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Medicine

तिब्बती मिनीपिग्स में संरक्षित इजेक्शन अंश के साथ दिल की विफलता का एक सर्जिकल मॉडल

Published: February 18, 2022 doi: 10.3791/63526
Automatic Translation
*1,2, *1,3, *1, *1, 2, 1, 1, 1, 1
1Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, 2Department of Cardiovascular Surgery, the First Affiliated Hospital, Jinan University, 3College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल अवरोही महाधमनी कसना का उपयोग कर संरक्षित इजेक्शन अंश के साथ दिल की विफलता का एक मिनीपिग मॉडल स्थापित करने के लिए एक कदम-दर-चरण प्रक्रिया का वर्णन करता है। कार्डियक आकृति विज्ञान, ऊतक विज्ञान और इस रोग मॉडल के कार्य के मूल्यांकन के तरीके भी प्रस्तुत किए गए हैं।

Abstract

दुनिया भर में आधे से अधिक हार्ट फेल्योर (एचएफ) के मामलों को प्रिज्रव्ड इजेक्शन फ्रैक्शन (एचएफपीईएफ) के साथ हार्ट फेल्योर के रूप में वर्गीकृत किया गया है। एचएफपीईएफ के मूलभूत तंत्र की जांच करने और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए बड़े पशु मॉडल सीमित हैं। यह काम एचएफपीईएफ के एक बड़े पशु मॉडल को स्थापित करने के लिए तिब्बती मिनीपिग में अवरोही महाधमनी कसना (डीएसी) की शल्य चिकित्सा प्रक्रिया का विस्तृत विवरण प्रदान करता है। इस मॉडल ने बाएं वेंट्रिकल में पुराने दबाव अधिभार को प्रेरित करने के लिए अवरोही महाधमनी के एक सटीक नियंत्रित कसना का उपयोग किया। इकोकार्डियोग्राफी का उपयोग हृदय में रूपात्मक और कार्यात्मक परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। डीएसी तनाव के 12 सप्ताह बाद, वेंट्रिकुलर सेप्टम हाइपरट्रॉफिक था, लेकिन बाएं वेंट्रिकल के फैलाव के साथ पीछे की दीवार की मोटाई काफी कम हो गई थी। हालांकि, मॉडल दिलों के एलवी इजेक्शन अंश को 12 सप्ताह की अवधि के दौरान >50% पर बनाए रखा गया था। इसके अलावा, डीएसी मॉडल ने हृदय संबंधी क्षति प्रदर्शित की, जिसमें फाइब्रोसिस, सूजन और कार्डियोमायोसाइट हाइपरट्रॉफी शामिल हैं। डीएसी समूह में दिल की विफलता मार्कर का स्तर काफी ऊंचा हो गया था। मिनीपिग्स में यह डीएसी-प्रेरित एचएफपीईएफ इस बीमारी के आणविक तंत्र की जांच और प्रीक्लिनिकल परीक्षण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

Introduction

संरक्षित इजेक्शन अंश (एचएफपीईएफ) के साथ दिल की विफलता दिल की विफलता के आधे से अधिक मामलों के लिए जिम्मेदार है और दुनिया भर में सार्वजनिकस्वास्थ्य मुद्दा बन गया है। नैदानिक टिप्पणियों ने एचएफपीईएफ की कई महत्वपूर्ण विशेषताओं का संकेत दिया है: (1) वेंट्रिकुलर डायस्टोलिक डिसफंक्शन, सिस्टोलिक कठोरता में वृद्धि के साथ, (2) बिगड़ा हुआ व्यायाम प्रदर्शन के साथ आराम पर सामान्य इजेक्शन अंश, और (3) कार्डियक रीमॉडेलिंग2। प्रस्तावित तंत्र हार्मोनल dysregulation, प्रणालीगत microvascular सूजन, चयापचय संबंधी विकार, और sarcomeric और बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन में असामान्यताएं शामिल हैं3. हालांकि, प्रयोगात्मक अध्ययनों से पता चला है कि कम इजेक्शन अंश (एचएफआरईएफ) के साथ दिल की विफलता इन परिवर्तनों का कारण बनती है। नैदानिक अध्ययनों ने एचएफपीईएफ 4,5 में एचएफआरईएफ के इलाज के लिए एंजियोटेंसिन रिसेप्टर इनहिबिटर और दवाओं के चिकित्सीय प्रभावों का पता लगाया है। हालांकि, HFpeF के लिए अद्वितीय चिकित्सीय दृष्टिकोण की आवश्यकता है। नैदानिक लक्षणों को समझने की तुलना में, एचएफपीईएफ के पैथोलॉजी, जैव रसायन और आणविक जीव विज्ञान में परिवर्तन खराब परिभाषित रहते हैं।

HFpEF के पशु मॉडल तंत्र, नैदानिक मार्करों और चिकित्सीय दृष्टिकोणों का पता लगाने के लिए विकसित किए गए हैं। सूअरों, कुत्तों, चूहों और चूहों सहित प्रयोगशाला जानवरों, HFpeF विकसित कर सकते हैं, और उच्च रक्तचाप, मधुमेह मेलेटस, और उम्र बढ़ने सहित विभिन्न जोखिम कारकों, प्रेरण कारक 6,7 के रूप में चुना गया. उदाहरण के लिए, अकेले डीऑक्सीकोर्टिकोस्टेरोन एसीटेट या उच्च वसा/चीनी आहार के साथ संयुक्त सूअरों में एचएफपीईएफ को प्रेरित करता है 8,9. वेंट्रिकुलर दबाव अधिभार एक और तकनीक है जिसका उपयोग बड़े और छोटे पशु मॉडल10 में एचएफपीईएफ विकसित करने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, एचएफपीईएफ को परिभाषित करने के लिए विशिष्ट ईएफ कट-ऑफ मूल्यों को हाल के वर्षों में महाद्वीपों में अपनाया गया है, जैसा कि यूरोपियन सोसाइटी ऑफ कार्डियोलॉजी दिशानिर्देशों में देखा गया है, अमेरिकन कॉलेज ऑफ कार्डियोलॉजी फाउंडेशन/अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन11, जापानी सर्कुलेशन सोसाइटी/जापानी हार्ट फेल्योर सोसाइटी12. इस प्रकार, कई पहले से स्थापित मॉडल एचएफपीईएफ अध्ययन के लिए उपयुक्त हो सकते हैं यदि नैदानिक मानदंड अपनाए जाते हैं। उदाहरण के लिए, Youselfi et al. ने दावा किया कि आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस स्ट्रेन, Col4a3-/-, एक प्रभावी HFpEF मॉडल था। इस तनाव ने विशिष्ट एचएफपीईएफ हृदय संबंधी लक्षण विकसित किए, जैसे डायस्टोलिक डिसफंक्शन, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन और कार्डियक रीमॉडेलिंग13. पिछले अध्ययन में वृद्ध बंदरों14 में ईएफ की मध्य-सीमा के साथ कार्डियक रीमॉडेलिंग को प्रेरित करने के लिए एक उच्च-ऊर्जा आहार का उपयोग किया गया था, जो मायोकार्डियम में एक चयापचय विकार, फाइब्रोसिस और कम एक्टोमायोसिन एमजीएटीपीस की विशेषता थी। माउस अनुप्रस्थ महाधमनी कसना (टीएसी) उच्च रक्तचाप प्रेरित वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोपैथी की नकल करने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले मॉडल में से एक है। बाएं वेंट्रिकल संकेंद्रित अतिवृद्धि से बढ़े हुए ईएफ के साथ कम ईएफ15,16 के साथ पतला रीमॉडेलिंग तक प्रगति करता है। इन दो विशिष्ट चरणों के बीच संक्रमणकालीन फेनोटाइप बताते हैं कि महाधमनी कसना तकनीक का उपयोग एचएफपीईएफ का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

पैथोलॉजिकल विशेषताएं, सेलुलर सिग्नलिंग, और एक पोर्सिन HFpEF मॉडल के mRNA प्रोफाइल पहले17 प्रकाशित किए गए थे। यहां, इस मॉडल को स्थापित करने के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है और इस मॉडल के फेनोटाइप का मूल्यांकन करने के लिए दृष्टिकोण प्रस्तुत किया गया है। प्रक्रिया चित्रा 1 में सचित्र है. संक्षेप में, सर्जिकल योजना मुख्य अन्वेषक, सर्जन, प्रयोगशाला तकनीशियनों और पशु देखभाल कर्मचारियों द्वारा संयुक्त रूप से बनाई गई थी। मिनीपिग ने जैव रासायनिक परीक्षण और इकोकार्डियोग्राफी सहित स्वास्थ्य परीक्षाएं कीं। सर्जरी के बाद, विरोधी भड़काऊ और एनाल्जेसिक प्रक्रियाएं की गईं। इकोकार्डियोग्राफी, हिस्टोलॉजिकल परीक्षा और बायोमार्कर का उपयोग फेनोटाइप का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था।

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Protocol

सभी जानवरों के अध्ययन को गुआंग्डोंग प्रयोगशाला पशु निगरानी संस्थान की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (अनुमोदन सं। IACUC2017009)। प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड (8 वां संस्करण, 2011, द नेशनल अकादमियां, यूएसए) के बाद सभी पशु प्रयोग किए गए थे। जानवरों को ग्वांगडोंग प्रयोगशाला पशु निगरानी संस्थान (लाइसेंस नं। SYXK (YUE) 2016-0122, चीन)। छह नर तिब्बती मिनीपिग (शम समूह और डीएसी समूह के लिए एन = 3 प्रत्येक, वजन में 25-30 किलोग्राम) का उपयोग एचएफपीईएफ मॉडल विकसित करने के लिए किया गया था।

1. पशु और उपकरण की तैयारी

  1. सर्जरी से पहले 14 दिनों के लिए जानवरों को सुविधा के लिए अनुकूलित करें।
  2. सर्जरी से पहले जैव रासायनिक परीक्षण और इकोकार्डियोग्राफी सहित स्वास्थ्य परीक्षण करें। CALAS85-50 प्रयोगशाला जानवरों के अनुसार संरचना (वेंट्रिकुलर फैलाव या अतिवृद्धि) और कार्य (ईएफ <2020%) में हृदय संबंधी असामान्यताओं वाले जानवरों को बाहर करें - प्रमुख अंगों के स्वास्थ्य मूल्यांकन के लिए दिशानिर्देश, जैसे कि हृदय, यकृत, गुर्दे, और बड़े प्रयोगशाला जानवरों के मस्तिष्क (चीनी एसोसिएशन फॉर लेबोरेटरी एनिमल साइंसेज, चीन)।
  3. सर्जरी के दिन पर भोजन न करके संज्ञाहरण से पहले 12 घंटे से अधिक के लिए जानवरों को उपवास करें।
  4. शल्य चिकित्सा कक्ष और उपकरणों (चित्रा 2) तैयार करें. एस्थीसिया वेंटिलेटर स्टेशन, पशु चिकित्सा और रोगी मॉनिटर, पशु चिकित्सा अल्ट्रासाउंड प्रणाली, एस्पिरेटर और अन्य सर्जिकल उपकरणों की जाँच करें। कैंची, संदंश, रिट्रैक्टर, स्केलपेल हैंडल, एस्पिरेटर हेड, सर्जिकल सुई, आदि को आटोक्लेव करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।

2. बेहोश करने की क्रिया, श्वासनली इंटुबैषेण, और नस कैनुलेशन

  1. जानवरों का वजन करें और संवेदनाहारी दवाओं की गणना करें। 1 मिलीग्राम/किग्रा ज़ोलेटिल इंजेक्शन (इंजेक्शन के लिए टिलेटामाइन और ज़ोलाज़ेपम) और 0.5 मिलीग्राम/किग्रा ज़ाइलाज़ीन हाइड्रोक्लोराइड इंजेक्शन ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ मिनीपिग्स को बेहोश करें।
  2. संयम और ऑपरेटिंग सर्जरी की मेज पर सही पार्श्व लेटा हुआ स्थिति में minipigs जगह. जानवरों के शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए हीटिंग सिस्टम चालू करें।
  3. इकोकार्डियोग्राफी (चरण 5) करें और रक्त के नमूनों के 2 एमएल एकत्र करें।
  4. एक पशु चिकित्सा संज्ञाहरण वेंटिलेटर स्टेशन (चित्रा 3 ए) ( सामग्री की तालिका) से जुड़े एक एंडोट्रैचियल ट्यूब के साथ मिनीपिग्स को इंटुबेट करें।
  5. 8 एमएल/किलोग्राम ज्वारीय मात्रा और 30 सांस/मिनट पर वेंटिलेशन शुरू करें। शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के दौरान isoflurane के 1.5% -2.5% के साथ जानवरों को बनाए रखें.
  6. एक कान नस (आमतौर पर सीमांत कान नस, चित्रा 3 बी) से एक परिधीय अंतःशिरा कैथेटर (26 जी) (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग अंतःशिरा कैनुलेशन स्थापित करें।
  7. पशु को पशु चिकित्सा मॉनिटर से कनेक्ट करें।

3. सर्जिकल प्रक्रिया

  1. बाएं वक्ष क्षेत्र को शेव करें। 0.7% आयोडीन और 75% अल्कोहल लागू करें ताकि स्कैपुला से डायाफ्राम तक त्वचा को तैयार किया जा सके (चित्र 3सी)।
  2. शल्य चिकित्सा क्षेत्र पर बाँझ पर्दे रखें.
  3. सामान्य संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए अंतःशिरा इंजेक्शन द्वारा प्रोपोफोल (5 मिलीग्राम / किग्रा) ( सामग्री की तालिका देखें) का प्रशासन करें।
  4. इलेक्ट्रोकॉटरी के साथ त्वचा चीरा से पहले 4 वें इंटरकोस्टल स्पेस के साथ चीरा (~ 15 सेमी लंबा) चिह्नित करें।
  5. मांसपेशियों और संयोजी ऊतक के दाग़ना और कुंद विच्छेदन का एक संयोजन का उपयोग कर छाती खोलें. ऑपरेशन के दौरान रक्त निकालने के लिए एक एस्पिरेटर का उपयोग करें।
  6. पसलियों (चित्रा 3 डी) को फैलाने के लिए एक रिब रिट्रेक्टर का प्रयोग करें।
  7. वक्ष अवरोही महाधमनी खंड का पता लगाएँ और कसना साइट (चित्रा 3E) का निर्धारण. दो बार (चित्रा 3 एफ) खंड के आसपास पाश करने के लिए दो 3-0 सर्जिकल टांके का प्रयोग करें. टांके द्वारा ऊतक क्षति से बचने के लिए सिवनी और महाधमनी के बीच चिकित्सा धुंध की तीन परतें रखें।
  8. कसना की डिग्री निर्धारित करने के लिए दबाव माप इकाइयों की स्थापना करें (चित्र 3एफ-एच)।
    नोट: इकाई में एक कैथेटर शामिल है जो पोत की दीवार, कनेक्शन ट्यूब, दबाव ट्रांसड्यूसर और एक रोगी मॉनिटर को पंचर करता है।
  9. वांछित कसना डिग्री प्राप्त करने के लिए धीरे-धीरे अवरोही महाधमनी खंड के आसपास सर्जिकल सिवनी कस लें। दबाव रीडिंग 20 मिनट के लिए स्थिर और स्थायी रूप से शल्य चिकित्सा समुद्री मील कस करने के लिए अनुमति दें.
  10. छाती गुहा में हवा और अतिरिक्त तरल पदार्थ को खाली करने के लिए एक जल निकासी छाती ट्यूब का उपयोग करें।
  11. परतों में छाती की दीवार को बंद करें, पसलियों को फिर से लगाएं और अवशोषित टांके के साथ मांसपेशियों को विभाजित करें।
  12. किसी भी रक्तस्राव की जाँच करें और अच्छा हेमोस्टेसिस सुनिश्चित करें।
  13. सर्जरी के बाद ऑपरेशन क्षेत्र में बेंज़िलपेनिसिलिन (800,000 इकाइयां) ( सामग्री की तालिकादेखें) की एक बोतल लागू करें।
  14. आंख झपकने और जानवर के अंग आंदोलन की उपस्थिति की निगरानी करें। वेंटिलेटर को डिस्कनेक्ट करें लेकिन एंडोट्रैचियल ट्यूब को छोड़ दें। सहज श्वास की उपस्थिति की निगरानी करें।
  15. जानवर को उसके आवास कक्ष में लौटा दें और उसे अपने आप जागने के लिए छोड़ दें।

4. सर्जरी के बाद की देखभाल

  1. 1 सप्ताह (20,000 यू / किग्रा) के लिए दैनिक बेंज़िलपेनिसिलिन लागू करें।
  2. 1 सप्ताह के लिए प्रतिदिन 1 मिलीग्राम/किलोग्राम फ्लुनिक्सिन मेग्लुमिन ( सामग्री की तालिकादेखें) लागू करें।
    नोट: ओपिओइड और एनएसएआईडी एनाल्जेसिक को इंट्रा- और पोस्ट-ऑपरेटिव रूप से प्रशासित किया जाना चाहिए।

5. ट्रान्सथोरासिक इकोकार्डियोग्राफी

  1. 1 मिलीग्राम / किग्रा ज़ोलेटिल के साथ जानवर को बेहोश करें।
  2. एक कैनवास कवर के साथ एक मोबाइल संयम इकाई में पशु रखें.
    नोट: मोबाइल संयम इकाई ( सामग्री की तालिकादेखें) में चार एपर्चर होते हैं जो जानवर के अग्रभाग और हिंद अंगों का विस्तार करने के लिए डिज़ाइन किए गए होते हैं।
  3. जानवर की बाईं छाती को शेव करें।
  4. शिखर नाड़ी को महसूस करने के लिए छाती के बाएं-केंद्र पर उंगलियों को रखें। अल्ट्रासोनिक जेल को आसपास के क्षेत्र में लागू करें।
  5. अल्ट्रासाउंड सिस्टम के चरणबद्ध सरणी ट्रांसड्यूसर (3-8 हर्ट्ज) को तीसरे इंटरकोस्टल स्पेस में रखें। ट्रांसड्यूसर को पूर्वकाल या पीछे की दिशा की ओर ले जाएं और पायदान कोण को समायोजित करें।
  6. एट्रिया, निलय और महाधमनी की पहचान करें। बी-मोड और एम-मोड पैरास्टर्नल लंबी-अक्ष छवियों को रिकॉर्ड करें।
    नोट: बी-मोड छवि पैपिलरी मांसपेशी स्तर पर बाएं वेंट्रिकल के क्रॉस-सेक्शन का प्रतिनिधित्व करती है, और एम-मोड छवि समय के साथ बाएं वेंट्रिकल की गति को दर्शाती है।
  7. पैरास्टर्नल शॉर्ट-एक्सिस व्यू प्राप्त करने के लिए ट्रांसड्यूसर हेड को 90° दक्षिणावर्त घुमाएं। बाएं वेंट्रिकल, दाएं वेंट्रिकल और पैपिलरी मांसपेशी की पहचान करें। बी-मोड और एम-मोड छवियों को रिकॉर्ड करें।
  8. हृदय संरचना और कार्य का आकलन करने के लिए अल्ट्रासाउंड प्रणाली के निर्माता द्वारा प्रदान किए गए वर्कस्टेशन का उपयोग करें।

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Representative Results

इकोकार्डियोग्राफी
कार्डियक संरचना और कार्य का मूल्यांकन सप्ताह 0, 2, 4, 6, 8, 10 और 12 में किया गया था। पैरास्टर्नल शॉर्ट-अक्ष दृश्य की बी-मोड और एम-मोड रिकॉर्डिंग चित्र 4A में प्रदर्शित की जाती हैं। इकोकार्डियोग्राफिक माप में वेंट्रिकुलर सेप्टम मोटाई (वीएसटी), पीछे की दीवार मोटाई (पीडब्लूटी), और बाएं वेंट्रिकुलर आंतरिक आयाम (एलवीआईडी) शामिल थे। अंत डायस्टोल पर वीएसटी डीएसी दिलों में वृद्धि हुई, जबकि अंत-डायस्टोल में पीडब्ल्यूटी में वृद्धि हुई और फिर अवलोकन अवधि के दौरान कमी आई, यह सुझाव देते हुए कि हाइपरट्रॉफिक रीमॉडेलिंग डीएसी मिनीपिग (चित्रा 4बी,सी)के बाएं वेंट्रिकल में मौजूद थी। अंत-डायस्टोल में एलवीआईडी सप्ताह 4 और 6 में कमी आई और फिर धीरे-धीरे सप्ताह 8 के बाद वृद्धि हुई, यह सुझाव देते हुए कि वेंट्रिकल्स फैलाव(चित्रा 4डी)से पहले गाढ़ा अतिवृद्धि से गुजरे। मॉडल दिलों के एलवीईएफ को 12 सप्ताह की अवधि (चित्रा 4ई) के दौरान >50% पर बनाए रखा गया था।

आकृति विज्ञान और दिल की विफलता मार्कर
सप्ताह 12 के बाद, दिलों को काटा गया जैसा कि पहले17 में वर्णित था। दिखावा दिल के उन लोगों के साथ तुलना में, डीएसी दिलों के इज़ाफ़ा (चित्रा 5 ए) मनाया गया था. कार्डियक ट्रोपोनिन I (cTnI) की सीरम एकाग्रता निर्माता के निर्देशों के बाद सप्ताह 0, 4, 8 और 12 में एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख किट का उपयोग करके निर्धारित की गई थी (सामग्री की तालिका देखें)। ऑप्टिकल घनत्व को माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 450 एनएम पर मापा गया था। दिल की विफलता मार्कर सीटीएनआई इसी समय बिंदुओं (चित्रा 5 बी)पर शम समूह की तुलना में डीएसी समूह में सप्ताह 4, 8, और 12 में काफी अधिक था।

हिस्टोलॉजिकल परीक्षा
बाएं और दाएं वेंट्रिकल, वेंट्रिकुलर सेप्टम, बाएं और दाएं आलिंद, माइट्रल वाल्व और महाधमनी की मुक्त दीवारों से ऊतकों को एकत्र किया गया और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया। ऊतकों एम्बेडेड थे, वर्गों में कटा हुआ, और हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) समाधान के साथ दाग पिछली रिपोर्ट17 के बाद. हाइपरट्रॉफिक कार्डियोमायोसाइट्स, फाइब्रोसिस, भड़काऊ कोशिकाओं, पाइकोनोटिक नाभिक और अन्य संरचनाओं की पहचान एक हल्के माइक्रोस्कोप से की गई थी। एट्रिया, वेंट्रिकुलर सेप्टम और निलय में कार्डियोमायोसाइट्स ने पिक्नोसिस (चित्रा 6ए) के साथ अतिवृद्धि प्रदर्शित की। मांसपेशियों की परतों को माइट्रल वाल्व(चित्रा 6बी)में कम किया गया था, और संवहनी एंडोथेलियल हाइपरप्लासिया महाधमनी(चित्रा 6सी)में देखा गया था। इसके अलावा, डीएसी ने मिनीपिग(चित्रा 7ए)के मायोकार्डियम में व्यापक फाइब्रोसिस को प्रेरित किया, बाएं वेंट्रिकल्स, दाएं एट्रियम, और महाधमनी की दीवारों(चित्रा 7बी)में भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ के साथ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रायोगिक डिजाइन। प्रयोगात्मक योजना प्रमुख अन्वेषक, सर्जन, प्रयोगशाला तकनीशियनों और पशु देखभाल कर्मचारियों द्वारा सहयोगात्मक रूप से बनाई गई थी। मिनीपिग ने जैव रासायनिक परीक्षण और इकोकार्डियोग्राफी सहित स्वास्थ्य परीक्षाएं कीं। सर्जरी के बाद, विरोधी भड़काऊ और एनाल्जेसिक प्रक्रियाएं की गईं। इकोकार्डियोग्राफी, हिस्टोलॉजिकल परीक्षा और बायोमार्कर परीक्षण ने दिल की विफलता फेनोटाइप का मूल्यांकन किया। जानवरों की संख्या, n = 3 प्रत्येक, शम और डीएसी समूहों के लिए थी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. सर्जिकल उपकरण। डीएसी सर्जरी के लिए आवश्यक उपकरणों (ए) में एस्पिरेटर (ए), सर्जिकल टेबल (बी), पशु चिकित्सा मॉनिटर (सी), एलईडी सर्जिकल लाइट्स (डी), और एस्थीसिया वेंटिलेटर स्टेशन (ई) शामिल थे। सर्जरी से पहले और बाद में जानवरों के दिलों की संरचना और कार्य का मूल्यांकन करने के लिए एक पशु चिकित्सा अल्ट्रासाउंड प्रणाली का उपयोग किया गया था (बी)। सर्जिकल उपकरणों में एक लैरींगोस्कोप (सी) और विभिन्न संदंश, स्केलपेल हैंडल और कैंची (डी) शामिल थे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सर्जिकल प्रक्रिया। बेहोश करने की क्रिया के बाद, जानवर को एंडोट्रैचियल ट्यूब (ए) के साथ इंटुबैट किया गया था, और अंतःशिरा कैनुलेशन एक कान नस (बी) के माध्यम से स्थापित किया गया था। सर्जिकल साइट जानवर (सी) के बाएं सीने पर थी। अवरोही महाधमनी (डी, ई) को उजागर करने के बाद, दबाव निगरानी (एसए, एससी) के लिए कसना साइट (एसबी) और आक्रामक साइटों को निर्धारित किया गया था (एफ, जी), और महाधमनी दबाव को रोगी मॉनिटर (एच) का उपयोग करके मापा गया था। एक कार्टून कसना रणनीति (I) का अवलोकन प्रदर्शित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ट्रान्सथोरासिक इकोकार्डियोग्राफी मूल्यांकन। सप्ताह 0 से सप्ताह 12 तक दबाव अधिभार दिलों के प्रतिनिधि बी-मोड और एम-मोड छवियों को (ए) में प्रदर्शित किया जाता है। 4 सेकंड के लिए रिकॉर्ड की गई M मोड छवियाँ दिखाई जाती हैं। गुलाबी पैमाने पट्टी 1 एस की रिकॉर्ड लंबाई इंगित करता है अंत में वेंट्रिकुलर पट मोटाई (वीएसटी) अंत डायस्टोल पर डीएसी दिल (बी) में वृद्धि हुई. इसके विपरीत, अंत-डायस्टोल पर पीछे की दीवार की मोटाई (पीडब्लूटी) धीरे-धीरे बढ़ी और अवलोकन अवधि (सी) के दौरान घट गई। अंत-डायस्टोल पर बाएं वेंट्रिकुलर आंतरिक आयाम (एलवीआईडी) सप्ताह 4 और सप्ताह 6 में कम हो गया और फिर धीरे-धीरे सप्ताह 8 (डी) के बाद बढ़ गया। मॉडल दिलों के एलवीईएफ को 12 सप्ताह की अवधि (ई) के दौरान >50% पर बनाए रखा गया था। जानवरों की संख्या, n = 3 प्रत्येक, शम और डीएसी समूहों के लिए थी। समूहों के बीच अंतर निर्धारित करने के लिए अयुग्मित टी-परीक्षणों का उपयोग किया गया था। *पी < 0.05 बनाम दिखावा समूह। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: हृदय आकृति विज्ञान और सीरम सीटीएनआई। दिल का आकार बढ़ता हुआ दिखाई दिया (ए)। दिल की विफलता मार्कर cTnI संबंधित समय बिंदुओं (बी) पर शम समूह की तुलना में डीएसी समूह में सप्ताह 4, 8 और 12 में काफी अधिक था। जानवरों की संख्या, n = 3 प्रत्येक, शम और डीएसी समूहों के लिए थी। समूहों के बीच अंतर निर्धारित करने के लिए अयुग्मित टी-परीक्षणों का उपयोग किया गया था। *पी < 0.05 बनाम दिखावा समूह। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: मायोकार्डियम, माइट्रल वाल्व और महाधमनी दीवार का ऊतक विज्ञान। एच & ई धुंधला प्रयोग के अंत में हृदय ऊतक की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एट्रिया, वेंट्रिकुलर सेप्टम और वेंट्रिकल्स में कार्डियोमायोसाइट्स ने हाइपरट्रॉफी (हरे रंग में तीर; ए), पायरोसिस के साथ (पीले रंग में तीर; मांसपेशियों की परतों को माइट्रल वाल्व (नीले रंग में तीर; संवहनी एंडोथेलियल हाइपरप्लासिया महाधमनी (नीली रेखाओं के भीतर का क्षेत्र) में देखा गया था; लाल तारांकन: ऊतकों की जांच की; एल वेंट्रिकल, बाएं वेंट्रिकल; आर वेंट्रिकल, सही वेंट्रिकल; एल एट्रियम, बाएं आलिंद ; आर. एट्रियम, दायां आलिंदा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: डीएसी दिल में फाइब्रोसिस और सूजन। हिस्टोलॉजिकल परीक्षा ने डीएसी मिनीपिग्स में व्यापक मायोकार्डियल फाइब्रोसिस दिखाया। बाएं वेंट्रिकल में एक फाइब्रोटिक क्षेत्र प्रदर्शित किया गया था (पीले रंग में तारांकन और तीर; बाएं निलय, दाएं आलिंद और महाधमनी की दीवारों (हरे रंग में तारांकन; लाल तारांकन: ऊतकों की जांच की; नीले रंग में तीर, ईोसिनोफिल; एल वेंट्रिकल, बाएं वेंट्रिकल; आर. एट्रियम, दायां आलिंदा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस अध्ययन ने तिब्बती मिनीपिग के लिए एचएफपीईएफ मॉडल विकसित करने के लिए डीएसी तकनीकों का उपयोग किया। एक कदम दर कदम पशु और साधन तैयारी प्रोटोकॉल बेहोश करने की क्रिया सहित यहाँ प्रस्तुत किया है, श्वासनली इंटुबैषेण, नस cannulation, शल्य प्रक्रिया, और सर्जरी के बाद की देखभाल. इकोकार्डियोग्राफिक बी-मोड और एम-मोड दिल की छवियों के लिए रिकॉर्डिंग तकनीक भी प्रस्तुत की जाती है। डीएसी के बाद, दिल सप्ताह 4 और 6 के दौरान बाएं वेंट्रिकुलर हाइपरट्रॉफी और सप्ताह 8 के बाद फैलाव से गुजरा। LVEF को 12 सप्ताह की अवधि के दौरान संरक्षित किया गया था। फाइब्रोसिस और सूजन डीएसी दिल में मनाया गया.

खुले छाती के ऑपरेशन और महाधमनी कसना के संयोजन का उपयोग बड़े और छोटे जानवरों में दिल की विफलता के मॉडल विकसित करने के लिए किया गया है। उदाहरण के लिए, कृंतक महाधमनी कसना-प्रेरित उच्च रक्तचाप 1950 के दशक18 की शुरुआत में रिपोर्ट किया गया था। सूअरों में आरोही महाधमनी के कसना ने 2-4 सप्ताह पुराने सूअरों में हल्के बाएं वेंट्रिकुलर हाइपरट्रॉफी को प्रेरित किया। आरोही महाधमनी का पता लगाने के लिए ऑपरेशन साइट के बारे में, कुछ अध्ययनों ने तीसरे इंटरकोस्टल स्पेस19,20 का चयन किया, जबकि एक अन्य अध्ययन ने पार्श्व थोरैकोटॉमी21 के लिए चौथे इंटरकोस्टल स्पेस का चयन किया। यह पाया गया कि अवरोही महाधमनी पर कसना वयस्क तिब्बती मिनीपिग में व्यावहारिक था। अवरोही महाधमनी खंड चौथे इंटरकोस्टल स्पेस के ठीक नीचे स्थित था और थोड़ा संयोजी ऊतक से घिरा हुआ था।

HFpeF की प्रमुख विशेषताओं को प्रेरित करने के लिए कसना की डिग्री महत्वपूर्ण हो सकती है। मेलेबी एट अल ने बताया कि एक छोटे से अंगूठी के आकार ने अतिवृद्धि को तेज कर दिया, जबकि बड़े रिंग आकार ने आरोही महाधमनी कसना22 के साथ चूहों में 8-20 सप्ताह के लिए ईएफ को संरक्षित किया। मैसी एट अल वेंट्रिकुलर हाइपरट्रॉफी21 को प्रेरित करने के लिए सूअरों में खुली छाती सर्जरी के लिए 20 मिमीएचजी का दबाव ढाल सेट करें। चार्ल्स एट अल ने मादा यॉर्कशायर-लैंड्रेस सूअरों में एचएफपीईएफ उत्पन्न करने के लिए प्रगतिशील कफ मुद्रास्फीतिको अपनाया 23. वर्तमान अध्ययन में, 12 सप्ताह के लिए अवरोही महाधमनी में दबाव में 20% की वृद्धि ने HFpeF का नेतृत्व किया। शोधकर्ताओं ने मादा ओसाबा सूअर10,24में एचएफपीईएफ को प्रेरित करने के लिए डीऑक्सीकोर्टिकोस्टेरोन एसीटेट या पश्चिमी आहार के साथ महाधमनी कसना तकनीक को भी जोड़ा है। कसना डिग्री आमतौर पर एक सूक्ष्म मैनोमीटर कैथेटर या इकोकार्डियोग्राफी का उपयोग करके मापा दबाव द्वारा अनुमान लगाया जाता है। महाधमनी दबाव को मापने के लिए एक उपकरण को संशोधित किया गया था। एक रोगी मॉनिटर से जुड़े डिस्पोजेबल रक्तचाप ट्रांसड्यूसर के साथ एक कैथेटर का उपयोग अवरोही महाधमनी पर दबाव रिकॉर्ड करने के लिए किया गया था।

हमारे पिछले अध्ययन minipigs17 में HFpEF दिल की ठेठ parasternal लंबी अक्ष छवियों प्रस्तुत; यहां, प्रतिनिधि पैरास्टर्नल शॉर्ट-एक्सिस छवियां जोड़ी जाती हैं। पहले के परिणामों के अनुरूप, मिनीपिग डीएसी मॉडल ने 12 सप्ताह की अवलोकन अवधि के दौरान कार्डियक रीमॉडेलिंग, गाढ़ा अतिवृद्धि और फैलाव के दो अलग-अलग चरणों को प्रदर्शित किया। ये फेनोटाइप एचएफपीईएफ के नैदानिक लक्षणों के अनुरूप हैं। इस काम में एचएफपीईएफ मॉडल में नए हिस्टोलॉजिकल निष्कर्ष भी सामने आए हैं। एट्रिया, वेंट्रिकुलर सेप्टम और वेंट्रिकल्स में कार्डियोमायोसाइट हाइपरट्रॉफी पाई जाती है। इसके अलावा, बाएं वेंट्रिकल, दाएं आलिंद और महाधमनी की दीवार में गंभीर भड़काऊ सेल घुसपैठ प्राप्त की जाती है। यह पिछले निष्कर्षों का पूरक है, जिसने डीएसीमायोकार्डियम 17 में इंटरल्यूकिन -6 और -1β, NFκB और साइटोकिन उत्पादन के अपरेगुलेशन का प्रदर्शन किया। एचएफपीईएफ सुअर के माइट्रल वाल्व में मांसपेशियों की परत गायब हो गई, यह सुझाव देते हुए कि माइट्रल वाल्व में असामान्यताओं ने हृदय की शिथिलता में योगदान दिया।

सफल और स्थिर सुअर मॉडल प्राप्त करने के लिए एक सड़न रोकनेवाला शल्य चिकित्सा प्रक्रिया की स्थापना महत्वपूर्ण है। सूअरों में महाधमनी कसना सर्जरी कृन्तकों की तुलना में अधिक ऑपरेटरों की आवश्यकता होती है। इसके लिए आमतौर पर दो सर्जनों, एक एनेस्थेसियोलॉजिस्ट, दो ऑपरेटिंग रूम नर्सों की एक अनुभवी सर्जिकल टीम की आवश्यकता होती है। ये भूमिकाएँ पशु चिकित्सकों, मानव सर्जनों और/या अच्छी तरह से प्रशिक्षित तकनीशियनों द्वारा ली जा सकती हैं। एक कृंतक सर्जरी की तुलना में जो महाधमनी कसना प्रक्रिया को पूरा करने में लगभग 30 मिनट का समय लेती है, सूअरों में इसी तरह की प्रक्रिया को पूरा करने में 3 घंटे से अधिक समय लग सकता है। व्यवहार में, बड़े जानवरों की सर्जरी के लिए अपर्याप्त सुविधाएं और कुशल कर्मी सुअर सर्जिकल मॉडल के आवेदन को सीमित करते हैं।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को गुआंग्डोंग विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (2008A08003, 2016A020216019, 2019A030317014), गुआंगज़ौ विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (201804010206), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31672376, 81941002), और प्रयोगशाला जानवरों की गुआंग्डोंग प्रांतीय कुंजी प्रयोगशाला (2017B030314171) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbable surgical suture Putong Jinhua Medical Co. Ltd, China 4-0
Aesthesia ventilator station Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, China WATO EX-35vet
Aspirator Shanghai Baojia Medical Apparatus Co., Ltd, China YX930D
Benzylpenicillin Sichuan Pharmaceutical. INC, China H5021738
Disposal endotracheal tube with cuff Shenzhen Verybio Co., Ltd, China 20 cm, ID 0.9
Disposal transducer Guangdong Baihe Medical Technology Co., Ltd, China
Dissection blade Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China
Electrocautery Shanghai Hutong Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China GD350-B
Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA kit Cusabio Biotech Co., Ltd, China CSB-E08594r
Eosin Sigma-Aldrich Corp. E4009
Flunixin meglumine Shanghai Tongren Pharmaceutical Co., Ltd., China Shouyaozi(2012)-090242103
Forceps Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Hematoxylin Sigma-Aldrich Corp. H3136
Isoflurane RWD Life Science Co., Ltd, China Veteasy for animals
Laryngoscope Taixing Simeite Medical Apparatus and Instruments Limited Co., Ltd, China For adults
LED surgical lights Mingtai Medical Group, China ZF700
Microplate reader Thermo Fisher Scientific, USA Multiskan FC
Microscope Leica, Germany DM2500
Mobile restraint unit Customized N/A A mobile restraint unit, made by metal frame and wheels, with a canvas cover
Oxygen Local suppliers, Guangzhou, China
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich Corp. V900894
Patient monitor Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China Beneview T5
Peripheral Intravenous (IV) Catheter Shenzhen Yima Pet Industry Development Co., Ltd., China 26G X 16 mm
Propofol Guangdong Jiabo Phamaceutical Co., Ltd. H20051842
Rib retractor Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Ruler Deli Manufacturing Company, China
Scalpel handles Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Scissors (g) Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Suture Medtronic-Coviden Corp. 3-0, 4-0
Ultrasonic gel Tianjin Xiyuansi Production Institute, China TM-100
Veterinary monitor Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China ePM12M Vet
Veterinary ultrasound system Esatoe, Italy MyLab30 Equiped with phased array transducer (3-8 Hz)
Xylazine hydrochloride injection Shenda Animal Phamarceutical Co., Ltd., China Shouyaozi(2016)-07003
Zoletil injection Virbac, France Zoletil 50 Tiletamine and zolazepam for injection

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References

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सर्जिकल मॉडल दिल की विफलता संरक्षित इजेक्शन अंश तिब्बती मिनीपिग बड़े पशु मॉडल अवरोही महाधमनी कसना क्रोनिक दबाव अधिभार बाएं वेंट्रिकल इकोकार्डियोग्राफी रूपात्मक परिवर्तन कार्यात्मक परिवर्तन वेंट्रिकुलर सेप्टम हाइपरट्रॉफी पीछे की दीवार मोटाई में कमी बाएं वेंट्रिकल फैलाव एलवी इजेक्शन फ्रैक्शन कार्डियक डैमेज फाइब्रोसिस सूजन कार्डियोमायोसाइट हाइपरट्रॉफी हार्ट फेल्योर मार्कर आणविक तंत्र
तिब्बती मिनीपिग्स में संरक्षित इजेक्शन अंश के साथ दिल की विफलता का एक सर्जिकल मॉडल
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Li, X., Tan, W., Li, X., Zheng, S.,… More

Li, X., Tan, W., Li, X., Zheng, S., Zhang, X., Chen, H., Pan, Z., Zhu, C., Yang, F. H. A Surgical Model of Heart Failure with Preserved Ejection Fraction in Tibetan Minipigs. J. Vis. Exp. (180), e63526, doi:10.3791/63526 (2022).

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