाता है।
  2. मोबाइल डेटा-संग्रह अनुप्रयोगों के साथ संग्रह और अलगाव डेटा को व्यवस्थित करने के लिए एक फुलक्रम प्रोजेक्ट बनाएँ.
    1. एक नो-कॉस्ट शैक्षिक समझौते 16 का उपयोग करके ऑनलाइन फुलक्रम के साथ एक खाता बनाएँ। ADD APP बटन 17 पर क्लिक करके एक Fulcrum खाते के लिए नेमाटोड फ़ील्ड नमूना अनुप्रयोग जोड़ें।
    2. ADD APP बटन18 पर क्लिक करके किसी खाते में नेमाटोड आइसोलेशन एप्लिकेशन जोड़ें.
      नोट: यह अनुशंसा की जाती है कि किसी स्थान की प्रत्येक यात्रा नामकरण सम्मेलन 'YearMonthLocation' का उपयोग करके अपने संग्रह परियोजना के रूप में आयोजित की जाती है, उदाहरण के लिए, 2020 फरवरी ऑस्ट्रेलिया।
  3. उपयोगकर्ताओं को संग्रह प्रोजेक्ट तक पहुँच प्रदान करने के लिए Fulcrum खाते में जोड़ें. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक उपयोगकर्ता परियोजना में भाग लेने के लिए Fulcrum मोबाइल एप्लिकेशन डाउनलोड करता है।
  4. मोबाइल अनुप्रयोग के साथ संग्रह (C-लेबल) और सूत्रकृमि अलगाव (S-लेबल) को ट्रैक करने के लिए QR-कोड लेबल्स का एक सेट मुद्रित करें. सी-लेबल को ज़िप-लॉक प्लास्टिक बैग में संलग्न करें, लेबल किए गए बैग को 25 के समूहों में रोल करें, और उन्हें पैकिंग के लिए एक रबर बैंड के साथ लपेटें। प्रयोगशाला में उपयोग के लिए एस-लेबल का सेट रखें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के दौरान, संग्रह (फ़ील्ड से substrates) बैग में या प्लेटों पर निहित हैं और सी-लेबल के साथ लेबल किए जाते हैं। पृथक नेमाटोड को एस-लेबल के साथ लेबल किया जाता है। सी-लेबल का उपयोग अद्वितीय संग्रहों की पहचान करने के लिए किया जाता है, और एस-लेबल का उपयोग अद्वितीय नेमाटोड आइसोलेट्स की पहचान करने के लिए किया जाता है। इन दो प्रकार के लेबल का उपयोग फुलक्रम डेटाबेस में किसी विशेष संग्रह (सी-लेबल) और उस संग्रह (एस-लेबल) से अलग किए गए नेमाटोड के बीच कनेक्शन बनाने के लिए किया जाता है। संग्रह परियोजना के लिए सी-लेबल के रूप में एस-लेबल की संख्या से दोगुना मुद्रित करें क्योंकि, औसतन, दो नेमाटोड प्रति संग्रह अलग-थलग होते हैं। यदि आवश्यक हो तो बाद में अधिक एस-लेबल मुद्रित किए जा सकते हैं। 2,500 अद्वितीय सी-लेबल (पूरक फ़ाइल 1) और 5,000 अद्वितीय एस-लेबल (पूरक फ़ाइल 2) पूरक में प्रदान किए जाते हैं।
  5. संग्रह के लिए 10 सेमी एनजीएमए प्लेटें और नेमाटोड को अलग करने के लिए 3.5 सेमी एनजीएमए प्लेटें तैयार करें। एक 10 सेमी प्लेट और कम से कम दो 3.5 सेमी प्लेटप्रति collection21 बनाओ। इन प्लेटों को स्थापित प्रोटोकॉल के बाद Escherichia कोलाई तनाव OP50 के साथ बीज कर रहे हैं। 1 महीने से अधिक समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग करने से पहले प्लेटों को स्टोर करें।

2. फ़ील्ड संग्रह

नोट: Caenorhabditis सूत्रकृमि अक्सर फल, नट्स, बीज, फली, फूल, तनों, वनस्पति कूड़े, और compost1,5,6,8 सहित सड़ने वाली सब्जी सामग्री से अलग कर रहे हैं। सबसे अच्छा substrates सड़े हुए हैं और फल या फूलों के रूप में लगभग पहचानने योग्य नहीं हैं; सब्सट्रेट से बचें जो बहुत शुष्क या गीले हैं (चित्रा 1)। सब्सट्रेट जोड़े में काम करके क्षेत्र से सबसे कुशलता से एकत्र किए जाते हैं। गैर संपर्क अवरक्त थर्मामीटर के साथ व्यक्ति संग्रह के लिए एक सब्सट्रेट का चयन करेगा और नमूना एकत्र करेगा, जबकि उनका साथी संग्रह डेटा रिकॉर्ड करने के लिए फुलक्रम में नेमाटोड फील्ड सैंपलिंग एप्लिकेशन का उपयोग करता है। संग्राहकों की जोड़ी इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएगी जब तक कि नमूनों की वांछित संख्या एकत्र नहीं की जाती है। फील्डवर्क के लिए आवश्यक सामग्रियों की सूची (पूरक तालिका 1) में पाई जाती है।

  1. फुलक्रम मोबाइल ऐप खोलें, ड्रॉप-डाउन मेनू से नेमाटोड फील्ड सैंपलिंग का चयन करें। प्रोजेक्ट में एक नया रिकॉर्ड शुरू करने के लिए + दबाएँ (चित्रा 2A). सब्सट्रेट की एक तस्वीर लें।
  2. चरण 1.2 (चित्रा 2B) में किए गए सही संग्रह प्रोजेक्ट का चयन करने के लिए शीर्ष केंद्र में बॉक्स पर क्लिक करें। संग्रह रिकॉर्ड के निचले भाग में सी-लेबल फ़ील्ड पर टैप करें और प्रॉम्प्ट दिखाई देने पर स्कैन करें चुनें। मोबाइल डिवाइस कैमरे का उपयोग करके संग्रह बैग पर बारकोड को स्कैन करें , फिर स्क्रीन के ऊपरी दाईं ओर हो गया पर टैप करें।
  3. सब्सट्रेट फ़ील्ड पर टैप करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से एक सब्सट्रेट प्रकार का चयन करें। सब्सट्रेट नोट्स फ़ील्ड को टैप करके और मैन्युअल रूप से नोट्स दर्ज करके सब्सट्रेट के बारे में नोट्स जोड़ें।
  4. ड्रॉप-डाउन मेनू से एक परिदृश्य चुनें. उस परिदृश्य को चुनें जो नमूना साइट का सबसे अच्छा प्रतिनिधित्व करता है।
  5. एक आकाश दृश्य चुनें। आकाश दृश्य चुनते समय, नमूना स्थल पर आकाश दृश्यता का वर्णन करें (उदाहरण के लिए, पेड़ों या अन्य संरचनाओं से बाधित दृश्यों के बिना एक पूर्ण आकाश दृश्य = पूर्ण)।
  6. गैर-संपर्क थर्मामीटर का उपयोग करके सब्सट्रेट की सतह के तापमान को मापें और सब्सट्रेट तापमान क्षेत्र में मूल्य रिकॉर्ड करें।
    नोट: तापमान को रिकॉर्ड करते समय सब्सट्रेट से 14 इंच से अधिक नहीं गैर-संपर्क थर्मामीटर पकड़ो।
  7. हैंडहेल्ड डिवाइस के साथ परिवेश के तापमान और आर्द्रता को मापें और इन डेटा को उचित क्षेत्रों में रिकॉर्ड करें।
    नोट:: जाँचें कि परिवेश का तापमान और आर्द्रता डिवाइस होल्ड पर नहीं हैं। बटन जारी होने पर माप इकाई बदल जाएगी. अनियमित रीडिंग से बचने के लिए डिवाइस को बाहरी जेब में रखें।
  8. स्क्रीन के ऊपरी बाईं ओर सहेजें पर टैप करके फुलक्रम में रिकॉर्ड सहेजें.
  9. सब्सट्रेट को लेने के लिए "दस्ताने" के रूप में उपयोग करने के लिए संग्रह बैग को उलटकर स्टिक्स या अन्य कठिन टुकड़ों के बिना सब्सट्रेट के एक चम्मच के बारे में इकट्ठा करें, फिर बैग को सील करें। बैग में एक पेपर तौलिया डालें यदि नमूना विशेष रूप से नम है।
    नोट: गर्म जलवायु में, संग्रह को ठंडा रखने के लिए कूलर पैक के साथ नरम कूलर में बैग रखें।
  10. दिन के लिए सभी नमूनों को एकत्र करने के बाद, संग्रह उपकरण को साफ करें, बैटरी को जांच से बाहर निकालें, बैटरी रिचार्ज करें, फ्रीजर पैक को फिर से फ्रीज करें। सूत्रकृमि फ़ील्ड नमूनाकरण अनुप्रयोग के ऊपर बाईं ओर सिंक्रनाइज़ेशन बटन टैप करके फुलक्रम संग्रह डेटा सिंक्रनाइज़ करें.
    नोट: अपलोड एक मजबूत सेलुलर कनेक्शन के बिना कई मिनट लग सकते हैं, इसलिए वाईफाई एक्सेस के लिए इंतजार करना सबसे अच्छा हो सकता है। डेटा मोबाइल उपकरणों पर रहेगा और क्लाउड पर सिंक्रनाइज़ किया जाएगा।
  11. नमूनों को रात भर शिपिंग बॉक्स में रखकर एक घर संस्थान में भेजें। उस समय को कम करें जब नमूनों को 11 डिग्री सेल्सियस से कम या 25 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान के संपर्क में लाया जाता है, जब कार्गो ले जाया जाता है, तो उन दिनों में शिपिंग पैकेज द्वारा।
    नोट: अधिकांश शिपिंग सुविधाएं दूरस्थ स्थानों में सप्ताहांत पर रात भर कार्गो शिप नहीं करती हैं।

3. प्रयोगशाला में क्षेत्र संग्रह से बाहर चढ़ाना

नोट:: यह अनुभाग लेबल संग्रह बैग से लेबल प्लेटों के लिए नमूनों के स्थानांतरण को व्यवस्थित करने के लिए कैसे विवरण देता है। नमूने रात भर शिपमेंट से या सीधे क्षेत्र से आ सकते हैं।

  1. संग्रह के शिपमेंट प्राप्त करें और टूटे हुए बैग या क्षति के अन्य सबूतों के लिए निरीक्षण करें। यदि बैग टूट गए हैं, तो सामग्री को छोड़ दें और 70% इथेनॉल के साथ अटूट संग्रह बैग को साफ करें; इथेनॉल के साथ बैग पर सी-लेबल से बचें क्योंकि यह लेबल को बदरंग कर देगा और इसे पढ़ना मुश्किल बना देगा।
  2. प्रत्येक ज़िप-लॉक बैग के लिए, बैग पर सी-लेबल को नोट करें और OP50 बैक्टीरिया के साथ देखी गई 10 सेमी प्लेट के ढक्कन पर एक मिलान सी-लेबल संलग्न करें।
    नोट: लेबल की गई 10 सेमी प्लेटों को बाकी प्रोटोकॉल के लिए 'सी-प्लेट्स' के रूप में संदर्भित किया जाता है। नमूनों को व्यवस्थित करने का सबसे आसान तरीका शीर्ष पर मिलान सी-प्लेट के साथ एक प्रयोगशाला बेंच पर संग्रह बैग रखना है (चित्रा 3)।
  3. प्रत्येक संग्रह के लिए, एक साफ प्लास्टिक चम्मच का उपयोग करके संग्रह बैग से सी-प्लेट में लगभग एक चम्मच नमूना स्थानांतरित करें। एक अर्धचंद्राकार या अंगूठी के आकार में बैक्टीरियल लॉन के चारों ओर नमूना जोड़ें, पूरी तरह से जीवाणु लॉन (चित्रा 4) को कवर न करें।
    नोट: जब यह उपयोग में नहीं है तो इसे 95% इथेनॉल के बीकर में रखकर चम्मच को साफ रखें। अतिरिक्त नमूनों को स्थानांतरित करने से पहले चम्मच को सुखाने के लिए एक पेपर तौलिया का उपयोग करें।
  4. संग्रह को संग्रह बैग से सी-प्लेटों में स्थानांतरित किए गए समय को रिकॉर्ड करें और धारा 4 में नेमाटोड को अलग करने का प्रयास करने से पहले कम से कम 24 घंटे के लिए सी-प्लेटों को कमरे के तापमान (आरटी) पर रखें।

4. संग्रह से नेमाटोड को अलग करना

  1. मोबाइल डिवाइस पर Fulcrum एप्लिकेशन खोलें और एप्लिकेशन मेनू (चित्रा 5A) से नेमाटोड अलगाव चुनें। निचले दाईं ओर + आइकन को टैप करके एक नया अलगाव रिकॉर्ड बनाएं (चित्रा 5 बी)।
  2. नई आइसोलेशन रिकॉर्ड स्क्रीन में, शीर्ष केंद्र पर बॉक्स में प्रदर्शित प्रोजेक्ट नाम की जाँच करके सही संग्रह प्रोजेक्ट की पुष्टि करें. यदि गलत प्रोजेक्ट प्रदर्शित होता है, तो सही प्रोजेक्ट (चित्रा 5C) पर स्विच करने के लिए प्रोजेक्ट नाम टैप करें।
  3. उस नमूने से जुड़े सी-लेबल को खोजने के लिए सी-लेबल फ़ील्ड के तहत चयन करें बटन पर टैप करें जिसमें से नेमाटोड को अलग किया जा रहा है (चित्रा 5 डी)। खोज आइकन पर टैप करें, फिर डिवाइस कैमरे के साथ सी-प्लेट पर सी-लेबल क्यूआर कोड को स्कैन करने के लिए स्कैन आइकन पर टैप करें। एक बार QR कोड स्कैन हो जाने के बाद, C-लेबल फ़ील्ड में एक C-लेबल रिकॉर्ड दिखाई देगा.
  4. डिवाइस कैमरा खोलने के लिए फ़ोटो फ़ील्ड में कैमरा आइकन पर टैप करें और इसका उपयोग क्यूआर कोड दृश्यमान (चित्रा 5ई) के साथ सी-प्लेट पर नमूने की तस्वीर लेने के लिए करें। आइसोलेशन स्क्रीन पर लौटने के लिए डन पर टैप करें।
    नोट:: इन अलगाव रिकॉर्ड फ़ोटो का उपयोग बाद के समय में सब्सट्रेट की विशिष्ट विशेषताओं का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।
  5. सी-प्लेट पर नेमाटोड की तलाश करने के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। नमूना पर नेमाटोड की उपस्थिति रिकॉर्ड करने के लिए नमूना फ़ील्ड पर कीड़े पर टैप करें (चित्रा 5F)। हाँ पर टैप करें यदि नेमाटोड सी-प्लेट पर मौजूद हैं और नहीं पर टैप करें यदि कोई नेमाटोड मौजूद नहीं हैं।
  6. पटरियों पर टैप करें यदि केवल नेमाटोड ट्रैक मौजूद हैं। यदि कोई नेमाटोड मौजूद नहीं हैं, तो सी-प्लेट को पैराफिल्म करें और इसे बायोहैजार्ड बिन में निपटाएं।
    नोट: Biohazard अपशिष्ट बिन पर सी प्लेट उलटें और धीरे से प्लेट के पीछे नल करने के लिए नमूना substrates के सभी dislodge. यह चरण सी-प्लेट पर सब्सट्रेट के नीचे हो सकने वाले नेमाटोड को ढूंढना और अलग करना आसान बनाता है।
  7. यदि नेमाटोड मौजूद हैं, तो सी-प्लेट से पांच सूत्रकृमि को अलग करें। एक सूत्रकृमि को अलग करने के लिए, एक नेमाटोड को सी-प्लेट से एक प्लेटिनम वायर पिक का उपयोग करके एस-प्लेट में स्थानांतरित करें। यदि संभव हो तो स्वस्थ, गुरुत्वाकर्षण वयस्कों को अलग करें। हालांकि, यदि वयस्क नहीं पाए जाते हैं तो अन्य चरणों को अलग करें।
    नोट: अलगाव के बाद, पांच एस-प्लेटों तक प्रत्येक पर एक एकल सूत्रकृमि होगा। इन एस-प्लेट (ओं) को एक ही सी-प्लेट से अलग-थलग नेमाटोड के साथ रखें, जो एक साथ एक साफ स्टैक में अन्य एस-प्लेटों से दूर एक साथ आयोजित किए जाते हैं जब तक कि वे फुलक्रम में प्रवेश नहीं कर लेते।
  8. इस अलगाव के लिए उपयोग की जाने वाली एस-प्लेट (एस) में प्रवेश करने के लिए एस-लेबल प्लेट्स फ़ील्ड पर टैप करें। निचले दाईं ओर + पर टैप करें। एस-लेबल पर टैप करें और फिर डिवाइस कैमरा खोलने के लिए स्कैन पर क्लिक करें। S-प्लेट पर S-लेबल QR कोड को स्कैन करने के लिए डिवाइस कैमरा का उपयोग करें.
    नोट:: सुनिश्चित करें कि S-लेबल कोड प्लेट पर कोड से मेल खाता है। यदि यह मेल खाता है, तो डन पर टैप करें। यदि ऐसा नहीं होता है, तो रद्द करें पर टैप करें और तब तक पुन: स्कैन करें जब तक कि यह मेल न खाता हो, फिर डन पर क्लिक करें। कभी-कभी आस-पास की प्लेटों के क्यूआर कोड गलती से स्कैन किए जाते हैं।
  9. प्रत्येक एस-प्लेट में प्रवेश करने के बाद, शीर्ष दाईं ओर सहेजें बटन के साथ प्रविष्टि को सहेजें। यदि यह सहेजा नहीं गया है, तो प्रविष्टि खो जाएगी. यदि आवश्यक हो तो अधिक एस-लेबल प्लेटों को जोड़ने के लिए निचले दाईं ओर + पर टैप करें जब तक कि सी-प्लेट से अलग किए गए सभी नेमाटोड दर्ज न किए जाएं। अलगाव रिकॉर्ड के लिए सभी एस-लेबल प्लेटों को जोड़ने के बाद, अलगाव रिकॉर्ड स्क्रीन पर वापस जाने के लिए ऊपरी बाईं ओर < बटन पर टैप करें।
    नोट:: गलतियों को हल नहीं किया जा सकता क्योंकि किसी अलगाव रिकॉर्ड को रद्द करने के लिए, ऊपरी बाईं ओर रद्द करें पर क्लिक करें। यह चरण एक संवाद खोलेगा जिसमें पूछा जाएगा कि क्या रिकॉर्ड को सहेजे बिना छोड़ा जा सकता है. यदि वांछित हो, तो हाँ, त्यागें पर क्लिक करें।
  10. ऊपरी दाईं ओर सहेजें बटन पर टैप करें एक बार जब अलगाव रिकॉर्ड में सभी जानकारी सही ढंग से जोड़ी जाती है। फिर अलग-थलग नेमाटोड के साथ एस-प्लेटों को पैराफिल्म करें और उन्हें नेमाटोड के साथ एस-प्लेटों को पकड़ने के लिए नामित क्षेत्र में अलग रखें।
  11. सी-प्लेट को पैराफिल्म करें और इसे बायोहैजार्ड बिन में छोड़ दें। फुलक्रम में सभी डेटा अपलोड करने के लिए सिंक आइकन पर टैप करें।
  12. सभी एस-प्लेटों को अल्फान्यूमेरिक क्रम में सॉर्ट करें, फिर एस-प्लेटों को कार्डबोर्ड बक्से में रखें। सुनिश्चित करें कि एस-प्लेटें ढक्कन-साइड नीचे और पैराफिल्मेड हैं। बॉक्स में एक स्थिति में चार एस-प्लेटों तक स्टैक करें और प्रोजेक्ट नाम, दिनांक, समय और एक अद्वितीय बॉक्स नंबर के साथ कार्डबोर्ड बॉक्स को लेबल करें।
  13. लेबल किए गए बक्से को RT पर संग्रहीत करें. इन आइसोलेट्स को प्रसार के लिए 48 घंटे और फिर से 168 घंटे में जांच की जाएगी यदि आवश्यक हो।

5. निर्यात एस-प्लेटों से Fulcrum

नोट:: यह अनुभाग विवरण कैसे S-लेबल Fulcrum प्रोजेक्ट डेटाबेस से अलगाव प्रक्रिया में उपयोग किया निर्यात करने के लिए। इन एस-लेबल का उपयोग आइसोफेमेल लाइनों को ट्रैक करने के लिए किया जाएगा, जबकि उन्हें अनुभाग 6-9 में अनुक्रम पहचान द्वारा पहचाना जा रहा है।

  1. Fulcrum वेबसाइट में साइन इन करें और नेमाटोड अलगाव आवेदन का चयन करें। स्क्रीन के बाईं ओर से निर्यातक पर क्लिक करें। इच्छित प्रोजेक्ट का चयन करने के लिए क्लिक करें, और नेमाटोड आइसोलेशन बॉक्स की जाँच करें। 'nematode_isolation_s_labeled_plates.csv' फ़ाइल वाली किसी .zip फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए अगला क्लिक करें.
  2. 'nematode_isolation_s_labeled_plates.csv' फ़ाइल खोलें और इसे आरोही क्रम में 'S-लेबल' स्तंभ द्वारा सॉर्ट करें (सबसे छोटा S-लेबल शीर्ष पर होगा). सभी एस-लेबल का चयन करें और उन्हें स्प्रेडशीट से कॉपी करें।
  3. एक वेब ब्राउज़र 19 का उपयोग कर जंगली अलग जीनोटाइपिंग टेम्पलेट Google शीट (wild_isolate_genotyping_template) पर नेविगेट करें।
    1. जीनोटाइपिंग टेम्पलेट टैब पर राइट-क्लिक करके इस Google शीट की एक प्रतिलिपि बनाएं, फिर कॉपी टू न्यू स्प्रेडशीट विकल्प का चयन करें। नया Google पत्रक देखने के लिए स्प्रेडशीट खोलें का चयन करें.
    2. इस नए पत्रक को 'wild_isolate_genotyping' के बाद फुलक्रम प्रोजेक्ट नाम के साथ नाम दें, उदाहरण के लिए, '2020FebruaryAustralia_wild_isolate_genotyping।
      नोट:: इस पत्रक प्रोटोकॉल के बाकी हिस्सों में 'जीनोटाइपिंग शीट' के रूप में संदर्भित किया जाता है।
  4. 'nematode_isolation_s_labeled_plates.csv' 's_label' स्तंभ से प्रतिलिपि बनाए गए S-लेबल को 's_label' शीर्षक वाले जीनोटाइपिंग पत्रक स्तंभ में चिपकाएँ. '1' के लिए 's_label_repeat_error' स्तंभ की जाँच करें. इस कॉलम में '1' के मान का अर्थ है कि एस-लेबल को जीनोटाइपिंग शीट पर कहीं डुप्लिकेट किया गया है। यदि दोहराव की खोज की जाती है, तो आगे बढ़ने से पहले उन्हें जांचें और सही करें।
  5. सभी S-लेबल्स के लिए जीनोटाइपिंग शीट 'isolation_box_number' स्तंभ भरें.

6. एस-प्लेटों पर प्रसार के लिए जाँच करें

  1. अलगाव के बाद 48 घंटे के बाद एस-प्लेटों पर जानवरों को फैलाने के लिए जांचें (चरण 4.11 से गाइड समय तक बॉक्स पर अंतिम अलगाव की तारीख और समय का उपयोग करें)।
    नोट: नेमाटोड को फैलाने वाले एस-प्लेट पर संतानों की विशेषता है।
  2. यदि एक एस-प्लेट फैल रही है, तो जीनोटाइपिंग शीट पर proliferation_48 कॉलम में '1' दर्ज करें, फिर एस-प्लेट को '48 एच प्रसार, बॉक्स 1' लेबल वाले बॉक्स में ले जाएं। एक प्रसार बॉक्स में अधिकतम 88 एस-प्लेटें रखें, फिर '48 एच प्रसार, बॉक्स 2' लेबल वाले एक नए बॉक्स को भरना शुरू करें। सुनिश्चित करें कि एस-लेबल 48 ज प्रसार बक्से में अल्फान्यूमेरिक क्रम में आयोजित किए जाते हैं।
    नोट: गैर-proliferating एस-प्लेटों का निपटान न करें; इन प्लेटों को 168 ज पोस्ट-आइसोलेशन पर फिर से जांचा जाएगा। यदि वांछित हो, तो इन एस-प्लेटों को संख्यात्मक क्रम में '48 ज गैर-प्रसार, बॉक्स एक्स' लेबल वाले बक्से में समेकित करें, लेकिन नए बॉक्स पर 168 एच चेक होने पर रिकॉर्ड करना याद रखें।
  3. 48 घंटे में सभी प्रसार एस-लेबल की पहचान करने के बाद, 48 घंटे में प्रसार के साथ एस-प्लेटों के लिए अनुभाग 7 पर जाएं।
  4. एस-प्लेटों की जांच करें जो 48 घंटे के बाद के अलगाव में फिर से 168 घंटे के बाद अलगाव पर नहीं बढ़ रहे थे।
    1. यदि एक एस-प्लेट अब फैल रही है, तो जीनोटाइपिंग शीट पर proliferation_168 कॉलम में '1' दर्ज करें और फिर एस-प्लेट को '168 एच प्रसार, बॉक्स 1' लेबल वाले बॉक्स में ले जाएं।
    2. एक प्रसार बॉक्स में अधिकतम 88 एस-प्लेटें रखें, फिर '168 एच प्रसार, बॉक्स 2' लेबल वाले एक नए बॉक्स को भरना शुरू करें। 168 ज प्रसार बक्से में अल्फान्यूमेरिक क्रम में एस-लेबल को व्यवस्थित करना सुनिश्चित करें।
  5. 168 घंटे के बाद कोई प्रसार नहीं है कि एस प्लेटों को छोड़ दें। 168 घंटे पर प्रसार के साथ एस-प्लेटों के लिए अनुभाग 7 पर जाएं।

7. आइसोफेमल लाइनों का लाइसिस

नोट:: यह चरण प्रसार बक्से में S-प्लेटों के लिए lysis कार्यपत्रकों को मुद्रित करने में मदद करने के लिए Google पत्रकों में डेटा फ़िल्टर उपकरण का उपयोग करेगा। लाइसिस वर्कशीट का उद्देश्य बेंच पर लाइसिस स्ट्रिप ट्यूबों में एस-लेबल के लिए सही पदों के साथ कर्मियों को प्रदान करना है।

  1. वांछित प्रोजेक्ट के लिए जीनोटाइपिंग शीट खोलें और Cmd + A टाइप करके सभी कक्षों का चयन करें। प्रत्येक स्तंभ शीर्ष लेख में फ़िल्टर बटन जोड़ने के लिए डेटा > Create a Filter पर क्लिक करें. केवल S-प्लेटों को प्रदर्शित करने के लिए फ़िल्टर बटन का उपयोग करें जिन्हें जीनोटाइप किया जाएगा. उदाहरण के लिए, यदि 48 घंटे पर प्रसार के साथ सभी एस-प्लेटों को झूठ बोलना है: 'proliferation_48' कॉलम में फ़िल्टर बटन पर क्लिक करें और '1' का चयन करें।
  2. एक बार जीनोटाइपिंग Google शीट फ़िल्टर किए जाने के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए प्रदर्शित एस-लेबल की सूची की समीक्षा करें कि वे कार्यपत्रक पर मुद्रित होने वाले एस-लेबल हैं।
    1. जीनोटाइपिंग Google शीट के 'strip_tube_number' कॉलम में, हर 11 पंक्तियों में एक अद्वितीय संख्या दर्ज करें।
    2. 1 से शुरू होने वाले क्रमिक क्रम में एक परियोजना के लिए स्ट्रिप ट्यूब नंबर दर्ज करें और कभी भी डुप्लिकेट नहीं किया गया। 'strip_tube_position' में, प्रत्येक स्ट्रिप ट्यूब नंबर के लिए 2 से 12 दर्ज करें।
      नोट: lysis के लिए 12-ट्यूब पट्टी ट्यूब का उपयोग करें। पहली स्थिति (strip_tube_position 1) नियंत्रण होगा, लेकिन नियंत्रण lysis कार्यपत्रकों में नहीं जोड़े जाते हैं (केवल strip_tube_positions जोड़े जाते हैं, 2-12)। लाइसिस के समय, सकारात्मक नियंत्रण तनाव 'एन 2' को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रत्येक सम-क्रमांकित स्ट्रिप ट्यूब की स्थिति 1 में जोड़ा जाएगा। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रत्येक विषम-क्रमांकित पट्टी ट्यूब की स्थिति 1 में कोई कीड़े नहीं जोड़े जाते हैं।
  3. जीनोटाइपिंग Google शीट को आगे फ़िल्टर करें ताकि एक प्रसार बॉक्स में केवल एस-लेबल शामिल किए जा सकें, जिन्हें झूठ बोलना है, फिर 'lysis_notes' के माध्यम से कॉलम 's_label' का चयन करें। प्रत्येक प्रसार बॉक्स को लाइसेड करने के लिए एक लाइसिस कार्यपत्रक मुद्रित करें.
  4. प्रिंट फ़ील्ड में ड्रॉप-डाउन मेनू पर क्लिक करें और चयनित कक्षों का चयन करें. ऊपरी दाईं ओर अगला पर क्लिक करें, फिर प्रसार बॉक्स के लिए लाइसिस कार्यपत्रक को मुद्रित करने के लिए संवाद का उपयोग करें।
  5. प्रत्येक प्रसार बॉक्स के लिए एक lysis कार्यपत्रक मुद्रित करने के लिए चरण 7.3-7.5 दोहराएँ।
    नोट: प्रत्येक प्रसार बॉक्स 88 एस-प्लेटों तक रखता है, जो आठ 12-वेल स्ट्रिप ट्यूबों से मेल खाती है।
  6. सभी नमूनों है कि lysed किया जाएगा के लिए 12 अच्छी तरह से पट्टी ट्यूब तैयार करें. लाइसिस कार्यपत्रक में असाइन किए गए एक अद्वितीय 'strip_tube_number' के साथ एक पट्टी ट्यूब को लेबल करें। इस लेबल को कैप स्ट्रिप और स्ट्रिप ट्यूब पर लिखा जाना चाहिए ताकि भ्रम से बचा जा सके यदि वे अलग हो जाते हैं। यहां तक कि पट्टी ट्यूबों में स्थिति 1 में एक सकारात्मक नियंत्रण (N2 कीड़े) होता है। ODD स्ट्रिप ट्यूबों में स्थिति 1 में एक नकारात्मक नियंत्रण (कोई कीड़े नहीं) होता है।
  7. सभी नमूनों के लिए पर्याप्त लाइसिस बफर (100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8.2, 5 mM MgCl2, 0.9% IGEPAL, 0.9% Tween 20, 0.02% जिलेटिन के साथ प्रोटीनेज K 0.4 mg/ mL की अंतिम एकाग्रता में जोड़ा गया) बनाएं और पिपेट त्रुटि के लिए 5% अतिरिक्त जोड़ें। आवश्यक के रूप में स्केल करें।
    नोट: लाइसिस बफर प्रोटीनेज के अलावा सभी अवयवों के संयोजन और -20 डिग्री सेल्सियस पर 10-50 मिलीलीटर एलीकोट में ठंड द्वारा सबसे अच्छा तैयार किया जाता है। ऐलीकोट को पिघलाएं और उपयोग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें; उपयोग करने से तुरंत पहले, प्रोटीनेज के जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं। काम करते समय लाइसिस बफर को बर्फ पर रखें।
  8. एक गाइड के रूप में मुद्रित lysis कार्यपत्रक का उपयोग करने के क्रम में एक विशेष पट्टी ट्यूब के लिए एस-प्लेटों को व्यवस्थित करें।
  9. एक पट्टी ट्यूब uncap और एक दोहराने पिपेटर के साथ प्रत्येक टोपी के लिए lysis बफर के 8 μL जोड़ें. एक समय में कैप्स की एक पट्टी में लाइसिस बफर जोड़ें क्योंकि lysis बफर वाष्पित हो जाएगा यदि RT पर छोड़ दिया जाता है और खुला। स्रोत प्लेटों (सकारात्मक नियंत्रण के लिए एस-प्लेट या एन 2 स्टॉक प्लेट) से 3-5 जानवरों को लाइसिस वर्कशीट पर इंगित उचित कैप पदों में चुनें। 5 से कम कीड़े के साथ किसी भी एस-प्लेट के लिए रिकॉर्ड नोट्स lysis कार्यपत्रक के lysis_notes अनुभाग में lysis करने के लिए उठाया.
  10. स्ट्रिप ट्यूब की प्रत्येक स्थिति में नेमाटोड लोड करने के बाद, कैप स्ट्रिप को स्ट्रिप ट्यूब पर वापस रखें। चिह्नित टोपी (स्थिति 1) का अंकित ट्यूब (स्थिति 1) के साथ मिलान करें. एक बार कैप्ड होने के बाद, स्ट्रिप ट्यूब को संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें जब तक कि नेमाटोड ट्यूब के नीचे न हों।
  11. पट्टी को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में पूरी तरह से जमे हुए (कम से कम 10 मिनट) तक रखें। चरण 7.9 से 7.11 तक दोहराएं जब तक कि सभी स्ट्रिप्स में लाइसिस के लिए नेमाटोड नहीं जोड़ा जाता है। ट्यूब स्ट्रिप्स को संख्यात्मक क्रम में व्यवस्थित करें।
  12. स्ट्रिप ट्यूबों के सेट को हटा दें और थर्मोसाइकलर में लाइसिस प्रोग्राम चलाएं: 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे, 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट, 12 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ें। जब लाइसिस प्रोग्राम किया जाता है, तो आरटी में 15 सेकंड के लिए 300 x g पर नमूनों को स्पिन करें और 1 सप्ताह तक -80 डिग्री सेल्सियस पर लिसेट को स्टोर करें।
  13. 96-अच्छी तरह से प्लेट धारकों का उपयोग करके संख्यात्मक क्रम में ट्यूब स्ट्रिप्स को व्यवस्थित करें और एक प्रसार बॉक्स नंबर, स्ट्रिप ट्यूब नंबर रेंज, तिथि और शोधकर्ता के आद्याक्षर के साथ एक लेबल शामिल करें। lysis कार्यपत्रक से जानकारी के साथ जीनोटाइपिंग पत्रक स्तंभ 'lysis_date' और 'lysis_notes' अद्यतन करें।

8. एसएसयू और आईटीएस 2 अनुक्रमों की पीसीआर

नोट:: यह अनुभाग प्रत्येक lysed S-प्लेट के लिए दो अलग-अलग PCRs निष्पादित करने के लिए कैसे पर निर्देश प्रदान करेगा। पहला प्राइमर सेट 18S rDNA छोटे सबयूनिट जीन (SSU) के 500-bp टुकड़े को बढ़ाता है; oECA1271 = आगे प्राइमर TACAATGGAAGGCAGCGCGC, oECA1272 = रिवर्स प्राइमर CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA 12. इस पीसीआर का उपयोग टेम्पलेट डीएनए की गुणवत्ता की जांच करने के लिए किया जाता है। पीसीआर लगभग सभी नेमाटोड प्रजातियों के लिए एसएसयू क्षेत्र को बढ़ाता है। यदि एसएसयू पीसीआर बढ़ाने में विफल रहता है, तो इस परिणाम से पता चलता है कि लाइसिस की गुणवत्ता खराब है और इस एस-प्लेट के लिए लाइसिस को दोहराया जाना चाहिए। दूसरा प्राइमर सेट 5.8S और 28S rDNA जीन (ITS2) के बीच आंतरिक ट्रांसक्रिप्टेड स्पेसर क्षेत्र के 2,000-bp टुकड़े को बढ़ाता है; oECA1687 = आगे प्राइमर CTGCGTTACTTACCACGAATTGCARAC, oECA202 = रिवर्स प्राइमर GCGGTATTTGCTACTACCAYYAMGATCTGC3. ITS2 PCR उत्पाद Sanger sequenced है और अनुक्रम अनुक्रम समानता द्वारा प्रजातियों के स्तर के लिए Caenorhabditis जीनस में सूत्रकृमि की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है।

  1. PCR के लिए उपयोग किए जाने वाले केवल S-लेबल को देखने के लिए जीनोटाइपिंग पत्रक में फ़िल्टरिंग उपकरण का उपयोग करें.
    1. pcr_plate_number अद्यतन करें, और जीनोटाइपिंग पत्रक में स्तंभों pcr_well करें। लाइसिस सामग्री के क्षरण को रोकने के लिए, SSU और ITS2 PCRs एक ही समय में चलाए जाते हैं।
    2. ITS2 और SSU PCRs के लिए एक ही pcr_plate_number का उपयोग करें, भले ही ये अलग-अलग प्लेटों में अलग-अलग प्रतिक्रियाएं हों। उन्हें 'एसएसयू' या 'आईटीएस 2' लेबल के साथ प्रतिष्ठित किया जाएगा।
  2. आठ या उससे कम स्ट्रिप ट्यूबों के लिए एक pcr_plate_number असाइन करें (96-वेल पीसीआर प्लेट की प्रति पंक्ति एक स्ट्रिप ट्यूब, आरोही क्रम में व्यवस्थित, उदाहरण के लिए, शीर्ष पर सबसे कम स्ट्रिप ट्यूब नंबर)। फिर स्ट्रिप ट्यूबों में प्रत्येक एस-लेबल को एक pcr_plate_well असाइन करें।
    नोट:: पट्टी ट्यूबों को आरोही क्रम में व्यवस्थित किया जाता है, जिसमें पंक्ति A को असाइन की गई सबसे कम पट्टी ट्यूब संख्या और पंक्ति H में उच्चतम संख्या होती है। सभी स्ट्रिप ट्यूबों की स्थिति 1 को स्तंभ 1 को असाइन किया गया है। इसलिए, स्ट्रिप ट्यूब नंबर 1, स्थिति 1 को पीसीआर प्लेट नंबर 1, अच्छी तरह से ए 01 को सौंपा जाएगा।
  3. पीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूनों को समायोजित करने के लिए 96-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट (ओं) को लेबल करें। प्रत्येक पीसीआर प्लेट को निम्नलिखित जानकारी के साथ लेबल करें: प्रोजेक्ट नाम, पीसीआर प्रकार, पीसीआर प्लेट नंबर, और पीसीआर की तारीख (उदाहरण के लिए, 2020FebruaryAustralia_SSU_1_20200304)। इसके अलावा, पट्टी ट्यूब संख्या है कि प्रत्येक पंक्ति में लोड किया जाएगा के साथ प्लेट लेबल.
  4. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से लाइसिस सामग्री को हटा दें और बर्फ पर लाइसिस सामग्री वाली स्ट्रिप ट्यूबों को पिघलाएं। जबकि लाइसिस सामग्री पिघल रही है, बर्फ पर अलग-अलग ट्यूबों में ITS2 और SSU मास्टर मिश्रण तैयार करें। SSU और ITS2 PCR व्यंजनों पूरक तालिका 2 में पाए जाते हैं।
    नोट: पिपेटिंग त्रुटि के लिए अनुमति देने के लिए प्रत्येक 96-अच्छी तरह से प्लेट के लिए पीसीआर मास्टर मिश्रण की 100 प्रतिक्रियाओं को तैयार करें। मास्टर मिश्रण को पकड़ने के लिए 15 एमएल या 50 एमएल शंक्वाकार का उपयोग करें यदि बड़ी मात्रा का उपयोग किया जाना है।
  5. भंवर मास्टर मिश्रण धीरे से जब तक Taq मिश्रण भर में वितरित किया जाता है. एक बार मिश्रित होने के बाद, मास्टर मिश्रण के 38 μL को बर्फ पर पीसीआर प्लेटों के उपयुक्त कुओं में मिलाया जाता है। मास्टर मिश्रण को पीसीआर प्लेटों में स्थानांतरित करने के लिए बाँझ एकल-उपयोग वी-बॉटम गर्त और 12-अच्छी तरह से बहु-चैनल पिपेट का उपयोग करें।
  6. टोपी से लाइसिस सामग्री को हटाने के लिए पिघले हुए लाइसिस स्ट्रिप ट्यूबों को नीचे स्पिन करें। ध्यान से सभी पट्टी ट्यूबों है कि पहली पीसीआर प्लेट में लोड किया जाएगा के ढक्कन हटा दें. पीसीआर प्लेट में उचित कुएं में 2 μL lysate जोड़ने के लिए एक कम-वॉल्यूम मल्टी-चैनल पिपेट (या तो 12-अच्छी तरह से या 8-अच्छी तरह से) का उपयोग करें। धीरे से 2 μL को हटाने से पहले एक बार ऊपर और नीचे lysate पिपेट.
    नोट:: यह सुनिश्चित करने के लिए युक्तियों की जाँच करें कि वे स्थानांतरण से पहले lysis शामिल हैं। पंक्तियों या स्तंभों के बीच युक्तियों को परिवर्तित करना याद रखें.
  7. पीसीआर चिपकने वाली पन्नी के साथ पीसीआर प्लेट को कवर करें और एक तंग सील बनाने के लिए एक रोलर का उपयोग करें। पन्नी लागू होने के बाद, संक्षेप में एक सेंट्रीफ्यूज में पीसीआर प्लेटों को नीचे स्पिन करें। प्लेट को बर्फ पर रखें जब तक कि यह थर्मोसाइकिलर में चलाने के लिए तैयार न हो जाए।
  8. उपयुक्त thermocycler प्रोग्राम के साथ PCRs चलाएँ। SSU और ITS2 PCR प्रोग्राम्स के विवरण के लिए पूरक तालिका 2 देखें.
  9. चरण 8.4- 8.8 को दोहराएँ जब तक कि सभी PCRs चलाए जाते हैं।
  10. जबकि पीसीआर प्रतिक्रियाएं चल रही हैं, एक 100 मिलीलीटर 1.5% एगारोज़ जेल डालें। प्रत्येक जेल नमूने या एक एकल पीसीआर प्लेट रखेगा।
    1. एक 500 mL फ्लास्क के लिए agarose के 1.5 ग्राम जोड़ें, तो 1x TAE बफर (पूरक तालिका 3) के 100 mL जोड़ें और मिश्रण करने के लिए घुमाव। जेल को भंग करने और ठंडा करने के लिए माइक्रोवेव करें।
    2. एक बार जब समाधान ठंडा हो जाता है, तो 10 मिलीग्राम / एमएल एथिडियम ब्रोमाइड समाधान के 5 μL जोड़ें और गठबंधन करने के लिए मिश्रण करें। चार 25-अच्छी तरह से कंघी के साथ एक कास्टिंग ट्रे में समाधान डालें ताकि जेल जेल में प्रत्येक पंक्ति के लिए 96 नमूनों के साथ-साथ एक सीढ़ी को समायोजित कर सके।
      नोट: एथिडियम ब्रोमाइड एक शक्तिशाली म्यूटाजेन है। एथिडियम ब्रोमाइड को संभालते समय, एक प्रयोगशाला कोट, रासायनिक प्रतिरोधी दस्ताने और रासायनिक सुरक्षा चश्मे का उपयोग करें।
  11. पीसीआर समाप्त होने से ठीक पहले, डिस्पोजेबल गर्त में 6x लोडिंग डाई जोड़ें और एक नए 96-वेल पीसीआर प्लेट के प्रत्येक कुएं में 6x लोडिंग डाई के 2 μL जोड़ने के लिए एक मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करें। इस प्लेट का उपयोग जेल में नमूनों को लोड करने के लिए किया जाएगा। सभी नमूनों को समायोजित करने के लिए इन प्लेटों को पर्याप्त बनाएं।
  12. जब पीसीआर हो जाते हैं, तो पीसीआर प्लेटों को हटा दें और उन्हें आरटी पर 15 सेकंड के लिए 300 x g पर संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें। पीसीआर प्लेटों को बर्फ पर तब तक स्टोर करें जब तक कि पीसीआर उत्पादों को जेल पर बाहर नहीं किया जा सकता।
    1. एक जेल पर उत्पादों को चलाने के लिए, 6x लोडिंग डाई के 2 μL युक्त 96-अच्छी तरह से प्लेट के उपयुक्त कुएं में प्रत्येक नमूने के 5 μL जोड़ने के लिए एक 12-अच्छी तरह से बहु-चैनल पिपेट का उपयोग करें।
    2. फिर हाल ही में कास्ट जेल के प्रत्येक कुएं में इस मिश्रण के 6 μL लोड करें। जेल की प्रत्येक पंक्ति के पहले कुएं में 1 KB प्लस सीढ़ी के 6 μL लोड करें।
      नोट: जेल के कुओं को भरने के लिए, जेल की पहली पंक्ति में पीसीआर प्लेट से पंक्ति A और पंक्ति B को इंटरस्पर्स करना आवश्यक हो सकता है। भ्रम से बचने के लिए, प्रत्येक पीसीआर नमूने के लिए जीनोटाइपिंग शीट में gel_number और gel_position रिकॉर्ड करें।
  13. प्लेट (ओं) में शेष पीसीआर पर एक नया पन्नी ढक्कन रखें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इन प्रतिक्रिया उत्पादों का उपयोग चरण 9 में अनुक्रमण के लिए किया जाएगा।
  14. पीसीआर उत्पादों को जेल पर 20 मिनट के लिए 120 वी पर चलाएं। जेल और रिकॉर्ड जो एस लेबल 'pcr_product_its2' और 'prc_product_ssu' जीनोटाइपिंग शीट के कॉलम में ITS2 और / या SSU PCR उत्पादों उपज. एक '1' के साथ एक बैंड की उपस्थिति को चिह्नित करें; कोई बैंड के लिए एक '0' चिह्नित करें।

9. Sanger अनुक्रमण और अनुक्रम ब्लास्ट के साथ सूत्रकृमि की पहचान

नोट:: यह अनुभाग S-लेबल से ITS2 amplicons अनुक्रमण के लिए निर्देश प्रदान करता है, ब्लास्ट एल्गोरिथ्म का उपयोग कर जैव प्रौद्योगिकी सूचना के लिए राष्ट्रीय केंद्र (एनसीबीआई) डेटाबेस के लिए उन अनुक्रमों को संरेखित, और S-प्लेटों पर सूत्रकृमि की पहचान करने के लिए ब्लास्ट परिणाम पार्सिंग।

  1. ITS2-positive है जो प्रत्येक नमूने के लिए, आगे प्राइमर oECA306 (CACTTTCAAGCAACCCGAC) का उपयोग करके Sanger अनुक्रमण के लिए शेष ITS2 PCR उत्पाद का उपयोग करें। जीनोटाइपिंग शीट में प्रत्येक एस-लेबल के 'sequencing_plate' और 'sequencing_well' स्तंभों को रिकॉर्ड करके अनुक्रमण आउटपुट फ़ाइलों को आसानी से एस-लेबल से लिंक करने के लिए व्यवस्थित करें।
  2. अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म से प्रत्येक S-लेबल के लिए .seq आउटपुट फ़ाइलें प्राप्त करें. उपनिर्देशिकाओं में स्थित अनुक्रमण के प्रत्येक बैच के लिए .seq फ़ाइलों के साथ किसी एकल निर्देशिका में किसी प्रोजेक्ट के लिए .seq फ़ाइलों को व्यवस्थित करें.
  3. आदेश-पंक्ति इंटरफ़ेस उपकरण खोलें और आदेश दर्ज करके .seq फ़ाइलों वाली शीर्ष निर्देशिका पर नेविगेट करें: cd . यदि यह पहले से मौजूद नहीं है, तो निम्न आदेश दर्ज करके सभी .seq फ़ाइलों के लिए एक मर्ज किया गया FASTA बनाएँ: */; cd $dir में dir के लिए; *.seq में फ़ाइल के लिए; ">" $file को प्रतिध्वनित करें; बिल्ली $file; >> किया गया. /all_seqs.fa; cd ..; किया।
    नोट:: यह कोड प्रोजेक्ट निर्देशिका में सभी .seq फ़ाइलों से 'all_seqs.fa' नामक मर्ज की गई FASTA फ़ाइल बनाएगा। इस फ़ाइल का उपयोग एनसीबीआई के अनुक्रम डेटाबेस में प्रत्येक एस-लेबल के ITS2 अनुक्रम को तेजी से संरेखित करने के लिए NCBI ऑनलाइन न्यूक्लियोटाइड ब्लास्ट टूल में किया जा सकता है।
  4. एक वेब ब्राउज़र में, NBCI ब्लास्ट वेबसाइट 20 पर नेविगेट करें और फ़ाइल चुनें बटन पर क्लिक करें। all_seqs.fa फ़ाइल का चयन करें जो अभी बनाया गया था, फिर बटन पर क्लिक करें कुछ समान अनुक्रम (BLASTn). ब्लास्ट खोज शुरू करने के लिए पृष्ठ के नीचे ब्लास्ट बटन पर क्लिक करें।
  5. प्रत्येक S-लेबल के लिए ब्लास्ट परिणामों के साथ जीनोटाइपिंग पत्रक अद्यतन करें। जीनोटाइपिंग Google शीट को अपडेट करना आसान बनाने के लिए फ़िल्टर टूल का उपयोग करें। प्रत्येक स्तंभ शीर्ष लेख में फ़िल्टर बटन जोड़ने के लिए डेटा > Create a Filter पर क्लिक करें. ब्लास्ट परिणामों के साथ अद्यतन किया जा करने के लिए अनुक्रमण प्लेटों का चयन करने के लिए sequencing_plate स्तंभ फ़िल्टर करें।
  6. प्रत्येक S-प्लेट ITS2 अनुक्रम (चित्रा 6) के लिए परिणामों की जाँच करने के लिए NCBI ब्लास्ट परिणाम पृष्ठ पर ड्रॉप-डाउन मेनू का उपयोग करें।
  7. कोई विस्फोट हिट के लिए जाँच करें. ड्रॉप-डाउन में एक अनुक्रम आईडी * के साथ उपसर्ग किया गया है, जिसमें कोई विस्फोट हिट नहीं है। इन S-लेबल्स के लिए, जीनोटाइपिंग शीट के manual_blast_notes स्तंभ में 'नो हिट <वर्तमान दिनांक>' दर्ज करें.
  8. एक संभावित नई Caenorhabditis प्रजातियों के लिए जाँच करें। संरेखण (चित्रा 6) की कल्पना करने के लिए शीर्ष हिट पर लिंक पर क्लिक करें। यदि शीर्ष हिट (1) एक Caenorhabditis प्रजाति है, (2) संरेखण अनुक्रम के केंद्र में पांच से अधिक बेमेल शामिल हैं, और (3) क्वेरी कवरेज 50% से अधिक है, तो इस परिणाम से पता चलता है कि आइसोलेट एक नई Caenorhabditis प्रजाति (चित्रा 7) हो सकता है। इन एस-प्लेटों के प्रवेश के लिए, 'species_id' कॉलम में शीर्ष ब्लास्ट हिट की प्रजातियां, 'possible_new_caeno_sp कॉलम' में 1 दर्ज करें, और प्रतिशत पहचान के साथ 'manual_blast_notes' कॉलम में 'संभावित नए केनो एसपी', (उदाहरण के लिए, 'संभावित नए कैनो एसपी 89% पहचान')।
  9. एस-प्लेट अनुक्रमों के लिए जो एक Caenorhabditis प्रजातियों के लिए ब्लास्ट करते हैं, 'species_id' कॉलम में शीर्ष ब्लास्ट हिट के पूर्ण जीनस और प्रजातियों का नाम दर्ज करें। उदाहरण के लिए, 'Caenorhabditis elegans'।
  10. एस-प्लेट अनुक्रमों के लिए जो एक गैर-Caenorhabditis प्रजातियों के लिए ब्लास्ट करते हैं, 'species_id' कॉलम में 'sp.' के बाद शीर्ष ब्लास्ट हिट के केवल जीनस में प्रवेश करें। इस संकेतन का मतलब है कि पृथक नामित जीनस के भीतर एक अज्ञात प्रजाति है। उदाहरण के लिए, 'Oscheius sp.'।
    नोट: ITS2 अनुक्रम का उपयोग Caenorhabditis जीनस 3,13 के बाहर प्रजातियों-स्तर के लिए मज़बूती से अलग-अलग की पहचान करने के लिए नहीं किया जा सकता है।
  11. जीनोटाइपिंग शीट के 'make_strain_name कॉलम' में 1 दर्ज करें यदि 'species_id' = 'Caenorhabditis elegans', 'Caenorhabditis briggsae', या 'Caenorhabditis tropicalis', या 'possible_new_caeno_sp' = 1।
  12. Caenorhabditis नामकरण सम्मेलनों के बाद अद्वितीय नामों के साथ उपभेदों का नाम दें, यानी, एक अद्वितीय प्रयोगशाला पदनाम जिसमें 2-3 अपरकेस अक्षर होते हैं, जिसके बाद प्रत्येक अद्वितीय स्ट्रेन 23 के लिए एक संख्या होती है। 'strain_name' स्तंभ में स्ट्रेन नाम दर्ज करें.
  13. उपभेदों के नाम के बाद, उन्हें स्थापित प्रोटोकॉल 24 का उपयोग करके क्रायोप्रिजर्व किया जा सकता है।

10. आर में easyFulcrum पैकेज के साथ संग्रह डेटा प्रसंस्करण

नोट:: यह चरण वर्णन करता है कि संग्रह डेटा (C-लेबल) और सूत्रकृमि अलगाव डेटा (S-लेबल) को easyFulcrum R पैकेज का उपयोग कर एक साथ लिंक करने के लिए कैसे करें। सॉफ़्टवेयर में ऐसे फ़ंक्शन शामिल हैं जो जीनोटाइपिंग शीट से जीनोटाइपिंग डेटा के साथ फुलक्रम डेटा में शामिल होंगे ताकि एस-लेबल प्रजातियों की पहचान और तनाव नाम एक एकल डेटा फ्रेम में व्यवस्थित हों।

  1. संग्रह प्रोजेक्ट के लिए नामित एक नई निर्देशिका बनाएँ. R पैकेज easyFulcrum15 में वर्णित आवश्यकताओं से मेल खाने के लिए निर्देशिका के भीतर फ़ोल्डर संरचना को व्यवस्थित करें।
  2. Fulcrum वेबसाइट पर नेविगेट करें और साइन इन करें. Fulcrum डेटाबेस से कच्चे प्रोजेक्ट डेटा निर्यात बाईं ओर Fulcrum वेबसाइट के डेटा निर्यात उपकरण का उपयोग कर निर्यात करें और निम्न चेकबॉक्स का चयन करें: प्रोजेक्ट, फ़ोटो शामिल करें, जीपीएस डेटा, फ़ील्ड नमूनाकरण और अलगाव शामिल हैं।
    नोट:: प्रोजेक्ट के लिए Fulcrum डेटा पाँच अल्पविराम-अलग मान (.csv) फ़ाइलों के रूप में निर्यात किया जाएगा। पूरा परियोजना डेटा आर में easyFulcrum पैकेज का उपयोग कर एक एकल डेटा फ्रेम में एक साथ शामिल हो जाएगा।
  3. Fulcrum से निर्यात की गई पांच .csv फ़ाइलों को चरण 10.1 में बनाई गई परियोजना निर्देशिका में ले जाएँ जैसा कि easyFulcrum विगनेट 21 में निर्देश दिया गया है।
  4. एक Rstudio सत्र खोलें और आर कंसोल 'install.packages("devtools")' और 'devtools::: install_github("AndersenLab/easyfulcrum")' में निम्नलिखित आदेश दर्ज करके R में easyfulcrum पैकेज स्थापित करें।
  5. एक नई आर स्क्रिप्ट खोलें और संग्रह data21 को संसाधित करने के लिए easyfulrum विगनेट में निर्देशों का पालन करें।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग हवाई और कैलिफोर्निया सहित कई स्थानों से केनोरहाबिडिटिस नेमाटोड एकत्र करने के लिए किया गया है। Caenorhabditis सूत्रकृमि के लिए अलगाव सफलता दर संग्रह स्थान, जलवायु, नमूना अनुभव, और सब्सट्रेट प्रकार नमूना के साथ भिन्न होता है। प्रोटोकॉल का उपयोग हवाई द्वीप समूह के बड़े पैमाने पर नमूने के लिए किया गया है, जहां कई वर्षों और मौसमों में नौ संग्रह परियोजनाएं आयोजित की गई हैं। Caenorhabditis प्रजातियों selfing के लिए अलगाव सफलता दर C. briggsae (4,506 नमूनों में से 162, 3.6%) और C. elegans (4,506 नमूनों में से 163, 3.6%), और C. tropicalis (4,506 नमूनों में से 26, 0.58%) के लिए बहुत कम है। selfing प्रजातियों में से प्रत्येक अन्य सब्सट्रेट श्रेणियों के सापेक्ष सड़ फल और फूल substrates पर समृद्ध है। नमूना सड़ने वाले फल और फूलों के सब्सट्रेट यदि शोधकर्ता सब्सट्रेट वरीयताओं को चिह्नित करने के बजाय सफलता दर को अधिकतम करने का प्रयास कर रहा है। हालांकि, सफलता की दर चयनित सब्सट्रेट की गुणवत्ता के साथ भिन्न होती है। उदाहरण के लिए, फल और फूलों के सब्सट्रेट के बीच, वे सब्सट्रेट जो बहुत सूखे, गीले या ताजा होते हैं, संभवतः केनोरहाबिडिटिस नेमाटोड उत्पन्न नहीं करेंगे।

इस संग्रह प्रोटोकॉल की स्केलेबिलिटी संग्रह की संख्या से स्पष्ट है जो शोधकर्ताओं की एक जोड़ी जंगली से एकत्र कर सकती है। उदाहरण के लिए, 2018 के अक्टूबर में, इस संग्रह प्रोटोकॉल का उपयोग करने वाले शोधकर्ताओं की एक जोड़ी दो हवाई द्वीपों पर कई स्थानों से 7 दिनों में कुल 1,000 से अधिक नमूने एकत्र करने में सक्षम थी। इस फील्ड टीम ने नमूनों को रात भर प्रयोगशाला में भेज दिया, जहां आठ शोधकर्ताओं की एक टीम ने नमूनों से 2,000 से अधिक नेमाटोड को अलग कर दिया क्योंकि वे पहुंचे थे। इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह क्षेत्र में आवश्यक उपकरणों और कर्मियों को कम करके दूरस्थ स्थानों में नमूने से जुड़ी लागत को कम करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, एक छोटी सी फील्ड टीम नमूनाकरण पर ध्यान केंद्रित कर सकती है, जबकि अलगाव टीम नेमाटोड को अलग करने के लिए माइक्रोस्कोप और आगर प्लेटों को विच्छेदित करने जैसे नाजुक और भारी उपकरणों का उपयोग करके अपने घर संस्थान में नमूनों को संसाधित कर सकती है। इसके अलावा, मोबाइल डेटा-संग्रह एप्लिकेशन का कार्यान्वयन नमूनों से जुड़े सभी फ़ील्ड डेटा को सीधे सी-लेबल से लिंक करने की अनुमति देता है, जो अलगाव टीम को नमूनों को संसाधित करते समय फील्ड टीम से स्वतंत्र रूप से काम करने में सक्षम बनाता है।

इस संग्रह प्रोटोकॉल का उपयोग करने वाले शोधकर्ताओं को उस प्रयास पर विचार करना चाहिए जो संग्रह परियोजना से पहले नेमाटोड को अलग करने के लिए आवश्यक है। अलगाव और पहचान के चरण दर-सीमित हैं, और एक छोटी संग्रह टीम नमूनों के साथ आइसोलेटर्स को जल्दी से अभिभूत कर सकती है। इसके अलावा, कई संग्रहों को संसाधित करने के लिए आवश्यक प्रयोगशाला स्थान चल रहे अनुसंधान (चित्रा 3) में हस्तक्षेप कर सकता है। इसके अतिरिक्त, कुछ अलग-थलग नेमाटोड को जीनोटाइप के लिए अतिरिक्त प्रयास की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, लगभग 2% आइसोलेट्स पहले लाइसिस प्रयास के बाद एसएसयू पीसीआर प्राइमर सेट के साथ बढ़ाने में विफल रहते हैं और यह सुनिश्चित करने के लिए फिर से झूठ बोला जाना चाहिए कि लाइसिस सामग्री आईटीएस 2 प्राइमर सेट (चित्रा 8) के साथ प्रवर्धन के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, लगभग 3% आइसोलेट्स सेंगर अनुक्रमण के प्रारंभिक दौर के बाद गुणवत्ता अनुक्रमों का उत्पादन करने में विफल रहते हैं। इन आइसोलेट्स के लिए, लाइसिस, आईटीएस 2 पीसीआर और सेंगर अनुक्रमण का एक और दौर अक्सर आवश्यक होता है, जो अलगाव टीम के लिए सौंपने का समय बढ़ा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, अकेले अनुक्रम पहचान एक नई केनोरहाबडिटिस प्रजातियों को सही ठहराने के लिए पर्याप्त सबूत नहीं है (चित्रा 7)। एक नए Caenorhabditis प्रजातियों के रूप में एक अलग उठाने को ठीक से सही ठहराने के लिए, संभोग प्रयोगों को करने और एक टाइप किए गए नमूने को स्थापित करने के लिए अतिरिक्त प्रयास किया जाना चाहिए। टाइप किए गए नमूने का एक औपचारिक रूपात्मक विवरण भी पसंद किया जाता है लेकिन आवश्यक नहीं है3। साथ में, इन विचारों से पता चलता है कि इस संग्रह प्रोटोकॉल को अपनाने वाले शोधकर्ताओं को अलगाव और पहचान चरणों के परीक्षण परीक्षणों से लाभ होगा ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि संग्रह परियोजना शुरू होने से पहले संसाधनों को ठीक से आवंटित किया जाता है। महत्वपूर्ण रूप से, यहां तक कि छोटी संग्रह परियोजनाएं भी इस प्रोटोकॉल से लाभान्वित हो सकती हैं क्योंकि प्रक्रिया अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य है, और प्रयोगशाला समूहों में गुणवत्ता नियंत्रण उद्देश्यों के लिए डेटा को आसानी से ऑडिट किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: सब्सट्रेट उदाहरण( A) एक आदर्श सड़ने वाला फल छवि (1) के केंद्र में दिखाया गया है, फल लगभग पहचानने योग्य नहीं है। कम सड़े हुए फल को पास में दिखाया गया है; ताजा गिरे फलों के नमूने से बचें (2). (बी) एक आदर्श रूप से विघटित फूल शीर्ष पर दिखाया गया है (3). ताजा गिरे हुए फूलों के नमूने से बचें (4). (सी) सूखी पत्तियों की ऊपरी परत के नीचे अंधेरे पत्ती कूड़े आदर्श है जब केनोरहाबिडिटिस नेमाटोड (5) को स्व-करने के लिए नमूना लिया जाता है। सूखी पत्ती कूड़े का नमूना लेने से बचें (6). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: नेमाटोड फ़ील्ड सैंपलिंग मोबाइल एप्लिकेशन। (A) फुलक्रम में ऐप्पल डिवाइस पर नेमाटोड फ़ील्ड सैंपलिंग एप्लिकेशन खोलने के बाद प्रारंभिक स्क्रीन। निचले दाएं में लाल तीर एक नया संग्रह रिकॉर्ड बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले + बटन को इंगित करता है। (बी) एक ऐप्पल डिवाइस पर दिखाए गए नए संग्रह रिकॉर्ड का एक उदाहरण। लाल तीर संग्रह रिकॉर्ड स्क्रीन के शीर्ष पर 'प्रोजेक्ट' फ़ील्ड को इंगित करता है। फ़ील्ड में नमूना लेते समय सही प्रोजेक्ट का चयन करना सुनिश्चित करें। प्रोजेक्ट फ़ील्ड बाद के संग्रह रिकॉर्ड बनाते समय उपयोग किए गए अंतिम प्रोजेक्ट के लिए डिफ़ॉल्ट हो जाएगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: संग्रह बैग और संग्रह प्लेटों को नमूने चढ़ाना से पहले आयोजित किया जाता है। यह आंकड़ा बाईं ओर सी-लेबल संग्रह बैग में नमूनों को दिखाता है। प्रत्येक संग्रह बैग में इसके शीर्ष पर एक मिलान सी-लेबल 10 सेमी प्लेट होती है। दाईं ओर 10 सेमी संग्रह प्लेटें हैं जिनमें संग्रह बैग से स्थानांतरित होने के बाद नमूना सामग्री होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एक संग्रह प्लेट (सी-प्लेट) ठीक से एक स्थानांतरित नमूने के साथ। जीवाणु लॉन के किनारे पर रखे गए विघटित फल के साथ एक 10 सेमी सी-प्लेट। सी-लेबल प्लेट ढक्कन से जुड़ा हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र5: नेमाटोड अलगाव मोबाइल अनुप्रयोग. (A) Fulcrum मोबाइल अनुप्रयोग में अनुप्रयोग चयन स्क्रीन. लाल तीर सूत्रकृमि अलगाव आवेदन करने के लिए इंगित करता है। (बी) फुलक्रम में एक ऐप्पल डिवाइस पर नेमाटोड आइसोलेशन एप्लिकेशन खोलने के बाद प्रारंभिक स्क्रीन। निचले दाएं में लाल तीर एक नया अलगाव रिकॉर्ड बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले + बटन को इंगित करता है। (C) एक ऐप्पल डिवाइस पर दिखाए गए एक नए अलगाव रिकॉर्ड का एक उदाहरण। लाल तीर अलगाव रिकॉर्ड स्क्रीन के शीर्ष पर 'प्रोजेक्ट' फ़ील्ड को इंगित करता है। अलग-थलग करते समय सही प्रोजेक्ट का चयन करना सुनिश्चित करें। प्रोजेक्ट फ़ील्ड बाद के अलगाव रिकॉर्ड बनाते समय उपयोग किए गए अंतिम प्रोजेक्ट के लिए डिफ़ॉल्ट हो जाएगा। (डी) सी-लेबल के तहत चयन करें फ़ील्ड को टैप करने के बाद, उपयोगकर्ता सी-लेबल खोजने के लिए खोज बटन (लाल तीर) पर टैप करेंगे जिससे वे नेमाटोड को अलग कर रहे हैं। (ई) सी-लेबल का चयन करने के बाद, उपयोगकर्ता डिवाइस कैमरे का उपयोग करके सी-प्लेट की तस्वीर लेंगे। (एफ) उपयोगकर्ता तब इनपुट करते हैं कि सी-प्लेट पर नेमाटोड हैं या नहीं। एस-लेबल को अलगाव रिकॉर्ड में जोड़ा जाता है यदि अलग-थलग होने के लिए नेमाटोड होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: NCBI BLAST परिणाम पृष्ठ. (1) ड्रॉप-डाउन मेनू सभी अनुक्रमों के लिए BLAST परिणाम देखने के लिए उपयोग किया जाता है। (2) ड्रॉप-डाउन से चयनित वर्तमान अनुक्रम का विवरण। इस स्थिति में S-लेबल S-05554 के लिए परिणाम दिखाए जाते हैं। (3) S-05554 के लिए शीर्ष ब्लास्ट हिट दिखाया गया है। बैंगनी पाठ इंगित करता है कि इस संरेखण को विज़ुअलाइज़ करने के लिए लिंक क्लिक किया गया है. कृपया संभावित नए Caenorhabditis प्रजातियों की पहचान करने के लिए आंखों से संरेखण का निरीक्षण करना सुनिश्चित करें, ऊपर चरण 9.8 देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र7: NCBI BLAST संरेखण विज़ुअलाइज़ेशन उदाहरण. (A) एक अलग के ITS2 क्वेरी अनुक्रम का एक उदाहरण जो C. kamaina विषय अनुक्रम के लिए संरेखित होता है. (1) संरेखण की प्रतिशत पहचान (89%), जो एक शीर्ष ब्लास्ट हिट के लिए कम है। (2) क्वेरी और विषय अनुक्रम (जी से ए) के बीच एक बेमेल। (3) संरेखण एल्गोरिथ्म द्वारा किए गए विषय अनुक्रम में एक चार आधार जोड़ी अंतर; क्वेरी या विषय में अंतराल खराब संरेखण को इंगित करते हैं। (4) संरेखण के केंद्र में एक सामान्यीकृत क्षेत्र जिसमें कई बेमेल और अंतराल होते हैं। इस तरह के एक क्षेत्र से पता चलता है कि क्वेरी अनुक्रम एक नई Caenorhabditis प्रजातियों से आ सकता है। दिखाया गया है कि एक नई प्रजाति, सी. ओइवी का एक वास्तविक संरेखण उदाहरण है, जिसे 2017 में खोजा गया था। (बी) एक अलग के ITS2 क्वेरी अनुक्रम और एक विषय अनुक्रम के बीच एक अच्छे संरेखण का एक उदाहरण। (5) संरेखण की प्रतिशत पहचान (99%), जिसका आमतौर पर अर्थ है कि क्वेरी अनुक्रम विषय के रूप में एक ही प्रजाति के अलगाव से आता है। (6) पूर्ण पहचान के साथ संरेखण का एक केंद्रीय क्षेत्र। इस तरह के एक क्षेत्र से पता चलता है कि क्वेरी आइसोलेट संभवतः विषय के समान प्रजाति है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: SSU और ITS2 PCR उत्पादों. शीर्ष जेल 12 प्रतिनिधि नमूनों के लिए एसएसयू प्राइमर सेट के साथ उत्पन्न पीसीआर उत्पादों को दिखाता है। एक डीएनए सीढ़ी को एक संदर्भ के रूप में बाईं ओर शामिल किया गया है। केनोरहाबिडिटिस नेमाटोड के लिए एसएसयू पीसीआर उत्पाद लंबाई में लगभग 500 बीपी हैं। नमूने 2-12 SSU प्राइमर सेट के साथ प्रवर्धित लेकिन नमूना एक नहीं किया. नमूना एक के लिए एक 500 बीपी SSU amplicon की अनुपस्थिति से पता चलता है कि lysis सामग्री खराब गुणवत्ता की थी और नमूना फिर से lysed किया जाना चाहिए. नीचे जेल शीर्ष जेल में दिखाए गए एक ही 12 नमूनों के लिए ITS2 प्राइमर सेट के साथ उत्पन्न पीसीआर उत्पादों को दिखाता है। सीढ़ी और नमूने दोनों जैल के लिए एक ही अभिविन्यास में हैं। 12 नमूनों में से छह ने ITS2 प्राइमर सेट के साथ विस्तारित नहीं किया। SSU और ITS2 बैंड के साथ नमूने Sanger अनुक्रमित कर रहे हैं और एनसीबीआई ब्लास्ट एल्गोरिथ्म का उपयोग कर अनुक्रम समानता द्वारा पहचाना. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: सी लेबल. एक PDF फ़ाइल जिसमें 2500 अद्वितीय C-लेबल होते हैं. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 2: एस लेबल. एक PDF फ़ाइल जिसमें 5000 अद्वितीय S-लेबल होते हैं. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक तालिका 1: क्षेत्र सामग्री. नेमाटोड के नमूने के लिए क्षेत्र में उपयोग की जाने वाली सामग्रियों की एक पैकिंग सूची। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 2: पीसीआर व्यंजनों और thermocycler शर्तों. ITS2 और SSU PCRs के लिए PCR व्यंजनों और thermocycler शर्तों की एक तालिका। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक तालिका 3: वैद्युतकणसंचलन बफर व्यंजनों. 0.5 M pH 8.0 Ethylenediaminetetraacetic एसिड समाधान (EDTA) और TRIS-एसीटेट-EDTA (TAE) बफर समाधान के लिए एक नुस्खा। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरण हैं जिन्हें सावधानी के साथ निष्पादित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि क्षेत्र और अलगाव टीमें क्षेत्र से नमूने एकत्र करने या प्रयोगशाला में नमूनों से नेमाटोड को अलग करने से पहले आवेदन में सही संग्रह परियोजना का चयन करने के लिए सावधान हैं। यदि गलत संग्रह प्रोजेक्ट चयनित है, तो गलत डेटा रिकॉर्ड ऑनलाइन रिकॉर्ड संपादन उपकरण का उपयोग कर Fulcrum डेटाबेस में सबसे अच्छा सही हैं। यह प्रक्रिया कई गलत रिकॉर्ड के लिए थकाऊ हो सकती है। हालाँकि, डेटाबेस रिकॉर्ड में किसी भी परिवर्तन को बनाए रखता है ताकि संग्रह और अलगाव रिकॉर्ड की पूरी ऑडिटिंग संभव हो सके। इस प्रोटोकॉल में अन्य महत्वपूर्ण चरणों में क्षेत्र से नमूनों को संभालना और उन नमूनों से अलग किए गए नेमाटोड शामिल हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि Caenorhabditis नेमाटोड नमूनाकरण और शिपमेंट चरणों से बच जाते हैं, नमूनों के तापमान को 4 डिग्री सेल्सियस और 25 डिग्री सेल्सियस के बीच बनाए रखा जाना चाहिए। 25 डिग्री सेल्सियस से ऊपर का तापमान C. elegans14 में बाँझपन का कारण बन सकता है। सुनिश्चित करें कि नेमाटोड को नुकसान को कम करने के लिए जब भी संभव हो, नमूनों को संग्रह बैग से संग्रह प्लेटों में स्थानांतरित कर दिया जाता है। नेमाटोड को अलग-थलग करने के बाद, यह महत्वपूर्ण है कि वे नष्ट होने से पहले जीनोटाइप और क्रायोप्रिजर्व किए जाते हैं। एस-प्लेटों पर जीवित नेमाटोड ढूंढना मुश्किल है जो दो से तीन सप्ताह से अधिक पुराने हैं क्योंकि कवक और जीवाणु संदूषण एस-प्लेटों को असुविधाजनक बना सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार के डेटा को समायोजित करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है जो शोधकर्ता क्षेत्र में रहते हुए एकत्र करना चाहते हैं। उदाहरण के लिए, एप्लिकेशन संपादन के लिए फुलक्रम के ऑनलाइन जीयूआई का उपयोग करके नए डेटा प्रविष्टि फ़ील्ड के साथ 'नेमाटोड फ़ील्ड सैंपलिंग' एप्लिकेशन को अनुकूलित करना आसान है। इसके अलावा, डेटा विश्लेषण पैकेज, easyFulcrum, नए data15 को संसाधित करते समय इन संपादनों को समायोजित कर सकता है। एक अन्य संशोधन उपयोगकर्ताओं को आकर्षक लग सकता है क्षेत्र में एक अलग नमूना विधि का उपयोग करना है। असतत सब्सट्रेट का नमूना लेने के बजाय, शोधकर्ता कई सब्सट्रेट प्रकारों वाले बड़े क्षेत्रों का नमूना लेने की इच्छा कर सकते हैं। इन बड़े नमूनों को Baermann फ़नल या ट्रे निष्कर्षण विधियों का उपयोग करके प्रयोगशाला में सबसे अच्छा संसाधित किया जाता है13। महत्वपूर्ण रूप से, सी-लेबल और एस-लेबल का उपयोग अभी भी इन तकनीकों के लिए लागू होता है और इसलिए मोबाइल अनुप्रयोगों के साथ संगत है।

इस प्रोटोकॉल की प्राथमिक सीमाएं प्रयोगशाला में अलगाव से पहले नेमाटोड के हैंडलिंग समय से संबंधित हैं। सबसे पहले, नमूना संग्रह और नेमाटोड अलगाव के बीच अंतराल का समय संग्रह के समय किसी दिए गए नमूने पर नेमाटोड के विकास के चरणों को रिकॉर्ड करना असंभव बनाता है। दूसरा, पुरुषों की आवृत्ति और प्रकृति में आउटक्रॉसिंग कैनोरहाब्डिटिस नेमाटोड 10 को स्व-करने के लिए महत्वपूर्ण विकासवादी प्रश्न हैं। यह विधि इन सवालों को संबोधित करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है क्योंकि नेमाटोड अलगाव से पहले कई पीढ़ियों से गुजरने की संभावना है। विलंबित अलगाव का मतलब है कि प्रकृति में पुरुष आवृत्ति का प्रत्यक्ष प्रमाण असंभव है। इसके अलावा, जीनोटाइपिंग चरणों के दौरान बहु-पीढ़ी की देरी का मतलब है कि एक सूत्रकृमि तनाव को अनुक्रमित करने से पहले आउटक्रॉसिंग (हेटरोजाइगोसिटी) के जीनोमिक सबूत ों को नष्ट कर दिया जाएगा। प्रकृति में विषमता की पहचान करने के लिए, प्रकृति से सीधे अलग एक सूत्रकृमि द्वारा उत्पादित संतानों का उपयोग अनुक्रमण 2 के लिए किया जाता है। इस प्रोटोकॉल की एक और संभावित सीमा यह है कि यह सेल्फिंग कैनोरहाबिडिटिस की पहचान की ओर पक्षपाती है। ऐसा इसलिए है क्योंकि स्व-प्रजातियों के अलग-अलग नेमाटोड में बाध्य आउटक्रॉसर्स की तुलना में फैलने का अधिक मौका होता है, जो केवल तभी फैलता है जब एक निषेचित मादा को अलग किया जाता है।

यह संग्रह विधि मौजूदा संग्रह प्रोटोकॉल13,14 पर आधारित है। इस तकनीक की प्रमुख प्रगति बड़े पैमाने पर संग्रह परियोजनाओं से जुड़े पारिस्थितिक और आणविक डेटा की विशाल मात्रा के संगठन की सुविधा के लिए मोबाइल प्रौद्योगिकी और अनुकूलित सॉफ़्टवेयर का उपयोग है। इस संग्रह प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न पारिस्थितिक डेटा का उपयोग केनोरहाबिडिटिस प्रजातियों की प्राकृतिक आबादी के लिए बकाया प्रश्नों को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इस विधि के साथ उत्पन्न डेटा का उपयोग हवाई द्वीप समूह में प्रजातियों के लिए आला वरीयताओं की खोज करने के लिए किया गया है। इसके अलावा, क्रायोप्रिजर्व्ड नेमाटोड के जीनोम को अनुक्रमित करके, शोधकर्ता जांच कर सकते हैं कि आनुवंशिक भिन्नता के पैटर्न पारिस्थितिक डेटा के साथ कैसे सहसंबद्ध हैं। इस तरह के अनुसंधान Caenorhabditis आबादी में स्थानीय अनुकूलन के हस्ताक्षर को उजागर कर सकते हैं और प्राकृतिक संदर्भों में आनुवंशिक भिन्नता की प्रासंगिकता में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं8। Caenorhabditis नेमाटोड में कई जीनों की एक कार्यात्मक समझ हासिल करने के लिए, पारिस्थितिक अध्ययन की संभावना है11 की आवश्यकता है। यहां तक कि सी एलिगन्स के लिए जीन के एक बड़े हिस्से में कार्यात्मक एनोटेशन का अभाव है, इसके बावजूद यह अनुक्रमित होने वाला पहला बहुकोशिकीय जानवर है और पृथ्वी पर सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किए गए जानवरों में से एक है। इस संग्रह प्रोटोकॉल को जंगली केनोरहाबडिटिस नेमाटोड के संग्रह और उनकी पारिस्थितिकी और प्राकृतिक आनुवंशिक विविधता के अध्ययन की सुविधा प्रदान करके इस ज्ञान अंतर को संबोधित करने में मदद करने के लिए विकसित किया गया था।

Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की कोई रिपोर्ट नहीं की है।

Acknowledgments

इस शोध को नॉर्थवेस्टर्न यूनिवर्सिटी से स्टार्ट-अप फंड और एक नेशनल साइंस फाउंडेशन करियर अवार्ड (आईओएस -1751035) द्वारा समर्थित किया गया था, दोनों ई.C ए को दिए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive labels Avery 61533 Printing the C-labels and S-labels
Agarose Thomas Scientific C748D75 agarose gel preparation
Backpack A backpack for each team member to hold equipment, samples, food, and water for the day.
Cardboard boxes Fisher Scientific AS261 Storage of S-plates
Centrifuge NA NA Neamtode lysis, SSU and ITS2 PCR
Collection bags Zip-lock NA Collection of substrates
Digital temperature/humidity meter Preciva HT-86 Measurement of ambient temperature and humidity
Disecting scope NA NA Nematode isolation, lysis
Disposible reservoirs USA Scientific 1306-1010 Aliquoting PCR master mixes and loading dye
DNA ladder, 1 KB plus Thermo Scientific SM0243 Visualizing SSU and ITS2 PCR products
dNTPs Thomas Scientific CB4430-2 PCR master mix component
easyFulcrum R package NA NA An R package for processing collection data http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html
EDTA solution (0.5 M pH 8.0) NA NA See supplemental table 3 for recipe
Ethanol (95%) NA NA Plating out samples, spoon sterilization
Ethidium bromide solution (10 mg/mL) VWR 97064-602 Visualizing SSU and ITS2 PCR products
External battery charger for mobile device NA NA External battery charger and charging cable for iPhone or Android
Flask (500 mL) Fisher Scientific FB501500 agarose gel preparation
Food NA NA Pack accordingly
Gel electrophoresis apparatus Thermo Scientific B2 Visualizing SSU and ITS2 PCR products
Gel electrophoresis power supply BioRad 1645050 Visualizing SSU and ITS2 PCR products
Gel loading dye, 6x NEB B7022S Visualizing SSU and ITS2 PCR products
ITS2 primer set NA NA oECA1687 = forward primer CTGCGTTACTTACCACGAATTG
CARAC, oECA202 = reverse primer GCGGTATTTGCTACTACCAYYAM
GATCTGC
ITS2 sequencing primer NA NA oECA306 = forward primer CACTTTCAAGCAACCCGAC
Lysis buffer NA NA Nematode lysis, see protocol for recipe
Microwave NA NA agarose gel preparation
Mobile device NA NA Charged phone in airplane mode. The Fulcrum app GPS positions are inaccurate compared to the GPS positions extracted from pictures. This setting ensures that you use less power and get more precise GPS measurements.
NGMA plates, 10 cm Fisher Scientific FB0875713 C-plates, see Andersen et al. 2014 for NGMA plate protocol.
NGMA plates, 3.5 cm Greiner Bio-One 5662-7102Q S-plates, see Andersen et al. 2014 for NGMA plate protocol.
Non-contact infrared thermometer Etekcity B00837ZGRY Measurement of substrate temperature
Paper towels NA NA Paper towels for absorbing excess moisture in a bagged sample.
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12 Plate sealing
PCR adhesive foil VWR 60941-126 PCR adhesive foil
PCR buffer (10x) Thomas Scientific CB3702-7 PCR master mix component
PCR plates (96-well) Thomas Scientific 1149K04 SSU and ITS2 PCRs
Pencil NA NA
Plastic spoons NA NA Plating out samples
Platinum pick NA NA Nematode isolation, lysis
Pre-labeled ziplock collection bags NA NA Bundles of zip-lock plastic bags pre-labelled with C-label barcodes. Each bundle should contain 25 barcoded bags wrapped with a rubber band.
Proteinase K Sigma 3115879001 Nematode lysis, added to lysis buffer just prior to use
R software NA NA R software: A language and environment for statistical computing https://www.R-project.org/
Soft cooler bag and ice pack NA NA Collection coolers and cooler packs to keep samples cool when ambient temperature is above 25 °C.
Spare batteries NA NA Extra batteries for sampling equipment
SSU primer set NA NA oECA1271 = forward primer TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = reverse primer CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA
Strip tube caps (12-well) Thomas Scientific 1159V29 Nematode lysis
Strip tubes (12-well) Thomas Scientific 1159V31 Nematode lysis
TAE buffer (1x) NA NA Visualizing SSU and ITS2 PCR products. See supplemental table 3 for recipe
Taq polymerase Thomas Scientific C775Y45 PCR master mix component
Thermocycler NA NA Neamtode lysis, SSU and ITS2 PCR
Water NA NA Pack accordingly

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References

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जीव विज्ञान अंक 181
सेल्फिंग <em>कैनोरहाब्डिटिस</em> नेमाटोड्स के पारिस्थितिक सर्वेक्षण करने के लिए एक अत्यधिक स्केलेबल दृष्टिकोण
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Crombie, T. A., Tanny, R. E.,… More

Crombie, T. A., Tanny, R. E., Buchanan, C. M., Roberto, N. M., Andersen, E. C. A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes. J. Vis. Exp. (181), e63486, doi:10.3791/63486 (2022).

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